一種復(fù)合光合菌肥的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明是屬于一種微生物菌服技術(shù)范圍，具體的說(shuō)是涉及到一種復(fù)合光合菌服的 制備方法。 技術(shù)背景
[0002] 光合細(xì)菌列為細(xì)菌口，真細(xì)菌綱，紅螺菌目，下分為紅螺菌亞目和綠菌亞目，其中 紅螺菌目下又分為紅螺菌科(紫色非硫細(xì)菌)和著色菌科(紫硫細(xì)菌)。歸屬于紅螺菌目的光 合細(xì)菌能在厭氧條件下進(jìn)行光合作用，且不釋放氧。細(xì)胞中含有細(xì)菌葉綠素和多種類胡蘿 h素，及細(xì)胞色素、泛麗和鐵氧化還原型的非血紅素鐵蛋白。根據(jù)《伯杰細(xì)菌手冊(cè)》第八版， 紅螺菌科的光合細(xì)菌能光合同化簡(jiǎn)單的有機(jī)物質(zhì)，大多數(shù)種不能W硫化物作為唯一光合電 子供體而生長(zhǎng)，當(dāng)硫化物或硫代硫酸鹽作為電子供體時(shí)，元素硫不是一個(gè)中間的氧化產(chǎn)物。 當(dāng)由硫化物形成元素硫時(shí)，元素硫不能進(jìn)一步氧化為硫酸鹽。所有的種都不能利用元素硫 作為電子供體。主要包括H個(gè)屬；紅螺菌屬，紅假單胞菌屬，紅微菌屬。紅螺菌屬中比較有 代表性的菌種為；深紅紅螺菌，纖細(xì)紅螺菌，黃錫紅螺菌，莫氏紅螺菌，度光紅螺菌。紅假單 胞菌屬中比較有代表性的菌種為；沼澤紅假單胞菌，綠色紅假單胞菌，嗜酸紅假單胞菌，膠 質(zhì)紅假單胞菌，芙膜紅假單胞菌，球形紅假單胞菌等。紅微菌屬主要代表菌種為萬(wàn)尼氏紅微 菌。
[0003] 著色菌科(紫硫細(xì)菌）在光照下，能利用硫化氨、硫代硫酸鹽、分子氨及其他無(wú)機(jī)或 有機(jī)還原劑把二氧化碳還原成有機(jī)物，同時(shí)能固定大氣中的氮。大多數(shù)種是嚴(yán)格厭氧的(只 有一個(gè)種一沙氏外硫紅螺菌能在黑暗中微好氧生長(zhǎng))，在有元素硫和硫化物時(shí)，具有光自養(yǎng) 同化二氧化碳的能力，元素硫在細(xì)胞內(nèi)居中地W球狀積累，有一個(gè)屬(外硫紅螺菌屬積累在 細(xì)胞外面。硫酸鹽是硫化合物的最終氧化產(chǎn)物。許多菌株能利用分子氨作為電子供體。所 有的菌株能光合同化一些簡(jiǎn)單的有機(jī)物質(zhì)，其中最廣泛被利用的是醋酸鹽和丙麗酸鹽。沒(méi) 有同化型硫酸還原作用的菌株僅在有硫化物或其它還原的硫化合物作為細(xì)胞硫來(lái)源時(shí)，才 能利用有機(jī)物質(zhì)，絕大多數(shù)菌株在無(wú)硫化氨或硫時(shí)，可利用有機(jī)物質(zhì)，因此所有的類型都是 潛在的混合營(yíng)養(yǎng)菌。
[0004] 著色菌科內(nèi)包括著色菌屬，囊硫菌屬，八球硫菌屬，硫螺旋菌屬，芙硫菌屬，閃囊菌 屬，板硫菌屬，可變桿菌屬，外硫紅螺菌屬。
[0005] 作為菌服，光合細(xì)菌能促進(jìn)±壤物質(zhì)轉(zhuǎn)化，改善±壤結(jié)構(gòu)，提高±壤服力，促進(jìn)作 物生長(zhǎng)。光合細(xì)菌大都具固氮能力，能提高±壤氮素水平，通過(guò)其代謝活動(dòng)能有效地提高 ±壤中某些有機(jī)成分、硫化物、氨態(tài)氮，并促進(jìn)有害污染物（如農(nóng)藥、化服）的轉(zhuǎn)化。同時(shí) 能促進(jìn)有益微生物的增殖，使共同參與±壤生態(tài)的物質(zhì)循環(huán)。此外，光合細(xì)菌產(chǎn)生的豐富 的生理活性物質(zhì)如脯氨酸、尿嚼巧、胞嚼巧、維生素、輔酶Q、類胡蘿h素等都能被植物直接 吸收，有助于改善作物營(yíng)養(yǎng)，激活植物細(xì)胞的活性，促進(jìn)根系發(fā)育，提高光合作用和生殖生 長(zhǎng)能力。光合細(xì)菌發(fā)酵液中含有多種生理活性物質(zhì)，如葉綠素A、B，類胡蘿h素，多種維生 素（尤其是B族維生素），多種植物激素（如144、643、484、己帰、細(xì)胞分裂素）、核酸、水楊 酸、多種氨基酸w及單細(xì)胞蛋白質(zhì)等。該些生理活性物質(zhì)具有或促進(jìn)植株根系生長(zhǎng)、或促進(jìn) 植株葉片生長(zhǎng)、或促進(jìn)果實(shí)中某些特異性成分的積累、或增加作物產(chǎn)量，從而改善農(nóng)產(chǎn)品品 質(zhì)。光合細(xì)菌能增強(qiáng)作物抗病防病能力。光合細(xì)菌含有抗細(xì)菌、抗病毒的物質(zhì)，該些物質(zhì)能 純化病原體的致病力W及抑制病原體生長(zhǎng)。同時(shí)光合細(xì)菌的活動(dòng)能促進(jìn)放線菌等有益微生 物增殖，抑制絲狀真菌等有害菌群生長(zhǎng)，從而有效地抑制某些植病的發(fā)生與蔓延。由于光合 細(xì)菌具有抗病防病作用，能延長(zhǎng)果品儲(chǔ)存期。光合細(xì)菌可提高植株葉綠素含量，促進(jìn)±壤 中固氮菌、根瘤菌、放線菌等微生物菌群的生長(zhǎng)，在煙草、蘿K甘墓、大豆等作物上噴施光 合細(xì)菌后，均能提高±壤中固氮菌、根瘤菌、放線菌及細(xì)菌數(shù)量，而絲狀真菌則減少，起到 ±壤修復(fù)的作用。光合細(xì)菌還具有減輕農(nóng)藥對(duì)農(nóng)作物的毒害和降解殘留農(nóng)藥。因此，光合 細(xì)菌在種植上具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0006] 但現(xiàn)有有關(guān)光合細(xì)菌的研究主要是針對(duì)紅螺菌科進(jìn)行研究，盡管也有些是一些 復(fù)合光合細(xì)菌，但其主要是針對(duì)紅螺菌科內(nèi)進(jìn)行混合培養(yǎng)，如專利號(hào)200910039525. 5 " - 種農(nóng)用光合細(xì)菌制劑的生產(chǎn)方法"使用的菌種為沼澤紅假單胞菌和球形紅細(xì)菌。專利號(hào) 201210255225. 2 "高活菌數(shù)光合細(xì)菌原代菌種的制種方法"使用的菌種為沼澤紅假單胞菌。 專利號(hào)200410048678. 3"高濃度光合細(xì)菌制劑的制備方法"使用的菌種為沼澤紅假單胞菌， 芙膜紅假單胞菌和球形紅假單胞菌；專利號(hào)201310734863. 7 "-種復(fù)合光合菌劑及其制備 方法"使用的菌種為球形紅假單胞菌，沼澤紅假單胞菌及深紅紅螺菌菌種；從現(xiàn)有文獻(xiàn)上來(lái) 看，大部份復(fù)合光合細(xì)菌只是對(duì)紅螺菌科中的菌進(jìn)行混合培養(yǎng)，還未有報(bào)道紅螺菌科與著 色菌科的菌之間進(jìn)行混合培養(yǎng)。
[0007] 國(guó)內(nèi)對(duì)著色菌科(紫色硫細(xì)菌）的研究?jī)H見(jiàn)于少數(shù)幾篇文獻(xiàn)，劉蔚等分離到一株桃 紅芙硫菌，認(rèn)為其具有較好的凈水能力及生物服料的能力，特別可W解決我國(guó)大部份±壤 內(nèi)因缺硫而影響農(nóng)作物生長(zhǎng)W至減產(chǎn)的問(wèn)題。四川大學(xué)的馮匙對(duì)紫硫細(xì)菌中的桃紅芙硫菌 進(jìn)行了研究，他認(rèn)為桃紅芙硫菌適于應(yīng)用到制作菌服和處理含硫污染物方面。但要投入實(shí) 際運(yùn)用，首要要解決的問(wèn)題是，該菌的生長(zhǎng)速度緩慢，一般要培養(yǎng)兩周W后才會(huì)有明顯的生 長(zhǎng)趨勢(shì)，培養(yǎng)20-40天才能做為菌劑使用，且0D650的值不高于1，活菌含量低于1億/毫 升，較長(zhǎng)的生長(zhǎng)周期不利于大規(guī)模的應(yīng)用。而到目前為止，還未見(jiàn)有關(guān)沙氏外硫紅螺菌服制 備方法技術(shù)方案公開(kāi)。也未有著色菌科(較強(qiáng)硫化氨的降解能力，促進(jìn)硫元素的物質(zhì)循環(huán)） 與紅螺菌科中的菌進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)作為菌服的技術(shù)方案進(jìn)行公開(kāi)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種著色菌科中的沙氏外硫紅螺菌與紅螺菌科 中的纖細(xì)紅螺菌混合培養(yǎng)，生長(zhǎng)速度快，菌體含量高，培養(yǎng)時(shí)間短，而且服效活性高、穩(wěn)定性 高、作用效果快的復(fù)合光合細(xì)菌服的制備方法。
[0009] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：采用著色菌科中的沙氏外硫紅 螺菌菌種與紅螺菌科中的纖細(xì)紅螺菌按W下步驟進(jìn)行培養(yǎng)： m、沙氏外硫紅螺菌半固體種子活化培養(yǎng)；將沙氏外硫紅螺菌種穿刺在半固體沙氏外 硫紅螺菌培養(yǎng)基中，25-3(TC光照培養(yǎng)7-10天，待穿刺的菌線變紅并長(zhǎng)出菌苔，即可為活化 的沙氏外硫紅螺菌種； 植、纖細(xì)紅螺菌平板活化：將纖細(xì)紅螺菌菌種在平板上劃線活化，溫度25-35C活化培 養(yǎng)3-5天，挑取大個(gè)菌落作為活化種子； 口 )、沙氏外硫紅螺菌種子培養(yǎng)；將活化的菌種接種至沙氏外硫紅螺菌種子液體培 養(yǎng)基中，溫度25-35 °C，光照強(qiáng)度為；1000-3000lux，光照厭氧培養(yǎng)7-10天，檢測(cè)種子的 0D660 > 1. 2,活菌數(shù)> 6億C化/ml即為種子培養(yǎng)液； 錯(cuò)、纖細(xì)紅螺菌種子培養(yǎng)；將挑取大個(gè)纖細(xì)紅螺菌菌落作為活化種子接種到種子培 養(yǎng)基中，溫度25-35 °C，光照強(qiáng)度為；1000-30001UX，光照靜置培養(yǎng)3-5天，檢測(cè)種子的 0D660 > 0. 8,活菌數(shù)> 4億C化/ml即為種子培養(yǎng)液； 巧、發(fā)酵培養(yǎng)；將沙氏外硫紅螺菌種子培養(yǎng)液與發(fā)酵培養(yǎng)基W 1 ;3-1 ;5的接種量接 種，同時(shí)將纖細(xì)紅螺菌種子培養(yǎng)液與發(fā)酵培養(yǎng)基按1 :6-1 ;10的接種量接入，在光照培養(yǎng)罐 中厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25-35°C，光照強(qiáng)度為；1000-40001ux，攬拌速度為120轉(zhuǎn)/分鐘，待 培養(yǎng)至第H天，開(kāi)始流加300 g/L的硫代硫酸軸溶液至發(fā)酵培養(yǎng)基硫代硫酸軸的濃度至1-3 g/L，繼續(xù)培養(yǎng)3-5天，待檢測(cè)其0D650 > 6,活菌數(shù)> 50億C化/ml,其中沙氏外硫紅螺菌不 低于25億C化/ml,纖細(xì)紅螺菌不低于20億C化/ml,即可放罐，灌裝，包裝成品。
[0010] 所述的半固體沙氏外硫紅螺菌培養(yǎng)基為：氯化饋0. 4-1. 2g/l，磯酸二氨鐘 0. 5-lg/L，二水氯化巧 0. 05-0. 2g/L，氯化鎮(zhèn) 0. 1-0. 5g/l，蘋果酸軸 2-10 g/l，醋酸軸 l-3g/ L，九水硫化軸0. l-lg/l，瓊脂8-lOg/L，氯化軸0. 5-4g/L, 12rC滅菌15分鐘，用醋酸調(diào)PH 至7. 0-7. 2,其中九水硫化軸先配制成0.1 g/mL單獨(dú)滅菌。
[0011] 所述的沙氏外硫紅螺菌種子液體培養(yǎng)基為：氯化饋0.4-1. 2g/l，磯酸二氨 鐘0. 5-lg/L，二水氯化巧0.05-0. 2g/L，氯化鎮(zhèn)0. 1-0. 5g/l，蘋果酸軸2-10 g/l，醋酸 軸l-3g/l，九水硫化軸0. 1-lg/L，氯化軸0. 5-4g/L，12rC滅菌15分鐘，用醋酸調(diào)PH至 7. 0-7. 2,其中九水硫化軸先配制成0.1 g/mL單獨(dú)滅菌。
[0012] 所述的纖細(xì)紅螺菌種子液體培養(yǎng)基為：氯化饋0. 8-1. 2g/l，磯酸二氨鐘0. 5-lg/ L，二水氯化巧0. 05-0. 2g/L，氯化鎮(zhèn)0. 1-0. 5g/l，蘋果酸軸2-10 g/l，醋酸軸l-3g/l，氯化 軸l-2g/^，酵母膏0.2-lg/L，12^C滅菌15分鐘，用滅菌醋酸調(diào)PH至7.0-7.2。
[0013] 所述的纖細(xì)紅螺菌平板固體培養(yǎng)基為種子液體培養(yǎng)基加入20 g/L的瓊脂形成的。
[0014] 所述的發(fā)酵培養(yǎng)基；氯化饋1. 2g/l，磯酸二氨鐘0. 8g/l，二水氯化巧0.1 g/l，氯化 鎮(zhèn)0. 3g/l，蘋果酸軸4g/l，醋酸軸8g/l，酵母膏0.4g/L，氯化軸Ig/L，12rC滅菌15分鐘， 用蘋果酸調(diào)PH至6. 8-7.0。
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