前將其置于Plexiglass盒15分鐘。Von Frey爪收回閾值被測量為在給藥 后30分鐘，在每只動物的受影響的爪上，在1 -2分鐘內(nèi)進行的數(shù)個獨立測定的平均值。預(yù)先 確定所用時間點以顯示每個測試組合物的最高鎮(zhèn)痛效應(yīng)。
[0296] 使用型號2290的測痛儀（IITC Life Science，Woodland Hills，CA)來檢測動物對 觸覺刺激的反應(yīng)閾值。將動物置于金屬絲網(wǎng)表面上的升高的Plexiglas盒中。在15分鐘的適 應(yīng)后，用以克為單位而測量的足夠力將測痛毛(von Frey hair)垂直應(yīng)用于動物的同側(cè)后 爪的跖面上以引起爪的彎曲反應(yīng)。反應(yīng)表示來自疼痛刺激的收回并構(gòu)成效力終點。
[0297] 莖里
[0298] 在基線，在5個試驗組的von Frey爪收回測量平均值之間沒有顯著差異。在給藥的 第四日，在給藥后30分鐘，用2%、4%和8%(w/w)的化合物A的藥物組合物處理的組全部顯 示出von Frey機械爪收回閾值的統(tǒng)計學(xué)顯著的增加，其表達為從基線的變化百分數(shù)(CFB)， 從而顯示鎮(zhèn)痛效應(yīng)(參見圖1)。具有化合物A的組合物的鎮(zhèn)痛效應(yīng)隨劑量增加（高達為8% (w/w)的試驗最高劑量)而增加，這顯示最大CFB百分數(shù)在+45.1 %。然而，1 % (w/w)劑量組沒 有顯示出明顯的von Frey機械爪收回閾值的增加。如圖1所示，結(jié)果表明范圍在2 %至8 % (w/v)中，化合物A的組合物在CFA-誘導(dǎo)的炎性疼痛模型中具有鎮(zhèn)痛效應(yīng)。
[0299] 生物學(xué)實施例2
[0300]在神經(jīng)性疼痛模型;慢性壓迫損傷中的效力時間進程
[0301] 神經(jīng)性疼痛的特征為自發(fā)性疼痛和刺激引起的異常性疼痛和痛覺過敏。在下述慢 性壓迫損傷模型中使用Sprague-Dawl ey大鼠來評價本發(fā)明的藥物組合物。
[0302] 在大鼠左后肢的中股位置使用10號手術(shù)刀片通過皮膚切開約3cm的切口并包扎。 小心地通過股二頭肌由鈍器剝離來暴露左坐骨神經(jīng)以使出血最小化。使用四個鉻腸縫線以 1mm至2mm的間隔沿坐骨神經(jīng)系四個寬松的結(jié)。當(dāng)在放大4倍的解剖顯微鏡下觀察時，寬松結(jié) 的拉力是足夠緊的以誘導(dǎo)坐骨神經(jīng)的輕微壓迫。作為偽對照，暴露右坐骨神經(jīng)并以上述相 同方式操作，除了不將縫線綁在神經(jīng)上。直接將抗菌軟膏涂覆在傷口上，并且使用無菌縫線 縫合肌肉。將Betadine?涂覆在肌肉及其周圍上，然后用手術(shù)鉗進行皮膚閉合。
[0303] 使由對機械刺激較低的爪收回閾值確定的同側(cè)腿的痛性神經(jīng)病發(fā)展至少14天。在 研究中登記僅具有明顯痛覺過敏的那些，其通過以克為單位測量的對測痛絲的爪收回降低 閾值而測定。在研究中登記的所有動物顯示爪收回閾值<12g。
[0304] 使用型號2290的測痛儀（IITC Life Science，Woodland Hills，CA)檢測動物對觸 覺刺激的反應(yīng)閾值。將動物置于金屬絲網(wǎng)表面上的升高的Plexiglass盒中。在15分鐘的適 應(yīng)后，用以克為單位檢測的足夠的力將測痛毛垂直應(yīng)用于動物的同側(cè)后爪的跖面上以引起 爪的彎曲反應(yīng)。反應(yīng)表示來自疼痛刺激的收回并構(gòu)成效力終點。在作為基線檢測的給藥之 前，記錄引起彎曲收回反應(yīng)所需的力(單位為克），并在給藥后多個時間點進行記錄。
[0305]在基線檢測之前的三天，在異氟醚下麻醉動物，并將整個同側(cè)后腿(包括上坐骨切 跡大腿區(qū)域、踝和足)剃毛。然后將動物隨機分為4個不同試驗組之一，所述試驗組包括介質(zhì) 對照組、5 % (w/v)利多卡因 （Xy locaine_?)和包含具有5 %或10 % Tr紐scuto膽p的4 % (w/w)化合物A的2個本發(fā)明藥物組合物。在基線檢測后，將lOOmg的試驗組合物涂覆在整個 剃毛區(qū)域上。然后將動物置于塑料管至少15分鐘以防止藥物的過早去除/攝入。然后，在各 個時間點進行von Frey檢測之前，將動物置于Plexiglas盒15分鐘。Von Frey爪收回閾值測 量為在給藥后〇.5、1和2小時，每只動物的受影響的爪上，在1-2分鐘內(nèi)進行的數(shù)個獨立測定 的平均值。
[0306] 題
[0307] 圖2示出每組的爪收回閾值的從基線的平均變化百分數(shù)(CFB)。在給藥后0.5小時， 在5%(w/v)利多卡因組和4%(w/w)化合物A的5%和10% Tmnscutol·? P試驗組分別觀察 至丨」+23.1%、+26.3%和+33.8%0?8。在給藥后1小時，在4%(￥/￥)化合物六的5%和10% Transcutol? P處理組分別觀察到+18.1 %和+26.7%的CFB。在晚于給藥后0.5小時的任意 時間點，在5%(w/v)利多卡因處理組沒有觀察到明顯變化(？>0.05)。4%(?/?)化合物A的 10%Transcutol組表現(xiàn)出從給藥后0.5小時到高至2小時的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，與4%(w/w)化合物A 的5%Transcutol組相比，其具有改善的效力和較長的鎮(zhèn)痛持續(xù)時間。當(dāng)與在CCI-誘導(dǎo)神經(jīng) 性疼痛模型中僅在高至給藥后〇 . 5小時內(nèi)表現(xiàn)出鎮(zhèn)痛效應(yīng)的5 %利多卡因組相比時，兩個 4% (w/w)化合物A的組都表現(xiàn)出較長的持續(xù)鎮(zhèn)痛效應(yīng)。
[0308] 生物學(xué)實施例3
[0309]糖尿病性神經(jīng)病的STZ模型
[0310]該研究評價了本發(fā)明的藥物組合物在雄性Sprague-Dawley大鼠的STZ誘導(dǎo)的神經(jīng) 性疼痛模型中的效力，其中在急性給藥后，與5 % (w/v)局部利多卡因（Xy丨〇caineκι)和 1.16 % (w/v)局部雙氯芬酸(Vo I taren?)相比。通過在大鼠中通過切除胰島素產(chǎn)生胰腺辟田 胞來誘發(fā)糖尿病狀態(tài)，從而建立模擬人類疾病狀態(tài)的痛性外周糖尿病性神經(jīng)病(PDN)的嚙 齒目動物模型。單一鏈脲霉素（STZ)注射破壞大鼠 ?3細胞并產(chǎn)生糖尿病狀態(tài)，其隨時間進入 痛性外周糖尿病性神經(jīng)病(PDN)。
[0311]將鏈脲霉素(STZ)溶于檸檬酸鹽緩沖液(20mM，pH 4.5)并以60mg/Kg的劑量腹膜內(nèi) 給藥以誘導(dǎo)胰腺細胞死亡。在注射后使用AccuSoft血糖監(jiān)測系統(tǒng)每周一次檢測血糖水平。 在初始注射后兩周對在第一注射后不顯示升高血糖水平的動物給予加強注射。血漿葡萄糖 濃度高于16mmol/L的動物被認為是糖尿病并且列入該研究中。使用下述von Frey試驗監(jiān)測 為糖尿病性神經(jīng)病標(biāo)志的痛覺過敏和異常性疼痛。記錄左爪和右爪二者的von Frey測量 值。在研究中登記僅具有明顯痛覺過敏的那些，其通過以克為單位測量的對測痛絲的爪收 回降低閾值而確定。在STZ注射后第八周內(nèi)進行研究。在該時間內(nèi)，密切地監(jiān)測它們的健康 狀況。
[0312]將動物隨機分為四個試驗組(n = 7只動物/組），其包括介質(zhì)對照、5% (w/v)利多卡 因(Xylocaine?)、1.16% (w/v)雙氯芬酸(Voharen?:)和具有4% (w/w)化合物A的藥物組 合物。在基線檢測后，將50mg的試驗組合物涂覆在整個左足上。然后將動物置于Plexiglas 管15分鐘以防止藥物的過早去除/攝入，然后除去Plexiglas盒以進行von Frey檢測。使用 測痛儀(型號2290，IITC Life Science，Woodland Hills,CA)檢測來自機械觸覺刺激的動 物的爪收回閾值。將動物置于金屬絲網(wǎng)表面上的升高的Plexiglas盒中。在15分鐘的適應(yīng) 后，用足夠的力將柔性測痛毛(尖端#15)垂直應(yīng)用于動物的同側(cè)后爪的跖面上以引起爪的 彎曲反應(yīng)。反應(yīng)表示來自疼痛刺激的收回并構(gòu)成效力終點。在作為基線檢測的給藥之前，記 錄引起彎曲收回反應(yīng)所需的力(克），并在給藥后30分鐘記錄。
[0313] 從處理(左)和未處理(右）的爪記錄收回測量值。使用GraphPad Prism 5統(tǒng)計分析 軟件分析von Frey爪收回數(shù)據(jù)。將單因素 AN0VA用于具有Bonferroni校正的多變量分析。將 未配對t檢驗用于單變量分析。結(jié)果表示為平均值±SEM。達到顯著性p〈0.05水平的值被認 為是統(tǒng)計學(xué)顯著的。
[0314] 結(jié)果
[0315] 在基線，在對處理的爪的von Frey爪收回檢測中，四個試驗組之間沒有顯著差異， 在左后爪和右后爪檢測之間也沒有差異。
[0316] 在給藥后30分鐘，圖3提供了每個組的（處理爪的）爪收回閾值的從基線的平均變 化百分數(shù)(CFB)。4% (w/w)化合物A劑量組從基線的變化達到44.9% (p〈0.05)，明顯高于在 5 % (w/v)利多卡因組觀察到的25.9 %的從基線的變化。在1.16 % (w/v)雙氯芬酸組中沒有 觀察到顯著的CFB。
[0317] 因此，在STZ-誘導(dǎo)的神經(jīng)性疼痛模型中，在給藥后30分鐘，含4% (w/w)化合物A的 組合物觀察到局部鎮(zhèn)痛效應(yīng)，其顯示為44.9%的從基線的變化，這高于參比化合物所觀察 到的局部效力。
[0318] 生物學(xué)實施例4
[0319]局部給藥和口服給藥的效力和全身暴露之間的關(guān)系;慢性壓迫損傷
[0320]在該研究中使用為在大鼠中已經(jīng)建立的神經(jīng)性疼痛模型的慢性壓迫損傷(CCI)模 型以比較雄性大鼠的局部和口服給藥之間的化合物A的效力和全身暴露水平。
[0321]如Bennett G J和Xie Y-K.，Pain，（1988)33:pp.87-107所述，通過在常見坐骨神 經(jīng)周圍放置寬松的縮緊性結(jié)扎，在大鼠中誘導(dǎo)外周神經(jīng)病。用3.5%異氟醚麻醉八周齡的雄 性Sprague Dawley大鼠，并在動物的左后肢的中股位置使用10號手術(shù)刀片通過皮膚切開約 3cm的切口并包扎。小心地通過股二頭肌由鈍器剝離來暴露左坐骨神經(jīng)以使出血最小化。使 用四個鉻腸縫線以1mm至2mm的間隔沿坐骨神經(jīng)系四個寬松的結(jié)。當(dāng)在放大4倍的解剖顯微 鏡下觀察時，寬松結(jié)的拉力是足夠緊的以誘導(dǎo)坐骨神經(jīng)的輕微壓迫。直接將抗菌軟膏涂覆 在傷口上，并且使用無菌縫線縫合肌肉。將Betadine?涂覆在肌肉及其周圍上，然后用手 術(shù)鉗進行皮膚閉合。
[0322] 使由對機械刺激較低的爪收回閾值確定的同側(cè)腿的痛性神經(jīng)病發(fā)展。在研究中登 記僅具有明顯痛覺過敏的那些，其通過以克為單位測量的對測痛絲的爪收回降低閾值而確 定。在研究中登記的所有動物顯示爪收回閾值<12g。
[0323] 使用型號2290的測痛儀（IITC Life Science，Woodland Hills，CA)檢測動物對機 械觸覺刺激的爪收回閾值。將動物置于金屬絲網(wǎng)表面上的升高的Plexiglass盒中。在該盒 中的15分鐘的適應(yīng)后，用以克為單位檢測的足夠的力將測痛毛垂直應(yīng)用于動物的同側(cè)后爪 的跖面上以引起爪的彎曲反應(yīng)。反應(yīng)表示來自疼痛刺激的收回并構(gòu)成效力終點。
[0324] 在爪收回基線檢測之后，將動物隨機分為4個不同試驗組(N = 8只動物/組），其包 括口服給藥的介質(zhì)對照組，局部給藥的介質(zhì)對照組，和兩個處理組。對于口服給藥組，在基 線檢測后通過口服灌胃對動物給藥?；谇懊娴难芯窟x擇化合物A的劑量，這表明與本發(fā)明 的含8% (w/w)化合物A的藥物組合物相比，口服劑量為25mg/Kg的化合物A產(chǎn)生疼痛反應(yīng)的 約半數(shù)最大逆轉(zhuǎn)和一定水平的效力。對于局部給藥組，將50mg試驗組合物涂覆在同側(cè)踝和 足上。然后將動物放置在塑料管中15分鐘以防止藥物的過早去除/攝入。然后，在爪收回檢 測之前，將動物置于Plexiglass盒15分鐘。Von Frey爪收回閾值測量為在每只動物的受影 響的爪上，在1-2分鐘內(nèi)進行的數(shù)個獨立測定的平均值。對于口服給藥組在給藥后60分鐘進 行收回檢測，而對于局部給藥組在給藥后30分鐘進行收回檢測，這表示在前面研究中所測 定的它們各自的峰效力時間點。
[0325] 在收回閾值檢測后，使用下列步驟，在其各自效力時間點后約10-15分鐘立即從相 同動物中提取血液樣本。在麻醉下通過頸靜脈穿刺使大鼠出血。相對于給藥時間，記錄提取 每個血液樣本的時間。將每個血液樣本(~150yL)收集在含1 OyL肝素（100單位)的肝素涂覆 的標(biāo)記微量采血管(microvette tube)中并立即放在冰上。在4°C下，離心血液樣本以分離 血漿。將血漿轉(zhuǎn)移入標(biāo)記管并在-80°C液氮中速凍以儲存。在分析時，將血漿解凍并使用固 相提取來進行提取，并且用HPLC/MS/MS量化血漿藥物濃度。
[0326] 使用GraphPad Prism 5統(tǒng)計分析軟件分析von Frey爪收回數(shù)據(jù)。將單因素 AN0VA 用于具有Bonferroni校正的多變量分析。將未配對t-檢驗用于單變量分析。結(jié)果表示為平 均值土SEM。達到顯著性p〈0.05水平的值被認為是統(tǒng)計學(xué)顯著的。
[0327] 莖里
[0328] 在基線，在四個試驗組的von Frey爪收回測量值之間沒有顯著差異。
[0329] 在圖4中示出每個組的爪收回閾值的從基線的平均變化百分數(shù)(CFB)。在給藥后60 分鐘和30分鐘，對于25mg/Kg化合物A的口服給藥組，CFB達到44.3 %，并且對于8 % (w/w)化 合物A的局部給藥組，CFB達到47.1 %，當(dāng)與介質(zhì)組相比時，其是統(tǒng)計學(xué)顯著的（p〈0.001)并 且顯示出鎮(zhèn)痛效應(yīng)。在口服和局部給藥組的CFB之間沒有觀察到統(tǒng)計學(xué)顯著(p=. 742)。
[0330] 在von Frey試驗后立即從動物收集血漿樣本。圖5顯示口服和局部給藥組的化合 物A的全身血漿濃度。在局部給藥組中化合物A的血漿水平顯著低于（~20 X) 口服給藥組的 水平(ρ〈0·0001)。
[0331] 在CCI神經(jīng)性疼痛模型中，與口服給藥25mg/kg化合物A(44%CFB)相比，局部給藥 8 % (w/w)化合物A表現(xiàn)出一定程度的效力(47 % CFB)。在局部給藥組中化合物A的全身血漿 暴露顯著低于（~20X) 口服給藥組。因此，在CCI神經(jīng)性疼痛模型中，局部給藥提供的化合 物A提供了與口服給藥化合物A相當(dāng)?shù)男Я?，同時具有最小的全身暴露。
[0332] 除非另外指出，任何本說明書中引用的美國專利、美國專利申請公開或PCT公開的 專利申請，均以其整體并入本文作為參考，其包括第61/308,759號美國臨時專利申請。 [0333]雖然更詳細地描述了前面的發(fā)明以有助于理解，但顯而易見地，可在所附的權(quán)利 要求范圍內(nèi)進行某些改變及修飾。因此，所述的實施方案應(yīng)被認為示例性說明，而非限制， 且本發(fā)明并不受本文所提供的細節(jié)限制，且可在所附權(quán)利要求范圍及其等同范圍內(nèi)進行修 飾。
【主權(quán)項】
1.用于向哺乳動物局部給藥的藥物組合物，其包含一種或多種藥物可接受的賦形劑和 治療有效量的具有下式的螺-羥吲哚化合物，其對映異構(gòu)體、對映異構(gòu)體的外消旋體或非外 消旋混合物，或其藥物可接受的鹽：
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于向動物局部給藥的藥物組合物，其中所述藥物組合物包含螺?羥吲哚化合物，其對映異構(gòu)體、外消旋體或非外消旋混合物，或其藥物可接受的鹽。這些藥物組合物用于治療和/或預(yù)防鈉通道介導(dǎo)的疾病或疾病狀態(tài)。
【IPC分類】A61P29/00, A61K31/407, A61P25/04
【公開號】CN105726531
【申請?zhí)枴緾N201610060072
【發(fā)明人】康拉德·斯圖爾特·溫特斯, 楊美東, 陳海剛
【申請人】澤農(nóng)醫(yī)藥公司
【公開日】2016年7月6日
【申請日】2011年2月25日
【公告號】CA2788440A1, CN102946859A, CN102946859B, EP2538919A2, US20130143941, WO2011106729A2, WO2011106729A3