本發(fā)明屬于新藥設(shè)計(jì)及合成領(lǐng)域，具體地，涉及芳氧苯酸類衍生物、其制備方法及將其作為FXR拮抗劑的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：心腦血管疾病是當(dāng)前危害人類生命和健康最嚴(yán)重的病癥，為中老年人的常見病和多發(fā)病，在許多國家是發(fā)病率和死亡率的首位。動脈粥樣硬化是許多心腦血管疾病的基礎(chǔ)，大量的實(shí)驗(yàn)和臨床資料證明動脈粥樣硬化和血脂代謝的異常密切相關(guān)。因此，血脂調(diào)節(jié)成為當(dāng)前該類新藥研究的重要領(lǐng)域。通過前瞻性、隨即和對照的臨床研究，已經(jīng)證明一些他汀類藥物可以減少動脈粥樣硬化和冠心病的發(fā)生，降低了冠心病所致的死亡率，降低了心肌梗死的發(fā)生率。進(jìn)一步研究還證明降脂藥物的治療可以減少粥樣硬化斑塊內(nèi)脂質(zhì)的含量，加固纖維脂而穩(wěn)定斑塊，減少斑塊破裂而引發(fā)的心肌梗死和腦梗死等等嚴(yán)重事件。此外，調(diào)血脂藥還可恢復(fù)受損血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，加強(qiáng)纖溶性和防止血栓形成，并且延緩人的動脈粥樣硬化的進(jìn)展并消退已形成的斑塊。因此，積極使用調(diào)血脂藥物治療是減輕動脈粥樣硬化和減少冠心病的發(fā)生的重要措施。目前臨床和常用的調(diào)節(jié)血脂的藥物品種較多，例如他汀類，苯氧芳酸類，離子交換樹脂或膽酸螯合劑，煙酸類以及其他調(diào)血脂類藥物。其中他汀類藥物(即HMG-CoA還原酶抑制劑)尤為引人注意。他汀類藥物是膽固醇合成酶的抑制劑。HMG-CoA在HMG-CoA還原酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榧籽觚埶幔☆愃帪榛瘜W(xué)結(jié)構(gòu)的開放酸部分與HMG-CoA相似，它可競爭性抑制甲氧龍酸的形成，從而降低了膽固醇的合成，因而可以降低血液中膽固醇和低密度脂蛋白(LDL-C)水平。臨床研究證明，冠心病患者即使血清中膽固醇和低密度脂蛋白的水平不很高或正常，他汀類藥物可以預(yù)防動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生、發(fā)展和減少冠心病的嚴(yán)重臨床事件。然而，長期服用除了他汀類藥物有上腹不適等消化系統(tǒng)癥狀外，相當(dāng)部分病人還會產(chǎn)生肝功能損害，轉(zhuǎn)氨酶升高，肌肉疼痛，肌酸激酶升高等副反應(yīng)。FXR是配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)膽汁酸為其天然配體，參與膽汁酸的代謝,因此也被稱為膽汁酸受體；鵝脫氧膽酸(CDCA)為其最合適的天然配體。GW406是第一個(gè)人工合成的FXR配體。FXR除參與機(jī)體內(nèi)膽汁酸的代謝，還對脂代謝和糖代謝等起著重要的調(diào)節(jié)作用。膽固醇代謝成膽汁酸主要有兩條通路:1.經(jīng)典通路是由CYP7A1催化，而且受膽汁酸的負(fù)反饋調(diào)節(jié)；2.替代通路是由CYP27A1催化，占人體總膽汁酸合成的18％，且作為經(jīng)典通路的補(bǔ)充。經(jīng)典代謝通路過程是膽固醇的氧化產(chǎn)物與LXR結(jié)合并誘導(dǎo)其與RXR形成二聚體，結(jié)合到DNA的LXR的反應(yīng)原件上，激CYP7A1的表達(dá)，然后CYP7A1催化膽固醇生成膽汁酸，膽汁酸與FXR結(jié)合并誘導(dǎo)其與RXR形成二聚體，結(jié)合到DNA的FXR 反應(yīng)原件上，激活SHP的表達(dá)，而SHP與LRH-1結(jié)合抑制CYP7A1的表達(dá)，從而維持膽固醇的代謝平衡。FXR對甘油三酯代謝的調(diào)控機(jī)制體現(xiàn)在抑制TG的合成：FXR經(jīng)SHP途徑下調(diào)SREBP-1c，而SREBP-1c是參與脂肪合成基因的主要轉(zhuǎn)錄因子，可激活多種參與脂肪酸和甘油三酯合成的酶的轉(zhuǎn)錄，包括ACC、FAS等。最近的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XR可以誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞的分化，從而促進(jìn)TG在脂肪細(xì)胞的儲存。也有文獻(xiàn)報(bào)道FXR拮抗劑降低TG的作用是通過下調(diào)SREBP-1c的方式實(shí)現(xiàn)的。目前，報(bào)道的FXR拮抗劑大部分為甾體類化合物，包括Z-guggulsterone(GS)、CDRI/80-574、sulfatedsterol和scalaranesesterterpene等。迄今為止，非甾體類FXR拮抗劑包括AGN34、取代的異噁唑衍生物。其中天然產(chǎn)物GS是FXR的一個(gè)高效拮抗劑，它能夠減少小鼠體內(nèi)低密度脂蛋白(LDL)和甘油三酷(TG)的水平但不能夠改善高膽固醇病人的血裝脂密度。FXR作為近幾年來調(diào)節(jié)血脂領(lǐng)域出現(xiàn)的新靶點(diǎn)，憑借其獨(dú)特的調(diào)節(jié)血脂機(jī)制，吸引了眾多科研工作者的目光。因此，針對FXR研發(fā)出對混合型高脂血癥有效的藥物具有很大意義。前期的酰胺類化合物、其制備方法及應(yīng)用(CN102838505A)和酯類化合物、其制備方法和應(yīng)用(CN102093II6A)兩篇專利中已發(fā)明了大量化合物并證實(shí)體內(nèi)降血脂作用，本專利中的發(fā)明以前期為基礎(chǔ)，發(fā)明了一類芳氧苯酸類衍生物，以羧酸、羧酸酯及酰胺為代表，重點(diǎn)進(jìn)行了體外FXR拮抗活性的研究，證實(shí)具有FXR拮抗作用，而大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有降血脂作用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為開拓臨床藥物的資源，本發(fā)明選擇合適的芳氧苯酸類化合物(尤其是吉非羅齊)與含氨基或羥基的苯甲酸或苯甲酸酯類化合物、含氨基或羥基的苯乙酸或苯乙酸酯類化合物，及其衍生物通過酰化反應(yīng)縮合，以酰胺鍵或酯鍵的形式連接，從而提供了一類新型的FXR拮抗劑，用于降血脂藥物的開發(fā)。本發(fā)明的第一方面是提供如下式(Ⅰ)所示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中：R1選自羥基、甲氧基、乙氧基、氨基。R2選自氫、鹵素、硝基、羧基、甲氧基、甲基。X選自N、O。n1為0或1。n2為0或1。如式(I)所示，在R2及基團(tuán)可以是在苯環(huán)上的任意取代位置。本發(fā)明中，如式(I)所示化合物的藥學(xué)上可接受的鹽較佳的為本發(fā)明化合物和堿性化合物反應(yīng)生成的鹽。所述的堿性化合物較佳的選自氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、碳酸鈉或碳酸氫鉀等。上述藥學(xué)上可接受的鹽容易分離，可采用常規(guī)分離方法提純，如溶劑萃取、稀釋、重結(jié)晶、柱色譜和制備薄層色譜等。在本發(fā)明的第一方面中，式(I)所示的化合物優(yōu)選為：在本發(fā)明第二方面，本發(fā)明提供了如上式(I)所示化合物的制備方法，包括：將化合物23與化合物II，在堿催化下，在適當(dāng)溶劑中反應(yīng)得到，反應(yīng)式見以下：其中，R1選自羥基、甲氧基、乙氧基或氨基；R2選自氫、鹵素、硝基、羧基、甲氧基或甲基；X選自N或O；所述的堿為三乙胺、N,N-二異丙基乙胺、吡啶、氫氧化鈉，適當(dāng)溶劑二氯甲烷、氯仿、四氫呋喃、二甲基甲酰胺、吡啶、二氧六環(huán)/水、或者其混合溶劑。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的堿選自三乙胺、吡啶或氫氧化鈉；更優(yōu)選三乙胺或氫氧化鈉。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的適當(dāng)溶劑選自：二氯甲烷、二氧六環(huán)/水。參考文獻(xiàn)，化合物23的制備通過將吉非羅齊溶于二氯甲烷中，加入定量催化劑-N,N二甲基甲酰胺攪拌，于常溫下滴加草酰氯，反應(yīng)一段時(shí)間得。上述式(I)所示化合物的制備方法，本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)人員可以依照經(jīng)驗(yàn)選取具體的操作步驟，例如：將化合物23溶于第一溶劑中備用，將化合物II加于第二溶劑中，加入堿于室溫下攪拌30-60分鐘，再于冰浴下攪拌條件下滴加化合物23的備用溶液，滴加完畢后常溫?cái)嚢柽^夜，酸化后萃取經(jīng)柱層析及得目標(biāo)化合物；其中：第一溶劑選自二氯甲烷、氯仿、四氫呋喃、二甲基甲酰胺、吡啶、二氧六環(huán)；第二溶劑選自二氯甲烷、氯仿、四氫呋喃、二甲基甲酰胺、吡啶、二氧六環(huán)：水/1-10:1-10的混合溶液；加入的堿為三乙胺、N,N-二異丙基乙胺、吡啶、2N氫氧化鈉溶液。此外，上述本發(fā)明優(yōu)選的化合物也還可以通過其他的合成方法得到，例如：一種實(shí)施方式中，化合物5還可以通過如下方法合成：將吉非羅齊溶于四氫呋喃中，加入堿攪拌30-60分鐘，將4-(2-溴乙?；?苯甲酸的四氫呋喃溶液于冰浴條件下緩慢滴加，常溫?cái)嚢柽^夜，酸化后萃取經(jīng)柱層析及得化合物5。其特征在于所加的堿為碳酸鉀、碳酸鈉、三乙胺、N,N-二異丙基乙胺。一種實(shí)施方式中，化合物8還可以通過如下方法合成：將化合物12溶于乙醇中，加入堿于80℃回流1-3小時(shí)，酸化萃取經(jīng)柱層析及得化合物8。另外一種實(shí)施方式，化合物11還可以通過如下方法合成：將化合物8溶于二氯甲烷中，滴加1滴N,N-二甲基甲酰胺后于常溫下滴加草酰氯攪拌2小時(shí)后，旋出溶劑及過量草酰氯，而后再溶于二氯甲烷中于冰浴條件下滴加于含有三乙胺的甲醇溶液中，滴加完畢后攪拌過夜，萃取經(jīng)柱層析及得化合物11。再一種實(shí)施方式，化合物22還可以通過如下方法合成：將化合物27溶于二氯甲烷中，于冰浴條件下緩慢通入氨氣攪拌，反應(yīng)1小時(shí)后萃取經(jīng)柱層析及得化合物22。在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提供了降血脂藥物組合物，其中包括第一方面所述的式(I)所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽以及藥學(xué)上可接受的載體。根據(jù)治療目的，可將藥物組合物制成各種類型的給藥單位劑型，如片劑、丸劑、粉劑、液體、懸浮液、乳液、顆粒劑、膠囊、栓劑和針劑(溶液及懸浮液)等。在本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提供了將如式(I)所示化合物(I)或其藥學(xué)上可接受的鹽、或其藥物組合物作為FXR拮抗劑的應(yīng)用。此外，本發(fā)明提供了將如式(I)所示化合物(I)或其藥學(xué)上可接受的鹽、或其藥物組合物在調(diào)節(jié)血脂中的應(yīng)用。本發(fā)明的如式(I)所示的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽在藥物組合物中的含量無特殊限制，可在很寬的范圍內(nèi)進(jìn)行選擇，通?？蔀橘|(zhì)量百分比1-70％，較佳的為質(zhì)量百分比1-30％。本發(fā)明中，所述的藥物組合物的給藥方法沒有特殊限制?？筛鶕?jù)病人年齡、性別和其 它條件及癥狀，選擇各種劑型的制劑給藥。例如，片劑、丸劑、溶液、懸浮液、乳液、顆粒劑和膠囊是口服給藥；針劑可以單獨(dú)給藥，或者和注射用輸送液(如葡萄糖溶液及氨基酸溶液)混合進(jìn)行靜脈注射，如有必要可以單純用針劑進(jìn)行肌肉、皮內(nèi)、皮下或腹內(nèi)注射；栓劑為給藥到直腸。本發(fā)明中，可以根據(jù)服藥方法、病人年齡、性別和其它條件以及癥狀適當(dāng)?shù)剡x擇用藥劑量。通常的給藥劑量可為：約0.1～300mg藥物活性成分/kg體重/天。一般來說，每個(gè)給藥單位劑型可含1～200mg的藥物活性成分。以下將通過具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，但并不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可在權(quán)利要求范圍內(nèi)對制備方法和使用儀器作出改進(jìn)，這些改進(jìn)也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。具體實(shí)施方式實(shí)施例1：5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氯的制備將吉非羅齊25.3g溶于二氯甲烷150mL中，加入N,N-二甲基甲酰胺1mL攪拌，于0℃下滴加草酰氯19.0g，常溫下反應(yīng)3小時(shí)，旋出二氯甲烷，得目標(biāo)化合物26.2g，收率97.5％。實(shí)施例2：4-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氧基)苯甲酸(化合物1)的制備將5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氯2.68g溶于1,4-二氧六環(huán)15mL中備用，將對羥基苯甲酸1.38g加于1,4-二氧六環(huán):水/1:1的15mL混合溶劑中，于0℃條件下加入2N氫氧化鈉10mL，攪拌30分鐘，再于0℃條件下滴加備用的溶液，繼續(xù)攪拌10小時(shí)，酸化，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鎂干燥，柱層析，得目標(biāo)化合物2.9g，收率78.4％。ESI-MSm/z:369[M-H]+.1H-NMR(400MHz,DMSO)δ:7.99-7.97(d,2H,J＝8.0Hz),7.18-7.16(d,2H,J＝8.0Hz),6.98-6.96(d,1H,J＝8.0Hz),6.73(s,1H),6.64-6.62(d,1H,J＝8.0Hz),4.00-3.98(t,2H,J＝5.6Hz),2.II(s,3H),2.08(s,3H),1.98-1.79(m,4H),1.32(s,6H).實(shí)施例3：3-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氧基)苯甲酸(化合物2)的制備將5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氯2.68g溶于1,4-二氧六環(huán)15mL中備用，將間羥基苯甲酸1.38g加于1,4-二氧六環(huán):水/1:1的15mL混合溶劑中，于0℃條件下加入2N氫氧化鈉水溶液10mL，攪拌30分鐘，再于0℃條件下滴加備用的溶液，繼續(xù)攪拌10小時(shí)，酸化，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鎂干燥，柱層析，得目標(biāo)化合物3.4g，收率91.9％。ESI-MSm/z:369[M-H]+.實(shí)施例4：2-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氧基)苯甲酸(化合物3)的制備將5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氯2.68g溶于1,4-二氧六環(huán)15mL中備用，將鄰羥基苯甲酸1.38g加于1,4-二氧六環(huán):水/1:1的15mL混合溶劑中，于0℃條件下加入2N氫氧化鈉水溶液10mL，攪拌30分鐘，再于0℃條件下滴加備用的溶液，繼續(xù)攪拌10小時(shí)，酸化，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鎂干燥，柱層析，得目標(biāo)化合物3.2g,收率86.5％。ESI-MSm/z:369[M-H]+.761[2M+Na-H]+.1HNMR(400MHz,DMSO)δ13.08(s,1H),7.91(d,J＝7.8Hz,1H),7.61(t,J＝7.8Hz,1H),7.37(t,J＝7.8Hz,1H),7.06(d,J＝7.8Hz,1H),6.98(d,J＝7.4Hz,1H),6.73(s,1H),6.63(d,J＝7.4Hz,1H),3.98(t,J＝4.7Hz,2H),2.25(s,3H),2.09(s,3H),1.87–1.73(m,4H),1.31(s,6H).實(shí)施例5：2-(4-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氧基)苯基)乙酸(化合物4)的制備將5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氯2.68g溶于1,4-二氧六環(huán)15mL中備用，將對羥基苯乙酸1.52g加于1,4-二氧六環(huán):水/1:1的15mL混合溶劑中，于0℃條件下加入 2N氫氧化鈉水溶液10mL，攪拌30分鐘，再于0℃條件下滴加備用的溶液，繼續(xù)攪拌10小時(shí)，酸化，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鎂干燥，柱層析，得目標(biāo)化合物3.2g,收率83.3％。ESI-MSm/z:383[M-H]+.1HNMR(400MHz,DMSO)δ12.35(s,1H),7.29(d,J＝8.6Hz,2H),6.99(d,J＝8.6Hz,2H),6.98(d,J＝7.3Hz,1H),6.74(s,1H),6.64(d,J＝7.3Hz,1H),3.99(t,J＝5.7Hz,2H),3.59(s,2H),2.25(s,3H),2.09(s,3H),1.85–1.72(m,4H),1.30(s,6H).實(shí)施例6：4-(2-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氧基)乙?；?苯甲酸(化合物5)的制備將吉非羅齊2.68g和無水K2CO32.76g加于四氫呋喃15mL中攪拌1小時(shí)，4-(2-溴乙酰基)苯甲酸2.43g的四氫呋喃溶液10mL用恒壓滴液漏斗緩慢滴加于上述混合液中，20℃繼續(xù)攪拌10小時(shí)，酸化，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鎂干燥，柱層析，得目標(biāo)化合物2.3g,收率55.8％。ESI-MSm/z:411[M-H]+.1HNMR(400MHz,DMSO)δ8.08(d,J＝8.4Hz,2H),8.04(d,J＝8.4Hz,2H),6.98(d,J＝7.4Hz,1H),6.73(s,1H),6.63(d,J＝7.4Hz,1H),5.50(s,2H),3.93(d,J＝4.2Hz,2H),2.25(s,3H),2.10(s,3H),1.75(s,4H),1.II(s,6H).實(shí)施例7：4-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰胺基)苯甲酸(化合物6)的制備將5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氯2.68g溶于1,4-二氧六環(huán)15mL中備用，將對氨基苯甲酸1.37g加于1,4-二氧六環(huán):水/1:1的15mL混合溶劑中，于0℃條件下加入2N氫氧化鈉10mL，攪拌30分鐘，再于0℃條件下滴加備用的溶液，繼續(xù)攪拌10小時(shí)，酸化，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鎂干燥，柱層析，得目標(biāo)化合物3.3g,收率89.4％。ESI-MSm/z:370[M+H]+.1H-NMR(400MHz,DMSO)δ:12.68(s,1H),9.48(s,1H),7.86-7.88(d,2H,J＝8.0Hz),7.77-7.79(d,2H,J＝8.0Hz),6.95-6.97(d,1H,J＝8.0Hz),6.66(s,1H),6.59-6.61(d,1H,J＝8.0Hz),3.89-3.91(t,2H),2.20(s,3H),2.06(s,3H),1.66-1.78(m,4H),1.25(s,6H).實(shí)施例8：3-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰胺基)苯甲酸(化合物7)的制備將5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氯2.68g溶于1,4-二氧六環(huán)15mL中備用，將間氨基苯甲酸1.37g加于1,4-二氧六環(huán):水/1:1的15mL混合溶劑中，于0℃條件下加入2N氫氧化鈉10mL，攪拌30分鐘，再于0℃條件下滴加備用的溶液，繼續(xù)攪拌10小時(shí)，酸化，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鎂干燥，柱層析，得目標(biāo)化合物3.5g,收率94.9％。ESI-MSm/z:384[M+H]+.1HNMR(400MHz,DMSO)δ12.75(s,1H),9.43(s,1H),8.27(s,1H),7.93(d,J＝8.2Hz,1H),7.63(d,J＝7.8Hz,1H),7.41(t,J＝7.9Hz,1H),6.96(d,J＝7.5Hz,1H),6.67(s,1H),6.60(d,J＝7.6Hz,1H),3.90(t,J＝5.8Hz,2H),2.21(s,3H),2.07(s,3H),1.85–1.73(m,2H),1.65(dd,J＝11.6,6.1Hz,2H),1.25(s,6H).實(shí)施例9：2-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰胺基)苯甲酸(化合物8)的制備將5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氯2.68g溶于二氯甲烷15mL中備用，將鄰氨基苯甲酸乙酯1.65g加于二氯甲烷15mL中，于0℃條件下加入三乙胺4.2mL，攪拌30分鐘，再于0℃條件下滴加備用的溶液，繼續(xù)攪拌10小時(shí)，稀鹽酸酸化，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鎂干燥，旋干萃取液后加入乙醇30mL和氫氧化鈉0.8g于80℃回流2小時(shí)，旋出溶劑，稀鹽酸酸化至PH2，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鎂干燥，旋干后柱層析，得目標(biāo)化合物2.9g,收率78.6％。ESI-MSm/z:370[M+H]+.392[M+Na]+.HNMR(400MHz,DMSO)δ11.56(s,1H),8.63(d,J＝8.0Hz,1H),8.01(d,J＝8.0Hz,1H),7.66–7.51(t,J＝7.6Hz,1H),7.14(t,J＝7.6Hz,1H),6.94(d,J＝7.5Hz,1H),6.64(s,1H),6.59(d,J＝7.4Hz,1H),3.89(t,J＝5.9Hz,2H),2.20(s,3H),2.04(s,3H),1.81–1.57(m,4H),1.27(s,6H).實(shí)施例10：2-(4-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰胺基)苯基)乙酸(化合物9)的制備將5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氯2.68g溶于1,4-二氧六環(huán)15mL中備用，將對氨基苯乙酸1.52g加于1,4-二氧六環(huán):水/1:1的15mL混合溶劑中，于0℃條件下加入2N氫氧化鈉水溶液10mL，攪拌30分鐘，再于0℃條件下滴加備用的溶液，繼續(xù)攪拌10小時(shí)，酸化，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鎂干燥，柱層析，得目標(biāo)化合物3.4g,收率88.7％。ESI-MSm/z:384[M+H]+.406[M+Na]+.1HNMR(400MHz,DMSO)δ9.17(s,1H),7.55(d,J＝8.4Hz,2H),7.16(d,J＝8.4Hz,2H),6.97(d,J＝7.5Hz,1H),6.68(s,1H),6.61(d,J＝7.4Hz,1H),3.91(t,J＝6.1Hz,2H),3.49(s,2H),2.22(s,3H),2.08(s,3H),1.85–1.58(m,4H),1.23(s,6H).實(shí)施例11：4-(2-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰胺基)乙?；?苯甲酸(化合物10)的制備將4-(2-溴乙酰基)苯甲酸2.43g和六次甲基四胺1.40g加于四氫呋喃20mL中，20℃條件下攪拌6小時(shí)，抽濾后將濾餅加入無水乙醇20mL中，向該混合液中加入4mL濃鹽酸，45℃下攪拌2小時(shí)，冷卻抽濾，5mL無水乙醇洗滌，烘干后加于15mL二氯甲烷中，再于0℃向該混合液中加入三乙胺4.2mL,緩慢滴入預(yù)先制備的10mL的5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氯2.68g,攪拌12小時(shí)后酸化，萃取，無水硫酸鎂干燥，旋干后柱層析，得目標(biāo)化合物1.2g，29.2％。ESI-MSm/z:410[M-H]+.1HNMR(400MHz,DMSO)δ8.02(q,J＝8.5Hz,4H),7.92(t,J＝5.5Hz,1H),6.98(d,J＝7.5Hz,1H),6.71(s,1H),6.62(d,J＝7.4Hz,1H),4.54(d,J＝5.5Hz,2H),3.88(t,J＝5.5Hz,2H),2.25(s,3H),2.10(s,3H),1.82–1.50(m,4H),1.14(s,6H).實(shí)施例12：2-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰胺基)苯甲酸甲酯(化合物11)的制備將2-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰胺基)苯甲酸(化合物8)3.69g溶于二 氯甲烷30mL中，加入N,N-二甲基甲酰胺0.5mL攪拌，于0℃下滴加草酰氯，常溫下反應(yīng)5小時(shí)，旋出過量的二氯甲烷草酰氯后再加于25mL二氯甲烷中，于0℃下滴入10mL甲醇和2.1mL的三乙胺混合液中攪拌12小時(shí)。稀鹽酸酸化，無水硫酸鎂干燥，柱層析，得目標(biāo)化合物3.1g,收率80.9％。ESI-MSm/z:384[M+H]+.1HNMR(400MHz,DMSO)δ11.08(s,1H),8.56(dd,J＝8.5,0.9Hz,1H),7.98(dd,J＝8.0,1.6Hz,1H),7.72–7.54(m,1H),7.26–7.08(m,1H),6.94(d,J＝7.5Hz,1H),6.64(s,1H),6.58(d,J＝7.5Hz,1H),3.90(d,J＝6.1Hz,2H),3.88(s,3H),2.20(s,3H),2.04(s,3H),1.79–1.73(m,2H),1.71–1.64(m,2H),1.28(s,6H).實(shí)施例13：2-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰胺基)苯甲酸乙酯(化合物12)的制備將5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氯2.68g溶于二氯甲烷15mL中備用，將鄰氨基苯甲酸乙酯1.65g加于二氯甲烷15mL中，于0℃條件下加入三乙胺4.2mL，攪拌30分鐘，再于0℃條件下滴加備用的溶液，繼續(xù)攪拌10小時(shí)，稀鹽酸酸化，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鎂干燥，柱層析，得目標(biāo)化合物3.3g,收率89.4％。ESI-MSm/z:398[M+H]+.420[M+Na]+.1HNMR(400MHz,DMSO)δ11.13(s,1H),8.57(d,J＝8.4Hz,1H),8.00(d,J＝6.8Hz,1H),7.62(t,J＝6.8Hz,1H),7.17(t,J＝8.4Hz,1H),6.95(d,J＝7.4Hz,1H),6.65(s,1H),6.59(d,J＝7.4Hz,1H),4.35(q,J＝7.1Hz,2H),3.90(t,J＝5.0Hz,2H),2.20(s,3H),2.04(s,3H),1.79–1.73(m,2H),1.71–1.64(m,2H),1.34(t,J＝7.1Hz,3H),1.28(s,6H).實(shí)施例14：2-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰胺基)-6-甲基苯甲酸(化合物13)的制備將5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氯2.68g溶于1,4-二氧六環(huán)15mL中備用，將2-氨基-6-甲基苯甲酸1.51g加于1,4-二氧六環(huán):水/1:1的15mL混合溶劑中，于0℃條件下加入2N氫氧化鈉10mL，攪拌30分鐘，再于0℃條件下滴加備用的溶液，繼續(xù)攪拌10小時(shí)，酸化，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鎂干燥，柱層析，得目標(biāo)化合物3.5g,收率91.4％。 ESI-MSm/z:382[M-H]+.1HNMR(400MHz,DMSO)δ9.82(s,1H),7.79(d,J＝8.4Hz,1H),7.34(t,J＝7.7Hz,1H),7.05(d,J＝7.7Hz,1H),6.97(d,J＝7.4Hz,1H),6.68(s,1H),6.61(d,J＝7.4Hz,1H),3.91(t,J＝5.2Hz,2H),2.41(s,3H),2.23(s,3H),2.07(s,3H),1.77–1.61(m,4H),1.22(s,6H).實(shí)施例15：2-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰胺基)-6-氟苯甲酸(化合物14)的制備將5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氯2.68g溶于1,4-二氧六環(huán)15mL中備用，將2-氨基-6-氟苯甲酸1.55g加于1,4-二氧六環(huán):水/1:1的15mL混合溶劑中，于0℃條件下加入2N氫氧化鈉10mL，攪拌30分鐘，再于0℃條件下滴加備用的溶液，繼續(xù)攪拌10小時(shí)，酸化，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鎂干燥，柱層析，得目標(biāo)化合物3.1g,收率80.1％。ESI-MSm/z:386[M-H]+.1HNMR(400MHz,DMSO)δ10.65(s,1H),8.07(d,J＝8.4Hz,1H),7.54(dd,J＝14.6,8.4Hz,1H),7.15(dd,J＝14.4,8.2Hz,1H),6.95(d,J＝7.6Hz,1H),6.66(s,1H),6.56(d,J＝8.4Hz,1H),3.90(t,J＝5.7Hz,2H),2.21(s,3H),2.06(s,3H),1.78–1.62(m,4H),1.II(s,6H).實(shí)施例16：2-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰胺基)-5-甲基苯甲酸(化合物15)的制備將5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氯2.68g溶于1,4-二氧六環(huán)15mL中備用，將2-氨基-5-甲基苯甲酸1.51g加于1,4-二氧六環(huán):水/1:1的15mL混合溶劑中，于0℃條件下加入2N氫氧化鈉10mL，攪拌30分鐘，再于0℃條件下滴加備用的溶液，繼續(xù)攪拌10小時(shí)，酸化，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鎂干燥，柱層析，得目標(biāo)化合物3.7g,收率96.7％。ESI-MSm/z:382[M-H]+.1HNMR(400MHz,DMSO)δ11.43(s,1H),8.52(d,J＝8.5Hz,1H),7.82(s,1H),7.40(dd,J＝8.7,2.0Hz,1H),6.95(d,J＝7.5Hz,1H),6.64(s,1H),6.59(d,J＝7.5Hz,1H),3.89(t,J＝5.9Hz,2H),2.29(s,3H),2.20(s,3H),2.04(s,3H),1.78–1.71(m,2H),1.70–1.62(m,2H),1.26(s, 6H).實(shí)施例17：2-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰胺基)-5-氟苯甲酸(化合物16)的制備將5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氯2.68g溶于1,4-二氧六環(huán)15mL中備用，將2-氨基-5氟苯甲酸1.51g加于1,4-二氧六環(huán):水/1:1的15mL混合溶劑中，于0℃條件下加入2N氫氧化鈉10mL，攪拌30分鐘，再于0℃條件下滴加備用的溶液，繼續(xù)攪拌10小時(shí)，酸化，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鎂干燥，柱層析，得目標(biāo)化合物3.4g,收率87.9％。ESI-MSm/z:386[M-H]+.1HNMR(400MHz,DMSO)δ11.37(s,1H),8.63(dd,J＝9.4,5.2Hz,1H),7.71(dd,J＝9.4,3.2Hz,1H),7.56–7.40(m,1H),6.94(d,J＝7.6Hz,1H),6.63(s,1H),6.58(d,J＝7.6Hz,1H),3.89(t,J＝5.9Hz,2H),2.20(s,3H),2.04(s,3H),1.78–1.60(m,4H),1.26(s,6H).實(shí)施例18：2-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰胺基)對苯二甲酸(化合物17)的制備將5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氯2.68g溶于1,4-二氧六環(huán)15mL中備用，將2-氨基對苯二甲酸1.81g加于1,4-二氧六環(huán):水/1:1的15mL混合溶劑中，于0℃條件下加入2N氫氧化鈉20mL，攪拌30分鐘，再于0℃條件下滴加備用的溶液，繼續(xù)攪拌10小時(shí)，酸化，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鎂干燥，柱層析，得目標(biāo)化合物3.9g,收率94.4％。ESI-MSm/z:412[M-H]+.1HNMR(400MHz,DMSO)δ11.51(s,1H),9.20(d,J＝1.6Hz,1H),8.08(d,J＝8.2Hz,1H),7.66(dd,J＝8.2,1.7Hz,1H),6.92(d,J＝7.4Hz,1H),6.63(s,1H),6.56(d,J＝7.4Hz,1H),3.90(t,J＝5.7Hz,2H),2.19(s,3H),2.03(s,3H),1.77–1.64(m,4H),1.28(s,6H).實(shí)施例19：2-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰胺基)-4-甲氧基苯甲酸(化合物18)的制備將5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氯2.68g溶于1,4-二氧六環(huán)15mL中備用，將2-氨基-4甲氧基苯甲酸1.67g加于1,4-二氧六環(huán):水/1:1的15mL混合溶劑中，于0℃條件下加入2N氫氧化鈉10mL，攪拌30分鐘，再于0℃條件下滴加備用的溶液，繼續(xù)攪拌10小時(shí)，酸化，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鎂干燥，柱層析，得目標(biāo)化合物3.6g,收率90.2％。ESI-MSm/z:398[M-H]+.實(shí)施例20：2-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰胺基)-4-氯苯甲酸(化合物19)的制備將5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氯2.68g溶于1,4-二氧六環(huán)15mL中備用，將2-氨基-4氯苯甲酸1.71g加于1,4-二氧六環(huán):水/1:1的15mL混合溶劑中，于0℃條件下加入2N氫氧化鈉10mL，攪拌30分鐘，再于0℃條件下滴加備用的溶液，繼續(xù)攪拌10小時(shí)，酸化，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鎂干燥，柱層析，得目標(biāo)化合物3.4g,收率84.4％。ESI-MSm/z:402[M-H]+.1HNMR(400MHz,DMSO)δ11.67(s,1H),8.72(s,1H),8.00(d,J＝8.6Hz,1H),7.20(dd,J＝8.6,2.2Hz,1H),6.98(d,J＝7.5Hz,1H),6.93(d,J＝7.6Hz,1H),6.70(s,1H),6.63(s,1H),6.58(t,J＝6.0Hz,1H),3.90(d,J＝4.1Hz,2H),2.20(s,3H),2.03(s,3H),1.78–1.71(m,2H),1.68–1.64(m,2H),1.27(s,6H).實(shí)施例21：2-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰胺基)-4-溴苯甲酸(化合物20)的制備將5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氯2.68g溶于1,4-二氧六環(huán)15mL中備用，將2-氨基-4溴苯甲酸2.16g加于1,4-二氧六環(huán):水/1:1的15mL混合溶劑中，于0℃條件下加入2N氫氧化鈉10mL，攪拌30分鐘，再于0℃條件下滴加備用的溶液，繼續(xù)攪拌10小時(shí)，酸化，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鎂干燥，柱層析，得目標(biāo)化合物3.9g,收率87.1％。ESI-MSm/z:446[M-H]+.1HNMR(400MHz,DMSO)δ11.72(s,1H),8.87(s,1H),7.92(d,J＝8.5Hz,1H),7.33(dd,J＝8.5,2.1Hz,1H),6.93(d,J＝7.5Hz,1H),6.63(s,1H),6.57(d,J＝7.5Hz,1H),3.90(t,J＝5.9Hz,2H),2.20(s,3H),2.03(s,3H),1.80–1.71(m,2H),1.71–1.62(m,2H),1.26(s,6H).實(shí)施例22：2-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰胺基)-4-硝基苯甲酸(化合物21)的制備將5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰氯2.68g溶于1,4-二氧六環(huán)15mL中備用，將2-氨基-4硝基苯甲酸1.82g加于1,4-二氧六環(huán):水/1:1的15mL混合溶劑中，于0℃條件下加入2N氫氧化鈉10mL，攪拌30分鐘，再于0℃條件下滴加備用的溶液，繼續(xù)攪拌10小時(shí)，酸化，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鎂干燥，柱層析，得目標(biāo)化合物3.6g,收率87.0％。實(shí)施例23：2-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰胺基)苯甲酰胺(化合物22)的制備將2-(5-(2,5-二甲基苯氧基)-2,2-二甲基戊酰胺基)苯甲酸(化合物8)3.69g溶于二氯甲烷30mL中，加入N,N-二甲基甲酰胺0.5mL攪拌，于0℃下滴加草酰氯，常溫下反應(yīng)5小時(shí)，旋出二氯甲烷過量的草酰氯后再加于30mL二氯甲烷中，于0℃下通入氨氣1小時(shí)，稀鹽酸酸化洗，飽和碳酸氫鈉水溶液洗，飽和氯化鈉水溶液洗，無水硫酸鎂干燥，柱層析，得目標(biāo)化合物3.3g，收率89.7％。ESI-MSm/z:370[M+H]+.1HNMR(400MHz,DMSO)δ11.55(s,1H),8.63(d,J＝7.6Hz,1H),8.01(d,J＝6.4Hz,1H),7.68–7.51(m,1H),7.14(t,J＝8.2Hz,1H),6.95(d,J＝11.5Hz,1H),6.65(s,1H),6.59(d,J＝7.1Hz,1H),3.90(t,J＝5.9Hz,2H),2.20(s,3H),2.04(s,3H),1.85 –1.53(m,4H),1.27(s,6H).實(shí)施例24：FXR拮抗活性測試所用試劑材料供應(yīng)商如下：1.基本緩沖液的配制a.準(zhǔn)備20ml1x基本緩沖液，混合后待用。緩沖液詳細(xì)列表如下：材料終濃度(mM)Tris-Hcl20EDTA1glycerol10％TritonX-1000.0025％KF400BSA0.01％SodiumMolybdate10DTT5H2O補(bǔ)足到20ml2.化合物溶液的配制a.對于對照化合物GS，先用100％DMSO稀釋成30mM母液，然后按3倍稀釋到所需終濃度。b.對于待檢測化合物，先用100％DMSO稀釋成20mM母液，然后按3倍稀釋到所需終濃度。c.對于激活化合物GW4064，用100％DMSO稀釋成520uM母液，然后加5nl到384孔板各孔中(不包括低值孔)待用，其終濃度達(dá)到130nM。3.1x蛋白混合液的配制a.按每孔需要10ul溶液計(jì)算，首先用1x基本緩沖液準(zhǔn)備2xFXR-LBD/EuAnti-GST蛋白溶液，使GST-FXR-LBD蛋白溶液終濃度達(dá)到3nM。詳表如下：材料終濃度(mM)GST-FXR-LBD3EuAnti-GST(nl)50nl/孔b.按每孔需要10ul溶液計(jì)算，首先用1x基本緩沖液準(zhǔn)備2xFXRBiotin-SRC1/SA-APC多肽溶液，使SRC1多肽溶液終濃度達(dá)到500nM。詳表如下：材料終濃度(mM)Biotin-Peptide500SA-APC50nl/孔c.把以上兩種2xGST-ER/EuAnti-GST溶液和2xpeptide/SA-APC溶液按體積1：1混合均勻，待用。d.將1x蛋白混合溶液加入384孔板每個(gè)孔，每孔加20ul。e.將384孔板放入離心機(jī)室溫1000轉(zhuǎn)離心10秒，取出。f.將384孔板在室溫放置3小時(shí)后讀數(shù)。4.TR-FRETassay讀數(shù)將384板放入EnVision多功能酶標(biāo)儀讀數(shù)。5.結(jié)果處理a.讀數(shù)665和615(nm)值，并以615值做校正值，最終數(shù)值表示為665值/615值。b.計(jì)算抑制率(％)根據(jù)以下公式計(jì)算抑制率(％)%Inhibition=(Max-XMax-Min)×100%]]>X是每個(gè)濃度的“665值比615值”。Min是只加DMSO的空白對照孔的“665值比615值”平均值。Max是只加激活化合物和DMSO的高信號對照孔的“665值比615值”平均值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：實(shí)施例25：片劑的制備處方：用量化合物150mg微晶纖維素250mg交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮50mg預(yù)膠化淀粉100mg硬脂酸鎂5mg制備方法：按上述配方，將粉碎過篩后的化合物1、微晶纖維素、預(yù)膠化淀粉和交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮均勻混合，然后與5％乙醇溶液混合，制粒、干燥，之后再與潤滑劑混合，壓片即可。其中，所述的化合物1粉碎過篩為過60目篩；所述的微晶纖維素、預(yù)膠化淀粉和交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮粉碎過篩為過80目篩；所述的制粒的顆粒粒徑大小為20目；所述的干燥的溫度較佳的為90℃控制水分質(zhì)量百分比3％以內(nèi)。實(shí)施例28：膠囊的制備制備方法：按上表配方，將藥物與輔料各原料混勻，填充至膠囊殼中即可。實(shí)施例26：注射劑制備制備方法：按上述配方，使用乳缽，將化合物或其鹽與潤濕劑研磨混合均勻，然后與助懸劑、防腐劑和注射用水均勻混合，再研磨即可。其中，所述的研磨的顆粒大小為0.5μm。實(shí)施例27：化合物降血脂藥效學(xué)研究試劑及批號：豬油市售膽固醇上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司批號：090720丙基硫氧嘧啶上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司批號：090505脫氧膽酸上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司批號：090615吐溫80CP國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司批號：F200905071,2-丙二醇國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司AR批號：T20070125脂肪乳劑制備方法：取豬油25g，放在200ml的燒杯里，放在煤氣灶上加熱,待溫度升到100℃時(shí),加入10g膽固醇,溶化,再加入1g丙硫氧嘧啶,充分?jǐn)噭?然后加入25ml吐溫80,制成油相。同時(shí)在另一燒杯中加入30ml蒸餾水和1,2－丙二醇20ml,放在水浴鍋中加熱至60℃,然后加入2g脫氧膽酸鈉,充分?jǐn)嚢柚钡酵耆芙?制成水相。然后將水相加入油相,充分混勻,即制成脂肪乳劑。動物適應(yīng)性喂養(yǎng)3天，根據(jù)體重分出6只作為空白對照組(Control)，其余動物每天上午9:00-11:00灌胃脂肪乳，1ml/100g體重，連續(xù)灌胃2周。再根據(jù)體重將給予脂肪乳劑的動物分為模型組(Model)陽性藥組和給藥組，每組動物數(shù)量根據(jù)化合物總量確定。繼續(xù)灌胃脂肪乳劑，同時(shí)陽性藥組給予Sim(10mg/kg)和SIPI-762380mg/kg，給藥組劑量分別為80、20mg/kg，模型組給予等體積溶劑。于分組當(dāng)日開始口服給藥，每天下午3:00-4:00給藥。每周一稱量體重，觀察動物情況。連續(xù)給藥14天，動物禁食12h，眼眶采血1ml。進(jìn)行血脂測定。采用日立自動生化分析儀7080測定血清膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-c)和高密度脂蛋白(HDL-c)。給藥后大鼠血脂水平(X±SD，mmol/L)當(dāng)前第1頁1 2 3