本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及干擾LCYB、LCYE基因表達(dá)同時超量表達(dá)PAP基因在制備花瓣呈紅色蕓薹屬植物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
油菜是重要的油料作物，栽培歷史悠久、經(jīng)濟(jì)價值高、用途廣泛、適應(yīng)性強(qiáng)，是我國的第一大油料作物，也是世界性的重要油料作物。物種分類學(xué)上，油菜由蕓薹屬的三個物種構(gòu)成，分別為甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus，2n＝38，AACC)、白菜型油菜(Brassicarapassp.oleiferasyn.B.campestris，2n＝20,AA)、芥菜型油菜(Brassicajuncea，2n＝36，AABB)。甘藍(lán)型油菜油菜是由白菜(Brassicarapa)與甘藍(lán)(Brassicaoleracea，2n＝18,CC)通過自然種間雜交后雙二倍化進(jìn)化而來的一種復(fù)合種，雖然栽培歷史僅有幾百年，但由于其生長勢強(qiáng)，豐產(chǎn)性高，已占世界及我國油菜種植面積90％的以上。白菜型油菜是蕓薹屬最早被馴化的物種之一，原產(chǎn)于我國西北地區(qū)的大白菜演化而來，世界范圍內(nèi)有廣泛的分布面積和悠久的栽培歷史。芥菜型油菜是由白菜與黑芥(Brassicanigra，2n＝16,BB)天然雜交后再自然加倍形成的雙二倍體復(fù)合種，中國是其原始起源與分化中心，種植范圍遍布世界。隨著經(jīng)濟(jì)水平的持續(xù)發(fā)展和社會現(xiàn)代化程度的不斷提升，大眾對生活品味的追求也與日俱增，不僅傳統(tǒng)的名山大川式的旅游越來越火，田園休閑觀光產(chǎn)業(yè)的發(fā)展也很迅速。油菜大面積生產(chǎn)上形成金黃色花的海洋，是越來越重要的田園生態(tài)旅游資源。油菜花觀賞的時間為每年的十二月底到來年夏季。每個地方因為種植的時間略有不同，花期會有一點差異。在我國已形成幾十個知名油菜花觀賞地區(qū)，油菜花開時，競相怒放、流金溢彩、綿延數(shù)十里，好似金浪滔滔的海洋。自然界花卉顏色雖然種類繁多，但除芥藍(lán)(B.oleraceavar.alboglabra)的花瓣是乳白色以外，蕓薹屬植物的花瓣普遍為黃色系列，商業(yè)油菜品種全是黃色花瓣，過于單調(diào)。隨著油菜花色田園生態(tài)觀光產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，迫切需要多姿多彩的花色性狀，使之還可以開出紅色、藍(lán)色等，在不影響油菜菜籽的出油率和其他傳統(tǒng)用途之外，增加其賞花價值，助推生態(tài)觀光旅游。此外，特定的花色還是油菜育種界渴望的選擇標(biāo)記性狀，而且花色的非黃色化還有助于減少露尾甲等蟲害。因此，需要解析油菜花色性狀的分子機(jī)理，并開展新花色的分子育種。蘿卜(Raphanussativus)屬于蘿卜屬，近年來的分子證據(jù)表明蘿卜與白菜、甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜的距離甚至遠(yuǎn)小于黑芥與它們的距離，意思是說蘿卜與蕓薹屬核心物種的距離小于蕓薹屬內(nèi)部的種間距離。但另一方面，蘿卜能開出紅色系的花色，而蕓薹屬和眾多近緣屬(如白芥屬)則只能開出黃色系的花。這是一個奇怪的現(xiàn)象，因此開展蕓薹屬與蘿卜花色性狀的比較研究，不僅是這些生物花色性狀基礎(chǔ)研究的需要，也可為油菜等蕓薹屬植物花色性狀的遺傳改良提供指導(dǎo)。重要觀花植物的花色分子機(jī)理和分子育種已取得顯著進(jìn)展，為研究其它植物花色機(jī)理和開展分子育種提供了重要參考?；ㄉ饕深慄S酮(flavonoids)和類胡蘿卜素(carotenoids)兩大類色素決定。類黃酮是最見的花色素，貢獻(xiàn)黃色、橙色、紅色到紫色的一系列色系。類黃酮為水溶性物質(zhì)，具有一個C15骨架，按結(jié)構(gòu)主要分為9類：查爾酮(chalcones)、橙酮(aurones)、異黃酮(isoflavonoids)、黃酮(flavones)、黃酮醇(flavonols)、黃烷雙醇(flavandiols)、花色苷(anthocyanins)、縮合單寧(condensedtannins,即原花青素,proanthocyanins)和鞣酐(phlobaphenes)，它們中對植物著色貢獻(xiàn)最大的是花色苷、黃酮醇、查爾酮和橙酮?；ㄉ帐亲畲蟮囊活愵慄S酮物質(zhì)，為花朵或其它組織貢獻(xiàn)品紅、紅色、紫色、藍(lán)色等色調(diào)，積累于細(xì)胞的液泡或色素細(xì)胞中，天竺葵素(pelargonidin)、矢車菊素(cyanidin)、飛燕草素(delphinidin)是最常見的三類花色苷；而黃色色調(diào)則由查爾酮、橙酮、黃酮醇、黃酮提供。矮牽牛、玉米、金魚草、擬南芥等植物中的類黃酮生物合成途徑已被充分解析。它是公共體丙烷生物合成途徑下游的一個重要分支途徑，苯丙烷途徑通過其它分支途徑合成木質(zhì)素、芪類、香豆素、植保素等多種次生物質(zhì)。類黃酮途徑的第一步是由查酮合酶(CHS)催化1分子p-香豆酰-CoA與3分子丙二酰-CoA縮合形成淺黃色的4,2’,4’,6’-四羥基查爾酮?；ㄉ张浠缣祗每亍⑹杠嚲账?、飛燕草素等是以查爾酮為底物，經(jīng)羥化、還原、氧化、側(cè)基修飾等幾步酶的催化反應(yīng)而形成，依次涉及CHI(查爾酮異構(gòu)酶)、F3H(黃烷酮3-羥化酶)、F3’H(類黃酮3’-羥化酶)、F3’5’H(類黃酮3’,5’-羥化酶)、DFR/FNR(二氫黃酮醇4-還原酶/黃烷酮4-還原酶)、ANS(花青素合成酶)等。由F3’H和F3’5’H決定的花青素(anthocyanidins)的B-環(huán)上的羥基越多，則顏色越偏向藍(lán)色。通常情況下，查爾酮和花青素被進(jìn)一步修飾，如糖基化(糖基轉(zhuǎn)移酶，GT)、甲基化(甲基轉(zhuǎn)移酶，MT)、?；??；D(zhuǎn)移酶，AT)，然后轉(zhuǎn)運(谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶，GST)到液泡中貯存。在黃色金魚草花的液泡中，查爾酮4’-O-葡萄糖苷被金魚草素合成酶(AS)轉(zhuǎn)變成亮黃色的金魚草素(6-O-葡萄糖苷)。艷桐草等植物的橙色至紅色花朵中，黃烷酮經(jīng)過幾步反應(yīng)而合成3-脫氧花色苷。此外，黃酮和黃酮醇也對花色起一定貢獻(xiàn)，它們?yōu)闊o色或淺黃色，可通過所謂共色作用來促進(jìn)藍(lán)色花色苷的形成和穩(wěn)定。黃酮和黃酮醇分別是以黃烷酮和二氫黃酮醇為底物，在黃酮合酶(FNS)和黃酮醇合酶(FLS)的催化下合成的。除花青素外，黃酮醇、查爾酮等其它類黃酮物質(zhì)也可能涉及糖基化等修飾。模式生物的研究表明，類黃酮途徑結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)是被一個由R2R3-MYB(有PAP、PFG、TT2等)、堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basichelix-loop-helix,bHLH，有TT8、GL3、EGL3等)和WD40重復(fù)(WDR，有TTG1等)形成的轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物所調(diào)控的，該三元復(fù)合物調(diào)控了觀花植物金魚草、矮牽牛、牽牛花、非洲菊和龍膽花的花瓣中花色苷著色的過程，調(diào)控行為受器官、組織等體內(nèi)信號和光、紫外線等外部信號所影響。擬南芥的研究表明，黃色調(diào)的黃酮醇(苷)生物合成途徑的表達(dá)則由PFG基因特異調(diào)控，其中成員MYB11、MYB12、MYB111在器官特異性上發(fā)生明顯分工。類胡蘿卜素(carotenoids)是脂溶性的紅色、橙色和黃色色素，嵌合在葉綠體和有色體的膜中。類胡蘿卜素是C40-四萜類化合物，由C5-異戊二烯基礎(chǔ)單元合成而來，植物、真菌、藻類和細(xì)菌均可合成，動物雖不能合成，但可從食物中攝入并用作色素和維生素A的前體物。類胡蘿卜素為許多花色貢獻(xiàn)了黃色色系，并單獨或與花色苷一道為玫瑰、菊花等一些植物的花瓣貢獻(xiàn)了橙/紅、黃褐色和褐色色調(diào)。迄今，植物類胡蘿卜素生物合成途徑的幾乎全部關(guān)鍵酶基因已被克隆和鑒定，整個途徑起始于質(zhì)體中的C5的異戊二烯焦磷酸(isopentenylpyrophosphate,IPP)單元，據(jù)認(rèn)為該途徑的有關(guān)酶之間形成復(fù)合物并結(jié)合于質(zhì)體膜上，4分子IPP縮合為1分子C20的香葉基香葉基焦磷酸(GGPP)，在八氫番茄紅素合酶(PSY)的催化下2分子GGPP頭對頭地偶合成C40的無色的八氫番茄紅素，它是第一個類胡蘿卜素。隨后，八氫番茄紅素脫飽和酶(PDS)和ζ-胡蘿卜素脫飽和酶(ZDS)向分子中順序引入共軛雙鏈，先后形成無色的六氫番茄紅素、淺黃色的ζ-胡蘿卜素、橙黃色的鏈孢紅素、紅色的番茄紅素。隨著共軛雙鏈數(shù)的增加，吸收波長向長波方向移動。脫飽和過程中產(chǎn)生的一些順式構(gòu)象被類胡蘿卜素異構(gòu)酶(CRTISO、Z-ISO)催化轉(zhuǎn)變?yōu)槿词綐?gòu)象。番茄紅素可被番茄紅素β-環(huán)化酶(LCYB)或番茄紅素ε-環(huán)化酶(LCYE)環(huán)化，這是該途徑的一個分支點。除半結(jié)球萵苣等植物外，絕大多數(shù)植物中LCYE只能給番茄紅素加入ε-環(huán)，合成黃色的含有1個β-環(huán)和1個ε-環(huán)的α-胡蘿卜素和其衍生物。β-和α-胡蘿卜素可發(fā)生進(jìn)一步的羥化或環(huán)氧化修飾，產(chǎn)生許多新結(jié)構(gòu)。胡蘿卜素的加氧產(chǎn)物稱為葉黃質(zhì)，β-環(huán)和ε-環(huán)的羥化過程分別由β-環(huán)羥化酶(CHYB)和ε-環(huán)羥化酶(CHYE)完成。PSY、GGPS和LCYB存在花特異型和果實特異型，顯示存在一條有色體特異的類胡蘿卜素合成途徑。玉米黃素環(huán)氧酶(ZEP)催化玉米黃素發(fā)生C5,6和C5’,6’位的環(huán)氧化，形成黃色的花藥黃質(zhì)和紫黃質(zhì)，它又可在新黃質(zhì)合成酶(NSY)的催化下轉(zhuǎn)變成新黃質(zhì)。9-順式-紫黃質(zhì)和9-順式-新黃質(zhì)還可用于合成脫落酸(ABA)。類胡蘿卜素合成途徑的調(diào)控基因克隆還有待加強(qiáng)，但研究表明該途徑的調(diào)節(jié)主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上，受體內(nèi)和環(huán)境因素影響，PSY是重要限速酶調(diào)控點，光信號通路參與對類蘿卜素途徑的調(diào)控，而且類胡蘿卜素裂解雙加氧酶(CCD)/NCED(9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶)從分解的角度參與重要調(diào)節(jié)作用。此外，VDE(紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶)催化紫黃質(zhì)和花藥黃質(zhì)轉(zhuǎn)化為玉米黃質(zhì)。擬南芥AtRAP2.2對特定組織中的類胡蘿卜素積累有弱的促進(jìn)作用，但最近研究表明它的功能主要是調(diào)控組織的耐缺氧存活能力。番茄DDB1和DET1通過對光反應(yīng)信號途徑的負(fù)調(diào)控而抑制類胡蘿卜素途徑，而甘藍(lán)OR(Orange)和番茄HSP21則是通過調(diào)控有色體的形成而促進(jìn)類胡蘿卜素的積累。此外，還存在第3類植物色素，即甜菜素(betalains)，是一類存在于液泡中的水溶性生物堿，可分為紅紫色系的甜菜紅素(betacyanins)和黃色色系的甜菜黃素(betaxanthins)，但甜菜素只發(fā)現(xiàn)于石竹目的10個科的植物和少數(shù)高等真菌中，其它植物中還沒有發(fā)現(xiàn)，而且從未發(fā)現(xiàn)甜菜素與花色苷并存于同一種植物中。由于多數(shù)重要觀花植物的花色并不全，存在花色上的重要缺陷，因此花色分子育種的代謝工程具有重要應(yīng)用前景。但是包括油菜在內(nèi)的整個蕓薹屬中，未見利用分子育種的代謝工程改造油菜花色的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供干擾蕓薹屬植物花瓣中β-環(huán)化酶基因LCYB、ε-環(huán)化酶基因LCYE表達(dá)同時超量表達(dá)PAP基因在制備花瓣呈紅色的蕓薹屬植物品種中的應(yīng)用；本發(fā)明的目的之二在于提供干擾蕓薹屬植物花瓣中β-環(huán)化酶基因LCYB、ε-環(huán)化酶基因LCYE表達(dá)同時超量表達(dá)PAP基因的植物表達(dá)載體；本發(fā)明的目的之三在于提供上述植物表達(dá)載體的制備方法；本發(fā)明的目的之四在于提供利用上述植物表達(dá)載體制備花瓣呈紅色的蕓薹屬植物品種的方法。為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：1、干擾蕓薹屬植物花瓣中β-環(huán)化酶基因LCYB、ε-環(huán)化酶基因LCYE表達(dá)同時超量表達(dá)PAP基因在制備花瓣呈紅色的蕓薹屬植物品種中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述干擾蕓薹屬植物花瓣中β-環(huán)化酶基因LCYB、ε-環(huán)化酶基因LCYE表達(dá)的序列如SEQIDNO.2所示，所述超量表達(dá)PAP基因的序列如SEQIDNO.3所示。優(yōu)選的，所述干擾蕓薹屬植物花瓣中β-環(huán)化酶基因LCYB、ε-環(huán)化酶基因LCYE表達(dá)的序列由擬南芥花瓣特異啟動子PAtAP3介導(dǎo)表達(dá)，所述花瓣特異啟動子PAtAP3的核苷酸序列如SEQIDNO.1第267位至第1044位所示。最優(yōu)選的，所述蕓薹屬植物為甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)。2、干擾蕓薹屬植物花瓣中β-環(huán)化酶基因LCYB、ε-環(huán)化酶基因LCYE表達(dá)同時超量表達(dá)PAP基因的植物表達(dá)載體，所述植物載體包括由花瓣特異啟動子介導(dǎo)的表達(dá)β-環(huán)化酶基因LCYB和ε-環(huán)化酶基因LCYERNA干擾序列的表達(dá)框和由組成型啟動子介導(dǎo)表達(dá)PAP基因的表達(dá)框。優(yōu)選的，所述花瓣特異啟動子介導(dǎo)表達(dá)β-環(huán)化酶基因LCYB、ε-環(huán)化酶基因LCYERNA干擾序列的表達(dá)框依次由花瓣特異啟動子PAtAP3、SEQIDNO.2所示的序列、間隔序列、SEQIDNO.2所示的反向互補(bǔ)序列和NOS終止子組成。更優(yōu)選的，所述由組成型啟動子介導(dǎo)表達(dá)PAP基因的表達(dá)框依次由CaMV35S啟動子，SEQIDNO.3所示序列和NOS終止子組成。3、所述植物表達(dá)載體的制備方法，包括如下步驟：將SEQIDNO.1所示序列經(jīng)AscI和SwaI雙酶切后連入經(jīng)同樣酶切的pFGC5941M質(zhì)粒，得pFGC5941CEPE質(zhì)粒，然后將SEQIDNO.2所示的序列連入pFGC5941CEPE載體的PAtAP3啟動子與間隔序列之間，形成中間載體pFGC5941CEPE-B2RNAia，再將SEQIDNO.2所示序列反向連入中間載體pFGC5941CEPE-B2RNAia的間隔序列與OCS終止子之間，得pFGC5941CEPE-B2RNAi載體，最后將SEQIDNO.3所示序列通過NcoI和AscI酶切位點連入經(jīng)同樣酶切的pFGC5941CEPE-B2RNAi載體，得干擾蕓薹屬植物花瓣中β-環(huán)化酶基因LCYB、ε-環(huán)化酶基因LCYE表達(dá)同時超量表達(dá)PAP基因的植物表達(dá)載體。優(yōu)選的，所述間隔序列為甘藍(lán)型油菜PAP2基因第2內(nèi)含子。4、利用所述植物表達(dá)載體制備花瓣呈紅色的蕓薹屬植物品種的方法，包括如下步驟：a.將權(quán)利要求5-7任一項所述植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，制得工程菌；b.將步驟a所得工程菌轉(zhuǎn)化蕓薹屬植物無菌苗的下胚軸，共培養(yǎng)后，在Basta除草劑抗性下誘導(dǎo)分化獲得再生苗，篩選陽性苗轉(zhuǎn)基因苗得花瓣呈紅色的蕓薹屬植物品種。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供了油菜等蕓薹屬核心物種及蘿卜花色機(jī)理，明確了黃花、白花、紅花之間的關(guān)鍵性差異表達(dá)基因位點，由此本發(fā)明克隆花瓣特異啟動子并改造獲得一種適合于花色基因工程的新型植物表達(dá)平臺載體，然后克隆相關(guān)基因或基因片段，構(gòu)建獲得一種在花瓣中抑制黃色類胡蘿卜素并積累番茄紅素和花青素苷的植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化油菜后創(chuàng)造出紅色油菜花表型的新型資源材料，該技術(shù)策略是油菜等蕓薹屬花色基因工程中的首創(chuàng)，也是通過類胡蘿卜素和類黃酮途徑聯(lián)合代謝工程修飾植物花色的首例。附圖說明為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：圖1為蕓薹屬和蘿卜花瓣的顯微觀察結(jié)果(A：甘藍(lán)型油菜(BnY)；B：甘藍(lán)型油菜(BnW)；C：芥菜型油菜(BjY)；D：白菜型油菜(BrY)；E：甘藍(lán)(BoY)；F：芥藍(lán)(BoW)；G：蘿卜(RsR))。圖2為DFR、TT8、GL3、EGL3在蕓薹屬花瓣與蘿卜花瓣間的差異表達(dá)(A為DFR在蕓薹屬花瓣與蘿卜花瓣間的差異表達(dá)；B為TT8在蕓薹屬花瓣與蘿卜花瓣間的差異表達(dá)；C為GL3在蕓薹屬花瓣與蘿卜花瓣間的差異表達(dá)；D為EGL3在蕓薹屬花瓣與蘿卜花瓣間的差異表達(dá)；BnYPe：甘藍(lán)型油菜黃花瓣；BnWPe：甘藍(lán)型油菜白花瓣；BjYPe：芥菜型油菜黃花瓣；BrYPe：白菜型油菜黃花瓣；BoYPe：羽衣甘藍(lán)黃花瓣；BoWPe：芥藍(lán)白花瓣；RsRPe：蘿卜紅紫花瓣)。圖3為OR、CCD1在蕓薹屬花瓣和蘿卜花瓣間的差異表達(dá)(BnYPe：甘藍(lán)型油菜黃花瓣；BnWPe：甘藍(lán)型油菜白花瓣；BjYPe：芥菜型油菜黃花瓣；BrYPe：白菜型油菜黃花瓣；BoYPe：羽衣甘藍(lán)黃花瓣；BoWPe：芥藍(lán)白花瓣；RsRPe：蘿卜紅紫花瓣)。圖4為NOS-PAtAP3、B2RNAi和BnPAP1PCR擴(kuò)增結(jié)果(A：NOS-PAtAP3；B：B2RNAi；C：BnPAP1)。圖5pFGC5941CEPE和pBLycoRF7載體構(gòu)建過程中酶切結(jié)果(A：AscI和SwaI雙酶切pFGC5941M；B：AscI和SwaI雙酶切pMD19-T-NOS-PAtAP3；C：SwaI和AatI雙酶切pFGC5941CEPE；D：SwaI和AatII雙酶切pMD19-T-B2RNAi；E：BamHI和XbaI雙酶切pMD19-T-B2RNAi；F：BamHI和XbaI雙酶切pFGC5941CEPE-B2RNAia；G：NcoI和AscI雙酶切pFGC5941CEPE-B2RNAi；H：NcoI和AscI雙酶切pMD19-T-BnPAP1)。圖6為pBLycoRF7轉(zhuǎn)化油菜植株的花瓣顏色(A：對照組；B：轉(zhuǎn)基因油菜)。具體實施方式下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。本發(fā)明實施例采用的植物材料：甘藍(lán)型油菜黃花瓣和發(fā)育中期種子(中雙9號品種)、甘藍(lán)型油菜乳花瓣、白菜型油菜黃花瓣(6Y733品系)、芥菜型油菜黃花瓣(CNG12011品系)、羽衣甘藍(lán)(B.oleraceavar.acephalaftricolor，K10-3品系)黃花瓣、芥藍(lán)變種白花瓣(R9057品系)、蘿卜紅花瓣均取自西南大學(xué)重慶市油菜工程技術(shù)研究中心歇馬基地的常規(guī)試驗植株。擬南芥(Arabidopsisthaliana，Columbia野生型)種子購自國際擬南芥中心，種植于室內(nèi)人工氣候室。本發(fā)明實施例采用的試劑及試劑盒：PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser(PerfectRealTime)、PremixExTaqTMII(TliRNaseHPlus)ROXplus、DNALigationKit、pMD19-T、TaqDNA聚合酶、DNaseI(RNase-free)及buffer、RNaseInhibitor、DL-2000及λ-HindIIIDNAMarker購自大連寶生物(TaKaRa)生物工程有限公司；RNAprepPure植物總RNA提取試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒、小量法質(zhì)粒抽提試劑盒購自上海華舜生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶購自立陶宛MBIFermentas公司；MS(Murashige&Skoogmedium,includingvitamins)培養(yǎng)基為荷蘭Duchefa公司產(chǎn)品；DL-2000plus、Easy-Taq酶、dNTPs等試劑購自北京全式金(Transgen)生物技術(shù)有限公司；X-Gluc(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronicacid)、利福平(Rif)、鏈霉素(Str)、卡那霉素(Kan)、氨芐青霉素(Amp)、瓊脂糖、Tris、CTAB、Tris飽和酚(pH＝8.0)、Tryptone、YeastExtract、X-gal、IPTG、CTAB等其它生化與分子生物學(xué)試劑購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；植物激素購自上海稼豐園藝用品等公司。本發(fā)明實施例采用的主要儀器：VeritiTM多重控溫PCR儀購自美國AppliedBiosystems公司；CFX96熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司；以及分子生物學(xué)和基因工程的其它設(shè)備設(shè)施。優(yōu)選實施例所用PCR引物合成和測序由上海英駿/英濰捷基公司、上海生工、北京六合華大等公司商業(yè)完成。實施例1、蕓薹屬和蘿卜花瓣顯色亞細(xì)胞器的顯微觀察分別采取新鮮的甘藍(lán)型油菜黃花瓣(BnY)；甘藍(lán)型油菜乳花瓣(BnW)；芥菜型油菜黃花瓣(BjY)；白菜型油菜黃花瓣(BrY)；羽衣甘藍(lán)黃花瓣(BoY)；芥藍(lán)白花瓣(BoW)；蘿卜紅花瓣(RsR)，放在冰面冷鮮保存運回實驗室，然后徒手切片，用低倍鏡觀察快速篩查，挑選合格切片進(jìn)行仔細(xì)觀察與照相，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示，蕓薹屬幾個物種的黃花瓣中顯黃色的物質(zhì)在一個細(xì)胞中呈現(xiàn)為眾多小顆粒狀，不均勻地分布于細(xì)胞內(nèi)，被液泡擠壓到貼壁的位置，說明黃色花瓣中顯色細(xì)胞器為有色體，其色素為黃色類胡蘿卜素。甘藍(lán)型油菜乳花瓣中也有一些細(xì)胞擁有淺黃色有色體，但總體數(shù)量少且細(xì)胞間不一致，芥藍(lán)白花瓣中幾乎看不到有色體，說明是有色體的減少或消失導(dǎo)致其黃色變淺或消失。蘿卜花瓣中紫紅色色素均勻分布于每個細(xì)胞的中央位置，越是中央越濃，越偏離中央越淡，說明蘿卜花瓣的顯色亞細(xì)胞器為液泡，顯色物質(zhì)為花青素苷。實施例2、檢測蕓薹屬和蘿卜花瓣色素在盛花期早晨分別取剛開放的甘藍(lán)型油菜黃花瓣(BnY)；甘藍(lán)型油菜乳花瓣(BnW)；芥菜型油菜黃花瓣(BjY)；白菜型油菜黃花瓣(BrY)；羽衣甘藍(lán)黃花瓣(BoY)；芥藍(lán)白花瓣(BoW)；蘿卜紅花瓣(RsR)，立即陰涼保鮮運回實驗室，50～60℃烘干，研成粉末后過60目篩，避光干燥保存。1、石油醚、鹽酸和氨水測試結(jié)果稱取保存的花瓣粉末0.100g，分別放入編有號碼的具塞試管中，分別加入石油醚、10％鹽酸、30％氨水各約10mL，輕輕混勻，過濾，觀察顏色變化，結(jié)果如下：(1)石油醚反應(yīng)：甘藍(lán)型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜都表現(xiàn)出亮黃色，表明類胡蘿卜含量的含量高；羽衣甘藍(lán)表現(xiàn)出淺黃色，說明其含有少量的類胡蘿卜素；而芥藍(lán)和蘿卜花表現(xiàn)出無色，表明不含類胡蘿卜素。(2)鹽酸測試：只有蘿卜紅花瓣表現(xiàn)出粉紅色，說明含有花青素苷，而甘藍(lán)型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜花瓣表現(xiàn)出不同程度的黃色，說明含黃酮(醇)而不含花青素。芥藍(lán)白和羽衣甘藍(lán)表現(xiàn)近無色，說明不含有花青素，而且黃酮(醇)也很少。(3)氨水測試：蕓薹屬各材料均表現(xiàn)出不同程度的黃色，說明其含有或多或少的黃酮(醇)，而蘿卜花表現(xiàn)出的黃綠色，該顏色是由花色苷呈現(xiàn)的藍(lán)色和類黃酮呈現(xiàn)的黃色混合而成，但所有材料均不表現(xiàn)橙紅色或紅色，說明不含橙酮。2、類黃酮的顯色反應(yīng)取保存的花瓣粉末0.100g，用甲醇提取24h，過濾，定容至50mL，各取2mL提取液，然后進(jìn)行下列顏色反應(yīng)，觀察顏色變化。(1)濃鹽酸-鎂粉反應(yīng)：加入少量鎂粉，再后加入濃鹽酸5滴，輕輕搖勻，靜置1h。結(jié)果顯示，甘藍(lán)型油菜、芥藍(lán)顯示無色，可能含有查爾酮、橙酮；甘藍(lán)型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜顯示極淡紫紅和微紫紅，說明不含查爾酮、橙酮和兒茶素，可能含有黃酮、黃酮醇、二氫黃酮醇、二氫黃酮；蘿卜花顯現(xiàn)出粉紅色，說明含有花青素。(2)濃鹽酸-鋅粉反應(yīng)：加入少量鋅粉，再加入濃鹽酸10滴，輕輕搖勻，靜置1h。結(jié)果顯示，蘿卜花呈現(xiàn)粉紅色，說明含有花青素苷。其余均無色或者黃色，說明不含花青素苷。(3)醋酸鉛反應(yīng)：加1.0％醋酸鉛2mL，輕輕搖勻，靜置2h。結(jié)果顯示，所有蕓薹屬材料均出現(xiàn)不同程度的黃色沉淀，說明類黃酮具備酚羥基而且不含查耳酮和橙酮，可能具有鄰二酚羥基或者兼有4-酮基、3-OH或者4-酮基、5-OH結(jié)構(gòu)；蘿卜花出現(xiàn)綠色沉淀，說明含有花青素苷。(4)三氯化鐵反應(yīng)：加5.0％三氯化鐵2ml，輕輕搖勻。結(jié)果顯示，所有材料都出現(xiàn)黃色，說明色素分子中不含酚羥基。(5)三氯化鋁反應(yīng)：加1.0％三氯化鋁甲醇溶液lml。結(jié)果顯示，所有材料都呈現(xiàn)程度不同的黃色，說明含類黃酮物質(zhì)。(6)濃硫酸反應(yīng)：加1.5mL濃H2SO4，輕輕搖勻，再置沸水浴5min。所有蕓薹屬材料均呈現(xiàn)不同程度的黃色，說明含黃酮(醇)，沸水中5min顏色不改變，說明不含查爾酮、橙酮，可能不含二氫黃酮，可能含異黃酮和二氫異黃酮。蘿卜花出現(xiàn)橙黃色，說明含有花青素。(7)四氫硼鈉反應(yīng)：加四氫硼鈉8mg，再加1.0％鹽酸2mL，輕輕搖勻，靜置2h。所有蕓薹屬材料均呈現(xiàn)程度不同的黃色，說明不含二氫黃酮和二氫黃酮醇。蘿卜花呈現(xiàn)極淡粉紅色，說明含有二氫黃酮和/或二氫黃酮醇。(8)堿性試劑反應(yīng)：加5％Na2CO33ml，輕輕搖勻，密閉靜置30min，通空氣10min。所有材料均呈現(xiàn)程度不同的黃色，通空氣后顏色不變，說明不含二氫黃酮醇。(9)氨性氯化銫反應(yīng)：取甲醇10ml，加氨水定容至25ml，成為被氨水飽和的甲醇溶液。向樣品液中加入0.01mol/L氯化鍶甲醇液10滴，再加被氨水飽和的甲醇液10滴，用手輕輕搖勻，靜置lh。蘿卜花呈現(xiàn)出沉淀，說明有3’,4’-二羥基取代。(10)硼酸反應(yīng)：加1.0％硼酸10滴，再加2.0％H3BO33ml，芥藍(lán)白花瓣呈現(xiàn)出無色，說明芥藍(lán)白花瓣類黃酮可能不含C5-OH。3、花瓣色素成分的紫外-可見光譜分析(1)葉綠素：稱取保存的花瓣0.100g，迅速用液氮研磨至粉末，采用體積分?jǐn)?shù)為90％的丙酮:乙醇(4:l，V/V)提取24h，過濾，定容至25ml，采用紫外-可見分光光度計在200～700nm范圍內(nèi)掃描。結(jié)果表明，所有樣品在662nm和644nm處均無吸收峰，說明均不含葉綠素。(2)類胡蘿卜素：稱取保存的花瓣0.100g，迅速用液氮研磨至粉末，加入石油醚:丙酮(1:1，V/V)提取24h，過濾，定容至25ml，采用紫外-可見分光光度計在200～700nm范圍內(nèi)掃描。結(jié)果表明，甘藍(lán)型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜、羽衣甘藍(lán)在440和470nm左右都有吸收峰，說明含有類胡蘿卜素，定量分析測定的含量分別為6.824、6.712、5.548、1.248mg/g。而芥藍(lán)和蘿卜花瓣則沒有特征吸收峰，說明不含有類胡蘿卜素。(3)類黃酮：稱取保存的花瓣0.100g，迅速用液氮研磨至粉末，加入鹽酸化甲醇(pH＝3)2ml置于4℃冰箱中提取24h，過濾，定容至25ml，用紫外-可見分光光度計在220～600nm范圍內(nèi)掃描。結(jié)果表明，甘藍(lán)型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜、羽衣甘藍(lán)、芥藍(lán)、蘿卜花瓣的提取液在330和270nm均有吸收峰，說明他們都含有類黃酮化合物，定量分析測定的含量分別為7.483、7.651、7.001、1.391、1.003、8.373mg/g。(4)花青素苷：稱取保存的花瓣0.100g，迅速用液氮研磨至粉末，加入甲醇提取24h，過濾，定容至50ml，用紫外-可見分光光度計在200～700nm范圍內(nèi)掃描。結(jié)果表明，蘿卜花瓣色素在532nm左右有較明顯的花色苷特征吸收峰，是花色苷帶I吸收峰，在260-270nm區(qū)域內(nèi)以一個不太強(qiáng)帶II的峰，定量分析測定的含量為237.27mg/100g。所有蕓薹屬樣本均無花色苷吸收峰，即不含花色苷。實施例3、蕓薹屬和蘿卜花瓣色素生物合成途徑的分子鑒定(1)蕓薹屬和蘿卜花瓣類黃酮途徑基因的表達(dá)特征為研究蕓薹屬和蘿卜花瓣色素出現(xiàn)差異的分子機(jī)理，設(shè)計蕓薹屬和蘿卜類黃酮途徑基因的RT-PCR檢測引物，并以5SrRNA作為內(nèi)參，具體如表1所示：表1、類黃酮途徑RT-PCR檢測引物在盛花期早晨分別取剛開放的甘藍(lán)型油菜黃花瓣(BnY)；甘藍(lán)型油菜乳花瓣(BnW)；芥菜型油菜黃花瓣(BjY)；白菜型油菜黃花瓣(BrY)；羽衣甘藍(lán)黃花瓣(BoY)；芥藍(lán)白花瓣(BoW)；蘿卜紅花瓣(RsR)，液氮冷凍運輸，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。然后用RNAprepPure植物總RNA提取試劑盒抽提總RNA，經(jīng)電泳分析和分光光度法檢測合格后，用RNase-freeDNaseI除去總RNA中的DNA雜質(zhì)，用RTReagentKitWithgDNAEraser(PerfectRealTime)試劑盒進(jìn)行進(jìn)一步去基因組DNA(gDNA)并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到總cDNA第一鏈。用CHS基因家族的一對保守區(qū)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，靶區(qū)間跨內(nèi)含子，電泳顯示所有樣品僅擴(kuò)出與預(yù)測大小一致的cDNA條帶而沒有g(shù)DNA條帶，進(jìn)一步用內(nèi)標(biāo)基因25SrRNA進(jìn)行檢測，各樣品間的擴(kuò)增條帶特異且亮度差異不大，說明反轉(zhuǎn)錄前已徹底去除了總RNA中的gDNA，所有樣品反轉(zhuǎn)錄成功且總cDNA濃度相差不大，可以用于基因表達(dá)定量PCR等實驗。然后采用PremixExTaqTMII(TliRNaseHPlus)kit在CFX96TMReal-TimeSystem上進(jìn)行熒光實時定量PCR，根據(jù)說明書的方法執(zhí)行PCR程序。反應(yīng)體系為20μL體系定量RT-PCR含有反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物0.1μL、SYBRPremixExTaqTMII(2×)10μL、各引物(10μM)0.4μL，其余體積用ddH2O補(bǔ)齊。PCR循環(huán)參數(shù)為：95℃預(yù)變性3min；50個擴(kuò)增循環(huán)(95℃變性10s、對應(yīng)溫度退火30s、72℃延伸30s)；65℃5s；95℃5s。實驗設(shè)置了2個RNA提取-反轉(zhuǎn)錄重復(fù)(生物學(xué)重復(fù))，每個反轉(zhuǎn)錄重復(fù)2次PCR(檢測重復(fù))，4次結(jié)果取平均值。并且通過熔化曲線分析驗證反應(yīng)的特異性，相對表達(dá)量根據(jù)2-ΔCt計算，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，CHS、CHI、F3H、TTG1、PAP基因家族在所有材料中均旺盛或中等程度表達(dá)，材料間差異不大。F3’H、F3H、FLS、PFG(MYB12、MYBL2)在各材料中均有表達(dá)，僅僅只材料間有高低差異而已。DFR、ANS、TT19、TT8、GL3、EGL3在蕓薹屬各材料中均沒有明顯的表達(dá)或表達(dá)極低，但在蘿卜中表達(dá)量卻很高。說明黃酮醇的合成在蕓薹屬和蘿卜花瓣中均處于旺盛或較旺盛的工作狀態(tài)，花青素苷的合成僅在蘿卜花瓣中旺盛工作卻在蕓薹屬花瓣中處于關(guān)閉狀態(tài)。(2)蕓薹屬和蘿卜花瓣類胡蘿卜素途徑的表達(dá)特征為進(jìn)一步研究蕓薹屬和蘿卜花瓣色素出現(xiàn)差異的分子機(jī)理，設(shè)計蕓薹屬和蘿卜類胡蘿卜素途徑17個功能位點基因家族的RT-PCR引物，并以25SrRNA作為內(nèi)參，具體引物如表2所示。表2本發(fā)明所用的類胡蘿卜素途徑RT-PCR檢測引物然后利用與上述相同的方法進(jìn)行RT-PCR，并通過熔化曲線分析驗證反應(yīng)的特異性，相對表達(dá)量根據(jù)2-ΔCt計算，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果顯示，類胡蘿卜素途徑的所有檢測基因位點在7個物種材料的花瓣中均表達(dá)，但也存在一些差異，一是蕓薹屬白/乳花瓣中CCD1表達(dá)水平明顯比黃花瓣中高，二是蘿卜花瓣中OR呈關(guān)閉狀態(tài)而不表達(dá)，蕓薹屬二倍體基本種中OR表達(dá)水平也沒有四倍體復(fù)合種中高。說明蘿卜花瓣中類胡蘿卜素的缺失是因為OR關(guān)閉而不能形成有色體，蕓薹屬白/乳花瓣中類胡蘿卜素的減少是因為類胡蘿卜素的分解過強(qiáng)。實施例4、植物表達(dá)平臺載體pFGC5941CEPE的構(gòu)建根據(jù)蕓薹屬和蘿卜花瓣類胡蘿卜素和類黃酮合成途徑上基因表達(dá)差異，設(shè)計克隆差異表達(dá)基因和構(gòu)建表達(dá)載體的引物，具體引物如表3所示。表3本發(fā)明中基因克隆、載體構(gòu)建與檢測所用引物(1)NOS-PAtAP3片段的獲得以pCAMBIA2301質(zhì)粒為PCR模板，用引物組合FTNOS和RTNOS擴(kuò)增并回收286bp的片段，得含NOS終止子的片段，其核苷酸序列如SEQIDNo.1第1-286位所示。采用CTAB法提取擬南芥葉片的基因組總DNA為PCR模板，用引物組合FPAtAP3和RPAtAP3擴(kuò)增并回收778bp的含花瓣特異啟動子PAtAP3片段(GenBankaccessionnumber:U30729)，其核苷酸序列如SEQIDNo.1第267-1044位所示。然后將兩種回收產(chǎn)物混合后作為PCR模板，用引物組合FTNOS和RPAtAP3擴(kuò)增，獲得片段大小為1044bp的融合片段NOS-PAtAP3，結(jié)果如圖4中A所示。然后切膠回收，與pMD19-T連接的pMD19-T-NOS-PAtAP3重組載體，將獲得的重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，對Amp抗性LB平板篩選的轉(zhuǎn)化子單克隆采用引物組合FTNOS和RPAtAP3進(jìn)行PCR檢測，測序結(jié)果顯示，融合片段NOS-PAtAP3序列如SEQIDNo.1所示。(2)pFGC5941CEPE的構(gòu)建抽提pMD19-T-NOS-PAtAP3重組質(zhì)粒，然后用AscI和SwaI進(jìn)行雙酶切，回收NOS-PAtAP3片段，見圖5中B所示；同時抽提pFGC5941M質(zhì)粒，經(jīng)AscI和SwaI雙酶切后回收載體骨架，如圖5中A所示。將NOS-PAtAP3片段和pFGC5941M質(zhì)粒連接后獲得11241bp的適合于花色基因工程的植物表達(dá)載體pFGC5941CEPE，將pFGC5941CEPE轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含Kan濃度為50mg/L的LB平板上篩選單克隆轉(zhuǎn)化子，將篩選獲得的單克隆轉(zhuǎn)化子用引物組合FTNOS和RPAtAP3與F35S3N和ROCST5N進(jìn)行PCR檢測，篩選陽性克隆子測序，選取序列無突變的克隆子備用。其獲得的pFGC5941CEPE重組質(zhì)粒中，在T-DNA區(qū)間含有Bar基因表達(dá)盒(提供對除草劑Basta的抗性)和2個可用于插入外源基因的表達(dá)盒，外源基因表達(dá)盒1含組成性啟動子CaMV35S和NOS終止子，可用于目的基因的正義或反義表達(dá)；外源基因表達(dá)盒2含花瓣特異啟動子PAtAP3、間隔子BnPAP2I2(甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)PAP2基因第2內(nèi)含子)和OCSPolyA終止子，可用于目的基因的RNA干擾、正義或反義表達(dá)。(3)串聯(lián)二價RNA干擾片段B2RNAi的克隆采用上述反轉(zhuǎn)錄得到的甘藍(lán)型油菜花瓣總cDNA第一鏈為模板，采用引物組合FBLCYBi和RBLCYBi擴(kuò)增LCYB基因家族的RNA干擾片段(387bp，加酶切位點和接頭后為411bp)，用引物組合FBLCYEi和RBLCYEI擴(kuò)增LCYE基因家族的RNA干擾片段(480bp，加接頭后為506bp)，分別回收。然后將2種PCR的回收產(chǎn)物等量混合后作為模版，用引物組合FBLCYBi和RBLCYEI擴(kuò)增成867bp片段，該片段串聯(lián)LCYB、LCYE兩個基因的RNA干擾片段，命名為B2RNAia，結(jié)果如圖4中B所示(加酶切位點后為893bp)。然后回收B2RNAia，與pMD19-T連接得pMD19-T-B2RNAi，pMD19-T-B2RNAi轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，對Amp抗性LB平板篩選的轉(zhuǎn)化子單克隆采用引物組合FBLCYBi+RBLCYEI進(jìn)行PCR檢測，送陽性克隆進(jìn)行測序，測序結(jié)果如SEQIDNo.2所示。(4)構(gòu)建植物表達(dá)載體pFGC5941CEPE-B2RNAi抽提pMD19-T-B2RNAi質(zhì)粒，用SwaI和AatII雙酶切(SwaI先切，再加AatII)，回收B2RNAi片段，見圖5中D所示；同時抽提pFGC5941CEPE質(zhì)粒，用SwaI和AatII雙酶切后，回收載體骨架，見圖5中C所示。將回收的B2RNAi片段連入pFGC5941CEPE植物表達(dá)載體的PAtAP3啟動子與間隔子BnPAP2I2之間，形成中間載體pFGC5941CEPE-B2RNAia，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用Kan抗性LB平板篩選的單克隆轉(zhuǎn)化子，然后分別采用引物組合FPAtAP3和FBLCYBi與RBLCYEI和RBnPAPI2進(jìn)行PCR檢測，PCR陽性克隆子備用。抽提pMD19-T-B2RNAi質(zhì)粒，用BamHI和XbaI雙酶切，回收B2RNAi的正義片段B2RNAi，見圖5中E所示。同時抽提pFGC5941CEPE-B2RNAia質(zhì)粒，用BamHI和XbaI雙酶切，回收載體骨架，見圖5中F所示。將B2RNAi連入pFGC5941CEPE-B2RNAia質(zhì)粒(間隔子BnPAP2I2與OCS終止子之間)，形成植物表達(dá)載體pFGC5941CEPE-B2RNAi，將植物表達(dá)載體pFGC5941CEPE-B2RNAi轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用Kan抗性LB平板篩選單克隆轉(zhuǎn)化子，再用FPAtAP3和FBLCYBi、FBLCYBi和ROCST5N、RBLCYEI和RBnPAPI2、FBnPAPI2和RBLCYEI4對引物組合進(jìn)行PCR鑒定，陽性克隆子測序，選取序列無突變的克隆子備用。(5)甘藍(lán)型油菜PAP1(BnPAP1)基因的cDNA編碼區(qū)的克隆我們從前的研究表明，甘藍(lán)型油菜PAP1(BnPAP1)基因主要在種皮中表達(dá)，激活類黃酮-原花青素的合成，也在衰老轉(zhuǎn)紅的莖葉中表達(dá)，激活類黃酮-花青素苷的合成。因此，本發(fā)明從甘藍(lán)型油菜發(fā)育的種子中克隆BnPAP1的cDNA編碼區(qū)，然后用于構(gòu)建正義載體并轉(zhuǎn)化油菜以后在花瓣中超量表達(dá)。提取甘藍(lán)型油菜發(fā)育中期種子的總RNA，如前法去gDNA后反轉(zhuǎn)錄得第一鏈cDNA，然后以第一鏈cDNA為模板，采用FBnPAP1和RBnPAP1引物組合擴(kuò)增BnPAP1基因，獲得BnPAP1基因744bp的編碼區(qū)(加酶切位點后為754bp)，電泳結(jié)果如4中C所示，將其膠回收，與pMD19-T連接成pMD19-T-BnPAP1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，對Amp抗性LB平板篩選的轉(zhuǎn)化子單克隆采用引物組合FBnPAP1和RBnPAP1進(jìn)行PCR檢測，送多個陽性克隆子測序，測序結(jié)果顯示BnPAP1序列如SEQIDNo.3所示，選取序列無突變的克隆子備用。(6)構(gòu)建植物表達(dá)載體pBLycoRF7抽提pMD19-T-BnPAP1質(zhì)粒，用NcoI和AscI雙酶切(AscI先切，再加NcoI)，回收BnPAP1基因片段，見圖5中H所示；同時抽提pFGC5941CEPE-B2RNAi質(zhì)粒，用NcoI和AscI雙酶切，回收載體骨架，見圖5中G所示。將回收的BnPAP1基因片段和pFGC5941CEPE-B2RNAi載體骨架連接，形成串聯(lián)二價RNAi和一價超量表達(dá)的三價植物表達(dá)載體，命名為pFGC5941CEPE-B2RNAi-BnPAP1ox，簡稱為pBLycoRF7。然后將pBLycoRF7轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，對Kan抗性LB平板篩選的轉(zhuǎn)化子單克隆分別用FPAtAP3和FBLCYBi、FBLCYBi和ROCST5N、RBLCYEI和RBnPAPI2、FBnPAPI2和RBLCYEI、F35S3N和RBnPAP1、FBnPAP1和RTNOS6對引物組合分別載體是否構(gòu)建成功，然后將陽性克隆子提取質(zhì)粒后采用凍融法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404，然后用含Kan、Str和Rif的抗性LB平板篩選的單克隆轉(zhuǎn)化子，并用上述6對引物組合進(jìn)行PCR檢測，篩選陽性克隆子作為工程菌株保存，用于植物轉(zhuǎn)化。實施例5、pBLycoRF7轉(zhuǎn)化油菜所有組織培養(yǎng)操作均在標(biāo)準(zhǔn)的植物組織培養(yǎng)條件下進(jìn)行，超凈工作臺、培養(yǎng)間、馴化間的潔凈級別分別為100級、10000級和100000級，相應(yīng)試劑、材料、器皿均按規(guī)程進(jìn)行無菌處理。甘藍(lán)型油菜典型黃花品種中雙10號的種子用75％乙醇表面消毒1min后用無菌水沖洗3次，然后用5％次氯酸鈉浸泡20min，無菌水沖洗干凈后接種于MS固體培養(yǎng)基中(MS粉4.41g/L+Phytagel2.6g/L+蔗糖30.0g/L，pH5.8，滅菌鍋濕熱滅菌；不加Phytagel即為液體培養(yǎng)基)，于25℃、2000Lux光照、16h/d光周期培養(yǎng)(后面的組培間培養(yǎng)條件除特別注明者外，均與此相同)。切取苗齡8d左右無菌苗的下胚軸切成長約0.5～1.0cm的小段，接種到預(yù)培培養(yǎng)基MSp上(MS培養(yǎng)基+1.0mg/L6-BA+1.0mg/L2,4-D)預(yù)培養(yǎng)3d。將-80℃保存的含有pBLycoRF7的LBA4404工程菌株在加有100mg/LKan、20mg/LStr和40mg/LRif的LB液體培養(yǎng)基中于28℃、250r/min振蕩培養(yǎng)1～2d，使農(nóng)桿菌生長至對數(shù)期，轉(zhuǎn)接培養(yǎng)一次。然后在5000rpm、10min室溫離心收集菌體，用浸染培養(yǎng)基MSm(MS液體培養(yǎng)基+1.0mg/L2,4-D+1.0mg/L6-BA+100μmol/LAS)調(diào)節(jié)細(xì)菌濃度至OD600約0.5左右，即為浸染液。將預(yù)培養(yǎng)后的下胚軸段浸入浸染液中5～10min，間歇性輕輕搖蕩，然后將下胚軸段在滅菌紙上吸干多余菌液，接種到共培培養(yǎng)基MSc(MS固體培養(yǎng)基+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA)中，于23.5℃暗培養(yǎng)48h。暗培養(yǎng)后用殺菌液體培養(yǎng)基MSk(MS液體培養(yǎng)基+1.0mg/L2,4-D+1.0mg/L6-BA+500mg/LCef)浸泡洗滌外植體3次，每次10min，然后用滅菌紙吸干表面液體，轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基MSi(MS固體培養(yǎng)基+1.0mg/L6-BA+1.0mg/L2,4-D+500mg/LCef+12.5mg/LBasta+6mg/LAgNO3)培養(yǎng)，每2周繼代1次，至長出肉眼可見的抗性愈傷，再轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基MSd(MS固體培養(yǎng)基+4.0mg/L6-BA+2.0mg/LZT+5.0mg/LAgNO3+500mg/LCef+12.5mg/LBasta)中培養(yǎng)14d以上，誘導(dǎo)愈傷組織分化出小芽，再轉(zhuǎn)接到莖分化培養(yǎng)基MSs(MS固體培養(yǎng)基+3.0mg/L6-BA+2.0mg/LZT+500mg/LCef+12.5mg/LBasta)培養(yǎng)至長出小莖，再轉(zhuǎn)接到長莖培養(yǎng)基MSe(MS固體培養(yǎng)基+0.05mg/L6-BA+500mg/LCef+12.5mg/LBasta)中培養(yǎng)至長完整無根小苗，再轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基MSr(MS固體培養(yǎng)基+2mg/LNAA)培養(yǎng)至長出發(fā)達(dá)根系，生根后的小苗經(jīng)馴化后，移栽到含有滅菌珍珠巖、蛭石、草炭土混合物(質(zhì)量比為1:1:1)的盆缽中，按溫室盆栽進(jìn)行管理。最終，pBLycoRF7轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜中雙10號后獲得28株再生植株；對再生植株葉片滴加200mg/LBasta溶液檢測抗性，并提取葉片基因組總DNA分別采用引物組合F35S3N和RBnPAP1、FBLCYBi和ROCST5N進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果表明獲得11株雙陽性轉(zhuǎn)基因植株。對轉(zhuǎn)基因陽性植株進(jìn)行全面的生物學(xué)和農(nóng)學(xué)觀察，結(jié)果如圖6所示。結(jié)果顯示，獲得的轉(zhuǎn)基因植株生長發(fā)育和背景性狀沒有明顯改變，但花瓣均變成了紅色，花瓣細(xì)胞顯微觀察表明紅色物質(zhì)既有來源于有色體的，也有來源于液泡的，生化成分檢測也表明新產(chǎn)生的紅色物質(zhì)既有番茄紅素，也有花青素苷。表明可以通過本發(fā)明的方法，抑制黃色色素并積累番茄紅素和花青素苷可以創(chuàng)造紅色油菜花。對轉(zhuǎn)基因當(dāng)代植株進(jìn)行自交繁殖，采用與轉(zhuǎn)基因當(dāng)代植株一樣的葉片滴加Basta抗性檢測，篩選鑒定出轉(zhuǎn)基因油菜純合優(yōu)株系，其花瓣顏色比轉(zhuǎn)基因當(dāng)代植株更紅，說明轉(zhuǎn)基因性狀可以穩(wěn)定遺傳且純合后代株系比當(dāng)代(雜合)單株的轉(zhuǎn)基因性狀更好。最后說明的是，以上實施例僅用以舉例說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但并非限制于此。盡管通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。這里特別申明，應(yīng)用形式上的如下改變也都必然屬于本發(fā)明的精神和范圍所覆蓋：1、本發(fā)明中的PAP1、LCYB、LCYE基因/基因片段，除了序列表中所列的核苷酸序列以外，還包括來自于親本物種白菜或甘藍(lán)中的對應(yīng)基因序列，也包括來自于這些物種中同一功能位點基因家族其它成員的序列，盡管它們與序列表中所列的核苷酸序列可能有小的差異。2、本發(fā)明中的基因和其片段，除了序列表中所列的核苷酸序列以外，也包括與它們在連續(xù)80bp及以上有98.00％以上一致性的任意核苷酸序列。3、本發(fā)明中LCYB、LCYE位點的RNA干擾片段，除了序列表中所列的核苷酸序列以外，也包括來自于同一基因其它位置的片段。4、本發(fā)明中對LCYB、LCYE位點表達(dá)的抑制，除了優(yōu)選實施例中所舉的RNA干擾技術(shù)以外，還可以采用反義RNA、基因組編輯(ZFN、TALEN、CRISPR-Cas)等技術(shù)來達(dá)到相同或相似的目的。5、本發(fā)明中的基因和其片段，除了象優(yōu)先實施例中所舉的采用pFGC5941的改造載體進(jìn)行構(gòu)建以外，還可以采用其它載體來進(jìn)行植物表達(dá)載體構(gòu)建，包括采用其它啟動子和終止子，來達(dá)到相同或相似的目的；本發(fā)明中的載體構(gòu)建物，除了象優(yōu)先實施例中所舉的采用根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404介導(dǎo)的改良葉盤法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化以外，也可以采用其它方法進(jìn)行植物遺傳轉(zhuǎn)化。6、本發(fā)明中的基因、基因片段和載體構(gòu)建物，除了象優(yōu)先實施例中所舉的用于甘藍(lán)型油菜以外，還可以應(yīng)用于其親本物種白菜、甘藍(lán)以及蕓薹屬的其它近緣種，來達(dá)到相同或相似的目的。