] 1、偏心光束離焦量探測模塊可將樣本離焦量轉(zhuǎn)化為與之線性相關(guān)的光斑半徑，而 通過計(jì)算光斑重心偏移量推算離焦量的傳統(tǒng)的灰度重心法，僅適用于反射光斑光強(qiáng)分布均 勻、光斑畸變少的表面，本發(fā)明提供的圖像處理算法建立的光斑半徑-離焦量的線性關(guān)系 模型的精確度更高，且抗噪能力強(qiáng)，可有效消除光斑光強(qiáng)分布不均、光斑畸變嚴(yán)重的情況， 尤其適合處理顯微鏡下樣本離焦量的探測，使得顯微鏡能在高倍物鏡下快速、精確對焦。
[0048] 2、本發(fā)明使用偏心光束法結(jié)合光斑圖像半徑檢測法，具體使用自適應(yīng)窗口的中值 濾波、基于OSTU閾值分割的Canny邊緣檢測、最小二乘法擬合等算法，計(jì)算光斑半徑實(shí)現(xiàn)對 焦，具有如下優(yōu)勢：
[0049] (1)線性范圍大：根據(jù)偏心光束法的基本原理，光斑半徑與離焦量成線性關(guān)系，而 光斑灰度重心偏移量與離焦量并非線性關(guān)系，而且光斑圖像存在的大量衍射導(dǎo)致灰度重心 法線性范圍很小，使用光斑圖像半徑檢測法線性范圍很大；
[0050] (2)精度高：光斑圖像內(nèi)部存在大量衍射造成的波紋狀缺陷，邊緣則存在大量毛 刺、噪聲，灰度重心法對這些缺陷非常敏感，而本發(fā)明提出的光斑圖像半徑檢測法主要針對 光斑圖像的邊緣進(jìn)行分析，可屏蔽光斑圖像內(nèi)部缺陷，使用最小二乘法處理擬合光斑邊緣， 也可消除大部分邊緣毛刺、噪聲的影響。
[0051] 3、本發(fā)明具有對焦速度快、對焦精度高，線性范圍大的優(yōu)點(diǎn)，可滿足顯微鏡在高倍 物鏡下快速、精確對焦的要求。
【附圖說明】
[0052] 通過閱讀參照以下附圖對非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、 目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯：
[0053] 圖1是本發(fā)明的硬件組成圖；
[0054] 圖2是本發(fā)明的壓電物鏡驅(qū)動(dòng)器；
[0055] 圖3是本發(fā)明的偏心光束離焦量探測模塊；
[0056] 圖4是本發(fā)明的近紅外激光器的圓柱凸輪調(diào)整機(jī)構(gòu)；
[0057] 圖5是本發(fā)明的安裝第二分光棱鏡的高精度蝸輪蝸桿安裝座；
[0058] 圖6是本發(fā)明的光斑半徑-離焦量線性關(guān)系模型；
[0059] 圖7是本發(fā)明的圖像處理算法流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0060] 下面對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明：本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行 實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程。應(yīng)當(dāng)指出的是，對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍。
[0061] 實(shí)施例：
[0062] 本實(shí)施例提供了一種基于偏心光束法的自動(dòng)對焦顯微鏡及其對焦方法。
[0063] 基于偏心光束法的自動(dòng)對焦顯微鏡，其硬件構(gòu)成包括自動(dòng)對焦裝置和XY載物臺(tái)， 所述自動(dòng)對焦裝置包括偏心光束離焦量探測模塊、顯微成像模塊、壓電物鏡驅(qū)動(dòng)器；所述的 偏心光束離焦量探測模塊用于發(fā)射偏心激光束照射樣本表面，并獲取反射回的半圓形光斑 圖像，且其半徑與樣本離焦量成線性關(guān)系；所述的XY載物臺(tái)用于移動(dòng)樣本，實(shí)現(xiàn)樣本的掃 描運(yùn)動(dòng)；所述的顯微成像模塊用于獲取對焦完成后清晰的樣本圖像；所述的壓電物鏡驅(qū)動(dòng) 器用于補(bǔ)償當(dāng)前視場的離焦量，完成對焦。
[0064] 所述自動(dòng)對焦裝置還包括計(jì)算機(jī)處理系統(tǒng)，所述的計(jì)算機(jī)處理系統(tǒng)用于控制XY 載物臺(tái)、對焦相機(jī)、成像相機(jī)，以及運(yùn)行光斑圖像處理算法，計(jì)算樣本離焦量，控制壓電物鏡 驅(qū)動(dòng)器完成對焦。
[0065] 進(jìn)一步地，所述的壓電物鏡驅(qū)動(dòng)器，與物鏡通過螺紋套筒剛性連接，且壓電物鏡驅(qū) 動(dòng)器的最大負(fù)載（額定負(fù)載）不小于物鏡和螺紋套筒的總重量。
[0066] 進(jìn)一步地，所述顯微成像模塊包括成像相機(jī)、第二聚焦透鏡組、第三分光棱鏡、物 鏡；其中：
[0067] 樣本的照明光線依次經(jīng)物鏡、第三分光棱鏡、第二聚焦透鏡組，可在成像相機(jī)上獲 取其顯微圖像。
[0068] 進(jìn)一步地，所述的顯微成像模塊，其硬件構(gòu)成包括成像相機(jī)、第二聚焦透鏡組、物 鏡，第二聚焦透鏡組內(nèi)置于一鏡筒中，且通過接口轉(zhuǎn)換器與成像相機(jī)連接。
[0069] 進(jìn)一步地，所述的偏心光束離焦量探測模塊，內(nèi)部集成了由近紅外激光器、激光擴(kuò) 束器、刀口、第一分光棱鏡、物鏡構(gòu)成偏心光束法的激光發(fā)射光路和由物鏡、第二分光棱鏡、 第一聚焦透鏡組、對焦相機(jī)組成偏心光束法的反射光成像光路；為避免與顯微成像模塊中 的照明光線相串?dāng)_，使用的激光器波長在近紅外區(qū)，第一分光棱鏡為帶阻型且涵蓋激光器 波長范圍，第二分光棱鏡為半反半透型；激光發(fā)射光路中刀口可遮擋一半的光束，使得入射 于樣本表面的光斑為半圓形光斑。
[0070] 進(jìn)一步地，所述的基于偏心光束法的自動(dòng)對焦顯微鏡，其特征在于，所述偏心光束 離焦量探測模塊的近紅外激光器嵌入圓柱凸輪結(jié)構(gòu)的激光器襯套中，通過撥動(dòng)與激光器襯 套連接的撥桿可改變近紅外激光器調(diào)整沿光軸方向的位置，進(jìn)而調(diào)整控制對焦相機(jī)獲取的 光斑圖像的大??；
[0071] 進(jìn)一步地，所述偏心光束離焦量探測模塊的反射成像光路中第二分光棱鏡固定于 蝸輪蝸桿旋轉(zhuǎn)安裝座上，通過蝸輪蝸桿旋轉(zhuǎn)安裝座可改變第二分光棱鏡與光軸之間的夾 角，進(jìn)而調(diào)整光斑圖像在對焦相機(jī)上的成像位置。
[0072] 進(jìn)一步地，所述對焦相機(jī)獲取的半圓形激光光斑半徑與樣本離焦量成線性關(guān)系， 當(dāng)樣本處于準(zhǔn)焦位置時(shí)，半圓形光斑半徑最小，甚至由于衍射的存在，近似于完整的圓斑； 當(dāng)樣本處于正離焦和負(fù)離焦?fàn)顟B(tài)時(shí)，對應(yīng)的半圓形激光光斑的形狀的方向不同，對應(yīng)的線 性關(guān)系的模型的斜率不同，且離焦量越大，光斑半徑越大：可綜合通過圖像處理算法判斷光 斑形狀的方向、計(jì)算光斑半徑求解當(dāng)前視場的離焦量。
[0073] 基于偏心光束法的自動(dòng)對焦顯微鏡自動(dòng)對焦方法，通過自動(dòng)對焦裝置實(shí)現(xiàn)；使用 自動(dòng)對焦裝置前需要對自動(dòng)對焦裝置的光路系統(tǒng)進(jìn)行檢查、調(diào)試：首先，調(diào)整近紅外激光發(fā) 射光路、樣本反射光光路、顯微成像光路使其三者光軸重合，保證對焦相機(jī)、成像相機(jī)的視 場一致，對焦相機(jī)可獲取激光光斑圖像，成像相機(jī)可獲取激光聚焦點(diǎn)處的樣本圖像；其次， 通過觀察計(jì)算機(jī)顯示的對焦相機(jī)上的激光光斑，調(diào)整偏心光束離焦量探測模塊中的刀口韌 邊恰好經(jīng)過光斑圓心點(diǎn)，遮擋住圓形激光束的一半。
[0074] 所述一種基于偏心光束法的自動(dòng)對焦顯微鏡的自動(dòng)對焦方法，其工作過程為：
[0075] (1)離焦量探測模塊發(fā)射半圓形激光束照射樣本表面，并獲取樣本反射形成的半 圓形光斑圖像；
[0076] (2)計(jì)算機(jī)處理系統(tǒng)對光斑圖像運(yùn)行圖像處理算法計(jì)算該視場下樣本離焦量；
[0077] (3)壓電物鏡驅(qū)動(dòng)器補(bǔ)償離焦量，完成對焦；
[0078] (4)顯微成像模塊獲取清晰的樣本圖像；
[0079] (5)XY載物臺(tái)移動(dòng)樣本至下一視場。
[0080] 所述的圖像處理算法包括如下步驟：
[0081] (1)將成像相機(jī)獲取的半圓形光斑圖像image(x，y)MXN轉(zhuǎn)化為二維灰度圖gray(X， y)MXN，（x，y)表示圖像像素坐標(biāo)，MXN表示圖像分辨率；
[0082] (2)使用自適應(yīng)窗口中值濾波算法平滑二維灰度圖gray(x，y)MXN，輸出圖像 /0,y)Mx W;
[0083] (3)使用基于OSTU的Canny邊緣檢測算法：
[0084] 首先使用OSTU算法計(jì)算圖像/〇,y)MxW的二值化閾值T，并以此閾值T對圖像 /(OOmxw進(jìn)行二值化，輸出光斑二值化圖像binary (x，y)MXN;
[0085] 然后使用Canny邊緣檢測處理得到光斑二值化圖像binary (x，y)MXN的完整邊緣 輪廓 edge(x，y)MXN;
[0086] (4)將獲取的完整邊緣輪廓edge(X，y)MXN作為掩膜處理光斑二值化圖像 binary (x，y) MXN，得邊緣輪廓AedgeA (x，y) MXN;使用完整邊緣輪廓edge (x，y) MXN減去邊緣輪 廓 AedgeA (x，y) MXN，得邊緣輪廓 BedgeB (x，y) MXN;
[0087] (5)使用最小二乘法分別擬合邊緣輪廓A edgeA(x，y)MXN和邊緣輪廓BedgeB(x， y)MXN，得到對應(yīng)的邊緣輪廓A的擬合圓半徑r A和邊緣輪廓B的擬合圓半徑r B;
[0088] (6)比較擬合圓半徑rA與擬合圓半徑r B的大小，其中較大者對應(yīng)的邊緣輪廓為非 半圓輪廓，較小者對應(yīng)的邊緣輪廓為半圓輪廓；
[0089] (7)分別計(jì)算邊緣輪廓AedgeA (x，y)MXN和邊緣輪廓BedgeB (x，y) MXN的灰度重心點(diǎn) pointA(xA，yA)及pointB(x B，yB)，（xA，yA)表示邊緣輪廓A的灰度重心點(diǎn)的像素坐標(biāo)，（x B， yB)表示表示邊緣輪廓B的灰度重心點(diǎn)的像素坐標(biāo)；
[0090] (8)比較xg x B的大小，其中較大者對應(yīng)的邊緣輪廓在圖像上位于較小者對應(yīng)的 邊緣輪廓的右側(cè)；據(jù)此得到非半圓輪廓與半圓輪廓的相對位置；
[0091] 所述相對位置包括如下兩種情況：
[0092] -非半圓輪廓位于半圓輪廓的左側(cè)，與樣本的正離焦?fàn)顟B(tài)相對應(yīng)；所述正離焦?fàn)?態(tài)是指樣本超出物鏡焦距的離焦情況；
[0093] -非半圓輪廓位于半圓輪廓的右側(cè)，與樣本的負(fù)離焦