本發(fā)明涉及重組基因工程疫苗，具體地，本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防動(dòng)物和人類禽型H1N1流感的重組基因工程疫苗，更具體地，本發(fā)明所涉及的疫苗是一種用于預(yù)防動(dòng)物和人類禽型H1N1流感的重組類禽型H1N1流感病毒滅活疫苗。

背景技術(shù)：
流感病毒是一種能廣泛感染禽類和哺乳動(dòng)物的分節(jié)段的負(fù)鏈RNA構(gòu)成的囊膜病毒。在全世界，流感常以零星暴發(fā)兼雜隨機(jī)的大流行的形式出現(xiàn)，在過(guò)去的幾十年里，各國(guó)家主要選擇利用的仍然是全病毒滅活苗，它主要刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫抵抗相同亞型的血凝素表面糖蛋白。類禽型H1N1在我國(guó)豬群中流行廣泛，并且疫情仍在繼續(xù)擴(kuò)大(YanChen,InfectGenetEvol.2013)。在2011年，我國(guó)江蘇省泗洪縣出現(xiàn)了人感染類禽型H1N1豬流感病毒事件，這也是我國(guó)第一次報(bào)道類禽型H1N1亞型豬流感感染人事件(HuanliangYang,Emerginfect2012)。A型流感病毒跨種傳播取決于病毒因適應(yīng)性變異導(dǎo)致的宿主范圍變化、宿主自身的限制性因素和環(huán)境因素的變化。為了對(duì)應(yīng)疫情的發(fā)展，本發(fā)明進(jìn)行了自然重組疫苗株的研制。理想的疫苗株應(yīng)具備與流行株良好的抗原匹配性，對(duì)雞胚無(wú)致病力及雞胚高滴度生長(zhǎng)性等條件。然而，很難從自然界分離具備上述條件的毒株作為疫苗株。在國(guó)內(nèi)，由于現(xiàn)地分離的野毒株雞胚適應(yīng)性較差，致使現(xiàn)行國(guó)內(nèi)的類禽型H1N1流感疫苗存在成本高、疫苗免疫期短等缺點(diǎn)。流感病毒A/PR/8/34(H1N1)(簡(jiǎn)稱PR8)是實(shí)驗(yàn)室雞胚適應(yīng)株，即該病毒可在雞胚內(nèi)生長(zhǎng)至很高滴度，這種雞胚適應(yīng)性由病毒的6個(gè)內(nèi)部基因決定。另外，當(dāng)兩個(gè)流感病毒共同感染一個(gè)細(xì)胞或雞胚時(shí)，可發(fā)生基因互換，從而產(chǎn)生新的基因重組病毒。因此，通過(guò)遺傳重組方法，可將流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的6個(gè)內(nèi)部基因和流行株的HA、NA基因的進(jìn)行重組而獲得一個(gè)新的重組病毒，該重組病毒具有與HA和NA基因供體毒株一致的抗原性，同時(shí)還具有流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的雞胚高滴度生長(zhǎng)特性。人工自然重組技術(shù)是一種簡(jiǎn)單有效的構(gòu)建2:6重組病毒疫苗株方法，流感病毒的基因組由8個(gè)分段的負(fù)鏈RNA片段組成，當(dāng)2個(gè)病毒共同感染雞胚或細(xì)胞時(shí)，其基因組片段會(huì)發(fā)生互換，從而產(chǎn)生一些新的重組病毒(reassortant)，通過(guò)含有相應(yīng)抗體陽(yáng)性血清的處理，則能夠有效的篩選2:6重組病毒疫苗株。(HualanChen,Vaccine2003)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題提供一種重組類禽型H1N1流感病毒滅活疫苗株及其制備方法。為了達(dá)到以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)手段為：本發(fā)明發(fā)明人在江蘇類禽型H1N1感染人事件當(dāng)?shù)胤蛛x得到一株豬流感病毒分離毒株，序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)該毒株與感染人的毒株高度同源，將該分離得到的病毒株命名為A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)，簡(jiǎn)稱SW/JS40(H1N1)。本發(fā)明利用人工重組方法，以H1N1亞型豬流感病毒A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)為表面抗原血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)基因供體，以流感病毒A/PR/8/34(H1N1)為聚合酶PB2亞基，聚合酶PB1亞基，聚合酶PA亞基，核蛋白(NP)，基質(zhì)蛋白(M)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NS)6個(gè)內(nèi)部基因的供體，通過(guò)自然重組得到了1株重組的類禽型H1N1流感病毒滅活疫苗株，命名為A型流感病毒A/swine/Jiangsu/40/PR8(H1N1)(簡(jiǎn)稱為JS40/PR8)，保藏在位于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址在中國(guó)武漢的武漢大學(xué)，其保藏號(hào)為CCTCCNO：V201419，保藏時(shí)間為2014年6月19日。本發(fā)明選用流感病毒的可在雞胚內(nèi)生長(zhǎng)至很高滴度的實(shí)驗(yàn)室雞胚適應(yīng)株A/PR/8/34(H1N1)的6個(gè)內(nèi)部基因作為骨架基因，并選用2011年分離得到的類禽型毒株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)的HA和NA基因作為表面基因，利用自然重組方法，制備了重組病毒JS40/PR8，該重組毒株將可以作為類禽型H1N1流感的疫苗株。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，JS40/PR8與我國(guó)類禽型H1N1流感病毒流行株SW/JS40(H1N1)抗原性一致，將對(duì)類禽型H1N1流感病毒流行株SW/JS40(H1N1)產(chǎn)生良好的特異保護(hù)性。該病毒含有流感病毒雞胚高滴度適應(yīng)株A/PR/8/34(H1N1)的6個(gè)內(nèi)部基因，因此具有良好的雞胚適應(yīng)性，病毒生長(zhǎng)滴度與野毒相比，可提高8倍以上；以此為疫苗株生產(chǎn)疫苗，可大大降低疫苗生產(chǎn)成本，提高疫苗質(zhì)量。因此，進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了所述的重組的類禽型H1N1流感病毒滅活疫苗株在制備預(yù)防類禽型H1N1流感病毒所導(dǎo)致疾病的藥物中的應(yīng)用。其中，優(yōu)選的，所述藥物用于預(yù)防動(dòng)物或人的類禽型H1N1流感病毒感染。更進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了一種構(gòu)建所述的重組的類禽型H1N1流感病毒滅活疫苗株的方法，該方法包括：(1)用類禽型H1N1流感病毒株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)和雞胚適應(yīng)疫苗株A/PR/8/34(H1N1)共同接種雞胚尿囊腔或細(xì)胞進(jìn)行自然重組；(2)用抗所述雞胚適應(yīng)疫苗株A/PR/8/34(H1N1)的抗體篩選，除去表面基因來(lái)源于所述雞胚適應(yīng)疫苗株A/PR/8/34(H1N1)的毒株；(3)將篩選得到的毒株在雞胚上進(jìn)行3代有限克隆純化，利用Trizol強(qiáng)裂變劑法，提取病毒RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后用設(shè)計(jì)的流感病毒A/PR/8/34(H1N1)和類禽型H1N1流感病毒國(guó)內(nèi)分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)病毒的各8對(duì)特異性鑒別引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，然后，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行核酸凝膠電泳，鑒定得到的重組病毒為HA和NA來(lái)自于類禽型H1N1流感病毒國(guó)內(nèi)分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)、6個(gè)內(nèi)部基因PB2、PB1、PA、NP、M及NS來(lái)自流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的重組病毒，即得。在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，所述的引物包括：只能擴(kuò)增出類禽型H1N1流感分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)基因的8個(gè)特異性片段而不能擴(kuò)增出流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的任何片段的類禽型H1N1流感分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)的8對(duì)特異性鑒別引物，引物序列如下：以及只能擴(kuò)增出流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的8個(gè)特異性片段而不能擴(kuò)增出類禽型H1N1流感分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)的任何片段的流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的8對(duì)特異性鑒別引物，引物序列如下所示：綜上，實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明制備得到了一株優(yōu)良的可用于預(yù)防類禽型H1N1流感病毒所導(dǎo)致疾病的病毒株，本發(fā)明的為類禽型H1N1流感疫苗的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)研究，奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。附圖說(shuō)明圖1A為以JS40和PR8毒株cDNA為模板，利用JS40毒株P(guān)B2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因的特異性引物進(jìn)行的擴(kuò)增；其中第一至第八泳道為使用JS40毒株的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因的特異性引物對(duì)JS40毒株cDNA的擴(kuò)增；M為DNAMarker2000；第九至第十六泳道為使用JS40毒株的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因的特異性引物對(duì)PR8毒株cDNA為模板的擴(kuò)增；圖1B為以JS40和PR8毒株cDNA為模板，利用PR8毒株P(guān)B2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因的特異性引物進(jìn)行的擴(kuò)增；其中1～8泳道為使用PR8毒株的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因的特異性引物對(duì)JS40毒株cDNA為模板的擴(kuò)增；M為DNAMarker2000；9～16泳道為使用PR8毒株的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因的特異性引物對(duì)PR8毒株cDNA為模板的擴(kuò)增；圖2為JS40/PR8重組病毒的PB2、PB1、PA、HA、NA、NP、M和NS基因的RT-PCR擴(kuò)增；1～8泳道：重組病毒JS40/PR8利用JS40的8對(duì)特異性鑒別引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物；M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；9～16泳道：重組病毒JS40/PR8利用PR8的8對(duì)特異性鑒別引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物；圖3為重組JS40/PR8病毒和野生型類禽型H1N1流感病毒A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)(簡(jiǎn)稱JS40)在最佳培養(yǎng)溫度35℃測(cè)定的生長(zhǎng)曲線；圖4為攻毒后各組小鼠的體重變化情況。序列說(shuō)明：SEQIDNo.1：JS40/PR8HA基因；SEQIDNo.2：JS40/PR8NA基因；SEQIDNo.3：JS40/PR8PB2基因；SEQIDNo.4：JS40/PR8PB1基因；SEQIDNo.5：JS40/PR8PA基因；SEQIDNo.6：JS40/PR8NP基因；SEQIDNo.7：JS40/PR8M基因；SEQIDNo.8：JS40/PR8NS基因。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)驗(yàn)材料1.病毒株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)(簡(jiǎn)稱JS40)(記載在文獻(xiàn)：一株類禽型H1N1亞型豬流感病毒的反向遺傳系統(tǒng)的建立，楊煥良等，《中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)》，2013年02期)由本實(shí)驗(yàn)室保存，A/PR/8/34(H1N1)(簡(jiǎn)稱PR8)購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所動(dòng)物流感中心。2.SPF雞胚及細(xì)胞9-11日齡的SPF雞胚購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所SPF雞胚孵化室，MDCK細(xì)胞(狗腎細(xì)胞)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所。3.主要試劑DATP、dGTP、dCTP、dTTP和rTaqDNA聚合酶購(gòu)于大連寶生物工程有限公司；RNA提取試劑TRIzol，鼠源反轉(zhuǎn)錄酶(MLV)試劑盒、DTT、RNaseOUT和DNA聚合酶購(gòu)自Invitrogen公司；膠回收試劑盒與小量質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自上海華舜生物工程有限公司；測(cè)序反應(yīng)試劑盒(CEQTMDTCSQuickStartKit)購(gòu)自BECKMAN公司；抗A/PR/8/34(H1N1)抗血清購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所動(dòng)物流感中心。4.引物分析比較，設(shè)計(jì)合成能擴(kuò)增出類禽型H1N1流感分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)基因的8個(gè)特異性片段而不能擴(kuò)增出流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的任何片段的類禽型H1N1流感分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)的16條鑒別引物，合成引物序列見(jiàn)表1。表1類禽型H1N1流感病毒A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)的8個(gè)特異性片段的鑒別引物序列另外，設(shè)計(jì)合成只能擴(kuò)增出流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的8個(gè)特異性片段而不能擴(kuò)增出類禽型H1N1流感分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)的任何片段的流感病毒A/PR/8/34(H1N1)16條鑒別引物，合成引物序列見(jiàn)表2。表2流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的8個(gè)特異性片段的鑒別引物序列實(shí)施例1：篩選、鑒定重組病毒方法的建立利用Trizol強(qiáng)裂變劑法，提取流感病毒A/PR/8/34(H1N1)和類禽型H1N1流感分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)的RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后用上述設(shè)計(jì)的流感病毒A/PR/8/34(H1N1)和類禽型H1N1流感分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)的片段特異性鑒別引物做PCR反應(yīng)。根據(jù)流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的基因設(shè)計(jì)的片段特異性鑒別引物只能擴(kuò)增出流感病毒A/PR/8/34(H1N1)毒株的8個(gè)特異性片段而不能擴(kuò)增出類禽型H1N1流感分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)毒株的任何片段，根據(jù)類禽型H1N1流感分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)的基因設(shè)計(jì)的片段特異性鑒別引物只能擴(kuò)增出類禽型H1N1流感分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)毒株的8個(gè)特異性片段而不能擴(kuò)增出流感病毒A/PR/8/34(H1N1)毒株的任何片段。這將證明篩選、鑒定重組病毒方法的建立。如圖1A所示，以類禽型H1N1流感病毒國(guó)內(nèi)分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)和流感病毒A/PR/8/34(H1N1)毒株的cDNA為模板，利用合成的流感病毒A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)的8對(duì)片段特異性引物擴(kuò)增，只有A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)的cDNA擴(kuò)增出了8條特異性片段，而A/PR/8/34(H1N1)毒株cDNA沒(méi)有擴(kuò)增出的任何片段。如圖1B所示，以類禽型H1N1流感病毒國(guó)內(nèi)分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)和流感病毒A/PR/8/34(H1N1)毒株的cDNA為模板，利用合成的流感病毒A/PR/8/34(H1N1)8對(duì)片段特異性引物擴(kuò)增，只有流感病毒A/PR/8/34(H1N1)毒株cDNA擴(kuò)增出了8條特異性片段，而流感病毒國(guó)內(nèi)分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)毒株cDNA沒(méi)有擴(kuò)增出任何片段。由此證明已經(jīng)建立了篩選方法，這種系統(tǒng)可以鑒定所制備的重組病毒的8條基因分別是來(lái)源于流感病毒A/PR/8/34(H1N1)還是類禽型H1N1流感病毒國(guó)內(nèi)分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)。實(shí)施例2：重組類禽型H1N1流感病毒JS40/PR8的制備與鑒定1.共感染-使兩個(gè)病毒基因組發(fā)生重組：100μl的類禽型H1N1流感病毒國(guó)內(nèi)分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)和50μl的流感病毒A/PR/8/34(H1N1)(簡(jiǎn)稱PR8)混合加入850μlPBS中，共同接種10日齡的SPF雞胚尿囊腔進(jìn)行自然重組。35℃培養(yǎng)24小時(shí)，收集尿囊液。2.抗體篩選-除去表面基因來(lái)源于流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的毒株：取50μl在上述特定的人工條件下收獲的尿囊液和600μl倍比(4倍)稀釋的抗A/PR/8/34(H1N1)抗血清混合，室溫作用30分鐘，再每個(gè)稀釋度接種三枚雞胚。接著，接種的雞胚在35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)，測(cè)定每個(gè)稀釋度接種的雞胚尿囊液的血凝價(jià)(參見(jiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血凝抑制試驗(yàn)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB)(GB/T14926.54-2001))，收集并保留低稀釋度的A/PR/8/34(H1N1)抗血清處理后接種的雞胚有血凝價(jià)的尿囊液。然后，相同方法做第二次的抗血清處理，同樣收集并保留低稀釋度的A/PR/8/34(H1N1)抗血清處理后接種的雞胚有血凝價(jià)的尿囊液。3.稀釋純化-除去內(nèi)部基因來(lái)源于H1N1流感病毒株的毒株：按照上述方法處理得到的病毒在雞胚上進(jìn)行3代有限克隆純化，利用Trizol強(qiáng)裂變劑法，提取病毒RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后用設(shè)計(jì)的流感病毒A/PR/8/34(H1N1)和類禽型H1N1流感病毒國(guó)內(nèi)分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)病毒的各8對(duì)特異性鑒別引物(表1和2)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。然后，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行核酸凝膠電泳，鑒定得到的重組病毒為HA和NA來(lái)自于類禽型H1N1流感病毒國(guó)內(nèi)分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)、6個(gè)內(nèi)部基因PB2、PB1、PA、NP、M及NS來(lái)自流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的重組病毒(見(jiàn)圖2)，將獲得的重組病毒命名為A/swine/Jiangsu/40/PR8(H1N1)，簡(jiǎn)稱JS40/PR8，保藏于位于中國(guó)武漢的武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號(hào)為CCTCCNO：V201419。4.重組病毒的序列鑒定提取重組病毒JS40/PR8的RNA，RT-PCR分別擴(kuò)增出重組病毒JS40/PR8的全基因組的8個(gè)片段，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行核酸凝膠電泳，膠回收后測(cè)定每一片段的特定序列。利用DNAStar軟件(DNAStarLasergeneV7.1)，對(duì)測(cè)定的序列與野生毒株類禽型H1N1流感病毒國(guó)內(nèi)分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)和流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的序列進(jìn)行序列比較，發(fā)現(xiàn)重組病毒JS40/PR8的基因組均沒(méi)有任何核苷酸的變化，表明重組病毒的HA和NA來(lái)自于類禽型H1N1流感病毒國(guó)內(nèi)分離A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)；6個(gè)內(nèi)部基因PB2、PB1、PA、NP、M及NS來(lái)自流感病毒A/PR/8/34(H1N1)。5.重組病毒JS40/PR8生長(zhǎng)曲線的測(cè)定將親本病毒類禽型H1N1流感病毒流行株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)(簡(jiǎn)稱JS40)和重組病毒JS40/PR8接種5組SPF雞胚，在35℃條件下分別培養(yǎng)24、48、72和96小時(shí)，取上述培養(yǎng)不同時(shí)間的雞胚進(jìn)行血凝測(cè)定，檢測(cè)親本毒株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)和重組病毒JS40/PR8的生長(zhǎng)曲線。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出重組病毒在35℃培養(yǎng)條件下，72小時(shí)時(shí)重組病毒的血凝效價(jià)遠(yuǎn)高于野生毒株類禽型H1N1流感病毒國(guó)內(nèi)分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)(如圖3所示)。制備流感疫苗株，不但要求其具有良好的免疫原性，而且要求在生產(chǎn)中具有良好的生長(zhǎng)特性，從重組JS40/PR8病毒在35℃培養(yǎng)條件下測(cè)定的生長(zhǎng)曲線可以看出，重組病毒生長(zhǎng)滴度較親本類禽型H1N1流感病毒國(guó)內(nèi)分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)有明顯提高，血凝效價(jià)高出8倍(如圖3所示)。這說(shuō)明本發(fā)明制備出了一株高生長(zhǎng)滴度的重組病毒，將為以后的批量生產(chǎn)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)利益。6.重組病毒JS40/PR8的抗原性分析根據(jù)親本毒株類禽型H1N1流感病毒國(guó)內(nèi)分離株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)與重組病毒的抗原和血清進(jìn)行交叉HI試驗(yàn)(參見(jiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血凝抑制試驗(yàn)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB)(GB/T14926.54-2001))的抗原性分析數(shù)據(jù)，從試驗(yàn)結(jié)果可以看出抗原差異小于2倍，說(shuō)明重組后，病毒依然保持著親本毒株的抗原性(參見(jiàn)表3)。表3：親本毒株A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)與重組病毒JS40/PR8的抗原性分析7.重組病毒JS40/PR8的致病力試驗(yàn)BALB/c小鼠經(jīng)常作為流感病毒致病性和宿主適應(yīng)性的哺乳動(dòng)物模型。為了解重組毒株的感染能力和致病性，本發(fā)明采用小鼠為動(dòng)物模型，將重組毒株SW/JS/40/PR8和親本毒株SW/JS/40/2011分別以106TCID50劑量經(jīng)鼻腔接種小鼠，觀察小鼠存活、體內(nèi)病毒復(fù)制及體重?fù)p失的情況。六周齡的SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠(購(gòu)自北京維通利華公司)，隨機(jī)分為三組，每組8只，稱量體重。所有小鼠分別經(jīng)CO2輕度麻醉后，第一組通過(guò)鼻腔接種50ul含有106TCID50的重組毒株SW/JS/40/PR8(JS40/PR8)的病毒液，第二組通過(guò)鼻腔接種50ul含有106TCID50的親本毒株SW/JS/40/2011(JS40/11)的病毒液，第三組接種50ulPBS作為對(duì)照組。感染病毒后每天稱量各組小鼠的單只體重，計(jì)算平均體重并觀察發(fā)病與存活情況，體重下降30％即實(shí)施安樂(lè)死。所有的小鼠均在擁有獨(dú)立通風(fēng)系統(tǒng)的鼠籠里飼養(yǎng)。每組于攻毒后第3d，隨機(jī)抽取3只存活小鼠，經(jīng)CO2麻醉后剖殺，采集腦、鼻甲、脾臟、腎臟、肺臟，分別進(jìn)行病毒含量的滴定；組織的病毒分離和鑒定收集的病料裝在滅菌EP管中，-70℃保存，取出用滅菌研磨器研磨，制成10％的DMEM組織懸液，離心后取上清液體在MDCK細(xì)胞上進(jìn)行滴定，按照測(cè)定TCID50方法進(jìn)行測(cè)定組織中病毒含量。小鼠每天稱量體重，至14d。結(jié)果表明所有組別小鼠均無(wú)死亡情況發(fā)生。在腦、脾、腎和鼻甲中均檢測(cè)不到病毒。在肺臟中重組毒株SW/JS/40/PR8病毒含量低于SW/JS/40/2011組(表4)，因病毒感染造成最大體重?fù)p失SW/JS/40/PR8為5％，低于SW/JS/40/2011組的10％(圖4)，表明重組毒株致病力低于親本毒株SW/JS/40/2011。表4兩組感染小鼠臟器病毒分離及致死情況結(jié)果8.重組病毒JS40/PR8的免疫原性實(shí)驗(yàn)將含量為108EID50/mL的重組病毒JS40/PR8以0.1％甲醛滅活后，以賽比克公司提供的MONTANIDETMISA206佐劑制備疫苗，以10只6周齡的SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠為模型動(dòng)物，0.1ml肌肉注射免疫，免疫后14d檢測(cè)血清中HI抗體滴度，血清中HI抗體滴度在80-320之間，表明重組病毒JS40/PR8具有良好的免疫原性。參考文獻(xiàn)：1.YangH,QiaoC,TangX,ChenY,XinX,ChenH.Humaninfectionfromavian-likeinfluenzaA(H1N1)virusesinpigs,China.EmergInfectDis.2012Jul；18(7):1144-6.2.ChenY,ZhangJ,QiaoC,YangH,ZhangY,XinX,ChenH.Co-circulationofpandemic2009H1N1,classicalswineH1N1andavian-likeswineH1N1influenzavirusesinpigsinChina.InfectGenetEvol.2013,13:331-3382012Nov10.3.HualanChen，KantaSubbarao，DavidSwayne，QiChen，XiuhuaLu，JacquelineKatz，NancyCox，YumikoMatsuoka.Generationandevaluationofanhigh-growthreassortantH9N2influenzaAvirusasapandemicvaccinecandidate.Vaccine