本發(fā)明屬于天然植物提取及應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及蒿屬植物奇蒿中單體奇蒿黃酮的提取及其在制備抑制無(wú)乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

無(wú)乳鏈球菌(Streptococcus.agalactiae,SAG)又稱為B族鏈球菌，是一種常見(jiàn)的革蘭氏陽(yáng)性球菌，常寄存于女性生殖道、直腸及呼吸道，為條件致病菌，在健康人群中帶菌率高達(dá)15％～35％。在免疫力低下、抗菌藥物廣泛應(yīng)用或院內(nèi)感染時(shí)，SAG易引起泌尿生殖道感染(張卓然，倪語(yǔ)星.臨床微生物和微生物檢驗(yàn)[M].第3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：86；趙明澤.無(wú)乳鏈球菌感染的臨床特點(diǎn)及耐藥性分析[J].浙江臨床醫(yī)學(xué),2010,12(9):1019-1020.)、皮膚感染、心內(nèi)膜炎、產(chǎn)后感染、新生兒敗血癥和新生兒腦膜炎等，是引起新生兒菌血癥和腦膜炎的常見(jiàn)致病菌(吳健寧，林潤(rùn)華，林健，等.孕婦泌尿生殖道112例無(wú)乳鏈球菌感染的耐藥性分析[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2008，37(3)：88-89.)。

在西方發(fā)達(dá)國(guó)家，SAG是新生兒感染最常見(jiàn)的致病菌，美國(guó)孕婦SAG定植率高達(dá)40％-50％，隨著對(duì)SAG定植孕婦產(chǎn)時(shí)進(jìn)行預(yù)防性抗生素治療，美國(guó)新生兒SAG早發(fā)型敗血癥發(fā)病率發(fā)生明顯降低(Newborn C O I D C O F A,CJ B,CL B,et al.Policy statement—Recommendations for the prevention of perinatal group B streptococcal(GBS)disease.[J].Pediatrics,2011,128(3):611-616.JR V.Prevention of Perinatal Group B Streptococcal Disease Revised Guidelines from CDC,2010[J].MMWR Recommendations&Reports,2010.)。我國(guó)對(duì)SAG感染的研究報(bào)道較少，國(guó)內(nèi)有醫(yī)院檢驗(yàn)室曾檢驗(yàn)出新生兒SAG感染的血培養(yǎng)呈陽(yáng)性，由SAG感染引起的新生兒肺炎、上呼吸道感染數(shù)量較多(吳健寧,林潤(rùn)華,林健等.孕婦泌尿生殖道112例無(wú)乳鏈球菌感染的耐藥性分析[J].醫(yī)學(xué)研究雜志,2008,37(3):88-89)。隨著臨床醫(yī)生和實(shí)驗(yàn)室工作員對(duì)SAG感染的重視，近年來(lái)我國(guó)新生兒SAG感染的病例報(bào)道呈逐漸上升趨勢(shì)，引發(fā)新生兒早發(fā)型敗血癥位居首位的致病菌為SAG，占總感染細(xì)菌的26.15％，根據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，2012年SAG感染病例明顯增加 (戴怡蘅,曾立軍,高平明.新生兒B族鏈球菌敗血癥16例臨床分析[J].中國(guó)新生兒科雜志,2012,27(1):44-46.黃小藝,劉志偉.婦幼保健院新生兒早發(fā)型血流感染分析[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2012,22(11):2329-2332.)。因此，我國(guó)醫(yī)務(wù)工作者應(yīng)盡早對(duì)孕婦進(jìn)行SAG定植檢查，對(duì)高危發(fā)病人群進(jìn)行預(yù)防干預(yù)，降低新生兒早發(fā)型SAG的發(fā)生。

SAG易感染圍產(chǎn)期新生兒及產(chǎn)婦，對(duì)非孕婦成人也發(fā)生感染。相關(guān)報(bào)道表示SAG對(duì)免疫力低下的非孕婦成人引起感染的疾病主要有皮膚軟組織感染、菌血癥、肺炎、骨髓炎，還有其他少見(jiàn)病例如腦膜炎、鏈球菌中毒性休克綜合征、感染性心內(nèi)膜炎等(TH S,MM F,S P,et al.Increasing Burden of Invasive Group B Streptococcal Disease in Nonpregnant Adults,1990-2007[J].Clinical Infectious Diseases,2009,49(1):85-92.)。由無(wú)乳鏈球菌感染引起的心肌內(nèi)膜炎死亡率高，該疾病單純的采用抗生素治療難以控制疾病的發(fā)展(SD P,AC M,DA M,et al.Infective endocarditis caused by Streptococcus agalactiae.[J].Int J Cardiol,1989,(2):179-183.)。SAG也是現(xiàn)在非孕婦成人化膿性關(guān)節(jié)炎的主要病原體，且由該菌引起的敗血癥關(guān)節(jié)炎死亡率最高(Nolla J M,G,Corbella X M P,et al.Group B streptococcus(Streptococcus agalactiae)pyogenic arthritis in nonpregnant adults.[J].Medicine,2003,82(2):119-128.)。我國(guó)無(wú)錫市人民醫(yī)院SAG主要發(fā)生于老年人和患有基礎(chǔ)疾病的患者，其引起的非孕婦成人感染主要有泌尿道感染、呼吸道感染、生殖道感染和皮膚軟組織感染(王艷艷,任靜,徐燕等.無(wú)乳鏈球菌在非孕婦成人患者中的臨床分布特點(diǎn)與耐藥性分析[J].中國(guó)醫(yī)藥科學(xué),2013,(7):87-88.)。非孕婦成人感染SAG的病例在不斷增加且病情嚴(yán)重，控制SAG的感染的發(fā)生迫在眉睫。

隨著抗生素類藥物的大量使用，SAG對(duì)多種抗生素藥物產(chǎn)生了耐藥性。相關(guān)數(shù)據(jù)報(bào)道，SAG對(duì)喹諾酮類、氨基苷類藥物具有耐藥性和大環(huán)內(nèi)酯類具有高度耐藥性(Spanish][I.[Streptococcus agalactiae highly resistant to fluoroquinolones].[J].EnfermedadesInfecciosas y MicrobiologíaClínica,2006,24(9):562-563.；M G,T L,G G,et al.High-Level Aminoglycoside Resistance In The Beta-Hemolytic Group G Streptococcus Isolate Bm2721[J].Antimicrob Agents Chemother.,1999,43(12)::3008–3010.)，對(duì)四環(huán)素耐藥率>90％，對(duì)紅霉素、克林霉素及左氧氟沙星的耐 藥率較高，并呈逐年上升趨勢(shì)(高晶,劉曉艷.女性泌尿生殖道無(wú)乳鏈球菌的耐藥性分析[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2015,(1).1673-8640.2015.01.004.)；SAG對(duì)青霉素、氨芐西林、頭孢曲松、頭孢噻肟和萬(wàn)古霉素?zé)o耐藥性，常選用青霉素作為治療SAG感染的首選藥物(伍婷婷,閔小春,王威.臨床患者感染無(wú)乳鏈球菌分離株的耐藥性分析[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2015,(1).2015-131516.)。青霉素藥物嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)局限了藥物的使用，對(duì)青霉素過(guò)敏的患者可以采用紅霉素或克林霉素進(jìn)行預(yù)防和治療，但其因具有較高的耐藥性，因此對(duì)紅霉素和克林霉素的使用受到了一定的限制。這對(duì)青霉素過(guò)敏者，治療由SAG引起的感染提出了挑戰(zhàn)。從植物中尋找高效、低毒的抗菌有效成分是現(xiàn)在抗生素藥物發(fā)展重要方向，本研究基于奇蒿中藥材的臨床應(yīng)用(榮遠(yuǎn)明,葉琦莉,何善明.用中藥劉寄奴治療急性細(xì)菌性痢疾34例[J].上海中醫(yī)藥雜志,1983,(1)：21.鄧存國(guó).劉寄奴治療早期乳癰效佳[J].中醫(yī)雜志,2008,(9):820-821.)，對(duì)奇蒿的抗菌有效成分(譚蔚峰，王靖，邢新.中藥奇蒿提取物體外抗菌活性的實(shí)驗(yàn)研究[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志，2010，28(2):101-104.)進(jìn)行分離純化，得到具有抗菌活性的去氫母菊內(nèi)酯酮單體化合物。該化合物對(duì)無(wú)乳鏈球菌抗菌效果顯著，為臨床抗生素藥物的研究開發(fā)和利用提供重要物質(zhì)基礎(chǔ)。本發(fā)明可指導(dǎo)中藥材奇蒿藥物資源的合理開發(fā)和應(yīng)用。

中藥奇蒿中含有豐富的化學(xué)成分，經(jīng)天然產(chǎn)物化學(xué)研究報(bào)道(溫晶,史海明,昝珂等.劉寄奴的化學(xué)成分研究[J].中草藥,2010,41:870-873.)奇蒿中所含化合物類型主要為黃酮類，香豆素類及倍半萜內(nèi)酯類等成分。其中，黃酮類化合物和香豆素類化合物均具有很好的抗菌藥理活性(陳秋榮.黃酮類化合物藥理作用的分析[J].中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥,2012,07(21):254-255.鄭玲,趙挺,孫立新.香豆素類化合物的藥理活性和藥代動(dòng)力學(xué)研究進(jìn)展[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2013,24(3):714-717.)，倍半萜類化合物也具有一定的抗菌活性。早期，我國(guó)藥物研究者從黃花蒿中發(fā)現(xiàn)具有抗痢疾桿菌活性顯著的倍半萜內(nèi)酯類化合物青蒿素，為抗痢疾藥物的研究取得了突破性進(jìn)展。文獻(xiàn)報(bào)道(文學(xué).青蒿素抗菌作用研究[J].人參研究,2009,21(4)：38-39)青蒿素對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌也均有明顯抗菌活性，其最低有效濃度分別為0.125mg/mL和0.25mg/mL；楊葉肖槿中倍半萜類化合物曼宋酮對(duì)芽孢桿菌具有一定的抑菌活性，其最低抑菌濃度為4.69ug/mL(Boonsri S,Karalai C,Ponglimanont C,et al.Cytotoxic and Antibacterial Sesquiterpenes from Thespesiapopulnea[J].J.Nat.Prod.,2008,71(7):1173-1177.)。目前，奇蒿中倍半萜類化合物抗菌活性仍未經(jīng)報(bào)道，故本報(bào)道采用臨床常見(jiàn)致病菌檢測(cè)奇蒿中倍半萜內(nèi)酯類化合物去氫母菊內(nèi)酯酮的抗菌藥理活性。

單體去氫母菊內(nèi)酯酮是蒿屬植物奇蒿中重要的倍半萜類化學(xué)成分，目前僅于艾科蒿屬植物銀葉艾蒿和陰地蒿中有此成分的報(bào)道；

前期，國(guó)外學(xué)者Seung-Ho Lee對(duì)中藥陰地蒿進(jìn)行分離純化，得到倍半萜類化合物去氫母菊內(nèi)酯酮(de-hydromatricarin)，該倍半萜類化合物主要存在蒿屬植物中，是蒿屬植物鑒別的重要參考依據(jù)。

去氫母菊內(nèi)酯酮為倍半萜類化合物，其藥理活性研究報(bào)道較少。目前僅有學(xué)者Seung-Ho Lee研究了該化合物的抗癌活性，學(xué)者Seung-Ho Lee從蒿屬植物中分離得到去氫母菊內(nèi)酯酮，并對(duì)其進(jìn)行了重組鼠FPTase(法尼基轉(zhuǎn)移酶)抑制試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果顯示去氫母菊內(nèi)酯酮對(duì)重組鼠FPTase(法尼基轉(zhuǎn)移酶)具有輕度的抑制作用，其IC₅₀為300μM，具有一定的抗癌活性。

國(guó)外學(xué)者Seung-Ho Lee取陰地蒿干燥花1kg，采用甲醇2L提取2次，濃縮提取液得陰地蒿甲醇提取物，提取物經(jīng)硅膠柱層析，甲醇-氯仿系統(tǒng)梯度洗脫得到各組流分，對(duì)各流分進(jìn)行FPTase(法尼基轉(zhuǎn)移酶)活性抑制試驗(yàn)得到活性流分，該活性組分由甲醇-氯仿系統(tǒng)為9:1-8:2洗脫得到，對(duì)該活性流分采用C18反相硅膠柱色譜，甲醇-水梯度洗脫得到70％甲醇洗脫的流分和80％甲醇洗脫的流分，對(duì)該2組流分進(jìn)行Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離，甲醇洗脫，然后對(duì)所得流分進(jìn)行反相高效制備色譜分離，得到去氫母菊內(nèi)酯酮單體化合物。(Lee S,Kang H,Song H,et al.Sesquiterpene Lactones,Inhibitors of Farnesyl Protein Transferase,Isolated from the Flower of Artemisia sylvatica[J].Tetrahedron,2000,56(27):4711–4715.)

以上去氫母菊內(nèi)酯酮提取工藝中采用柱色譜法直接分離粗提物，分離化合物的極性區(qū)間大，分離具有盲目性，工作量大，得到目標(biāo)化合物耗時(shí)長(zhǎng)。且采用活性追蹤法確定分離目標(biāo)化合物，過(guò)程復(fù)雜繁瑣，給提取工藝帶來(lái)了不便。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種蒿屬植物奇蒿中單體去氫母菊內(nèi)酯酮的提取方法及其在制備抑制無(wú)乳鏈球菌藥物中的應(yīng)用。

蒿屬植物奇蒿中單體去氫母菊內(nèi)酯酮的提取方法，按照下述步驟進(jìn)行：

A、制備總粗提物

將中藥奇蒿(南劉寄奴HerbaArtemisiaeAnomalae)粉碎，取奇蒿粉末30kg，加入提取溶劑70％乙醇水(乙醇和水的體積比為7:3)300L，加熱70℃回流提取2h，提取2次，將提取液減壓濃縮，得粗提取物5.3kg。

B、分離純化

將5.3kg粗提取物加水10L溶解，使其混懸，得提取物混懸液，加入石油醚萃取三次(提取物混懸液與每次加入萃取的石油醚體積比為1:2)，棄去三次石油醚萃取液，得到經(jīng)石油醚萃取后的提取物混懸液；再向經(jīng)石油醚萃取后的提取物混懸液中加入氯仿萃取三次(經(jīng)石油醚萃取后的提取物混懸液與每次加入萃取的氯仿體積比為1:2)，合并三次萃取液，減壓回收溶劑得氯仿部位浸膏1.5kg。將氯仿部位浸膏上硅膠色譜柱(氯仿部位浸膏1.5kg，加入1.5kg硅膠干法拌樣上柱，裝柱硅膠7kg，以石油醚-二氯甲烷-甲醇-甲酸系統(tǒng)6:2:1:0.1的混合溶液溶解硅膠裝柱)，用石油醚-二氯甲烷-甲醇-甲酸系統(tǒng)以6:2:1:0.1約60L和4:2:1:0.1約20L進(jìn)行梯度洗脫，流速為3滴/秒，接樣體積1L，各流分采用薄層色譜點(diǎn)樣法點(diǎn)樣，在石油醚-二氯甲烷-甲醇-甲酸為4:2:1:0.1的展開劑系統(tǒng)中，Rf為0.5各流分合并，減壓回收溶劑得到流分Fr1。

流分Fr1用反相高效液相制備，制備條件為色譜柱Kromasil C18(250mm×21.2mm i.d.；5μm)；流動(dòng)相比例為乙腈：0.2％甲酸水＝28:72，流速20ml/min，柱溫25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)250nm，根據(jù)檢測(cè)器譜圖上顯示的出峰位置，時(shí)間段在28.5min到29.5min內(nèi)接收流分“Ⅰ”，得到單體去氫母菊內(nèi)酯酮。

采用高效液相色譜法對(duì)所得流分進(jìn)行純度檢測(cè)，測(cè)得流份“Ⅰ”為單一色譜峰，純度高于99％，揮干溶劑后對(duì)流分“Ⅰ”進(jìn)行MS、¹HNMR和¹³CNMR分析，根據(jù)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)，流分“Ⅰ”為去氫母菊內(nèi)酯酮。

去氫母菊內(nèi)酯酮結(jié)構(gòu)式如下式Ⅰ：

該化合物為白色粉末，ESI-MS m/z:345.1487[M+HCOO]^—,結(jié)合¹H-NMR和¹³C-NMR譜圖數(shù)據(jù)確定分子式為C₁₇H₁₈O₅。¹H-NMR(CDCl₃,600MHz)δ:6.19(1H,t,J＝1.2HZ,H-3),3.49(1H,d,J＝10.2HZ,H-5),3.70(1H,t,J＝10.2HZ,H-6),3.25(1H,dt,J＝3.6,10.2HZ,H-7),4.91(1H,dt,J＝1.8,12.6HZ,H-8),2.71,2.46(IH,dd,J＝2.4,13.8HZ,H-9),6.23,5.64(2H,d,J＝3HZ,H-13),2.33(3H,s,H-14),2.44(3H,s,H-15),2.15(3H,s,H-17)；¹³C-NMR(CDCl₃,600MHz)δ:133.5(C-1),194.8(C-2),135.9(C-3),169.1(C-4),51.5(C-5),81.3(C-6),54.9(C-7),69.2(C-8),44.3(C-9),144.5(C-10),135.9(C-11),169.2(C-12),121.7(C-13),19.7(C-14),21.2(C-15),169.5(C-16),20.9(C-17)；根據(jù)二維核磁譜圖HMBC表示，C10與H15相關(guān)，C16與H17相關(guān)，C4與H14相關(guān)，由COSY譜圖顯示，H5與H6相關(guān)，H6與H7相關(guān)，H7與H8相關(guān)，NOESY譜圖中H7與H5和H9遠(yuǎn)程相關(guān)，通過(guò)以上信息得到化合物Ⅰ結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的去氫母菊內(nèi)酯酮(dehydromatricarin)基本一致，故鑒定該化合物結(jié)構(gòu)為(去氫母菊內(nèi)酯酮)。(Lee S,Kang H,Song H,et al.Sesquiterpene Lactones,Inhibitors of Farnesyl Protein Transferase,Isolated from the Flower of Artemisia sylvatica[J].Tetrahedron,2000,56(27):4711–4715.)

本發(fā)明還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了通過(guò)上述方法制備的單體去氫母菊內(nèi)酯酮，經(jīng)抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示其對(duì)無(wú)乳鏈球菌效果更佳，比現(xiàn)行抗無(wú)乳鏈球菌感染的首選藥青霉素的效果更佳，對(duì)其他臨床常見(jiàn)致病菌也具有一定抗菌活性。

上述制備方法所得的單體去氫母菊內(nèi)酯酮在制備抑制無(wú)乳鏈球菌藥物中的應(yīng)用。

有益效果：

企業(yè)大規(guī)模制備化合物時(shí)，首先對(duì)中藥材進(jìn)行粉碎提取制備粗體物，然后采用不同溶劑萃取粗體物得到各極性部位，通過(guò)TLC薄層層析法確定目標(biāo)化合物所在的極性部位，再對(duì)該極性部位進(jìn)一步分離純化。對(duì)柱層析法得到各流份采用TLC薄層層析法確定目標(biāo)化合物，該確定目標(biāo)化合物的方法較活性追蹤法操作簡(jiǎn)單、快捷、易行。

上述制備所得的單體化合物去氫母菊內(nèi)酯酮具有抗菌活性，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性球菌活性明顯，對(duì)革蘭氏陰性桿菌活性較弱，經(jīng)體外抗菌實(shí)驗(yàn)顯示去氫母菊內(nèi)酯酮對(duì)無(wú)乳鏈球菌(CICC10465)的抑菌濃度是0.1mg/mL，殺菌濃度是0.3mg/mL；對(duì)金黃色葡萄球菌(CMCC26003)的抑菌濃度是0.3mg/mL，殺菌濃度為1mg/mL，對(duì)金黃色葡萄球菌(ATCC6538)的抑菌濃度均為0.1mg/mL，殺菌濃度為1mg/mL；對(duì)革蘭氏陰性桿菌大腸桿菌(CMCC44102)的抑菌濃度為1mg/mL，殺菌濃度為3mg/mL；對(duì)痢疾志賀菌(CMCC(B)51252)的抑菌濃度為0.1mg/mL，殺菌濃度為3mg/mL，其抑菌效果圖見(jiàn)圖9-13。

附圖說(shuō)明

圖1去氫母菊內(nèi)酯酮負(fù)離子模式掃描的MS圖譜，去氫母菊內(nèi)酯酮的加甲酸根負(fù)離子檢測(cè)峰為[M+HCOO]^—＝345.1487m/z

圖2實(shí)施例1正相柱分離流分Fr3中去氫母菊內(nèi)酯酮的高效液相色譜圖。

圖3實(shí)施例1中流分Fr3經(jīng)凝膠柱分離后得到流分A中去氫母菊內(nèi)酯酮的高效液相色譜圖。

圖4實(shí)施例1中流分A中去氫母菊內(nèi)酯酮在反相高效液相制備色譜中檢測(cè)器的位置示意圖。

圖5實(shí)施例1中流分“Ⅰ”(去氫母菊內(nèi)酯酮)純度檢測(cè)的高效液相色譜圖。

圖6實(shí)施例2中正相柱流分Fr3中去氫母菊內(nèi)酯酮的高效液相色譜圖。

圖7實(shí)施例2中流分Fr3中去氫母菊內(nèi)酯酮在反相高效液相制備色譜中檢測(cè)器的位置示意圖。

圖8實(shí)施例2中流分“Ⅰ”(去氫母菊內(nèi)酯酮)純度檢測(cè)的高效液相色譜圖色譜圖。

圖9去氫母菊內(nèi)酯酮對(duì)無(wú)乳鏈球菌的抗菌效果圖

圖10去氫母菊內(nèi)酯酮對(duì)金黃色葡萄球菌(CMCC26003)的抗菌效果圖

圖11去氫母菊內(nèi)酯酮對(duì)金黃色葡萄球菌(ATCC6538)的抗菌效果圖

圖12去氫母菊內(nèi)酯酮對(duì)痢疾志賀菌的抗菌效果圖

圖13去氫母菊內(nèi)酯酮對(duì)大腸桿菌的抗菌效果圖

圖14青霉素G對(duì)無(wú)乳鏈球菌的抗菌效果圖

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。

實(shí)施例1

蒿屬植物中單體奇蒿黃酮的提取方法，按照下述步驟進(jìn)行：

A、制備總粗提物

將南劉寄奴HerbaArtemisiaeAnomalae干藥材30kg粉碎，用300L的70％乙醇水(乙醇和水的體積比為7:3)加熱至70℃回流提取2次，合并提取液，減壓回收溶劑，得粗提物5.3kg。

B、分離純化

將5.3kg粗提取物加水10L溶解，使其混懸，得提取物混懸液，加入石油醚萃取三次(提取物混懸液與每次加入萃取的石油醚體積比為1:2)，合并三次萃取液，減壓回收溶劑得石油醚部位浸膏，棄去三次石油醚部位浸膏，得到經(jīng)石油醚萃取后的提取物混懸液；再向經(jīng)石油醚萃取后的提取物混懸液中加入氯仿萃取三次(經(jīng)石油醚萃取后的提取物混懸液與每次加入萃取的氯仿體積為1:2)，合并三次萃取液，減壓回收溶劑得氯仿部位浸膏；將氯仿部位浸膏上硅膠柱色譜(氯仿部位浸膏1.5kg，加入1.5kg硅膠干法拌樣上柱，裝柱硅膠7kg，以石油醚-二氯甲烷-甲醇-甲酸系統(tǒng)8:2:1:0.1的溶液溶解硅膠裝柱。)，用石油醚-二氯甲烷-甲醇-甲酸系統(tǒng)以8:2:1:0.1、6:2:1:0.1、4:2:1:0.1、2:2:1:0.1、1:1:1:0.1進(jìn)行梯度洗脫，每個(gè)梯度約60L，流速為3滴/秒，各流分接樣體積1L，通過(guò)薄層層析法對(duì)各流分進(jìn)行點(diǎn)樣，合并相同極性的流分，按極性差別從小到大共得到7個(gè)部分洗脫液Fr1-Fr7，其中Fr3部分為6:2:1:0.1和4:2:1:0.1洗脫部分，該部分在極性為4:2:1:0.1的石油醚-二氯甲烷-甲醇-甲酸展開劑系統(tǒng)中Rf值為0.5。Fr3經(jīng)HPLC檢測(cè)，出峰時(shí)間t＝26.232為目標(biāo)化合物峰。Fr3的HPLC譜圖見(jiàn)2。

流分Fr3用Sephadex G-20凝膠柱色譜分離，用氯仿-甲醇1:1溶液2L等度 洗脫，流速為6秒/滴，接樣體積約接50mL，合并相同極性流份，得組分Fr3a-Fr3q，各流分經(jīng)HPLC檢測(cè)，出峰時(shí)間26.232min為目標(biāo)化合物去氫母菊內(nèi)酯酮的峰，合并含有目標(biāo)峰的樣品流分Fr3h-Fr3n得流分A。流分A的HPLC檢測(cè)譜圖見(jiàn)圖3，保留時(shí)間為25.228min為目標(biāo)化合物峰。

以上制備過(guò)程中HPLC法色譜條件為色譜柱Kromasil C18(250mm×4.6mm i.d.；5μm)；流動(dòng)相比例為乙腈(A)：0.2％甲酸水(B)；梯度洗脫，0～20min，35％～50％A，20min～30min，50％～60％A，30min～45min，60％～95％A，流速1ml/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)250nm。

流分A用反相高效液相制備，制備條件為色譜柱Kromasil C18(250mm×21.2mm i.d.；5μm)；流動(dòng)相比例為乙腈：0.2％甲酸水＝28:72，流速20ml/min，柱溫25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)250nm，根據(jù)檢測(cè)器譜圖上顯示，時(shí)間段在28.5min到29.5min內(nèi)接收流分“Ⅰ”，如下圖4(出峰時(shí)間t＝29min處為去氫母菊內(nèi)酯酮的吸收峰)。

采用高效液相色譜法對(duì)所得流分進(jìn)行純度檢測(cè)，測(cè)得流份“Ⅰ”為單一色譜峰，純度高于99％，揮干溶劑后對(duì)流分“Ⅰ”進(jìn)行MS、¹HNMR和¹³CNMR分析，根據(jù)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)，流分“Ⅰ”為去氫母菊內(nèi)酯酮。去氫母菊內(nèi)酯酮的MS譜圖見(jiàn)圖1，流分“Ⅰ”的HPLC檢測(cè)譜圖見(jiàn)圖5(出峰時(shí)間t＝8.696min處為去氫母菊內(nèi)酯酮的吸收峰)。

去氫母菊內(nèi)酯酮的結(jié)構(gòu)式Ⅰ如下：

該化合物為白色粉末，ESI-MS m/z:345.1487[M+HCOO]^—,結(jié)合¹H-NMR和¹³C-NMR譜圖數(shù)據(jù)確定分子式為C₁₇H₁₈O₅。¹H-NMR(CDCl₃,600MHz)δ:6.19(1H,t,J＝1.2HZ,H-3),3.49(1H,d,J＝10.2HZ,H-5),3.70(1H,t,J＝10.2HZ,H-6), 3.25(1H,dt,J＝3.6,10.2HZ,H-7),4.91(1H,dt,J＝1.8,12.6HZ,H-8),2.71,2.46(IH,dd,J＝2.4,13.8HZ,H-9),6.23,5.64(2H,d,J＝3HZ,H-13),2.33(3H,s,H-14),2.44(3H,s,H-15),2.15(3H,s,H-17)；¹³C-NMR(CDCl₃,600MHz)δ:133.5(C-1),194.8(C-2),135.9(C-3),169.1(C-4),51.5(C-5),81.3(C-6),54.9(C-7),69.2(C-8),44.3(C-9),144.5(C-10),135.9(C-11),169.2(C-12),121.7(C-13),19.7(C-14),21.2(C-15),169.5(C-16),20.9(C-17)；根據(jù)二維核磁譜圖HMBC表示，C10與H15相關(guān)，C16與H17相關(guān)，C4與H14相關(guān)，由COSY譜圖顯示，H5與H6相關(guān)，H6與H7相關(guān)，H7與H8相關(guān)，NOESY譜圖中H7與H5和H9遠(yuǎn)程相關(guān)，通過(guò)以上信息得到化合物Ⅰ結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)^[13]報(bào)道的去氫母菊內(nèi)酯酮(dehydromatricarin)基本一致，故鑒定該化合物結(jié)構(gòu)為(去氫母菊內(nèi)酯酮)。(Lee S,Kang H,Song H,et al.Sesquiterpene Lactones,Inhibitors of Farnesyl Protein Transferase,Isolated from the Flower of Artemisia sylvatica[J].Tetrahedron,2000,56(27):4711–4715.)

實(shí)施例2

A、制備總粗提物

取奇蒿(南劉寄奴HerbaArtemisiaeAnomalae)干藥材30kg粉碎，用300L的70％乙醇水(乙醇和水的體積比為7:3)加熱至70℃回流提取2次，合并提取液，減壓回收溶劑，得粗提物5.3kg。

B、分離純化

將5.3kg粗提取物加水10L溶解，使其混懸，得提取物混懸液，加入石油醚萃取三次(提取物混懸液與每次加入萃取的石油醚體積比為1:2)，合并三次萃取液，減壓回收溶劑得石油醚部位浸膏，棄去三次石油醚部位浸膏，得到經(jīng)石油醚萃取后的提取物混懸液；再向經(jīng)石油醚萃取后的提取物混懸液中加入氯仿萃取三次(經(jīng)石油醚萃取后的提取物混懸液與每次加入萃取的氯仿體積為1:2)，合并三次萃取液，減壓回收溶劑得氯仿部位浸膏；將氯仿部位浸膏上硅膠柱色譜(氯仿部位浸膏1.5kg，加入1.5kg硅膠干法拌樣上柱，裝柱硅膠7kg，以石油醚-二氯甲烷-甲醇-甲酸系統(tǒng)8:2:1:0.1的溶液溶解硅膠裝柱。)，用石油醚-二氯甲烷-甲醇-甲酸系統(tǒng)以8:2:1:0.1、6:2:1:0.1、4:2:1:0.1、2:2:1:0.1、1:1:1:0.1進(jìn)行梯度洗脫，每個(gè)梯度約60L，流速為3滴/秒，各流分接樣體積1L，通過(guò)薄層層析法對(duì)各流分進(jìn)行點(diǎn)樣，合并相同極性的流分，按極性差別從小到大共得到7個(gè)部分洗脫液 Fr1-Fr7，其中Fr3部分為6:2:1:0.1和4:2:1:0.1洗脫部分，該部分在極性為4:2:1:0.1的石油醚-二氯甲烷-甲醇-甲酸展開劑系統(tǒng)中Rf值為0.5。Fr3經(jīng)HPLC檢測(cè)，色譜條件為色譜柱Kromasil C18(250mm×4.6mm i.d.；5μm)，流動(dòng)相比例為乙腈：0.2％甲酸水＝43:57，流速1ml/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)250nm，出峰時(shí)間t＝24.333為目標(biāo)化合物峰。Fr3的HPLC譜圖見(jiàn)6。

流分Fr3用反相高效液相制備，制備條件為色譜柱Kromasil C18(250mm×21.2mm i.d.；5μm)；流動(dòng)相比例為乙腈：0.2％甲酸水＝28:72，流速20ml/min，柱溫25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)250nm，根據(jù)檢測(cè)器譜圖上顯示，時(shí)間段在28.5min到29.5min內(nèi)接收流分“Ⅰ”，如下圖7(出峰時(shí)間t＝29min處去氫母菊內(nèi)酯酮的吸收峰)。

采用高效液相色譜法對(duì)所得流分進(jìn)行純度檢測(cè)，測(cè)得流份“Ⅰ”為單一色譜峰，純度高于99％，揮干溶劑后對(duì)流分“Ⅰ”進(jìn)行MS、¹HNMR和¹³CNMR分析，根據(jù)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)，流分“Ⅰ”為去氫母菊內(nèi)酯酮。流分“Ⅰ”為去氫母菊內(nèi)酯酮純度檢測(cè)HPLC譜圖見(jiàn)圖8，去氫母菊內(nèi)酯酮的MS譜圖見(jiàn)圖1。

去氫母菊內(nèi)酯酮的結(jié)構(gòu)式Ⅰ如下：

該化合物為白色粉末，ESI-MS m/z:345.1487[M+HCOO]^—,結(jié)合¹H-NMR和¹³C-NMR譜圖數(shù)據(jù)確定分子式為C₁₇H₁₈O₅。¹H-NMR(CDCl₃,600MHz)δ:6.19(1H,t,J＝1.2HZ,H-3),3.49(1H,d,J＝10.2HZ,H-5),3.70(1H,t,J＝10.2HZ,H-6),3.25(1H,dt,J＝3.6,10.2HZ,H-7),4.91(1H,dt,J＝1.8,12.6HZ,H-8),2.71,2.46(IH,dd,J＝2.4,13.8HZ,H-9),6.23,5.64(2H,d,J＝3HZ,H-13),2.33(3H,s,H-14),2.44(3H,s,H-15),2.15(3H,s,H-17)；¹³C-NMR(CDCl₃,600MHz)δ:133.5(C-1),194.8 (C-2),135.9(C-3),169.1(C-4),51.5(C-5),81.3(C-6),54.9(C-7),69.2(C-8),44.3(C-9),144.5(C-10),135.9(C-11),169.2(C-12),121.7(C-13),19.7(C-14),21.2(C-15),169.5(C-16),20.9(C-17)；根據(jù)二維核磁譜圖HMBC表示，C10與H15相關(guān)，C16與H17相關(guān)，C4與H14相關(guān)，由COSY譜圖顯示，H5與H6相關(guān)，H6與H7相關(guān)，H7與H8相關(guān)，NOESY譜圖中H7與H5和H9遠(yuǎn)程相關(guān)，通過(guò)以上信息得到化合物Ⅰ結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)^[13]報(bào)道的去氫母菊內(nèi)酯酮(dehydromatricarin)基本一致，故鑒定該化合物結(jié)構(gòu)為(去氫母菊內(nèi)酯酮)。(Lee S,Kang H,Song H,et al.Sesquiterpene Lactones,Inhibitors of Farnesyl Protein Transferase,Isolated from the Flower of Artemisia sylvatica[J].Tetrahedron,2000,56(27):4711–4715.)

實(shí)施例3

去氫母菊內(nèi)酯酮的體外實(shí)驗(yàn)

一、主要試驗(yàn)材料

菌種：金黃色葡萄球菌(CMCC26003)、大腸桿菌(CMCC44102)購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；金黃色葡萄球菌(ATCC6538)、痢疾志賀菌[CMCC(B)51252]和無(wú)乳鏈球菌(CICC10465)購(gòu)自南京便診生物科技有限公司。

主要試劑：青霉素G鈉鹽無(wú)水購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；改良肉湯培養(yǎng)基和血瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；96孔板和培養(yǎng)皿購(gòu)自廣州潔特生物過(guò)濾制品有限公司。

主要儀器：LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-ID型單人凈化工作臺(tái)，蘇州凈化；ELX800酶標(biāo)儀，基因有限公司；HZQ-X100恒溫振蕩培養(yǎng)箱，華美生化儀器；DHP-022電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海申賢恒溫設(shè)備廠。

二、去氫母菊內(nèi)酯酮的抗菌實(shí)驗(yàn)

藥物配制：待篩樣品去氫母菊內(nèi)酯酮以10mg/ml溶解于體積分?jǐn)?shù)50％的乙醇溶劑中，陽(yáng)性藥(青霉素G鈉鹽)以100mg/ml溶解于蒸餾水中。

菌種活化和培養(yǎng)：

a.稱取18g改良肉湯培養(yǎng)基于300ml蒸餾水中，于121℃滅菌20min。無(wú)菌條件下，分裝至15ml的離心管中，每管10ml。

b.取1ml培養(yǎng)基至菌種凍干粉中，吹打混勻后轉(zhuǎn)移到15ml離心管，于37℃，150rpm培養(yǎng)24h。

c.取100ul菌懸液涂布于血瓊脂培養(yǎng)基表面，于37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。挑取單克隆于肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h。

3.MBC和MIC測(cè)定：

a.取培養(yǎng)24h后的細(xì)菌種96孔板，每孔100ul；設(shè)置不加藥孔，加藥孔和陽(yáng)性對(duì)照藥孔。加藥濃度從3mg/ml起，用培養(yǎng)基3倍梯度稀釋，共6個(gè)梯度。陽(yáng)性對(duì)照藥孔從10mg/ml起，3倍梯度稀釋，共6個(gè)梯度。

b.酶標(biāo)板490nm測(cè)定OD值：加完藥測(cè)定0h，2h，4h，8h和24h共6個(gè)時(shí)間點(diǎn)，計(jì)算MIC。

c.取酶標(biāo)板中有抑菌效果的菌液，均勻涂抹于平板培養(yǎng)基上，生化培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，無(wú)菌落形成的最小濃度即為MBC.

三、試驗(yàn)結(jié)果及分析

該研究選用青霉素為陽(yáng)性對(duì)照藥，分別考察了去氫母菊內(nèi)酯酮對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、痢疾志賀菌以及無(wú)乳鏈球菌的抗菌活性。結(jié)果顯示去氫母菊內(nèi)酯酮對(duì)無(wú)乳鏈球菌(CICC10465)的抑菌濃度是0.1mg/mL，殺菌濃度是0.3mg/mL；對(duì)金黃色葡萄球菌(CMCC26003)的抑菌濃度是0.3mg/mL，殺菌濃度為1mg/mL，對(duì)金黃色葡萄球菌(ATCC6538)的抑菌濃度均為0.1mg/mL，殺菌濃度為1mg/mL；對(duì)革蘭氏陰性桿菌大腸桿菌(CMCC44102)的抑菌濃度為1mg/mL，殺菌濃度為3mg/mL；對(duì)痢疾志賀菌(CMCC(B)51252)的抑菌濃度為0.1mg/mL，殺菌濃度為3mg/mL。青霉素對(duì)無(wú)乳鏈球菌(CICC10465)的抑菌濃度是3mg/mL，殺菌濃度是3mg/mL。去氫母菊內(nèi)酯酮對(duì)各臨床致病菌活性效果圖見(jiàn)圖9-13，青霉素對(duì)無(wú)乳鏈球菌抗菌效果圖見(jiàn)圖14。

以上活性數(shù)據(jù)表示，去氫母菊內(nèi)酯酮對(duì)檢測(cè)各臨床致病菌的抑菌活性強(qiáng)弱順序?yàn)椋簾o(wú)乳鏈球菌(CICC10465)＝痢疾志賀菌(CMCC(B)51252)＝金黃色葡萄球菌(ATCC6538)>金黃色葡萄球菌(CMCC26003)>大腸桿菌(CMCC44102)；去氫母菊內(nèi)酯酮對(duì)檢測(cè)各臨床致病菌的殺菌活性強(qiáng)弱順序?yàn)?無(wú)乳鏈球菌(CICC10465)>金黃色葡萄球菌(ATCC6538)＝金黃色葡萄球菌(CMCC26003)>痢疾志賀菌(CMCC(B)51252)＝大腸桿菌(CMCC44102),綜合以上活性數(shù)據(jù)順 序,可以發(fā)現(xiàn)去氫母菊內(nèi)酯酮對(duì)各檢測(cè)致病菌的抗菌活性強(qiáng)弱順序?yàn)?無(wú)乳鏈球菌(CICC10465)>金黃色葡萄球菌(ATCC6538)>痢疾志賀菌(CMCC(B)51252)>金黃色葡萄球菌(CMCC26003)>大腸桿菌(CMCC44102)，表示去氫母菊內(nèi)酯酮對(duì)無(wú)乳鏈球菌的抗菌作用效果最顯著，以上抗菌效果圖見(jiàn)圖9-13。

根據(jù)實(shí)例3方案對(duì)單體去氫母菊內(nèi)酯酮進(jìn)行的體外抗菌實(shí)驗(yàn)，活性數(shù)據(jù)顯示去氫母菊內(nèi)酯酮對(duì)無(wú)乳鏈球菌(CICC10465)的抑菌濃度是0.1mg/mL，其陽(yáng)性對(duì)照藥青霉素對(duì)無(wú)乳鏈球菌(CICC10465)的抑菌濃度是3mg/mL，去氫母菊內(nèi)酯酮對(duì)無(wú)乳鏈球菌(CICC10465)的抑菌活性是青霉素的30倍；去氫母菊內(nèi)酯酮對(duì)無(wú)乳鏈球菌(CICC10465)的殺菌濃度是0.3mg/mL，青霉素對(duì)無(wú)乳鏈球菌(CICC10465)的殺菌濃度是3mg/mL，即去氫母菊內(nèi)酯酮對(duì)無(wú)乳鏈球菌(CICC10465)的殺菌活性是青霉素的10倍。以上對(duì)比數(shù)據(jù)表明去氫母菊內(nèi)酯酮抗無(wú)乳鏈球菌活性顯著，能有效的抑制和殺死無(wú)乳鏈球菌，且抗菌活性明顯高于陽(yáng)性藥青霉素，青霉素抗菌效果圖見(jiàn)14。

我國(guó)對(duì)SAG感染的重視和防治研究較晚，且長(zhǎng)期大量不規(guī)范使用抗生素藥物，導(dǎo)致SAG對(duì)多種抗生素藥物產(chǎn)生了耐藥性。目前，SAG對(duì)青霉素的耐藥性較小，從天然產(chǎn)物中尋找抗生素替代藥物以免其對(duì)現(xiàn)行抗生素藥物產(chǎn)生耐藥性，對(duì)SAG耐藥性的控制具有重要意義。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)去氫母菊內(nèi)酯酮對(duì)SAG的抗菌活性顯著，且較現(xiàn)行首選抗SAG感染藥物青霉素的抗菌活性強(qiáng)10倍以上，具有替代青霉素治療SAG感染的潛力，對(duì)研究開發(fā)有效的抗SAG感染藥物提供有效物質(zhì)資源。去氫母菊內(nèi)酯酮對(duì)金黃色葡萄球菌也表現(xiàn)出明顯的抗菌活性，并對(duì)革蘭氏陰性桿菌痢疾志賀菌和大腸桿菌具有一定的抗菌作用，因此，去氫母菊內(nèi)酯酮可研究開發(fā)為廣譜抗菌藥物。本發(fā)明考察了去氫母菊內(nèi)酯酮的體外抗菌活性，為進(jìn)一步研究該化合物的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)和生物利用度提供科學(xué)依據(jù)。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等同物界定。