本發(fā)明涉及一種DNA檢測(cè)方法，尤其涉及一種簡(jiǎn)單、高效、定量的DNA檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

自1977年Sanger發(fā)明了DNA雙脫氧鏈終止法DNA測(cè)序技術(shù)以來(lái)(Sanger F.,Nichlen S.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1977,74(2):5463-5467)，DNA測(cè)序已經(jīng)取得了跨越式發(fā)展。Sanger法的原理是在反應(yīng)體系中加入一定比例的2’,3’-雙脫氧核苷酸(ddNTP)，然后隨著ddNTP的摻入，鏈反應(yīng)會(huì)終止延伸。Sanger法操作簡(jiǎn)單，而且隨著熒光標(biāo)記的發(fā)明，逐漸實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化。其中，最著名的測(cè)序儀器便是美國(guó)ABI公司開發(fā)的ABI377和ABI3730等，其中基于毛細(xì)管電泳技術(shù)的3730到目前仍在廣泛使用。雖然Maxam和Gilbert也于1977年發(fā)明了化學(xué)法測(cè)定DNA序列的技術(shù)，但是由于操作繁瑣，該技術(shù)并未獲得廣泛推廣(Maxam A.M.,Gilbert W.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1977,74(2):560-564)。

這些年隨著下一代測(cè)序技術(shù)(Next Generation Sequencing，NGS)的飛速發(fā)展，DNA測(cè)序開始往高通量、低成本的方向在發(fā)展。目前NGS市場(chǎng)主要是使用Illumina公司提供的測(cè)序平臺(tái)，剩余的市場(chǎng)使用由Life Technologies(Thermo Fisher Scientific)、454Roche和Pacific Biosciences等公司提供的平臺(tái)。各個(gè)公司的平臺(tái)各有特點(diǎn)，但是都是在朝著降低成本、提高通量和速度的方向在努力。

自誕生以來(lái)，NGS已經(jīng)在多個(gè)領(lǐng)域獲得了廣泛應(yīng)用，例如，生物研發(fā)、醫(yī)療診斷和人類基因組計(jì)劃等。通常的做法是將雙鏈DNA模板隨機(jī)打斷，然后連上接頭進(jìn)行測(cè)序。如果出發(fā)的樣本是RNA，則需要先將RNA反轉(zhuǎn)錄為DNA樣本，然后再進(jìn)行測(cè)序。

對(duì)于較短的單鏈DNA(ssDNA)樣品，目前也有為數(shù)不多一些的技術(shù)方案 來(lái)利用NGS平臺(tái)進(jìn)行測(cè)定。例如，Gansauge等人曾經(jīng)使用生物素標(biāo)記的接頭(adaptor)來(lái)與ssDNA連接，然后再連入第二個(gè)接頭，之后用PCR的方法進(jìn)行擴(kuò)增，并利用現(xiàn)有的NGS平臺(tái)進(jìn)行序列測(cè)定(M.-T.Gansauge,M.Meyer,Nat.Protoc.,2013,8(4):737-748)。該方案需要兩次連接接頭；而且第二個(gè)接頭是經(jīng)過(guò)特別設(shè)計(jì)的，含有2’,3’雙脫氧結(jié)構(gòu)以保證只連接一條鏈。同時(shí)，該方案比較適合于較少量的ssDNA的序列測(cè)定，但特別不適合對(duì)ssDNA中序列的定量分析，因此該方法主要用于古生物DNA的測(cè)定，重點(diǎn)針對(duì)損壞的微量DNA。另外，該方案只能與Illumina平臺(tái)配套，一定程度上限制了該方案的使用范圍。由于該方案還需要進(jìn)行PCR擴(kuò)增，且PCR有一定的偏好性，該方案會(huì)影響數(shù)據(jù)的絕對(duì)定量結(jié)果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)目前DNA檢測(cè)方法存在的成本高、適用性差、定量性差等問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種新的檢測(cè)DNA序列的方法，可以實(shí)現(xiàn)高效、簡(jiǎn)便和準(zhǔn)確的定性和定量檢測(cè)。

本發(fā)明第一個(gè)方面是提供一種檢測(cè)DNA序列的方法，步驟包括：

從單鏈DNA(ssDNA)待測(cè)樣品出發(fā)，在DNA序列一個(gè)末端連接DNA接頭(adaptor)序列；其中，所述DNA接頭序列的5’端含有磷酸化基團(tuán)(Pi基團(tuán))；使所述DNA接頭序列形成雙鏈；

將ssDNA合成雙鏈DNA；

利用NGS平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

本發(fā)明上述內(nèi)中，所述DNA待測(cè)樣品中，DNA可以是寡核苷酸(oligonucleotide)、或比寡核苷酸更長(zhǎng)或更短的DNA；如：可以是5-500堿基的序列，更優(yōu)選為7-500堿基的序列，更優(yōu)選為10-450堿基的序列，更優(yōu)選為20-450堿基的序列，更優(yōu)選為25-400堿基的序列，更優(yōu)選為30-350堿基序列，更優(yōu)選為35-300堿基序列，更優(yōu)選為40-250堿基序列，如45堿基、50堿基、60堿基、65堿基、70堿基、75堿基、100堿基、150堿基等。

本發(fā)明上述內(nèi)容中，所述DNA接頭序列優(yōu)選為寡核苷酸序列，所述DNA接頭序列的長(zhǎng)度優(yōu)選為5-250堿基，更優(yōu)選為7-240堿基，更優(yōu)選為10-230堿 基，更優(yōu)選為12-200堿基，更優(yōu)選為15-180堿基，更優(yōu)選為20-150堿基，如25堿基、30堿基、50堿基、80堿基、100堿基、110堿基、120堿基。

本發(fā)明上述內(nèi)容中，使所述DNA接頭序列形成雙鏈的方法可以是選自：加入引物，其中所述引物與所述DNA接頭序列之間至少部分特異互補(bǔ)，以與DNA接頭序列形成互補(bǔ)雙鏈；或者所述接頭本身設(shè)計(jì)為部分雙鏈結(jié)構(gòu)。

因此，本發(fā)明上述內(nèi)容中，所述DNA接頭序列可以是單鏈序列，也可以是雙鏈序列，所述雙鏈序列可以是僅為部分雙鏈結(jié)構(gòu)，如5’端為單鏈結(jié)構(gòu)而3’端為雙鏈結(jié)構(gòu)。

當(dāng)所述DNA接頭序列為單鏈結(jié)構(gòu)時(shí)，所述接頭序列3’端優(yōu)選為含有羥基。

當(dāng)所述DNA接頭序列為雙鏈結(jié)構(gòu)時(shí)，5’端含Pi基團(tuán)的為正鏈，另一條鏈為反鏈。

當(dāng)所述DNA接頭序列為雙鏈結(jié)構(gòu)時(shí)，可以優(yōu)選為3’端為平端、正鏈的3’端突出、正鏈的3’端縮進(jìn)、3’端封閉、3’端帶有可化學(xué)切割部分、在3’端雙鏈之間通過(guò)莖環(huán)結(jié)構(gòu)連接。

當(dāng)所述DNA接頭序列為單鏈、3’端為平端、正鏈的3’端突出或正鏈的3’端縮進(jìn)時(shí)，所述正鏈3’端帶有羥基基團(tuán)、或?qū)辛u基的3’端進(jìn)行了可逆修飾。

當(dāng)所述DNA接頭序列含有莖環(huán)時(shí)，在正鏈和/或反鏈上還可以存在能夠酶切的堿基修飾或酶切位點(diǎn)，所述堿基修飾可以選自脫氨、烷基化修飾中的任意一種或幾種，如甲基化修飾，也可以是尿嘧啶，應(yīng)當(dāng)理解的是，所述堿基修飾可以是一個(gè)堿基或多個(gè)堿基修飾；所述酶切位點(diǎn)如位點(diǎn)非常稀少的酶切位點(diǎn)，如歸位內(nèi)切酶、限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)。所述歸位內(nèi)切酶如I-Dmol、I-Scel、I-Ceul等，并優(yōu)選為I-Scel，其識(shí)別和酶切DNA核心序列包含如下序列或其反向互補(bǔ)序列：

5’-ATTACCCTGTTATCCCTA-3’

當(dāng)所述DNA接頭序列3’端封閉(如3’端羥基被封閉)時(shí)，所述封閉可以是、但不限于：堿基修飾、3’端雙脫氧處理中的任意一種，并且所述修飾可以是可逆修飾，如對(duì)含有羥基的3’端進(jìn)行可逆修飾。

當(dāng)所述DNA接頭序列3’端封閉時(shí)，在正鏈或反鏈上還可以存在能夠酶切的堿基修飾或酶切位點(diǎn)，所述堿基修飾可以選自脫氨、烷基化修飾，如甲基化修飾，也可以是尿嘧啶；所述酶切位點(diǎn)如位點(diǎn)非常稀少的酶切位點(diǎn)，如歸位內(nèi)切酶，如 I-Dmol、I-Scel、I-Ceul等。

在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述檢測(cè)DNA序列的方法，步驟包括：

從單鏈DNA(ssDNA)待測(cè)樣品出發(fā)，在DNA序列一個(gè)末端連接DNA接頭序列；其中，所述DNA接頭序列為單鏈序列，5’端含Pi基團(tuán)，3’端含羥基；

加入引物，在DNA聚合酶作用下，將ssDNA合成雙鏈DNA；其中，所述引物與所述DNA接頭序列之間至少部分特異互補(bǔ)；

利用NGS平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述檢測(cè)DNA序列的方法，步驟包括：

從單鏈DNA(ssDNA)待測(cè)樣品出發(fā)，在DNA序列一個(gè)末端連接DNA接頭序列；其中，所述DNA接頭序列含雙鏈結(jié)構(gòu)，其中正鏈的5’端含Pi基團(tuán)，正鏈的3’端含羥基；

在DNA聚合酶作用下，將ssDNA合成雙鏈DNA；

利用NGS平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述檢測(cè)DNA序列的方法，步驟包括：

從單鏈DNA(ssDNA)待測(cè)樣品出發(fā)，在DNA序列一個(gè)末端連接DNA接頭序列；其中，所述DNA接頭序列含雙鏈結(jié)構(gòu)，其中正鏈的5’端含Pi基團(tuán)，正鏈和反鏈之間在3’端形成莖環(huán)連接，DNA接頭序列中含有甲基化修飾堿基；

在DNA聚合酶作用下，將ssDNA合成雙鏈DNA；

在特異性切割甲基化修飾DNA的酶作用下，去除DNA接頭序列中的莖環(huán)；

利用NGS平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述檢測(cè)DNA序列的方法，步驟包括：

從單鏈DNA(ssDNA)待測(cè)樣品出發(fā)，在DNA序列一個(gè)末端連接DNA接頭序列；其中，所述DNA接頭序列含雙鏈結(jié)構(gòu)，其中正鏈的5’端含Pi基團(tuán)，正鏈和反鏈之間在3’端形成莖環(huán)連接，DNA接頭序列中含有甲基化修飾堿基；

在特異性切割甲基化修飾DNA的酶作用下，去除DNA接頭序列中的莖環(huán)；

在DNA聚合酶作用下，將ssDNA合成雙鏈DNA；

利用NGS平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述檢測(cè)DNA序列的方法，步驟包括：

從單鏈DNA(ssDNA)待測(cè)樣品出發(fā)，在DNA序列一個(gè)末端連接DNA接頭序 列；其中，所述DNA接頭序列含雙鏈結(jié)構(gòu)，其中正鏈的5’端含Pi基團(tuán)，正鏈和反鏈之間在3’端形成莖環(huán)連接，DNA接頭序列中含有尿嘧啶；

在特異性切割尿嘧啶的酶(如NEB公司的USER^TM Enzyme)作用下，去除DNA接頭中的莖環(huán)；

在DNA聚合酶作用下，將ssDNA合成雙鏈DNA；

利用NGS平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

本發(fā)明上述內(nèi)容中，所述待測(cè)樣品在5’端含有磷酸化基團(tuán)的，還包括在連接DNA接頭序列之前進(jìn)行脫磷的步驟。

本發(fā)明第二個(gè)方面是提供一種上述檢測(cè)DNA序列的方法的應(yīng)用。所述應(yīng)用可以是定量、定性檢測(cè)DNA序列中的任意一種或幾種，更優(yōu)選為進(jìn)行定量檢測(cè)DNA。

在一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述應(yīng)用包括在合成核苷酸藥物質(zhì)檢中的應(yīng)用：步驟包括：

將合成的核苷酸藥物粗產(chǎn)物進(jìn)行純化，分離出純化產(chǎn)物和雜質(zhì)產(chǎn)物；

采用本發(fā)明第一個(gè)方面所述的方法，對(duì)純化產(chǎn)物和/或雜質(zhì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

在另一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述應(yīng)用包括在合成核苷酸藥物質(zhì)檢中的應(yīng)用：步驟包括：

將合成的核苷酸藥物粗產(chǎn)物進(jìn)行純化，分離出純化產(chǎn)物和雜質(zhì)產(chǎn)物；

采用本發(fā)明第一個(gè)方面所述的方法，對(duì)純化產(chǎn)物和/或雜質(zhì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

將檢測(cè)結(jié)果與已檢測(cè)合格的產(chǎn)品中的檢測(cè)結(jié)果相對(duì)比，如果檢測(cè)結(jié)果與合格產(chǎn)品一致的檢測(cè)結(jié)果一致，則該純化后的產(chǎn)物為合格產(chǎn)品；否則為不合格產(chǎn)品。

在另一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述應(yīng)用包括在合成核苷酸藥物質(zhì)檢中的應(yīng)用：步驟包括：

將合成的核苷酸藥物粗產(chǎn)物進(jìn)行純化，分離出純化產(chǎn)物和雜質(zhì)產(chǎn)物；

采用本發(fā)明第一個(gè)方面所述的方法，對(duì)純化產(chǎn)物和/或雜質(zhì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

將檢測(cè)結(jié)果與已檢測(cè)合格的產(chǎn)品中的檢測(cè)結(jié)果相對(duì)比，如果檢測(cè)結(jié)果與合格產(chǎn)品一致的檢測(cè)結(jié)果一致，則該純化后的產(chǎn)物為合格產(chǎn)品；如果檢測(cè)結(jié)果不一致，則需要對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行安全性測(cè)試。

在另一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述應(yīng)用包括在合成核苷酸藥物質(zhì)檢中的應(yīng)用：步 驟包括：

將合成的核苷酸藥物粗產(chǎn)物進(jìn)行純化，分離出純化產(chǎn)物和雜質(zhì)產(chǎn)物；

采用本發(fā)明第一個(gè)方面所述的方法，對(duì)純化產(chǎn)物和/或雜質(zhì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

將檢測(cè)結(jié)果與已檢測(cè)合格的產(chǎn)品中的檢測(cè)結(jié)果相對(duì)比，如果檢測(cè)結(jié)果與合格產(chǎn)品一致的檢測(cè)結(jié)果一致，則該純化后的產(chǎn)物為合格產(chǎn)品；如果檢測(cè)結(jié)果不一致，則需要對(duì)超出預(yù)定含量的雜質(zhì)進(jìn)行安全性測(cè)試。

本發(fā)明上述內(nèi)容中，所述核苷酸藥物可以是預(yù)防疾病、治療疾病的藥物中的任意一種或幾種。并優(yōu)選為寡核苷酸類藥物，如反義寡核苷酸。

其中，所述藥物可以是包括抗病毒藥物、抗腫瘤藥物、激素類藥物中的任意一種或幾種，如促紅細(xì)胞生成素、生長(zhǎng)激素、表皮生長(zhǎng)因子、胰島素、白介素、集落刺激因子。

其中，所述反義寡核苷酸也可以是包括化學(xué)修飾反義寡核苷酸、Decoy寡核苷酸中的任意一種或幾種，如硫代修飾反義寡核苷酸、嵌合寡核苷酸、雜合寡核苷酸、肽核酸、鎖核酸、嗎啉化寡核苷酸、磷酰胺酯化寡核苷酸、2’-O-烷基化寡核苷酸中的任意一種或幾種。

應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明上述內(nèi)容中，所述“莖環(huán)”指的是一段核苷酸序列，其在3’端將DNA接頭的兩條鏈進(jìn)行連接。

發(fā)明人通過(guò)廣泛而深入的研究，建立了一套用于ssDNA測(cè)序的技術(shù)方案。首先用給ssDNA連上接頭序列，需要加入特異的引物，與接頭形成互補(bǔ)的雙鏈，然后在DNA聚合酶的作用下，生成dsDNA，以利用現(xiàn)有的NGS測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用上述技術(shù)方案成功地進(jìn)行了多組ssDNA序列的測(cè)定。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明檢測(cè)DNA序列的方法流程框圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例中幾種接頭序列結(jié)構(gòu)示意圖；

圖3為本發(fā)明中使用單鏈接頭的檢測(cè)DNA序列的方法流程示意圖；

圖4-6為本發(fā)明使用雙鏈接頭的檢測(cè)DNA序列的方法流程示意圖；

圖7-8為本發(fā)明使用含莖環(huán)結(jié)構(gòu)接頭的檢測(cè)DNA序列的方法流程示意圖.

具體實(shí)施方式

下面參照附圖，并結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明檢測(cè)DNA序列的方法及其應(yīng)用進(jìn)行詳細(xì)介紹。

圖1給出了本發(fā)明檢測(cè)DNA序列的方法流程框圖，本發(fā)明先將ssDNA的一端連接一端DNA接頭序列，然后生成雙鏈DNA，最后進(jìn)行NGS檢測(cè)。

其中，NGS(Next Generation Sequencing)為高通量測(cè)序(High-Throughput sequencing)，是相對(duì)于傳統(tǒng)的桑格測(cè)序(Sanger Sequencing)而言的。目前高通量測(cè)序的主要平臺(tái)代表為Illumina、Life Technologies(Thermo Fisher Scientific)、羅氏公司(Roche)和Pacific Biosciences的測(cè)序平臺(tái)。

圖2給出了幾種不同的DNA接頭序列，其中：

第(1)種為單鏈接頭序列，其5’端為磷酸化基團(tuán)，3’端為羥基(-OH)；

第(2)種為部分雙鏈接頭序列，正鏈(圖中較長(zhǎng)的鏈)5’端為磷酸化基團(tuán)，3’端為羥基，并且反鏈(短鏈)在3’端與正鏈之間形成雙鏈；該接頭序列分為3’端為平端、突出和縮進(jìn)三種，具體詳見下述實(shí)施例；

第(3)種為部分雙鏈接頭序列，與第(2)種接頭序列不同之處在于，兩條鏈在3’端形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，彼此通過(guò)該莖環(huán)結(jié)構(gòu)連接；圖中，正鏈和反鏈中均含有尿嘧啶U，但本發(fā)明也可以僅在正鏈或僅在反鏈上含有該尿嘧啶U；

第(4)為部分雙鏈接頭序列，與第(3)中接頭不同之處在于，反鏈上含有某種堿基修飾X，該堿基修飾可以是能夠進(jìn)行酶切的甲基化修飾，或者本身為酶切位點(diǎn)，如位點(diǎn)非常稀少的酶切位點(diǎn)，如歸位內(nèi)切酶如I-Dmol、I-Scel、I-Ceul等；如果X為限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，可以生成雙鏈后進(jìn)行酶切，以去除3’端的部分；

第(5)種為部分雙鏈接頭序列，與第(2)種接頭序列不同之處在于，正鏈3’端被封閉，例如堿基修飾或者3’端雙脫氧處理，因此不能與5’端形成磷酸二酯鍵，并且3’端帶有類似于第(4)中序列的某種堿基修飾X；另外，3’端也可以是可逆修飾，在此情況下，3’端帶有可化學(xué)切割的部分，而無(wú)需該堿基修飾X。

圖2中，X或U并不意味著必須是一個(gè)堿基，也可以是多個(gè)堿基或一個(gè)序 列段。

實(shí)施例1

參照?qǐng)D3，本實(shí)施例中DNA接頭序列為單鏈序列。

從ssDNA出發(fā)，在ssDNA一個(gè)末端連接該單鏈的DNA接頭序列。

加入與該DNA接頭序列部分特異互補(bǔ)的引物，以與該DNA接頭序列形成互補(bǔ)的雙鏈。

在DNA聚合酶的作用下，將ssDNA形成雙鏈DNA(dsDNA)。

純化后，利用現(xiàn)有的NGS平臺(tái)，進(jìn)行建庫(kù)、測(cè)序等操作。

實(shí)施例2

參照?qǐng)D4，本實(shí)施例中DNA接頭序列為部分雙鏈序列，并且3’端為平端。

從ssDNA出發(fā)，在ssDNA一個(gè)末端連接該部分雙鏈的的DNA接頭序列。

由于DNA接頭序列帶有部分雙鏈模板，可以直接加入DNA聚合酶，在DNA聚合酶的作用下，將ssDNA形成雙鏈DNA(dsDNA)。

純化后，利用現(xiàn)有的NGS平臺(tái)，進(jìn)行建庫(kù)、測(cè)序等操作。

實(shí)施例3

參照?qǐng)D5，本實(shí)施例中DNA接頭序列為部分雙鏈序列，與實(shí)施例2不同之處在于，正鏈3’端縮進(jìn)。

從ssDNA出發(fā)，在ssDNA一個(gè)末端連接該部分雙鏈的的DNA接頭序列。

由于DNA接頭序列帶有部分雙鏈模板，可以直接加入DNA聚合酶，在DNA聚合酶的作用下，將ssDNA形成雙鏈DNA(dsDNA)。

純化后，利用現(xiàn)有的NGS平臺(tái)，進(jìn)行建庫(kù)、測(cè)序等操作。

實(shí)施例4

參照?qǐng)D6，本實(shí)施例中DNA接頭序列為部分雙鏈序列，與實(shí)施例2不同之處在于，正鏈3’端突出。

從ssDNA出發(fā)，在ssDNA一個(gè)末端連接該部分雙鏈的的DNA接頭序列。

由于DNA接頭序列帶有部分雙鏈模板，可以直接加入DNA聚合酶，在DNA聚合酶的作用下，將ssDNA形成雙鏈DNA(dsDNA)。

純化后，利用現(xiàn)有的NGS平臺(tái)，進(jìn)行建庫(kù)、測(cè)序等操作。

實(shí)施例5

參照?qǐng)D7，本實(shí)施例中DNA接頭序列為部分雙鏈序列，與實(shí)施例2不同之處在于，正鏈和反鏈在3’端形成莖環(huán)，并且正鏈和反鏈上在靠近3’端的位置含有尿嘧啶U。

從ssDNA出發(fā)，在ssDNA一個(gè)末端連接該部分雙鏈的的DNA接頭序列。

由于正鏈和反鏈帶有U，因此，需要使用特異性切割尿嘧啶的酶(如NEB公司的USER^TM Enzyme)進(jìn)行處理，去除接頭中的莖環(huán)。然后加入DNA聚合酶，在DNA聚合酶的作用下，將ssDNA形成雙鏈DNA(dsDNA)。

純化后，利用現(xiàn)有的NGS平臺(tái)，進(jìn)行建庫(kù)、測(cè)序等操作。

實(shí)施例6

參照?qǐng)D8，本實(shí)施例中DNA接頭序列為部分雙鏈序列，與實(shí)施例5不同之處在于，反鏈上在靠近3’端的位置含有甲基化修飾堿基X。

從ssDNA出發(fā)，在ssDNA一個(gè)末端連接該部分雙鏈的的DNA接頭序列。

使用特異性切割甲基化修飾DNA的酶(如MspJI等)進(jìn)行處理，去除接頭中的莖環(huán)。然后加入DNA聚合酶，在DNA聚合酶的作用下，將ssDNA形成雙鏈DNA(dsDNA)。

純化后，利用現(xiàn)有的NGS平臺(tái)，進(jìn)行建庫(kù)、測(cè)序等操作。

實(shí)施例7

由于對(duì)藥物安全性的特殊要求，目前寡核苷酸藥物過(guò)程中，每批次合成的藥物均需要進(jìn)行重復(fù)的安全性檢測(cè)，成本高，花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)。本發(fā)明可用于合成的寡核苷酸藥物的質(zhì)量檢測(cè)，具體方法如下：

首先，記錄合格批次的寡核苷酸藥物中活性核苷酸序列以及可能存在的雜質(zhì)的含量和種類。

將后續(xù)批次合成的寡核苷酸藥物粗產(chǎn)品進(jìn)行純化，分離出純化產(chǎn)品和雜質(zhì)產(chǎn)品；

一般情況下，純化產(chǎn)品中會(huì)不可避免的含有部分雜質(zhì)，而雜質(zhì)中也會(huì)存在部分目標(biāo)產(chǎn)物，因此，本發(fā)明可以使用純化產(chǎn)品或者雜質(zhì)產(chǎn)品作為初始ssDNA待測(cè)樣品。

按照上述實(shí)施例1-6中任意一種方法，進(jìn)行NGS定量和定性檢測(cè)，將檢測(cè)結(jié)果與合格批次的結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比，如果二者相符，則該批次合成的寡核苷酸藥物 為合格產(chǎn)品，因此可以大大簡(jiǎn)化不同批次合成藥物檢測(cè)流程和降低檢測(cè)成本。

通過(guò)上述實(shí)施例可以看出，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

1)對(duì)于ssDNA的序列測(cè)定，特別是較短ssDNA的序列測(cè)定，目前缺乏很好的技術(shù)手段，暫時(shí)只有Gansauge等人在2013年發(fā)明的用于ssDNA的序列測(cè)定的方案；該方案比較適合于較少量的ssDNA的序列測(cè)定，而且特別不適合對(duì)ssDNA中序列的定量分析。與之相比，本發(fā)明只使用一個(gè)特定設(shè)計(jì)的接頭，而且在出發(fā)ssDNA量可以保證的情況下，無(wú)需進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以直接進(jìn)行NGS序列測(cè)定，保證了覆蓋效率和絕對(duì)定量的優(yōu)勢(shì)。

2)Gansauge等人在2013年發(fā)明的技術(shù)方案，目前只適用于Illumina平臺(tái)，與其它NGS平臺(tái)匹配的不好，這也限制了該方案的使用范圍。但本發(fā)明方法可以與目前所有的NGS平臺(tái)匹配。

以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 王金，趙國(guó)屏

<120> 一種檢測(cè)DNA序列的方法

<140> 201510198849.9

<141> 2015-04-24

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 歸位內(nèi)切酶識(shí)別和酶切的DNA核心序列

<400> 1

attaccctgt tatcccta 18