基于偏心光束法的自動(dòng)對焦顯微鏡及其對焦方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及顯微鏡對焦技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種采用偏心光束法作為離焦量檢測光 路、配合光斑圖像處理算法計(jì)算樣本離焦量的自動(dòng)對焦裝置及方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 偏心光束法是一種典型的顯微鏡主動(dòng)對焦方法，通常結(jié)合灰度重心法處理激光光 斑圖像以計(jì)算樣本離焦量。但是灰度重心法要求光斑有良好的對稱性且光強(qiáng)分布均勻，而 樣本表面的凹凸情況非常復(fù)雜，并且受光源光強(qiáng)分布不均勾、第二和第三分光棱鏡分光效 果不理想、刀口處的衍射、樣本不同細(xì)胞組織間反射率的差異等原因，對焦相機(jī)獲取的光斑 圖像中殘留大量的噪聲及畸變，光斑的光強(qiáng)分布也嚴(yán)重背離高斯分布，以上原因?qū)е率褂?線性模型擬合灰度重心的坐標(biāo)偏移量與離焦量的數(shù)據(jù)，在實(shí)際應(yīng)用中會(huì)帶來超出了顯微鏡 物鏡景深的誤差，導(dǎo)致自動(dòng)對焦效果很差，獲取的樣本顯微成像質(zhì)量不能滿足應(yīng)用需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述不足，提供一種對焦速度快、對焦 精度高、線性范圍大的基于偏心光束法的自動(dòng)對焦顯微鏡及其對焦方法，可滿足顯微鏡在 高倍物鏡下快速、精確對焦的要求。
[0004] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0005] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種基于偏心光束法的自動(dòng)對焦顯微鏡，包括自 動(dòng)對焦裝置和XY載物臺(tái)，所述自動(dòng)對焦裝置包括偏心光束離焦量探測模塊、顯微成像模塊 和壓電物鏡驅(qū)動(dòng)器；其中：
[0006] 所述偏心光束離焦量探測模塊用于發(fā)射偏心激光束照射樣本表面，并獲取反射回 的半圓形光斑圖像，所述半圓形光斑圖像的半徑與樣本離焦量在一定范圍內(nèi)成線性關(guān)系；
[0007] 所述XY載物臺(tái)用于移動(dòng)樣本，實(shí)現(xiàn)樣本的掃描運(yùn)動(dòng)；
[0008] 所述顯微成像模塊，用于獲取對焦完成后清晰的樣本圖像；
[0009] 所述壓電物鏡驅(qū)動(dòng)器用于補(bǔ)償當(dāng)前視場的離焦量，完成對焦。
[0010] 優(yōu)選地，所述顯微成像模塊包括成像相機(jī)、第二聚焦透鏡組、第三分光棱鏡、物鏡； 其中：樣本的照明光線依次經(jīng)物鏡、第三分光棱鏡、第二聚焦透鏡組，最后在成像相機(jī)上獲 取樣本的顯微圖像。
[0011] 進(jìn)一步地，所述的壓電物鏡驅(qū)動(dòng)器，與物鏡通過螺紋套筒剛性連接，且壓電物鏡驅(qū) 動(dòng)器的最大負(fù)載（額定負(fù)載）不小于物鏡和螺紋套筒的總重量。
[0012] 優(yōu)選地，所述偏心光束離焦量探測模塊內(nèi)部包括集成的近紅外激光器、激光擴(kuò)束 器、刀口、第一分光棱鏡、第二分光棱鏡、第一聚焦透鏡組以及對焦相機(jī)；其中：
[0013] 所述近紅外激光器、激光擴(kuò)束器、刀口、第一分光棱鏡、第三分光棱鏡以及物鏡形 成偏心光束法的激光發(fā)射光路；
[0014] 所述物鏡、第三分光棱鏡、第二分光棱鏡、第一聚焦透鏡組、對焦相機(jī)形成偏心光 束法的光斑反射光路；
[0015] 所述激光發(fā)射光路與光斑反射光路光軸重合，對焦相機(jī)與成像相機(jī)視場一致。
[0016] 優(yōu)選地，所述偏心光束離焦量探測模塊的近紅外激光器嵌入圓柱凸輪結(jié)構(gòu)的激光 器襯套中，通過撥動(dòng)與激光器襯套連接的撥桿可改變近紅外激光器調(diào)整沿光軸方向的位 置，進(jìn)而調(diào)整控制對焦相機(jī)獲取的光斑圖像的大小；
[0017] 優(yōu)選地，所述偏心光束離焦量探測模塊的反射成像光路中第二分光棱鏡固定于蝸 輪蝸桿旋轉(zhuǎn)安裝座上，通過蝸輪蝸桿旋轉(zhuǎn)安裝座可改變第二分光棱鏡與光軸之間的夾角， 進(jìn)而調(diào)整光斑圖像在對焦相機(jī)上的成像位置。
[0018] 優(yōu)選地，所述自動(dòng)對焦裝置還包括計(jì)算機(jī)處理系統(tǒng)，所述偏心光束離焦量探測模 塊、顯微成像模塊、壓電物鏡驅(qū)動(dòng)器以及XY載物臺(tái)分別與計(jì)算機(jī)處理系統(tǒng)連接，用于：
[0019] 控制XY載物臺(tái)運(yùn)動(dòng)；
[0020] 調(diào)整對焦相機(jī)和成像相機(jī)；
[0021] 運(yùn)行圖像處理算法；
[0022] 計(jì)算樣本離焦量；
[0023] 控制壓電物鏡驅(qū)動(dòng)器完成對焦。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種上述基于偏心光束法的自動(dòng)對焦顯微鏡的 自動(dòng)對焦方法，包括如下步驟：
[0025] a、偏心光束離焦量探測模塊發(fā)射半圓形偏心激光束照射樣本表面，并獲取樣本反 射形成的半圓形光斑圖像；
[0026] b、計(jì)算機(jī)處理系統(tǒng)對半圓形光斑圖像運(yùn)行圖像處理算法，計(jì)算當(dāng)前視場下樣本離 隹量.
[0027] c、壓電物鏡驅(qū)動(dòng)器5補(bǔ)償離焦量，完成對焦；
[0028] d、顯微成像模塊獲取清晰的樣本圖像；
[0029] e、XY載物臺(tái)移動(dòng)樣本至下一視場。
[0030] 優(yōu)選地，所述圖像處理算法包括如下步驟：
[0031] (1)將成像相機(jī)獲取的半圓形光斑圖像image (x，y)MXN轉(zhuǎn)化為二維灰度圖gray (X， y)MXN，（x，y)表示圖像像素坐標(biāo)，MXN表示圖像分辨率；
[0032] (2)使用自適應(yīng)窗口中值濾波算法平滑二維灰度圖gray(x，y)MXN，輸出圖像 f mxn>
[0033] (3)使用基于OSTU的Canny邊緣檢測算法：該算法首先使用OSTU算法計(jì)算圖像 /〇,y)Mxiv的二值化閾值T，并以此閾值T對圖像/(x,y) Mxw進(jìn)行二值化，可輸出光斑二值 化圖像binary (x，y)MXN，然后使用Canny邊緣檢測處理得到的光斑二值化圖像binary (X， y)MXN的完整邊緣輪廓edge(x，y) MXN;
[0034] (4)將獲取的完整邊緣輪廓edge (x，y) MXN作為掩膜處理光斑二值化圖像 binary (x，y) MXN，可得邊緣輪廓AedgeA (x，y) MXN;使用完整邊緣輪廓edge (x，y) MXN減去邊緣 輪廓 AedgeA(x，y)MXN可得邊緣輪廓 BedgeB(x，y) MXN;
[0035] (5)使用最小二乘法分別擬合邊緣輪廓A edgeA(x，y)MXN、邊緣輪廓BedgeB(x，y) MXN，得到對應(yīng)的邊緣輪廓A的擬合圓半徑r A、邊緣輪廓B的rB;
[0036] (6)比較擬合圓半徑rA與擬合圓半徑r B的大小，其中較大者對應(yīng)的邊緣輪廓部分 為非半圓輪廓，較小者對應(yīng)的邊緣輪廓部分為半圓輪廓；
[0037] (7)分別計(jì)算邊緣輪廓AedgeA(x，y)MXN、邊緣輪廓BedgeB(x，y) MXN的灰度重心點(diǎn) pointA(xA，yA)及pointB(x B，yB)，（xA，yA)表示邊緣輪廓A的灰度重心點(diǎn)的像素坐標(biāo)，（x B， yB)表示表示邊緣輪廓B的灰度重心點(diǎn)的像素坐標(biāo)；
[0038] (8)比較14與x B的大小，其中較大者對應(yīng)的邊緣輪廓部分在圖像上位于較小者對 應(yīng)的邊緣輪廓部分的右側(cè)；據(jù)此得到非半圓輪廓與半圓輪廓的相對位置，相對位置只有兩 種情況：非半圓輪廓位于半圓輪廓的左側(cè)或右側(cè)，與樣本的兩種離焦?fàn)顟B(tài)--正離焦和負(fù) 離焦一一相對應(yīng)，該對應(yīng)關(guān)系可事先進(jìn)行實(shí)驗(yàn)確定；正離焦是指樣本超出物鏡焦距的離焦 情況，負(fù)離焦是指樣本在物鏡焦距內(nèi)的離焦情況；
[0039] (9)樣本判定為正離焦?fàn)顟B(tài)時(shí)，將rA、rB中的較小者直接代入光斑半徑-離焦量線 性關(guān)系模型；樣本判定為負(fù)離焦?fàn)顟B(tài)時(shí)，將r A、^中的較小者乘以-1代入光斑半徑-離焦 量關(guān)系模型；計(jì)算當(dāng)前樣本離焦量；
[0040] 所述光斑半徑-離焦量關(guān)系模型具體為：
[0041] 光斑半徑絕對值超出數(shù)值rmax時(shí)，光斑半徑-離焦量之間為非線性關(guān)系；光斑半徑 絕對值小于數(shù)值1~_時(shí)，樣本處于準(zhǔn)焦?fàn)顟B(tài)下，，r _表示線性關(guān)系區(qū)間內(nèi)的光斑半徑最大 值，rmin表示線性關(guān)系區(qū)間內(nèi)的光斑半徑最小值；樣本處于正離焦?fàn)顟B(tài)或負(fù)離焦?fàn)顟B(tài)時(shí)，根 據(jù)S = k?r+b計(jì)算離焦量，S表示離焦量，k表示線性模型的斜率，:r表示當(dāng)前光斑半徑，b 表示樣本在物鏡景深范圍內(nèi)時(shí)上述圖像處理算法計(jì)算所得的光斑半徑；其中正離焦時(shí)k > 〇,負(fù)離焦時(shí)k < 0, r = min{rA，rB}，k、b的具體數(shù)值由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析得到。
[0042] 優(yōu)選地，在對基于偏心光束法的自動(dòng)對焦顯微鏡自動(dòng)對焦前，還需要對自動(dòng)對焦 裝置進(jìn)行檢查和調(diào)試，包括如下步驟：
[0043] 首先，調(diào)整激光發(fā)射光路、光斑反射光路、顯微成像光路，使三者光軸重合，保證對 焦相機(jī)和成像相機(jī)的視場一致；對焦相機(jī)能夠獲取激光光斑圖像，成像相機(jī)能夠獲取激光 聚焦點(diǎn)處的樣本圖像；
[0044] 其次，觀察對焦相機(jī)上的激光光斑，調(diào)整偏心光束離焦量探測模塊中的刀口韌邊 恰好經(jīng)過光斑圓心點(diǎn)，遮擋住激光束的一半，形成半圓形光斑圖像。
[0045] 本發(fā)明提供的基于偏心光束法的自動(dòng)對焦顯微鏡及其對焦方法，偏心光束離焦量 探測模塊發(fā)射半圓形激光束照射樣本表面，并獲取樣本反射形成的半圓形光斑圖像；計(jì)算 機(jī)處理系統(tǒng)經(jīng)過自適應(yīng)中值濾波、基于OSTU的Canny邊緣檢測、最小二乘法擬合等算法處 理灰度化的光斑圖像可得到光斑半徑，根據(jù)半徑-離焦量的線性關(guān)系模型，可計(jì)算該視場 下樣本離焦量；壓電物鏡驅(qū)動(dòng)器帶動(dòng)物鏡補(bǔ)償離焦量；對焦完成后，顯微成像模塊獲取清 晰的樣本圖像。
[0046] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
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