本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及生產(chǎn)L-2-氨基丁酸的重組菌及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：L-2-氨基丁酸是抑制人體神經(jīng)信息傳遞的脂肪族氨基酸，具有降低血氨，加強(qiáng)葡萄糖磷酸酯酶的活性，促進(jìn)腦細(xì)胞代謝等功能，臨床可用于腦血管病后遺癥的治療和牙科的無(wú)痛去齲。此外，L-2-氨基丁酸還是一種重要的化工原料和醫(yī)藥中間體，已廣泛應(yīng)用于抗結(jié)核藥物鹽酸乙胺丁醇和抗癲癇藥物左乙拉西坦等的合成。L-2-氨基丁酸的生產(chǎn)方法主要分為化學(xué)法、酶法和微生物發(fā)酵法。化學(xué)法主要包括脫硫反應(yīng)法、正丁酸鹵代反應(yīng)法、丁酮酸還原法等。化學(xué)法研究起步較早，雖然工藝成熟，但化學(xué)合成法存在耗能高、環(huán)境污染大、生產(chǎn)成本高等缺點(diǎn)，不利于工業(yè)化應(yīng)用；微生物發(fā)酵法指利用大腸桿菌等微生物直接發(fā)酵生產(chǎn)L-2-氨基丁酸。目前，國(guó)外對(duì)于微生物發(fā)酵法合成L-2-氨基丁酸的研究有一篇報(bào)道(ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2010,107(14):6234-6239.)，該報(bào)道在傳統(tǒng)誘變菌種大腸桿菌ATCC98082的基礎(chǔ)上通過(guò)突變篩選谷氨酸脫氫酶及過(guò)表達(dá)蘇氨酸脫氨酶構(gòu)建了一株L-2-氨基丁酸的工程菌，但該工程菌L-2-氨基丁酸產(chǎn)量只有5.4g/L，與實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用存在較大差距。中國(guó)專(zhuān)利201210015308.4在蘇氨酸高產(chǎn)菌株的基礎(chǔ)上，通過(guò)過(guò)表達(dá)蘇氨酸脫氨酶與氨基酸脫氫酶合成L-2-氨基丁酸，但該方法發(fā)酵60h，L-2-氨基丁酸產(chǎn)量只有20g/L，仍無(wú)法適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)需求；酶法制備L-2-氨基丁酸主要分為轉(zhuǎn)氨酶法、脫氫酶法、氨基?；阜?、氨基氧化酶法等。脫氫酶法是指2-酮丁酸在脫氫酶的催化作用下合成L-2-氨基丁酸。Galkin和Kulakova等利用大腸桿菌共表達(dá)L-亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶，其中L-亮氨酸脫氫酶能夠催化丁酮酸和NH3生產(chǎn)L-2-氨基丁酸，甲酸脫氫酶以甲酸銨為底物再生NADH，釋放出二氧化碳和NH3(AppliedandEnvironmentalMicrobiology,1997,63(12):4651-4656.)，此法生產(chǎn)L-2-氨基丁酸濃度達(dá)到36g/L，轉(zhuǎn)化率大于80％。但該方法以2-酮丁酸為原料，大大提高了原料成本，導(dǎo)致生產(chǎn)成本較高，限制了該工藝的工業(yè)化應(yīng)用。中國(guó)專(zhuān)利201210066624.4和201010139227.6等報(bào)道了以L-蘇氨酸為原料，先由蘇氨酸脫氨酶轉(zhuǎn)化成2-酮丁酸，再由亮氨酸脫氫酶催化2-酮丁酸合成L-2-氨基丁酸，反應(yīng)中加入輔酶再生體系。由于專(zhuān)利中所用酶催化劑需要克隆表達(dá)后經(jīng)細(xì)胞破碎提取或直接購(gòu)買(mǎi)，大大增加了生產(chǎn)成本，不利于推廣應(yīng)用。轉(zhuǎn)氨酶法是指2-酮丁酸在轉(zhuǎn)氨酶的催化作用下合成2-氨基丁酸(圖1)。1999年，F(xiàn)otheringham等利用大腸桿菌K12菌株過(guò)表達(dá)酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶、蘇氨酸脫氨酶及乙酰乳酸合成酶，以L-蘇氨酸和L-天冬氨酸為底物通過(guò)轉(zhuǎn)氨反應(yīng)合成了L-2-氨基丁酸，同時(shí)通過(guò)乙酰乳酸合成酶消除副產(chǎn)物丙酮酸(Bioorganic&MedicinalChemistry,1999,7(10):2209-2213.)。但是該法生產(chǎn)L-2-氨基丁酸的轉(zhuǎn)化率僅為54％，產(chǎn)量?jī)H為27.8g/L，且轉(zhuǎn)化過(guò)程中產(chǎn)生副產(chǎn)物NH3、L-丙氨酸和3-羥基-2-丁酮，由于L-2-氨基丁酸與副產(chǎn)物丙氨酸性質(zhì)相似，導(dǎo)致該法制備的2-氨基丁酸純化較為困難。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供能夠提高L-2-氨基丁酸產(chǎn)量的重組菌及其制備方法，以及利用重組菌生產(chǎn)L-2-氨基丁酸的方法。為此，本發(fā)明一方面提供一種生產(chǎn)L-2-氨基丁酸的重組菌,所述重組菌為同時(shí)過(guò)表達(dá)蘇氨酸脫氨酶、轉(zhuǎn)氨酶和谷氨酸脫氫酶的菌株。在上述技術(shù)方案中，所述蘇氨酸脫氨酶的氨基酸序列為SEQIDNo.2或SEQIDNo.5所示，所述轉(zhuǎn)氨酶的氨基酸序列為SEQIDNo.7、SEQIDNo.9、SEQIDNo.11或SEQIDNo.13所示，所述谷氨酸脫氫酶的氨基 酸序列為SEQIDNo.15所示；所述蘇氨酸脫氨酶的基因序列為SEQIDNo.1中10～1554位或SEQIDNo.3中10～999位所示，所述轉(zhuǎn)氨酶的基因序列為SEQIDNo.6中22～951位、SEQIDNo.8中15～1208位、SEQIDNo.10中9～1388位或SEQIDNo.12中9～1262位所示，所述谷氨酸脫氫酶的基因序列為SEQIDNo.14中177～1520位所示。在上述技術(shù)方案中，所述重組菌的出發(fā)菌為埃希氏菌屬的細(xì)菌，優(yōu)選為大腸桿菌(Escherichiacoli)，更優(yōu)選為E.coliBL21(DE3)。本發(fā)明的另一方面，提供一種制備L-2-氨基丁酸重組菌的方法，包括如下步驟：同時(shí)過(guò)表達(dá)蘇氨酸脫氨酶、轉(zhuǎn)氨酶及谷氨酸脫氫酶，得到所述重組菌。在上述技術(shù)方案中，所述過(guò)表達(dá)蘇氨酸脫氨酶、轉(zhuǎn)氨酶及谷氨酸脫氫酶通過(guò)如下步驟實(shí)現(xiàn)：增加出發(fā)菌中蘇氨酸脫氨酶、轉(zhuǎn)氨酶及谷氨酸脫氫酶基因的拷貝數(shù)。在上述技術(shù)方案中，所述方法進(jìn)一步包括將所述出發(fā)菌的谷氨酸脫氫酶基因的啟動(dòng)子替換為具有更強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性的元件，和/或?qū)⑺龀霭l(fā)菌的蘇氨酸脫氨酶基因的核糖體結(jié)合位點(diǎn)替換為具有更強(qiáng)翻譯活性的元件。所述更強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性的元件和更強(qiáng)翻譯活性的元件可為任何轉(zhuǎn)錄活性較高的元件和任何翻譯活性較高的元件，例如本發(fā)明中使用的RBS(SEQIDNo.4中33-39bp核苷酸序列)和強(qiáng)啟動(dòng)子T7(SEQIDNo.14中85-109bp核苷酸序列)。在上述技術(shù)方案中，通過(guò)攜帶所述蘇氨酸脫氨酶、轉(zhuǎn)氨酶及谷氨酸脫氫酶基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化所述出發(fā)菌來(lái)增加所述出發(fā)菌中蘇氨酸脫氨酶、轉(zhuǎn)氨酶及谷氨酸脫氫酶基因的拷貝數(shù)；攜帶蘇氨酸脫氨酶、轉(zhuǎn)氨酶及谷氨酸脫氫酶基因的表達(dá)質(zhì)粒沒(méi)有限制，可以是任何能夠高效表達(dá)目的蛋白的質(zhì)粒；優(yōu)選地，所述質(zhì)粒為pET28a。在上述技術(shù)方案中，所述蘇氨酸脫氨酶的基因序列為SEQIDNo.1中10～1554位或SEQIDNo.3中10～999位所示，所述轉(zhuǎn)氨酶的基因序列為SEQIDNo.6中22～951位、SEQIDNo.8中15～1208位、SEQIDNo.10中9～1388位或SEQIDNo.12中9～1262位所示，所述谷氨酸脫氫酶的基因序列為SEQIDNo.14中177～1520位所示。其中，所述蘇氨酸脫氨酶選自但不限于大腸桿菌、芽胞桿菌，轉(zhuǎn)氨酶選自但不限于大腸桿菌、芽胞桿菌。谷氨酸脫氫酶選自但不限于，大腸桿菌。所述大腸桿菌蘇氨酸脫氨酶可以為合成型蘇氨酸脫氨酶IlvA或分解型蘇氨酸脫氨酶TdcB；所述芽胞桿菌蘇氨酸脫氨酶可以為枯草芽胞桿菌蘇氨酸脫氨酶IlvA。所述大腸桿菌轉(zhuǎn)氨酶可以為支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶IlvE、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶AvtA、酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶TyrB、腐胺氨基轉(zhuǎn)移酶PatA。所述芽胞桿菌轉(zhuǎn)氨酶可以為支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶IlvK、轉(zhuǎn)氨酶PatA或磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶SerC。谷氨酸脫氫酶為大腸桿菌谷氨酸脫氫酶GdhA。在上述技術(shù)方案中，所述出發(fā)菌為選自埃希氏菌屬的細(xì)菌，優(yōu)選為大腸桿菌(Escherichiacoli)，更優(yōu)選為E.coliBL21(DE3)。本發(fā)明的再一方面，提供一種利用上述任意一項(xiàng)所述的重組菌生產(chǎn)L-2-氨基丁酸的方法，包括如下步驟：A)培養(yǎng)重組菌，在所述重組菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的中期，進(jìn)行異丙基硫代半乳糖苷誘導(dǎo)，異丙基硫代半乳糖苷誘導(dǎo)濃度為0.01mmol/L～1mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)至菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期或穩(wěn)定期前期對(duì)培養(yǎng)的菌體進(jìn)行離心，收集菌體；B)以緩沖液攪拌懸浮步驟A)中收集的重組菌，直接利用菌體細(xì)胞在底物蘇氨酸和氨基供體谷氨酸存在下進(jìn)行催化生產(chǎn)。所述底物蘇氨酸濃度為0.1～300g/L,谷氨酸為5～150g/L，催化條件為37℃、pH為6.0～7.5、DO為20％～60％。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，與現(xiàn)有的L-2-氨基丁酸生產(chǎn)方法相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)、本發(fā)明的重組菌通過(guò)過(guò)表達(dá)蘇氨酸脫氨酶、轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酸脫氫酶，可以利用蘇氨酸脫氨酶、轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酸脫氫酶三酶催化體系生產(chǎn)L-2-氨基丁酸，實(shí)現(xiàn)了催化副產(chǎn)物α-酮戊二酸的循環(huán)利用，進(jìn)而提高了底物氨基供體的利用率，有效提高了L-2-氨基丁酸的產(chǎn)量和底物轉(zhuǎn)化率。(2)本發(fā)明全部采用過(guò)表達(dá)關(guān)鍵酶的全細(xì)胞進(jìn)行催化反應(yīng)，避免了酶催化劑的提取等過(guò)程，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝。附圖說(shuō)明參考以下附圖，將有助于更好地理解本發(fā)明的方案及有益效果。圖1為轉(zhuǎn)氨酶法制備L-2-氨基丁酸的反應(yīng)原理圖。圖2為本發(fā)明制備L-2-氨基丁酸的反應(yīng)原理圖。圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的表達(dá)質(zhì)粒pET28a-tdcB的示意圖。圖4為本發(fā)明實(shí)施例提供的表達(dá)質(zhì)粒pET28a-tdcB-ilvE的示意圖。圖5為本發(fā)明實(shí)施例提供的SDS-PAGE蛋白檢測(cè)圖。圖6為本發(fā)明實(shí)施例提供的表達(dá)質(zhì)粒pET28a-tdcB-ilvE-gdhA的示意圖。具體實(shí)施方式為了便于理解，以下將通過(guò)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。依據(jù)本說(shuō)明書(shū)的論述，本發(fā)明的許多變化、改變對(duì)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)都是顯而易見(jiàn)的。另外，本發(fā)明引用了公開(kāi)文獻(xiàn)，這些文獻(xiàn)是為了更清楚地描述本發(fā)明，它們的全文內(nèi)容均納入本文進(jìn)行參考，就好像它們的全文已經(jīng)在本文中重復(fù)敘述過(guò)一樣。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中如未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段和市售的常用儀器、試劑，可參見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第3版)》(科學(xué)出版社)、《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)(第4版)》(高等教育出版社)以及相應(yīng)儀器和試劑的廠商說(shuō)明書(shū)等參考。以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而非用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1、L-2-氨基丁酸初級(jí)工程菌ABA1和ABA2的構(gòu)建一、蘇氨酸脫氨酶表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建蘇氨酸脫氨酶催化蘇氨酸脫氨生產(chǎn)2-酮丁酸，過(guò)表達(dá)蘇氨酸脫氨酶，促進(jìn)蘇氨酸向2-酮丁酸的轉(zhuǎn)化。根據(jù)Genbank中E.coliK12W3110的ilvA基因設(shè)計(jì)引物，以E.coliK12W3110基因組為模板，分別以WY1423、WY1424為引物，使用高保真聚合酶KAPAHiFiTMHotStar進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR按如下方式進(jìn)行：94℃變性30s(秒)，54℃退火30s(秒)，以及72℃延伸30s(秒)(30個(gè)循環(huán))，PCR擴(kuò)增得到1560bp的PCR產(chǎn)物(序列1)，將PCR獲得的DNA片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離純化，回收片段經(jīng)NdeI和BamHI雙酶切后，與同樣雙酶切處理的表達(dá)載體pET28a(購(gòu)自Novagen公司)連接。連接產(chǎn)物采用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α，在含卡那霉素(50μg/mL)的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子傳代培養(yǎng)三代后，以WB923和WB924為引物，采用菌落PCR鑒定轉(zhuǎn)化子，得到1845bp為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，對(duì)鑒定正確的轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，并對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行NdeI和BamHI雙酶切鑒定，得到1560bp酶切片段的為正確質(zhì)粒。將PCR和酶切鑒定正確的質(zhì)粒送去測(cè)序，結(jié)果該質(zhì)粒為將序列表中序列1所示的核苷酸插入載體pET28a中得到的重組質(zhì)粒，命名為pET28a-ilvA。ilvA為合成型蘇氨酸脫氨酶基因，其基因序列為序列表中序列1中10～1554位所示。以E.coliK12W3110基因組為模板，分別以WY1422、WY997為引物，擴(kuò)增得到1035bp的PCR產(chǎn)物(SEQIDNo.3)，按照上述同樣的方法，構(gòu)建蘇氨酸脫氨酶表達(dá)質(zhì)粒pET28a-tdcB(圖3)。tdcB為分解型蘇氨酸脫氨酶基因，其基因序列為序列表中序列3中10～999位所示。上述所用的引物序列如下：WY1423:GGAATTCCATATGGCTGACTCGCAACCCCT(NdeI)WY1424:CGGGATCCCTAACCCGCCAAAAAGAACC(BamHI)WB923:TAATACGACTCACTATAGGGWB924:TGCTAGTTATTGCTCAGCGGWY1422:GGAATTCCATATGCATATTACATACGATCTGCC(NdeI)WY997:CGCGGATCCAGTACTCATATCCTATCCTC(BamHI)二、支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建支鏈氨基酸轉(zhuǎn)移酶催化2-酮丁酸轉(zhuǎn)氨生成L-2-氨基丁酸。在脫氨酶催化蘇氨酸生成2-酮丁酸的基礎(chǔ)上，過(guò)表達(dá)支鏈氨基酸轉(zhuǎn)移酶以催化2-酮丁酸生成L-2-氨基丁酸。以E.coliK12W3110基因組為模板，以WY998、WY1403為引物，擴(kuò)增得到979bp的PCR產(chǎn)物(SEQIDNo.6)；按照實(shí)施例1中所述方法，構(gòu)建蘇氨酸轉(zhuǎn)氨酶表達(dá)質(zhì)粒pET28a-ilvE。ilvE基因編碼支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶，其基因序列為序列表中SEQIDNo.6中22～951位所示。WY998：CGCGGATCCAGAAGGAGATATACCATGACCACGAAGAAAGCTGA(BamHI)WY1403：ACGCGTCGACCGTGCCGTCCCATTTTTTGT(SalI)三、蘇氨酸脫氨酶及轉(zhuǎn)氨酶串聯(lián)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建將已構(gòu)建的質(zhì)粒pET28a-tdcB和pET28a-ilvE分別用SalI和BamHI雙酶切，回收酶切片段pET28a-tdcB與ilvE進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物采用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α，在含卡那霉素(50μg/mL)的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子傳代培養(yǎng)三代后，以WY998和WB924為引物，采用菌落PCR鑒定轉(zhuǎn)化子，得到1084bp為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，對(duì)鑒定正確的轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，并對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行SalI和BamHI雙酶切鑒定，得到979bp酶切片段的為正確質(zhì)粒。將PCR和酶切鑒定正確的質(zhì)粒送去測(cè)序，結(jié)果該質(zhì)粒為將序列表中SEQIDNo.6所示核苷酸插入載體pET28a-tdcB中得到的重組質(zhì)粒，命名為pET28a-tdcB-ilvE(圖4)。按照上述同樣的方法，利用已構(gòu)建質(zhì)粒pET28a-ilvA和pET28a-ilvE，構(gòu)建蘇氨酸脫氨酶與轉(zhuǎn)氨酶串聯(lián)表達(dá)質(zhì)粒pET28a-ilvA-ilvE。四、L-2-氨基丁酸初級(jí)工程菌的構(gòu)建將已構(gòu)建好的質(zhì)粒pET28a-tdcB-ilvE電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，將該菌株命名為ABA1(BL21/pET28a-tdcB-ilvE)。利用SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)情況(圖5)。SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示，構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒中蘇氨酸脫氨酶與轉(zhuǎn)氨酶均已表達(dá)。按照上述同樣的方法，構(gòu)建L-2-氨基丁酸初級(jí)工程菌株ABA2(BL21/pET28a-ilvA-ilvE)。實(shí)施例2、L-2-氨基丁酸初級(jí)工程菌全細(xì)胞催化生產(chǎn)L-2-氨基丁酸利用L-2-氨基丁酸初級(jí)工程菌ABA1(BL21/pET28a-tdcB-ilvE)、ABA2(BL21/pET28a-ilvA-ilvE)催化生產(chǎn)L-2-氨基丁酸。種子培養(yǎng)基具體如下：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L；卡那霉素50mg/L。菌體生長(zhǎng)階段培養(yǎng)基具體如下：酵母粉，10.00g/L；K2HPO4·3H2O，0.90g/L；KH2PO4，1.14g/L；(NH4)2SO4，10.00g/L；MgSO4·7H2O，0.30g/L；微量元素(TMS)儲(chǔ)液，5.00mL/L。其中TMS儲(chǔ)液：FeSO4·7H2O，10.000g/L；CaCl2，1.350g/L；ZnSO4·7H2O，2.250g/L；MnSO4·4H2O，0.500g/L；CuSO4·5H2O，1.000g/L；(NH4)6Mo7O24·4H2O，0.106g/L；Na2B4O7·10H2O，0.230g/L；CoCl2·6H2O，0.480g/L；35％HCl，10.000mL/L。緩沖液：KH2PO4，1.36g/L；Na2HPO4，5.67g/L。菌體催化階段培養(yǎng)基具體如下：MgSO4·7H2O，0.50g/L；(NH4)2SO4，5.00g/L；KH2PO4，1.36g/L；Na2HPO4，5.67g/L；蘇氨酸，50.00g/L；谷氨酸，10.00g/L。(一)、種子液的獲得將工程菌ABA1(BL21/pET28a-tdcB-ilvE)和ABA2(BL21/pET28a-ilvA-ilvE)接種到種子培養(yǎng)基中，種子液培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度37℃，搖床轉(zhuǎn)速為220rpm，培養(yǎng)時(shí)間6h，得到種子液，OD600為4.0。(二)、菌體培養(yǎng)與收集將種子液按5％的接種量接種到含有終濃度50μg/mL卡那霉素的上述菌體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中(1L搖瓶)，進(jìn) 行菌體培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37℃，搖床轉(zhuǎn)速為220rpm。發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)補(bǔ)加700g/L的葡萄糖，控制發(fā)酵體系中葡萄糖的濃度為5～10g/L。通過(guò)補(bǔ)加濃氨水調(diào)控pH，維持在6.9左右。當(dāng)OD600＝40時(shí)，加入IPTG(終濃度為0.4mmol/L)誘導(dǎo)重組質(zhì)粒攜帶的基因表達(dá)。菌體培養(yǎng)8h，OD600約80，6000×g離心6min，收集菌體。(三)、搖瓶催化實(shí)驗(yàn)生產(chǎn)L-2-氨基丁酸將收集的菌體以緩沖液進(jìn)行重懸浮，并全部接種到含有終濃度50μg/mL卡那霉素的搖瓶菌體催化培養(yǎng)基中。進(jìn)行搖瓶催化實(shí)驗(yàn)，搖床溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為220rpm。發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)補(bǔ)加700g/L的葡萄糖，控制發(fā)酵體系中葡萄糖的濃度為5～10g/L。通過(guò)補(bǔ)加濃氨水調(diào)控pH，維持在6.9左右。菌體催化持續(xù)約36h。收集菌體催化產(chǎn)物，12000×g離心2min，收集上清液。(四)、檢測(cè)L-2-氨基丁酸的含量在不同的發(fā)酵時(shí)間取發(fā)酵產(chǎn)物離心取上清液，使用高壓液相色譜法(HPLC)進(jìn)行檢測(cè)。具體方法如下(2,4-二硝基氟苯柱前衍生高效液相法)：取10μL上述上清液于2mL離心管中，加入200μLNaHCO3水溶液(0.5mol/L，pH9.0)和100μL1％的2,4-二硝基氟苯-乙腈溶液(體積比)，于60℃水浴中暗處恒溫加熱60min，然后冷卻至25℃，加入700μLKH2PO4水溶液(0.01mol/L，pH7.20±0.05，用NaOH水溶液調(diào)整pH)，放置15min過(guò)濾后可進(jìn)樣，進(jìn)樣量為15μL。所用色譜柱為C18柱(ZORBAXEclipseXDB-C18，4.6×150mm，Agilent，USA)；柱溫：40℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：360nm；流動(dòng)相A為0.04mol/LKH2PO4水溶液(pH7.20±0.05，用40g/LKOH水溶液調(diào)整pH)，流動(dòng)相B為55％乙腈水溶液(體積比)，流動(dòng)相流速為1mL/min，洗脫過(guò)程如下表1所示：表1流動(dòng)相洗脫程序時(shí)間(min)流動(dòng)相A(％)流動(dòng)相B(％)086142881248614107030203070241090270100結(jié)果如下表2所示，搖瓶催化18h，工程菌ABA1(BL21/pET28a-tdcB-ilvE)的L-2-氨基丁酸產(chǎn)量為3.72g/L，ABA2(BL21/pET28a-ilvA-ilvE)的L-2-氨基丁酸產(chǎn)量為2.82g/L。表2菌株ABA1和ABA2的L-2-氨基丁酸產(chǎn)量菌株L-2-氨基丁酸產(chǎn)量(g/L)ABA13.72±0.51ABA22.82±0.03由上表可以看出，蘇氨酸脫氨酶TdcB的催化效果優(yōu)于IlvA，過(guò)表達(dá)TdcB的菌株ABA1的L-2-氨基丁酸產(chǎn)量較過(guò)表達(dá)IlvA的菌株提高了31.91％。實(shí)施例3、L-2-氨基丁酸工程菌ABA3、ABA4、ABA5的構(gòu)建一、多種轉(zhuǎn)氨酶表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶TyrB催化芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨反應(yīng)，腐胺氨基轉(zhuǎn)移酶PatA催化腐胺的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)，纈氨 酸丙酮酸氨基轉(zhuǎn)移酶AvtA催化纈氨酸和丙酮酸生成丙氨酸及3-甲基-2-酮丁酸，為比較三種轉(zhuǎn)氨酶催化2-酮丁酸生成2-氨基丁酸的催化能力的差別，分別構(gòu)建含三種轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)質(zhì)粒和菌株。以E.coliK12W3110基因組為模板，以WY1405、WY1406為引物，擴(kuò)增得到1256bp的PCR產(chǎn)物(SEQIDNo.8)；以WY1408、WY1409為引物，擴(kuò)增得到1436bp的PCR產(chǎn)物(SEQIDNo.10)；以WY1411、WY1412為引物，擴(kuò)增得到1314bp的PCR產(chǎn)物(SEQIDNo.12)。按照實(shí)施例1中所述方法，分別構(gòu)建蘇氨酸轉(zhuǎn)氨酶表達(dá)質(zhì)粒pET28a-tyrB、pET28a-patA和pET28a-avtA。tyrB為酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因，基因序列為SEQIDNo.8中15-1208位所示，patA為腐胺氨基轉(zhuǎn)移酶基因，基因序列為SEQIDNo.10中9-1388位所示，avtA為纈氨酸丙酮酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因，基因序列為SEQIDNo.12中9-1262位所示。按照實(shí)施例1中的方法，利用已構(gòu)建質(zhì)粒pET28a-tdcB和pET28a-tyrB，構(gòu)建蘇氨酸脫氨酶與轉(zhuǎn)氨酶串聯(lián)表達(dá)質(zhì)粒pET28a-tdcB-tyrB。利用已構(gòu)建質(zhì)粒pET28a-tdcB和pET28a-patA，構(gòu)建蘇氨酸脫氨酶與轉(zhuǎn)氨酶串聯(lián)表達(dá)質(zhì)粒pET28a-tdcB-patA。利用已構(gòu)建質(zhì)粒pET28a-tdcB和pET28a-avtA，構(gòu)建蘇氨酸脫氨酶與轉(zhuǎn)氨酶串聯(lián)表達(dá)質(zhì)粒pET28a-tdcB-avtA。WY1405：CATGCCATGGGACATCGCGTGTTTCAAAAAGT(NcoI)WY1406：ACGCGTCGACAATTTCACTGCAGGCTGGGT(SalI)WY1408：CATGCCATGGGATTGAACAGGTTACCTTCGAG(NcoI)WY1409：CCGCTCGAGAAAAGATCGGATGGCGACGT(XhoI)WY1411：CATGCCATGGGCATGACATTCTCCCTTTTTGG(NcoI)WY1412：ACGCGTCGACTGCAGAAATCATGTAGGCCT(SalI)二、轉(zhuǎn)氨酶相應(yīng)工程菌株的構(gòu)建按照實(shí)施例1中的方法，利用已構(gòu)建質(zhì)粒pET28a-tdcB-tyrB、pET28a-tdcB-patA、pET28a-tdcB-avtA分別構(gòu)建L-2-氨基丁酸工程菌株ABA3(BL21/pET28a-tdcB-tyrB)，ABA4(BL21/pET28a-tdcB-patA)，ABA5(BL21/pET28a-tdcB-avtA)。實(shí)施例4、工程菌ABA3、ABA4、ABA5催化生產(chǎn)L-2-氨基丁酸利用構(gòu)建的過(guò)表達(dá)不同轉(zhuǎn)氨酶的工程菌ABA3(BL21/pET28a-tdcB-tyrB)、ABA4(BL21/pET28a-tdcB-patA)、ABA5(BL21/pET28a-tdcB-avtA)進(jìn)行L-2-氨基丁酸的全細(xì)胞催化實(shí)驗(yàn)。種子培養(yǎng)及菌體生長(zhǎng)階段培養(yǎng)基如上述實(shí)施例2中所述。種子液的獲得、菌體培養(yǎng)及搖瓶催化方法如實(shí)施例2中所述。按照實(shí)施例2中所述的方法，檢測(cè)催化液中L-2-氨基丁酸的含量。催化液檢測(cè)結(jié)果如下：搖瓶催化18h，工程菌ABA1的L-2-氨基丁酸產(chǎn)量為3.72g/L，工程菌ABA3的L-2-氨基丁酸產(chǎn)量為2.60g/L，工程菌ABA4的L-2-氨基丁酸產(chǎn)量為0.66g/L，工程菌ABA5的L-2-氨基丁酸產(chǎn)量為0.87g/L。表3菌株ABA1、ABA3、ABA4和ABA5的L-2-氨基丁酸產(chǎn)量菌株L-2-氨基丁酸產(chǎn)量(g/L)ABA13.72±0.51ABA32.60±0.03ABA40.66±0.01ABA50.87±0.08由上表3可以看出，轉(zhuǎn)氨酶TyrB、PatA及AvtA均可用于催化2-酮丁酸生成2-氨基丁酸，支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶IlvE的催化效果優(yōu)于TyrB、PatA及AvtA。實(shí)施例5、L-2-氨基丁酸工程菌ABA6的構(gòu)建為考察不同強(qiáng)度基因表達(dá)元件對(duì)L-2-氨基丁酸催化效果的影響，構(gòu)建攜帶優(yōu)化的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)的蘇氨酸脫氨酶表達(dá)質(zhì)粒及其相應(yīng)的L-2-氨基丁酸工程菌。以E.coliK12W3110基因組為模板，分別以WY1433、WY997為引物，擴(kuò)增得到1072bp的PCR產(chǎn)物(SEQIDNo.4)，其攜帶有大腸桿菌蘇氨酸脫氨酶自身RBS序列(SEQIDNo.4中33～39bp核苷酸)，按照實(shí)施例1中的方法，構(gòu)建蘇氨酸脫氨酶表達(dá)質(zhì)粒pET28a-RBStdcB。利用已構(gòu)建質(zhì)粒pET28a-RBStdcB和pET28a-ilvE，構(gòu)建攜帶自身RBS序列的蘇氨酸脫氨酶和轉(zhuǎn)氨酶串聯(lián)表達(dá)質(zhì)粒pET28a-RBStdcB-ilvE。利用已構(gòu)建質(zhì)粒pET28a-RBStdcB-ilvE構(gòu)建L-2-氨基丁酸工程菌株ABA6(BL21/pET28a-RBStdcB-ilvE)。WY1433：TGCTCTAGACGGTTACCTACATATTTAAT(XbaI)實(shí)施例6、工程菌ABA6和ABA1催化產(chǎn)L-2-氨基丁酸按照實(shí)施例2中的方法，利用工程菌ABA6催化生產(chǎn)L-2-氨基丁酸。催化液HPLC檢測(cè)結(jié)果如下：搖瓶催化18h，工程菌ABA1(BL21/pET28a-tdcB-ilvE)的L-2-氨基丁酸產(chǎn)量為3.72g/L，工程菌ABA6(BL21/pET28a-RBStdcB-ilvE)的L-2-氨基丁酸產(chǎn)量為4.18g/L。表4菌株ABA1和ABA6的L-2-氨基丁酸產(chǎn)量菌株L-2-氨基丁酸產(chǎn)量(g/L)ABA13.72±0.51ABA64.18±0.03結(jié)果顯示，通過(guò)優(yōu)化tdcB基因的RBS，L-2-氨基丁酸的產(chǎn)量提高12.37％。實(shí)施例7、L-2-氨基丁酸高級(jí)工程菌的構(gòu)建一、蘇氨酸脫氨酶、轉(zhuǎn)氨酶及谷氨酸脫氫酶串聯(lián)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建谷氨酸脫氫酶催化α-酮戊二酸生成谷氨酸。在表達(dá)蘇氨酸脫氨酶及轉(zhuǎn)氨酶的基礎(chǔ)上，利用谷氨酸脫氫酶實(shí)現(xiàn)氨基供體谷氨酸的循環(huán)利用。以E.coliK12W3110基因組為模板，以WY1426、WY1420為引物，擴(kuò)增得到1398bp的PCR產(chǎn)物(SEQIDNo.14中所示175～1572bp核苷酸序列)，按照實(shí)施例1中所述方法，構(gòu)建谷氨酸脫氫酶表達(dá)質(zhì)粒pET28a-gdhA。gdhA為谷氨酸脫氫酶基因，基因序列為SEQIDNo.14中177-1520位所示。根據(jù)已構(gòu)建的質(zhì)粒pET28a-gdhA的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增含T7啟動(dòng)子的gdhA片段。以pET28a-gdhA為模板，分別以WY1427、WY1420為引物，擴(kuò)增得到1572bp的PCR產(chǎn)物(SEQIDNo.14)，為含T7啟動(dòng)子的gdhA片段，將PCR獲得的DNA片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離純化，回收片段經(jīng)SalI和XhoI雙酶切后，與同樣雙酶切處理的表達(dá)載體pET28a-tdcB-ilvE連接。連接產(chǎn)物采用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α，在含卡那霉素(50μg/mL)的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子傳代培養(yǎng)三代后，以WY1427和WB924為引物，采用菌落PCR鑒定轉(zhuǎn)化子，得到1656bp為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，對(duì)鑒定正確的轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，并對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行SalI和XhoI雙酶切鑒定，得到1572bp酶切片段的質(zhì)粒為陽(yáng)性質(zhì)粒。將PCR和酶切鑒定正確的質(zhì)粒送去測(cè)序，結(jié)果該質(zhì)粒為將序列表中SEQIDNo.14所示核苷酸插入載體pET28a-tdcB-ilvE中得到的重組質(zhì)粒，命名為pET28a-tdcB-ilvE-gdhA(圖6)WY1426：CATGCCATGGATCAGACATATTCTCT(NcoI)WY1420：CCGCTCGAGCCCATTTGTAGGCCTGATAA(XhoI)WY1427：ACGCGTCGACCGCCAGCAACCGCACCTGTG(SalI)二、L-2-氨基丁酸高級(jí)工程菌ABA7的構(gòu)建將已構(gòu)建好的質(zhì)粒pET28a-tdcB-ilvE-gdhA電轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)中，將該菌株命名為ABA7(BL21/pET28a-tdcB-ilvE-gdhA)。利用SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)情況(圖5)。SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示，構(gòu)建的串聯(lián)表達(dá)質(zhì)粒攜帶的蘇氨酸脫氨酶、轉(zhuǎn)氨酶和谷氨酸脫氫酶均已表達(dá)。實(shí)施例8、高級(jí)工程菌ABA7催化生產(chǎn)L-2-氨基丁酸利用菌株ABA7(BL21/pET28a-tdcB-ilvE-gdhA)進(jìn)行發(fā)酵罐催化生產(chǎn)L-2-氨基丁酸實(shí)驗(yàn)。種子培養(yǎng)基具體如下：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L；卡那霉素50mg/L。發(fā)酵罐菌體生長(zhǎng)階段培養(yǎng)基具體如下：酵母粉，10.00g/L；K2HPO4·3H2O，0.90g/L；KH2PO4，1.14g/L；(NH4)2SO4，10.00g/L；MgSO4·7H2O，0.30g/L；TMS儲(chǔ)液，5.00mL/L。其中TMS儲(chǔ)液：FeSO4·7H2O，10.000g/L；CaCl2，1.350g/L；ZnSO4·7H2O，2.250g/L；MnSO4·4H2O，0.500g/L；CuSO4·5H2O，1.000g/L；(NH4)6Mo7O24·4H2O，0.106g/L；Na2B4O7.10H2O，0.230g/L；CoCl2.6H2O，0.480g/L；35％HCl，10.000mL/L。緩沖液：KH2PO4，1.36g/L；Na2HPO4，5.67g/L。發(fā)酵罐菌體催化階段培養(yǎng)基具體如下：MgSO4·7H2O，0.50g/L；(NH4)2SO4，5.00g/L；KH2PO4，1.36g/L；Na2HPO4，5.67g/L；蘇氨酸，100.00g/L；谷氨酸，10.00g/L。(一)、種子液的獲得將工程菌ABA1(BL21/pET28a-tdcB-ilvE)和ABA7(BL21/pET28a-tdcB-ilvE-gdhA)接種到種子培養(yǎng)基中，種子液培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度37℃，搖床轉(zhuǎn)速為220rpm，培養(yǎng)時(shí)間6h，得到種子液，OD600為4.0。(二)、發(fā)酵罐菌體培養(yǎng)與收集將種子液按照5％的接種量接種到含有終濃度50μg/mL卡那霉素的發(fā)酵罐菌體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。采用的發(fā)酵罐為7.5L發(fā)酵罐(BioFlo115，NBS)：內(nèi)置定速可編程控泵，可以實(shí)現(xiàn)恒速補(bǔ)料。發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)蠕動(dòng)泵補(bǔ)加700g/L的葡萄糖，控制發(fā)酵體系中葡糖糖的濃度為5～10g/L。通過(guò)加熱套和冷卻水控制發(fā)酵溫度維持在37℃；通入空氣提供溶氧，轉(zhuǎn)速與溶氧信號(hào)級(jí)聯(lián)控制溶氧維持在30％；補(bǔ)加濃氨水調(diào)控pH，維持在6.9左右。菌體培養(yǎng)持續(xù)約7h，OD600約80。當(dāng)OD600＝40時(shí)，加入IPTG(終濃度為0.4mmol/L)誘導(dǎo)重組質(zhì)粒攜帶的基因表達(dá)。收集發(fā)酵罐培養(yǎng)的菌體，6000×g離心8min，以緩沖液進(jìn)行重懸浮，6000×g離心8min收集菌體。(三)、發(fā)酵罐催化生產(chǎn)L-2-氨基丁酸將收集的菌體全部接種到含有終濃度50μg/mL卡那霉素的發(fā)酵罐菌體催化培養(yǎng)基中。采用的發(fā)酵罐為7.5L發(fā)酵罐(BioFlo115，NBS)：內(nèi)置定速可編程控泵，可以實(shí)現(xiàn)恒速補(bǔ)料。發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)蠕動(dòng)泵補(bǔ)加700g/L的葡萄糖，控制發(fā)酵體系中葡萄糖的濃度為5～10g/L。通過(guò)加熱套和冷卻水控制發(fā)酵溫度維持在37℃；通入空氣提供溶氧，轉(zhuǎn)速與溶氧信號(hào)級(jí)聯(lián)控制溶氧維持在30％；補(bǔ)加濃氨水調(diào)控pH，維持在6.9左右，菌體催化持續(xù)約48h。收集菌體催化產(chǎn)物，12000×g離心2min，收集上清液。采用實(shí)施例2中所述的方法進(jìn)行HPLC檢測(cè)，結(jié)果如下表所示，工程菌ABA7的L-2-氨基丁酸產(chǎn)量為57.23g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為1.43g/L/h；對(duì)照菌ABA1的L-2-氨基丁酸產(chǎn)量為18.53g/L；生產(chǎn)強(qiáng)度為0.62g/L/h。表5ABA1和ABA7的L-2-氨基丁酸產(chǎn)量菌株L-2-氨基丁酸產(chǎn)量(g/L)催化時(shí)間(h)ABA118.53±4.5730ABA757.23±7.9040本實(shí)施例的結(jié)果顯示，蘇氨酸脫氨酶、轉(zhuǎn)氨酶及谷氨酸脫氫酶三酶共表達(dá)的工程菌ABA7較對(duì)照菌株ABA1的L-2-氨基丁酸產(chǎn)量提高了2.09倍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3