本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，涉及蛋白質(zhì)的非天然氨基酸的定點(diǎn)插入及小分子藥物的定點(diǎn)偶聯(lián)方法。所述方法包括基于基因密碼子擴(kuò)展技術(shù)將非天然氨基酸定點(diǎn)引入蛋白質(zhì)，以及借助非天然氨基酸與效應(yīng)性小分子的定點(diǎn)連接。

背景技術(shù)：

下面以利妥昔單抗為例說明本發(fā)明的背景技術(shù)，但是下述內(nèi)容無論如何都不能理解為其是現(xiàn)有技術(shù)的承認(rèn)，也無論無何都不能認(rèn)為本發(fā)明的僅僅適用于利妥昔單抗。

(1)利妥昔單抗

B淋巴細(xì)胞抗原CD20分子表達(dá)于從晚期前B細(xì)胞到成熟B細(xì)胞的所有B細(xì)胞表面(Loken et al.,1987,Blood 70,1316-1324)它在90％以上的B細(xì)胞淋巴瘤中穩(wěn)定表達(dá)，所以非常適合作為靶向治療的靶點(diǎn)(McLaughlin et al.,1998,Journal of clinical oncology:official journal of the American Society of Clinical Oncology 16,2825-2833)。CD20單克隆抗體在治療B細(xì)胞淋巴瘤以及慢性淋巴細(xì)胞白血病中取得了令人滿意效果。美國(guó)IDEC針對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤制備的抗CD20單克隆抗體Rituximab(C2B8)-利妥昔單抗，即美羅華，是FDA批準(zhǔn)的第一個(gè)用于治療B細(xì)胞淋巴瘤的抗體，是第一個(gè)上市的靶向淋巴瘤和白血 病B細(xì)胞表面CD20的人鼠嵌合單克隆抗體。它是IgG1κ免疫球蛋白，輕鏈及重鏈的可變區(qū)為鼠源，恒定區(qū)部分為人源(DrugBank DB0073)。利妥昔單抗的重鏈由451個(gè)氨基酸組成，輕鏈由213個(gè)氨基酸組成，其輕鏈序列如SEQ ID NO:1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；重鏈序列如SEQ ID NO:3所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。其主要作用機(jī)制包括抗體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作用，補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作用以及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡作用。

盡管美羅華在臨床治療中已經(jīng)顯現(xiàn)出了很好的療效，但總反應(yīng)率都在50％左右，完全治愈率不超過20％，復(fù)發(fā)及耐藥現(xiàn)象常有發(fā)生(McLaughlin et al.,1998,Journal of clinical oncology:official journal of the American Society of Clinical Oncology 16,2825-2833；Coiffier et al.,2002,The New England journal of medicine 346,235-242；Maloney et al.,1997,Blood 90,2188-2195)。因此，以CD20為靶點(diǎn)，研發(fā)更有效的抗體藥物有著很大的市場(chǎng)價(jià)值。

(2)抗體偶聯(lián)藥物

放療化療作為腫瘤治療的主要手段在臨床應(yīng)用十分廣泛，其主要通過造成DNA雙鏈斷裂，抑制細(xì)胞有絲分裂，抑制DNA及相關(guān)蛋白的合成來殺滅腫瘤細(xì)胞。然而，傳統(tǒng)的放化療對(duì)正常細(xì)胞有較大殺傷作用，因此通過將同位素或者化療藥物與靶向性抗體偶聯(lián)來提高藥物療效并減少副作用的研究一直得到廣泛的關(guān)注。

抗體偶聯(lián)藥物是蛋白質(zhì)藥物中新興的一部分，也稱為免疫偶聯(lián)物。免疫偶聯(lián)藥物由具有靶向性的單抗組分與細(xì)胞殺傷組分兩部分構(gòu) 成，根據(jù)細(xì)胞殺傷組分的不同，主要分為放射免疫治療藥物(偶聯(lián)同位素)、抗體藥物偶聯(lián)物(偶聯(lián)小分子藥物)、免疫毒素(偶聯(lián)細(xì)菌毒素)和酶聯(lián)抗體的前藥治療藥物(偶聯(lián)酶)四類(Weiner et al.,2012,Cell 148,1081-1084)。將治療藥物與單抗偶聯(lián)，利用抗體的靶向性將治療藥物精確的運(yùn)送到靶細(xì)胞，可以有效的提高靶細(xì)胞局部的藥物濃度，減少藥物在體內(nèi)正常細(xì)胞分布，從而實(shí)現(xiàn)藥物高效低毒的治療效果。

以放射免疫偶聯(lián)藥物為例，其目前在臨床應(yīng)用廣泛。放射免疫顯像藥物(radioimmunoimaging，RII)利用單抗將診斷性核素運(yùn)至靶部位，通過ECT進(jìn)行斷層顯像以及計(jì)算機(jī)三維重構(gòu)，用以顯示該部位瘤體的大小，位置等；放射性免疫治療藥物(radiommunotherapy，RIT),即利用抗體作為載體，將治療性核素引導(dǎo)到腫瘤部位進(jìn)行內(nèi)照射的治療方法，在淋巴瘤方面取得突出的臨床效果。其中有兩個(gè)放射免疫治療藥物通過了FDA的藥物審批。這兩個(gè)藥物都是靶向CD20治療復(fù)發(fā)或耐藥的濾泡性淋巴瘤：一個(gè)是90Y-ibritumomab tiuxetan(Zevalin)，另一個(gè)是131I-tositumomab(Bexxar 2014年因和90Y-ibritumomab tiuxetan作用相同而撤市)。其中患者對(duì)于Zevalin的總反應(yīng)率達(dá)到了80％，完全治愈率約為30％(Goldsmith et al.,2010,Seminars in nuclear medicine 40,122-135)。

(3)抗體藥物偶聯(lián)技術(shù)

傳統(tǒng)的抗體偶聯(lián)物通常以抗體上賴氨酸側(cè)鏈的氨基，或者二硫鍵還原后的巰基為功能基團(tuán)偶聯(lián)小分子?？贵w表面有80個(gè)左右的賴氨 酸以及30個(gè)左右的半光氨酸，所以傳統(tǒng)的修飾方法是非定點(diǎn)非定量的。而抗體小分子的偶聯(lián)物缺少有效的分離手段，故傳統(tǒng)的偶聯(lián)方法并不適合大規(guī)模生產(chǎn)制備的質(zhì)量控制?？贵w表面有很多的功能區(qū)域，甚至破壞抗體的二硫鍵，隨機(jī)的偶聯(lián)可能會(huì)影響到抗體抗原的結(jié)合，降低抗體在體內(nèi)的半衰期，影響抗體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作用以及補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作用，偶聯(lián)過多的小分子還會(huì)增加抗體藥物的免疫原性。

(4)基因密碼子擴(kuò)展技術(shù)

近年來遺傳密碼擴(kuò)展技術(shù)發(fā)展迅速，利用琥珀終止密碼子為有義編碼子，通過引入相應(yīng)的正交tRNA及氨酰tRNA合成酶，最終可以將設(shè)計(jì)好的非天然氨基酸引入蛋白質(zhì)中。根據(jù)非天然氨基酸的性質(zhì)，可以賦予蛋白質(zhì)特殊的功能。到目前為止，這一技術(shù)已經(jīng)將幾十種非天然氨基酸成功地定點(diǎn)表達(dá)在蛋白質(zhì)表面，涉及的非天然氨基酸中帶有炔基和疊氮等，利用這些生物正交基團(tuán)，就可以特異性地對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定點(diǎn)修飾。

面對(duì)現(xiàn)有抗體小分子偶聯(lián)藥物不定點(diǎn)不定量修飾的問題，將基因密碼子擴(kuò)展技術(shù)應(yīng)用到現(xiàn)有的抗體偶聯(lián)物制備中，將有效的促進(jìn)抗體偶聯(lián)物的發(fā)展。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
:

發(fā)明人經(jīng)過對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的思考和研究，利用古甲烷球菌的tRNA(tRNA^Pyl)和吡咯賴氨酰-tRNA合成酶(tRNA^Pyl/PylRS)的蛋白質(zhì)翻譯系統(tǒng)使非天然氨基酸定點(diǎn)插入到蛋白表面，從而得 到定點(diǎn)突變的目的蛋白。然后將所述定點(diǎn)突變的蛋白作為可被進(jìn)一步定點(diǎn)偶聯(lián)的原料，與連接臂或效應(yīng)小分子偶聯(lián)，得到的偶聯(lián)物進(jìn)一步與效應(yīng)小分子，例如放射性核素，偶聯(lián)，進(jìn)而得到單一位點(diǎn)定點(diǎn)偶聯(lián)的產(chǎn)物，特別地，所述蛋白是利妥昔單抗。

相比于其它方法，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)可體現(xiàn)在如下的一個(gè)或幾個(gè)方面：

1.可以在蛋白質(zhì)任意位點(diǎn)引入非天然氨基酸，從而創(chuàng)造可以僅對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行特異性修飾的原料蛋白；

2.利用非天然氨基酸上特有的活性基團(tuán)，可以實(shí)現(xiàn)高效，特異性的修飾目的；

3.特定位點(diǎn)的定點(diǎn)偶聯(lián)可以帶來更好的藥效。選擇偶聯(lián)在非功能區(qū)，可以有效的減少藥物偶聯(lián)對(duì)蛋白質(zhì)活性、穩(wěn)定性、半衰期帶來的影響；選擇偶聯(lián)在非暴露區(qū)，固定小分子的修飾數(shù)量，可以降低潛在的免疫原性，減少體內(nèi)的酶解作用，從而降低偶聯(lián)物脫靶的可能；

4.通過修飾條件的優(yōu)化，利用環(huán)辛炔介導(dǎo)的無銅Click反應(yīng)，可以實(shí)現(xiàn)高效，對(duì)蛋白無害，簡(jiǎn)單易行的偶聯(lián)反應(yīng)。

具體地，在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，提供了引入非天然氨基酸的目的蛋白，例如利妥昔單抗，主要通過兩個(gè)步驟：(1)構(gòu)建含有在選定的位點(diǎn)上具有琥珀密碼子突變的編碼目的蛋白，例如利妥昔單抗基因的載體，(2)構(gòu)建并獲得pXH-N₃質(zhì)粒，將步驟(1)與(2)在合適的宿主細(xì)胞中共表達(dá)，且在培養(yǎng)基中加入非天然氨基酸，獲得引入突變的目的蛋白，例如利妥昔單抗。

該突變系統(tǒng)的原理在于：突變型的tRNA^Pyl/PylRS滿足下列關(guān)系：(1)：突變型的tRNA^Pyl不能利用宿主細(xì)胞的賴氨酰tRNA合成酶，只能被突變型的PylRS酰化；(2)：突變型的PylRS只能?；痶RNA^Pyl，不能?；渌黷RNA，因此，突變型tRNAPyl和PylRS之間的關(guān)系是正交性的，即突變型的PylRS只能?；蛔冃蛅RNA^Pyl，同時(shí)突變型的tRNA^Pyl只能被突變型的PylRS?；?，也就是說同一質(zhì)粒中的突變型的tRNA^Pyl和PylRS是絕對(duì)的相互專一的。這種正交性的酶并且是只有這種酶可以把非天然氨基酸?；竭@種正交的tRNA上，并且只能?；@種tRNA，而不能?；渌膖RNA。獲得的正交賴氨酰tRNA合酶/tRNA系統(tǒng)，使非20種常見氨基酸的Lys-azido，也可稱為：NAEK，與琥珀密碼子相對(duì)應(yīng)，從而將非天然氨基酸定點(diǎn)引入到目的蛋白，例如利妥昔單抗中。

在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，通過將帶有琥珀密碼子的利妥昔單抗基因插入到載體例如pEF-1b中，將插入后得到的載體和所述的pXH-N₃一起瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Freestyle293F細(xì)胞系，然后可通過在培養(yǎng)基中添加非天然氨基酸例如NAEK，最后從培養(yǎng)基上清液中獲得定點(diǎn)突變的目的蛋白，例如突變型利妥昔單抗。

在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中定點(diǎn)引入非天然氨基酸的突變重組蛋白或肽，如在特定位點(diǎn)引入非天然氨基酸NAEK，其特有的疊氮基團(tuán)可以特異性地和偶聯(lián)物，例如雙功能連接臂，發(fā)生Click反應(yīng)，從而將目的小分子定點(diǎn)偶聯(lián)在目的蛋白上。

在本發(fā)明的另外的實(shí)施方案中，提供了一種雙功能連接臂DIBO-DOTA。該連接臂一端帶有環(huán)辛炔(DIBO)，可供特異性識(shí)別疊氮基團(tuán)并與之偶聯(lián)；另一端帶有螯合基團(tuán)1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid(DOTA)，該基團(tuán)可以牢固螯合Y⁹⁰，Lu¹⁷⁷等金屬同位素。例如突變型利妥昔單抗及其定點(diǎn)偶聯(lián)小分子，

在本發(fā)明的另外的實(shí)施方案中，將純化的NAEK定點(diǎn)突變目的蛋白或肽，例如利妥昔單抗與DIBO-DOTA進(jìn)行無銅催化的Click反應(yīng)，使得DIBO-DOTA通過利妥昔單抗上的含有疊氮基團(tuán)的非天然氨基酸而實(shí)行定點(diǎn)且定量的偶聯(lián)，由于反應(yīng)的高效性，經(jīng)過簡(jiǎn)單的除鹽操作即可得到定點(diǎn)定量偶聯(lián)小分子，例如DIBO-DOTA的目的蛋白或肽。經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)初步證明，經(jīng)非天然氨基酸替換以及定點(diǎn)偶聯(lián)小分子的利妥昔單抗仍然具有生物學(xué)活性。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將偶聯(lián)有連接臂DIBO-DOTA的目的蛋白或肽，例如利妥昔單抗，與放射性同位素反應(yīng)，進(jìn)而將放射性同位素定點(diǎn)定量的偶聯(lián)到目的蛋白或肽中，例如利妥昔單抗。所得到的定點(diǎn)偶聯(lián)有放射性同位素的抗體，可以更有效的進(jìn)行放射性顯像，放射性靶向治療等。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明選取了哺乳動(dòng)物細(xì)胞懸浮表達(dá)體系，該體系所用細(xì)胞經(jīng)過懸浮馴化，既可以瞬時(shí)大量表達(dá)目的蛋白，又可通過構(gòu)建穩(wěn)定系，進(jìn)行大規(guī)模的發(fā)酵培養(yǎng)。

更為具體地，本發(fā)明提供了：

1.突變的多肽，其至少1個(gè)位點(diǎn)上的氨基酸被突變?yōu)榉翘烊话被?，所述非天然氨基酸為?/p>

所示的Lys-azido(NAEK)，或其它含有疊氮結(jié)構(gòu)的非天然氨基酸。

2.如項(xiàng)1所述的突變的多肽，所述多肽是利妥昔單抗。

3.如項(xiàng)2所述的突變的多肽，所述突變位于SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO:4中的任意的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)。

4.如項(xiàng)3所述的突變的多肽，所述突變位點(diǎn)選自：示于SEQ ID NO:2第K168位，SEQ ID NO：4的第A122位，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO：4上對(duì)其他對(duì)活性影響較小的位點(diǎn)中的一個(gè)或多個(gè)。

5.如項(xiàng)1所述的突變的多肽，其突變氨基酸是第N位氨基酸，所述突變氨基酸在所述多肽中的連接方式如下式所示：

其中，由R₁到R₂的方向?yàn)榘被嵝蛄械腘末端到C末端方向，R₁為多肽中的第1至第N-1位氨基酸殘基，

R₂為多肽中的第N+1位至C末端的氨基酸殘基，R₄為

6.如項(xiàng)5所述的突變的多肽，所述突變的多肽是突變的利妥昔單抗。

7.如項(xiàng)6所述的突變的多肽，所述第N位氨基酸是SEQ ID NO：2或SEQ ID NO:4中任意一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上的氨基酸。

8.如項(xiàng)7所述的突變的多肽，所述突變位點(diǎn)選自：示于SEQ ID NO:2第K168位，SEQ ID NO：4的第A122位，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO：4上其他對(duì)活性影響較小的位點(diǎn)中的一個(gè)或多個(gè)。

9.如項(xiàng)1所述的突變的多肽，其包含可供偶聯(lián)疊氮及金屬同位素的雙功能連接臂，所述連接臂一端含有環(huán)辛炔(DIBO)基團(tuán)，另一端含有DOTA，所述雙功能連接臂結(jié)構(gòu)如下式所示：

10.如項(xiàng)9所述的突變的多肽，其中所述的突變的多肽是突變的利妥昔單抗。

11.前述任一項(xiàng)中的突變的多肽，其重鏈氨基酸序列是SEQ ID NO:10。

12.前述任一項(xiàng)中的突變的多肽，其輕鏈氨基酸序列是SEQ ID NO:8。

13.經(jīng)過定點(diǎn)偶聯(lián)后的如項(xiàng)1所述的突變的多肽，其結(jié)構(gòu)如下式所示：

其中，其中第N個(gè)氨基酸發(fā)生突變，R1為第1至第N-1位氨基酸殘基，R2為第N+1位至C末端的氨基酸殘基，R3為DOTA或其他直接或間接提供功能的小分子。

14.如項(xiàng)13所述的經(jīng)過定點(diǎn)偶聯(lián)后的突變的多肽，其中突變前的多肽包含氨基酸序列為SEQ ID NO：2的重鏈和/或序列為SEQ ID NO:4的輕鏈。

15.如項(xiàng)14所述的經(jīng)過定點(diǎn)偶聯(lián)后的突變的多肽，其中的R₃為DOTA，其螯合放射性同位素。

16.如項(xiàng)15所述的經(jīng)過定點(diǎn)偶聯(lián)后的突變的多肽，所述放射性同位素選自Lu¹⁷⁷，Cu⁶⁴或Y⁹⁰。

17.如項(xiàng)13-16中任一項(xiàng)所述的經(jīng)過定點(diǎn)偶聯(lián)后的突變的多肽，所述偶聯(lián)物中的R₃選自阿霉素(doxorubicin)、一甲基澳瑞他汀(Monomethyl auristatin E，MMAE)。

18.編碼項(xiàng)1-12中的突變的多肽的核酸分子。

19.包含項(xiàng)18所述的核酸分子的載體。

20.一種載體，其是pXH-N3。

21.一種藥物組合物，其含有有效量的項(xiàng)1-12中任一項(xiàng)的所述的突變的多肽，或者項(xiàng)13-17所述的經(jīng)過定點(diǎn)偶聯(lián)后的突變的多肽。

22.如項(xiàng)21所述的藥物組合物，在制備用于放射性顯像、治療頑固性惡性腫瘤或腫瘤復(fù)發(fā)的藥物中的用途。

23.一種微生物，其含有項(xiàng)19或20的載體。

24.如項(xiàng)23所述的微生物，其是大腸桿菌。

25.一種動(dòng)物細(xì)胞，其含有項(xiàng)19或20的載體。

26.如項(xiàng)25所述的動(dòng)物細(xì)胞，其是Freestyle293細(xì)胞系。

附圖說明：

圖1：美羅華的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)及活性驗(yàn)證

A：Western Blot驗(yàn)證抗體表達(dá)：第一道為空載體轉(zhuǎn)化對(duì)照，第二道為插入美羅華基因的載體表達(dá)。圖示抗體成功進(jìn)行了表達(dá)；

B：不同表達(dá)載體對(duì)表達(dá)量的影響：從左至右分別為pcDNA3.1,pEF-1b，pBudce4.1；圖示pEF-1b載體最有利于抗體的表達(dá)；

C：熒光共聚焦驗(yàn)證表達(dá)抗體活性：從左至右，抗體分別作用Jurket，Raji，Ramos RA1細(xì)胞，其中Jurkat細(xì)胞為CD20陰性細(xì)胞，作為陰性對(duì)照，Raji和Ramos RA1細(xì)胞為CD20陽性細(xì)胞；

D：流式細(xì)胞術(shù)分析驗(yàn)證表達(dá)抗體活性：M1區(qū)域內(nèi)為CD20 陰性細(xì)胞Jurket的抗體結(jié)合響應(yīng)值，M2區(qū)域內(nèi)為CD20陽性細(xì)胞Raji和Ramos RA細(xì)胞的抗體結(jié)合相應(yīng)值；

圖2：pXH-N₃載體的優(yōu)化及構(gòu)建

A：pXH-N₃載體示意圖；

B：Western Blot驗(yàn)證各類型啟動(dòng)子啟動(dòng)tRNA對(duì)非天然氨基酸插入效率的影響，從左至右啟動(dòng)子名稱分別為：U1,mu6，H1，hu6,7sk；圖示7sk啟動(dòng)子相對(duì)其余啟動(dòng)子非天然氨基插入型蛋白表達(dá)效率最高；

C：細(xì)胞水平上，綠色熒光蛋白驗(yàn)證各啟動(dòng)子非天然氨基酸插入效率；與圖2B結(jié)果相符合；

D：不同啟動(dòng)子對(duì)終止密碼子TAG通讀效率影響，從左至右分別為U1,mu6，H1，hu6,7sk啟動(dòng)子，通讀效率高等價(jià)于非天然氨基酸插入效率的高效；

E：7sk啟動(dòng)子串聯(lián)不同個(gè)數(shù)tRNA對(duì)終止密碼子TAG通讀效率的影響，從左至右分別為1、2、3、4以及5個(gè)7sk-tRNA串聯(lián)單位，由圖可知在7sk啟動(dòng)子下，串聯(lián)4個(gè)tRNA的非天然氨基酸插入效率最高；

圖3：突變型美羅華的表達(dá)

A.美羅華可變區(qū)與CD20結(jié)合短肽晶體結(jié)構(gòu)示意圖(Ding Jianping et al.J.Biol.Chem.2007,282:15073-15080)；由圖所示，選擇有一定表面暴露程度，以及不影響與受體結(jié)合的三個(gè)位點(diǎn)LC-P15，LC-K168以及HC-A122作為潛在的非天然氨基酸插入位點(diǎn)；

B.Western Blot驗(yàn)證突變型蛋白表達(dá)，從左至右分別為WT美羅華(無非天然氨基酸插入型美羅華)；LC-P15位點(diǎn)突變美羅華不加非天然氨基酸(UAA)，加UAA；HC-A122位點(diǎn)突變美羅華不加UAA，加UAA；LC-K168位點(diǎn)突變美羅華不加UAA，加UAA；由圖可知HC-A122以及LC-K168位點(diǎn)成功插入非天然氨基酸；

圖4：突變型美羅華表達(dá)的條件優(yōu)化

A.不同細(xì)胞系對(duì)及轉(zhuǎn)染試劑對(duì)表達(dá)條件的影響：從左至右分 別為Freestyle293細(xì)胞系25kDa直鏈PEI轉(zhuǎn)染，F(xiàn)reestyle293細(xì)胞系40kDa分枝鏈PEI轉(zhuǎn)染，F(xiàn)reestyle CHO細(xì)胞系25kDa直鏈PEI轉(zhuǎn)染，F(xiàn)reestyle CHO細(xì)胞系40kDa分枝鏈PEI轉(zhuǎn)染；由圖可見瞬轉(zhuǎn)情況下293細(xì)胞系較CHO細(xì)胞系表達(dá)量有顯著提高，而40kDa分枝鏈PEI較25kDa直鏈PEI有更好的表達(dá)效果；

B.轉(zhuǎn)染DNA總量與PEI比例(質(zhì)量比)對(duì)轉(zhuǎn)染效率影響，由圖可見DNA:PEI＝1:4時(shí)，表達(dá)效率較高；

C.固定DNA總量，在HC-A122突變型蛋白的表達(dá)過程中，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒輕鏈，重鏈以及pXH-N₃的比例對(duì)表達(dá)效率的影響；

D：添加劑(VPA以及NaBut)添加與否以及表達(dá)時(shí)間對(duì)表達(dá)效率的影響；

圖5：突變型美羅華定點(diǎn)偶聯(lián)DIBO-DOTA

A.完整抗體定點(diǎn)定量偶聯(lián)2個(gè)DIBO-DOTA的ESI-MS圖譜；

B.還原處理抗體樣品后，定點(diǎn)定量在重鏈偶聯(lián)1個(gè)DIBO-DOTA的ESI-MS圖譜；

C.完整抗體非定點(diǎn)偶聯(lián)DOTA-SCN的ESI-MS圖譜；

D.還原處理抗體樣品后，非定點(diǎn)、非定量在輕鏈和/或重鏈偶聯(lián)1個(gè)或數(shù)個(gè)DOTA-SCN的ESI-MS圖譜；

圖6：定點(diǎn)偶聯(lián)DIBO-DOTA美羅華定點(diǎn)標(biāo)記放射性同位素

A：紙薄層層析檢驗(yàn)野生型美羅華(RTX-WT)非定點(diǎn)偶聯(lián)Cu⁶⁴產(chǎn)率，左：過PD-10柱前；右：過PD-10柱除剩余小分子后；

B：紙薄層層析檢驗(yàn)重鏈A122位突變型美羅華(RTX-122)定點(diǎn)偶聯(lián)Cu⁶⁴產(chǎn)率，左：過PD-10柱前；右：過PD-10柱除剩余小分子后；圖示中，通過PD-10柱處理，得到了較純凈(>98％)的放射性免疫偶聯(lián)物；

C：放射性自顯影確認(rèn)放射性同位素的定點(diǎn)偶聯(lián)，左圖為考馬斯亮藍(lán)染色，右圖為放射性伽馬射線自顯影，兩圖對(duì)應(yīng)位置從左至右依次為RTX-WT-DTT,RTX-WT+DTT,RTX-122-DTT,RTX-122+DTT，(DTT 為二硫蘇糖醇，為蛋白還原劑)；圖示表明，兩樣品均成功偶聯(lián)放射性同位素Cu⁶⁴，RTX-WT樣品為非定點(diǎn)偶聯(lián)，其在重鏈及輕鏈位置均有放射性射線顯影，而RTX-122為定點(diǎn)偶聯(lián)，突變及偶聯(lián)位點(diǎn)在重鏈A122位置，故僅有重鏈有放射性射線顯影；

圖7：定點(diǎn)標(biāo)記⁶⁴Cu抗體的Micro-PET顯像

美羅華定點(diǎn)偶聯(lián)Cu⁶⁴荷瘤小鼠的Micro-PET成像結(jié)果：

A：18小時(shí)Micro-PET成像結(jié)果，左為注射500uCi RTX-122-Cu⁶⁴荷瘤小鼠，右圖為注射500uCi RTX-122-Cu⁶⁴以及4倍劑量冷抗體(未偶聯(lián)放射性同位素)作為封閉的荷瘤小鼠；

B：60小時(shí)Micro-PET成像結(jié)果；

圖示表明隨時(shí)間延長(zhǎng)，放射性免疫物保留了腫瘤的靶向性，較高水平的富集到腫瘤部位。

為了更好地理解本發(fā)明，發(fā)明人用實(shí)施例對(duì)具體試驗(yàn)進(jìn)行闡述和說明，其中所述實(shí)施例僅用于說明，并不限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。任何與本發(fā)明等價(jià)的變體或者實(shí)施方案都包括在本發(fā)明中。

實(shí)施例1：包含定點(diǎn)突變的美羅華的基因載體的構(gòu)建

(1)輔助質(zhì)粒的構(gòu)建及獲得

通過條件的優(yōu)化及嘗試，確定4個(gè)tRNA由7sk啟動(dòng)子(其序列如SEQ ID NO:6所示)串聯(lián)表達(dá)為最優(yōu)，構(gòu)建并獲得pXH-N₃輔助載體：該載體以pUC19為模板，通過利用BamHI酶切位點(diǎn)，引入4個(gè)串聯(lián)的7sk啟動(dòng)子及tRNA；再引入CMV強(qiáng)啟動(dòng)子控制下的tRNA合成酶及其poly A終止信號(hào)；利用EcorI酶切位點(diǎn)，引入真核復(fù)制原件f1 ori及SV40；該質(zhì)粒可以表達(dá)特異識(shí)別非天然氨基酸NAEK的tRNA和tRNA合成酶。

(2)含美羅華的質(zhì)粒的獲得

經(jīng)全基因合成，獲得美羅華的基因(SEQ ID NO：1和3)。然后將其連接在pEF-1b(Life Technologies)真核表達(dá)載體中，獲得野生型美羅華的表達(dá)質(zhì)粒(pEF-RTX-HC-WT和 pEF-RTX-LC-WT，其分別表達(dá)美羅華的重鏈及輕鏈部分)。

(3)定點(diǎn)突變位點(diǎn)的選擇

根據(jù)美羅華的晶體結(jié)構(gòu),美羅華與其受體的結(jié)合位點(diǎn),并綜合考慮抗原表位,酶解位點(diǎn)等信息[Ding Jianping et al.J.Biol.Chem.2007,282:15073-15080]，選取了幾個(gè)適合位點(diǎn)進(jìn)行修飾,其主要基于以下因素:1.氨基酸暴露于蛋白表面以方便偶聯(lián)；2.不影響抗體與受體的正常結(jié)合；3.不影響抗體本身的性質(zhì)，例如穩(wěn)定性等；

通過更詳細(xì)的文獻(xiàn)資料查閱[Sondermann et al.Nature,2000,406:267-273；Mulkerrin et al.J.Immunol.2000,164:4178-4184；Sun et al.J.Biol.Chem.2001,276:16469-16477],發(fā)明人選取重鏈的A122位(HC-A122)，輕鏈的K168(LC-K168)位，P15(LC-P15)為特定位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變,以此突變型美羅華為原料并對(duì)其進(jìn)行定點(diǎn)小分子的偶聯(lián)。

(4)定點(diǎn)突變的引物設(shè)計(jì)以及突變載體構(gòu)建

針對(duì)美羅華重鏈的第A122位，輕鏈的K168位和P15位，設(shè)計(jì)能夠使編碼所述氨基酸的密碼子突變?yōu)殓昝艽a子的引物，具體引物如下表所示。

表1：突變引物列表

利用定點(diǎn)突變?cè)噭┖? Lightning Site-Directed Mutagenesis Kits，Catalog #210518)，按說明書操作以上述步驟(2) 中獲得的野生型美羅華表達(dá)載體pEF-RTX-HC-WT和pEF-RTX-LC-WT為模板將美羅華重鏈的第A122位，輕鏈的第K168位和第P15位這幾個(gè)位點(diǎn)的氨基酸密碼子突變?yōu)殓杲K止密碼子，構(gòu)建得到表達(dá)質(zhì)粒(pEF-RTX-HC122、pEF-RTX-LC168、pEF-RTX-LC15),經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證突變成功。

實(shí)施例2：定點(diǎn)突變的美羅華的表達(dá)和純化

本發(fā)明中構(gòu)建pXH-N₃質(zhì)粒中含有源自古甲烷球菌的tRNA(tRNA^Pyl)和吡咯賴氨酰-tRNA合成酶(pheRS)，在表達(dá)細(xì)胞中，以琥珀終止密碼子(TAG)為有義編碼子，能夠使非天然氨基酸NAEK摻入到蛋白中，從而造成美羅華的定點(diǎn)突變。下面，發(fā)明人對(duì)NAEK的摻入可能性和突變蛋白質(zhì)的生產(chǎn)性能進(jìn)行了檢測(cè)。

1：非天然氨基酸NAEK的合成和鑒定

非天然氨基酸Lys-azido的化學(xué)合成反應(yīng)式如下

如上式所述，將原料1(2-溴乙醇)2.3mL溶于90mL丙酮以及15mL水的混合溶液，加入NaN33.12g，60℃油浴加熱回流反應(yīng)20h。冷卻至室溫，旋蒸除去丙酮，無水乙醚萃取(30mL×8)，無水Na2SO4干燥，旋蒸除去溶劑得2.62g無色液體產(chǎn)物2。

將產(chǎn)物2(500mg，5.74mmol)加入到三光氣(1.70g，5.74mmol)的THF(10ml)溶液中。0℃攪拌反應(yīng)8h，溶劑蒸干。剩余物在真空下干燥1h，得到無色油狀產(chǎn)物3。

將3溶解在1.5ml的THF中并緩慢加入Boc-Lys-OH(1.7g，6.88mmol)的1M NaOH(20ml)/THF(5ml)的溶液中。0℃攪拌反 應(yīng)12h并逐漸升溫到室溫。重新將反應(yīng)液冷卻到0℃并用0℃的1M的鹽酸溶液將反應(yīng)液pH值調(diào)整至2～3。反應(yīng)液用EtOAc萃取(30mL×5)，有機(jī)層用2×100ml的飽和食鹽水洗滌。無水Na2SO4干燥有機(jī)層、過濾、旋蒸除去溶劑得到1.65g無色粘稠液體產(chǎn)物4不用進(jìn)一步純化。

將4溶于15mL CH2Cl2中，攪拌下緩慢滴加15mL TFA，室溫下反應(yīng)30min后蒸出溶劑，剩余液體產(chǎn)物用5mL甲醇溶解，加入100mL乙醚，析出大量白色固體沉淀，過濾干燥得到1.38g白色固體終產(chǎn)物5。1H NMR(D2O):δ＝1.22-1.45(m,4H),1.67-1.73(m,2H),2.99(m,2H),3.38(m,2H),3.70(m,1H),4.09(m,2H).13C NMR(D2O):δ＝21.4,28.4,29.6,39.5,53.4,56.2,57.8,116.0(TFA),153.1,162.3(TFA),172.9.HRMS:m/z calcd for C9H17N5O4[M]+:259.1281；found:259.1283，證明得到的Lys-azido結(jié)構(gòu)正確。2：pXH-N₃的構(gòu)建

通過文獻(xiàn)資料的調(diào)研，tRNA^Pyl的高效表達(dá)是非天然氨基酸有效插入的關(guān)鍵因素之一，而過高的表達(dá)量又會(huì)對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒效應(yīng)，因此合理的優(yōu)化tRNA^Pyl表達(dá)，可以有助于突變型蛋白的大量表達(dá)。

(1)首先固定tRNA的個(gè)數(shù)(1個(gè))，通過更換嘗試不同的啟動(dòng)子，包括U1、mu6、H1、hu6以及7sk啟動(dòng)子，以第39位氨基酸為非天然氨基酸的綠色熒光蛋白(GFP39TAG)為報(bào)告蛋白，驗(yàn)證不同啟動(dòng)子對(duì)非天然氨基酸插入效率的影響，如圖2-B,C所示；結(jié)果表明7sk(SEQ ID NO:6)啟動(dòng)子在選擇的啟動(dòng)子中，能夠最有效的插入非天然氨基酸；

(2)固定啟動(dòng)子為7sk啟動(dòng)子，通過改變tRNA串聯(lián)個(gè)數(shù)，包括1、2、3、4和5個(gè)，以螢火蟲熒光素酶為報(bào)告基因，海腎熒光素酶為參比基因，兩基因間包含有含有TAG終止密碼子的連接臂，通過TAG通讀效率來檢測(cè)不同tRNA串聯(lián)個(gè)數(shù)對(duì)非天然氨基酸插入效率的影響，如圖2-E所示；圖示表明當(dāng)串聯(lián)4個(gè)tRNA的時(shí)候， 非天然氨基酸的插入效率較最高；

(3)通過將tRNA合成酶pheRS，4個(gè)啟動(dòng)子7sk-tRNA^pyl通過基因亞克隆方法克隆進(jìn)同一載體pUC19(利用BamHI酶切位點(diǎn))如圖2-A所示，構(gòu)建成輔助載體pXH-N₃，其序列如SEQ ID NO:5所示。

3：突變美羅華的NAEK摻入表達(dá)及純化

(1)以表達(dá)重鏈A122位置的突變型(RTX-H122)為例：將實(shí)施例1的步驟2和4獲得的pEF-RTX-LC-WT(其表達(dá)美羅華抗體的輕鏈氨基酸)以及pEF-RTX-HC122(其表達(dá)美羅華抗體的重鏈氨基酸，并在第122號(hào)位點(diǎn)含有點(diǎn)突變),以及實(shí)施例2的步驟3的pXH-N₃以一定比例混合，再與轉(zhuǎn)染試劑PEI按一定比例混合，共同加入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，同時(shí)加入NAEK至終濃度1mM，100rpm，37℃，8％CO₂表達(dá)若干天后收集培養(yǎng)上清；

(2)隨后對(duì)表達(dá)細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染試劑，各載體比例，載體與轉(zhuǎn)染試劑比例，添加劑種類等對(duì)突變型表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，如圖4所示，最終確定表達(dá)條件為Freestyle293細(xì)胞系，40kDa枝鏈PEI轉(zhuǎn)染，載體與PEI比例為1:4(質(zhì)量比)，三種載體比例pEF-RTX-LC-WT:pEF-RTX-HC122:pXH-N₃＝1:1:3,添加VPA，表達(dá)7天；

(3)將收集的培養(yǎng)上清9000rpm，4℃高速離心10min，除細(xì)胞及細(xì)胞碎片，經(jīng)過中空纖維過濾系統(tǒng)進(jìn)行微濾及超濾進(jìn)一步處理濃縮(40倍以上)，并進(jìn)行Ni-NTA-Bind緩沖液的交換，再次離心去除細(xì)胞碎片，經(jīng)過Ni-NTA金屬螯合親和層析，用Ni-NTA-Wash緩沖液充分洗滌，最后用Ni-NTA-Elute緩沖液洗脫，得到初步純化的美羅華樣品，純度約為95％。將初步純化后的蛋白樣品經(jīng)過4-5次超濾換液，換至小分子偶聯(lián)緩沖液中(20mM Tris-HCl pH＝8.0,200mM NaCl,經(jīng)Chelex100 5×20cm處理三遍，徹底清洗殘余金屬離子)。

4：突變美羅華的鑒定

(1)設(shè)計(jì)對(duì)照組，將未加NAEK的表達(dá)細(xì)胞作為對(duì)照，做相同轉(zhuǎn) 染處理；

(2)收集培養(yǎng)上清，直接加入SDS-PAGE上樣緩沖液煮樣處理，并做SDS-PAGE電泳及Western Blot分析，對(duì)比目的位置蛋白質(zhì)條帶，可明顯觀察到加入NAEK組表達(dá)出全長(zhǎng)美羅華，如圖3所示。

實(shí)施例3：突變體與雙功能連接臂(DIBO-DOTA)的定點(diǎn)偶聯(lián)

1：雙功能連接臂DIBO-DOTA的合成和鑒定：

將化合物1(2.88g,14.0mmol)溶于20mL無水CH2Cl2中，N2保護(hù)，緩慢加入BF3·OEt2(2.59mL,21.0mmol)，之后將體系移至-10℃冷井中，攪拌下緩慢滴加三甲基硅烷化重氮甲烷(2.0mol/Lin hexanes)的CH2Cl2溶液(10.5mL三甲基硅烷化重氮甲烷溶于20mL無水CH2Cl2)，1小時(shí)滴加完畢。-10℃下繼續(xù)反應(yīng)2-4小時(shí)后，將反應(yīng)液傾入50mL冰水中淬滅反應(yīng)，分離出有機(jī)相，水相用CH2Cl2萃取(2×50mL)。有機(jī)相合并后用飽和食鹽水洗滌(2×40mL)，無水硫酸鈉干燥后過濾濃縮，硅膠柱分離(石油醚:CH2Cl2,v/v,2/1)得到淡黃色產(chǎn)物2(2.22g,72％).1H NMR(300MHz,CDCl3):δ8.26(1H,q,J＝1.4,6.6Hz),7.13-7.43(7H,m),7.05(2H,q,J＝3.8,12.9Hz),4.06(2H,s).13C NMR(75MHz,CDCl3):δ 196.6,136.9,136.3,135.4,133.8,133.1,132.4,131.4,130.6,129.3,128.8,128.0,127.3,126.9,48.4.MALDI HRMS:m/z 243.0767[M+Na+].Calcd for C16H12NaO+:243.0780.

將化合物2(2.20g,10mmol)溶于EtOH和THF的混合溶劑中(1/1,v/v,80mL)，攪拌下緩慢加入硼氫化鈉(0.76g,20mmol)，室溫反應(yīng)隔夜。TLC檢測(cè)反應(yīng)完全后，向體系中緩慢滴加1mL醋酸淬滅反應(yīng)。旋蒸除去溶劑后加入80mL CH2Cl2混懸，飽和食鹽水洗滌(3×80mL)，無水硫酸鈉干燥后過濾濃縮，硅膠柱分離(石油醚:乙酸乙酯,v/v,8/1；梯度洗脫效果不好)得到白色固體產(chǎn)物3(2.00g,91％).1H NMR(300MHz,CDCl3):δ7.50(1H,m),7.14-7.30(7H,m),6.90(2H,q,J＝2.7,12.0Hz),5.31(1H,q,J＝6.3,10.0Hz),3.41(2H,m).13C NMR(75MHz,CDCl3):δ141.7,136.7,136.2,134.5,131.7,131.5,130.1,129.9,129.3,128.7,127.4,127.2,126.9,125.9,74.4,42.7.MALDI HRMS:m/z 245.0949[M+Na+].Calcd for C16H14NaO+:245.0937.

將化合物3(1.11g,5mmol)溶于25mL CHCl3中，攪拌下緩慢滴加溴素(0.26mL,5mmol)。室溫下反應(yīng)0.5h，TLC檢測(cè)原料反應(yīng)完全后，旋蒸除去溶劑，硅膠柱分離(石油醚：CH2Cl2,v/v,2/1，或者梯度洗脫)得到黃色粘稠液體產(chǎn)物4(1.11g，58％)。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ7.54-7.47(2H,aromatics),7.31-6.72(6H,aromatics),5.77(1H,d,J＝5.4Hz,CHBr),5.22(1H,dd,J＝3.6,15.9Hz,CHOH),5.19(1H,d,J＝5.4Hz,CHBr),3.50(1H,dd,J＝3.6,15.9Hz,CH2),2.75(1H,dd,J＝3.6,15.9Hz,CH2).13C NMR(75MHz,CDCl3):δ141.3,140.0,137.2,134.0,133.4,131.5,131.3,130.9,127.8,126.2,123.7,121.3,76.5,70.0,62.3,32.2.MALDI HRMS:m/z402.9313[M+Na+].Calcd for C16H14Br2NaO+:402.9304.

將化合物4(0.77g,2mmol)溶于20mL干燥的THF中，N2保護(hù)，攪拌下緩慢滴加2.0M LDA的THF溶液(4mL,8mmol)。室溫反應(yīng)0.5h，向反應(yīng)體系中緩慢滴加0.5mL蒸餾水淬滅反應(yīng)。旋 蒸除去溶劑，用80mlDCM溶解，用飽和食鹽水洗滌兩次，油相干燥拌樣，硅膠柱分離(石油醚:乙酸乙酯,v/v,8/1，或者梯度洗脫)得到白色固體產(chǎn)物5(0.25g,57％)。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ7.67(1H,aromatics),7.37-7.18(7H,aromatics),4.57(1H,dd,J＝2.1,14.7Hz,CHOH),3.04(1H,dd,J＝2.1,14.7Hz,CH2),2.86(1H,dd,J＝2.1,14.7Hz,CH2).13C NMR(75MHz,CDCl3):δ154.5,150.6,128.6,127.1,1127.0,126.0,125.8,125.1,124.7,123.0,122.7,121.7,111.9,109.6,74.2,47.7

將化合物5(0.22g,1mmol)溶于30mLCH2Cl2中，加入0.4mL吡啶及對(duì)硝基氯甲酸苯酯(0.4g,2mmol)。室溫下反應(yīng)過夜，TLC檢測(cè)原料5反應(yīng)完全后，反應(yīng)液用飽和食鹽水洗滌(2×40mL)，無水硫酸鈉干燥后過濾濃縮，硅膠柱分離(石油醚：CH2Cl2,v/v,2/1)得到白色固體產(chǎn)物6(0.34g,72％)。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ8.23-8.18(2H,aromatics),7.56-7.54(2H,aromatics),7.46-7.18(8H,aromatics),5.52(1H,dd,J＝3.9,15.3Hz,CHOH),3.26(1H,dd,J＝3.9,15.3Hz,CH2),2.97(1H,dd,J＝3.9,15.3Hz,CH2)；13C NMR(75MHz,CDCl3):δ154.5,150.7,149.1,148.7,129.0,127.4,127.3,126.7,126.5,125.5,125.2,124.3,124.0,122.6,122.4,120.8,120.6,120.2,112.2,108.5,80.6,44.8；MALDI HRMS:m/z 408.0852[M+Na+].Calcd for C23H15NNaO5+:408.0842.

將乙二胺(30mg,0.5mmol)溶于10mL(無水)CH2Cl2中，加入300μL三乙胺，N2保護(hù)，攪拌下加入化合物6(38mg,0.1mmol)。用二氯甲烷甲醇體系沖柱(30:1-5:1)。得到化合物7.1HNMR(300MHz,CDCl3):δ7.51-7.50(2H,aromatics),7.35-7.28(6H,aromatics),5.50(1H,s,CHOH),3.26-3.15(3H),2.93-2.85(3H)；13CNMR(75MHz,CDCl3):δ155.6,152.0,150.9,129.8,127.9,127.8,126.9,126.1,125.8,123.7,123.6,121.2,112.8,109.9,46.1,43.6,41.5.

2：NAEK定點(diǎn)突變蛋白的雙功能連接臂定點(diǎn)定量偶聯(lián)(見圖5)

含有NAEK的定點(diǎn)突變蛋白，借助NAEK上的疊氮基團(tuán)，與DIBO-DOTA(含有環(huán)辛炔結(jié)構(gòu)的化合物)通過環(huán)辛炔的環(huán)張力實(shí)現(xiàn)無銅催化的Click連接反應(yīng)。無銅催化連接反應(yīng)體系如下：

RTX-122-NAEK(其是實(shí)施例2制備的) 1ug/ul

DIBO-DOTA 1mM

反應(yīng)條件：4℃，垂直混懸12小時(shí)。

結(jié)果驗(yàn)證雙功能連接臂DIBO-DOTA定點(diǎn)定量的偶聯(lián)到美羅華上(見圖5-A,B)，經(jīng)過上述反應(yīng)條件能夠在12小時(shí)內(nèi)將95％以上的美羅華定點(diǎn)偶聯(lián)雙功能連接臂，反應(yīng)后的復(fù)合物經(jīng)過超濾除鹽，溶液交換至同位素偶聯(lián)緩沖液中(20mM乙酸銨-乙酸pH＝5.5，Chelex100處理3遍)，得到的連接產(chǎn)物可用作定點(diǎn)標(biāo)記同位素用。

實(shí)施例4：突變體放射性同位素的定點(diǎn)偶聯(lián)及鑒定

正電子成像術(shù)(Positron emission tomography,PET)已經(jīng)越來越成為腫瘤治療中的關(guān)鍵性技術(shù)，而Cu⁶⁴由于其半衰期短(～12小時(shí))，對(duì)人體危害小，其與DOTA較易形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，因此適合研究進(jìn)行PET的現(xiàn)象治療；而Lu¹⁷⁷由于其半衰期適中(～6天)，主要釋放beta射線，輻射半徑短，從而較適宜進(jìn)行治療性放射免疫偶聯(lián)物的研發(fā)。

1：美羅華-Cu⁶⁴的定點(diǎn)偶聯(lián)：

雙功能連接臂(DIBO-DOTA)的一端DIBO通過八元環(huán)辛炔與突變型抗體的疊氮基團(tuán)進(jìn)行無銅Click反應(yīng)，另一端DOTA通過螯合作用與放射性金屬同位素反應(yīng)。放射性同位素Cu⁶⁴由北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科生產(chǎn)制備，美羅華-Cu⁶⁴連接反應(yīng)體系如下：

RTX-122-DIBO-DOTA 100ug(1mg/ml)

Cu⁶⁴ 2mCi

反應(yīng)條件：42℃靜置1小時(shí)。

結(jié)果依次進(jìn)行Radio-TLC，以及SDS-PAGE分析(如圖6-A、 B、C所示)，確認(rèn)同位素進(jìn)行偶聯(lián)后，經(jīng)過PD-10柱簡(jiǎn)單除鹽，能夠獲得放免純度>98％的放射免疫偶聯(lián)物；

2：荷瘤小鼠的美羅華-Cu⁶⁴的Micro-PET成像

將CD20表達(dá)陽性細(xì)胞Ramos A1細(xì)胞以1×10⁷/只右側(cè)腋下注射嚴(yán)重免疫缺陷(Severe Combined Immune-deficiency，SCID)小鼠，約兩周后，尾靜脈注射300-350uCi美羅華-Cu⁶⁴偶聯(lián)物，另作封閉組，同時(shí)注射500ug未偶聯(lián)放射性物質(zhì)美羅華作為封閉劑。于注射后18小時(shí)，60小時(shí)，以1.5％異氟烷麻醉小鼠，進(jìn)行Micro-PET顯像，如圖7所示。

由顯像結(jié)果可見，隨時(shí)間推移，放射性物質(zhì)明顯富集于腫瘤部位，PET可見到清晰的瘤體圖像。

雖然用上述實(shí)施方式描述了本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解的是，在不背離本發(fā)明的精神的前提下，本發(fā)明可進(jìn)行進(jìn)一步的修飾和變動(dòng)，且這些修飾和變動(dòng)均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。例如，本申請(qǐng)雖然以美羅華偶聯(lián)Cu⁶⁴為例進(jìn)行了說明，但是很顯然，本發(fā)明不應(yīng)當(dāng)僅僅限于美羅華偶聯(lián)Cu⁶⁴，本領(lǐng)域技術(shù)人可將本發(fā)明適用于任何目的蛋白偶聯(lián)任何小分子。