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干擾LCYB、LCYE表達(dá)同時(shí)超量表達(dá)PAP在制備花瓣呈紅色蕓薹屬植物中的應(yīng)用的制作方法與工藝

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干擾LCYB、LCYE表達(dá)同時(shí)超量表達(dá)PAP在制備花瓣呈紅色蕓薹屬植物中的應(yīng)用的制作方法與工藝

技術(shù)特征:
1.干擾蕓薹屬植物花瓣中β-環(huán)化酶基因LCYB、ε-環(huán)化酶基因LCYE表達(dá)同時(shí)超量表達(dá)PAP基因在制備花瓣呈紅色的蕓薹屬植物品種中的應(yīng)用,其特征在于:干擾蕓薹屬植物花瓣中β-環(huán)化酶基因LCYB、ε-環(huán)化酶基因LCYE表達(dá)的序列如SEQIDNO.2所示,超量表達(dá)PAP基因的序列如SEQIDNO.3所示。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其特征在于:用于干擾蕓薹屬植物花瓣中β-環(huán)化酶基因LCYB、ε-環(huán)化酶基因LCYE表達(dá)的序列由擬南芥花瓣特異啟動(dòng)子PAtAP3介導(dǎo)表達(dá),所述花瓣特異啟動(dòng)子PAtAP3的核苷酸序列如SEQIDNO.1第267位至第1044位所示。3.根據(jù)權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的應(yīng)用,其特征在于:所述蕓薹屬植物為甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)。4.干擾蕓薹屬植物花瓣中β-環(huán)化酶基因LCYB、ε-環(huán)化酶基因LCYE表達(dá)同時(shí)超量表達(dá)PAP基因的植物表達(dá)載體,其特征在于:所述植物載體包括由花瓣特異啟動(dòng)子介導(dǎo)的表達(dá)β-環(huán)化酶基因LCYB、ε-環(huán)化酶基因LCYERNA干擾序列的表達(dá)框和由組成型啟動(dòng)子介導(dǎo)表達(dá)PAP基因的表達(dá)框,其特征在于:所述花瓣特異啟動(dòng)子介導(dǎo)表達(dá)β-環(huán)化酶基因LCYB、ε-環(huán)化酶基因LCYERNA干擾序列的表達(dá)框依次由花瓣特異啟動(dòng)子PAtAP3、SEQIDNO.2所示的序列、間隔序列、SEQIDNO.2所示的序列的反向互補(bǔ)序列和OCS終止子組成;所述由組成型啟動(dòng)子介導(dǎo)表達(dá)PAP基因的表達(dá)框依次由CaMV35S啟動(dòng)子,SEQIDNO.3所示序列和NOS終止子組成;其制備方法如下:將SEQIDNO.1所示序列經(jīng)Asc和Swa雙酶切后連入經(jīng)同樣酶切的pFGC5941M質(zhì)粒,得pFGC5941CEPE質(zhì)粒,然后將SEQIDNO.2所示的序列連入pFGC5941CEPE載體的PAtAP3啟動(dòng)子與間隔序列之間,形成中間載體pFGC5941CEPE-B2RNAia,再將SEQIDNO.2所示序列反向連入中間載體pFGC5941CEPE-B2RNAia的間隔序列與OCS終止子之間,得pFGC5941CEPE-B2RNAi載體,最后將SEQIDNO.3所示序列通過(guò)Nco和Asc酶切位點(diǎn)連入經(jīng)同樣酶切的pFGC5941CEPE-B2RNAi載體,得干擾蕓薹屬植物花瓣中β-環(huán)化酶基因LCYB、ε-環(huán)化酶基因LCYE表達(dá)同時(shí)超量表達(dá)PAP基因的植物表達(dá)載體。5.權(quán)利要求4所述植物表達(dá)載體的制備方法,其特征在于,包括如下步驟:將SEQIDNO.1所示序列經(jīng)Asc和Swa雙酶切后連入經(jīng)同樣酶切的pFGC5941M質(zhì)粒,得pFGC5941CEPE質(zhì)粒,然后將SEQIDNO.2所示的序列連入pFGC5941CEPE載體的PAtAP3啟動(dòng)子與間隔序列之間,形成中間載體pFGC5941CEPE-B2RNAia,再將SEQIDNO.2所示序列反向連入中間載體pFGC5941CEPE-B2RNAia的間隔序列與OCS終止子之間,得pFGC5941CEPE-B2RNAi載體,最后將SEQIDNO.3所示序列通過(guò)Nco和Asc酶切位點(diǎn)連入經(jīng)同樣酶切的pFGC5941CEPE-B2RNAi載體,得干擾蕓薹屬植物花瓣中β-環(huán)化酶基因LCYB、ε-環(huán)化酶基因LCYE表達(dá)同時(shí)超量表達(dá)PAP基因的植物表達(dá)載體。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法,其特征在于:所述間隔序列為甘藍(lán)型油菜PAP2基因第2內(nèi)含子。7.利用權(quán)利要求4所述植物表達(dá)載體制備花瓣呈紅色的蕓薹屬植物品種的方法,其特征在于,包括如下步驟:a.將權(quán)利要求4所述植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌,制得工程菌;b.將步驟a所得工程菌轉(zhuǎn)化蕓薹屬植物無(wú)菌苗的下胚軸,共培養(yǎng)后,在Basta除草劑抗性下誘導(dǎo)分化獲得再生苗,篩選陽(yáng)性苗轉(zhuǎn)基因苗得花瓣呈紅色的蕓薹屬植物品種。
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