1.一種生產(chǎn)L-2-氨基丁酸的重組菌,其特征在于,所述重組菌為同時(shí)過(guò)表達(dá)蘇氨酸脫氨酶、轉(zhuǎn)氨酶和谷氨酸脫氫酶的菌株。
2.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)L-2-氨基丁酸的重組菌,其特征在于,所述蘇氨酸脫氨酶的氨基酸序列為SEQ ID No.2或SEQ ID No.5所示,所述轉(zhuǎn)氨酶的氨基酸序列為SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11或SEQ ID No.13所示,所述谷氨酸脫氫酶的氨基酸序列為SEQ ID No.15所示;
所述蘇氨酸脫氨酶的基因序列為SEQ ID No.1中10~1554位或SEQ ID No.3中10~999位所示,所述轉(zhuǎn)氨酶的基因序列為SEQ ID No.6中22~951位、SEQ ID No.8中15~1208位、SEQ ID No.10中9~1388位或SEQ ID No.12中9~1262位所示,所述谷氨酸脫氫酶的基因序列為SEQ ID No.14中177~1520位所示。
3.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)L-2-氨基丁酸的重組菌,其特征在于,所述重組菌的出發(fā)菌為埃希氏菌屬的細(xì)菌,優(yōu)選為大腸桿菌(Escherichia coli),更優(yōu)選為E.coli BL21(DE3)。
4.一種制備生產(chǎn)L-2-氨基丁酸的重組菌的方法,其特征在于,包括如下步驟:同時(shí)過(guò)表達(dá)蘇氨酸脫氨酶、轉(zhuǎn)氨酶及谷氨酸脫氫酶,得到所述重組菌。
5.如權(quán)利要求4所述的制備生產(chǎn)L-2-氨基丁酸的重組菌的方法,其特征在于,所述過(guò)表達(dá)蘇氨酸脫氨酶、轉(zhuǎn)氨酶及谷氨酸脫氫酶通過(guò)如下步驟實(shí)現(xiàn):
增加出發(fā)菌中蘇氨酸脫氨酶、轉(zhuǎn)氨酶及谷氨酸脫氫酶基因的拷貝數(shù)。
6.如權(quán)利要求5所述的制備生產(chǎn)L-2-氨基丁酸的重組菌的方法,其特征在于,所述方法進(jìn)一步包括將所述出發(fā)菌的谷氨酸脫氫酶基因的啟動(dòng)子替換為具有更強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性的元件,和/或?qū)⑺龀霭l(fā)菌的蘇氨酸脫氨酶基因的核糖體結(jié)合位點(diǎn)替換為具有更強(qiáng)翻譯活性的元件。
7.如權(quán)利要求5所述的制備生產(chǎn)L-2-氨基丁酸的重組菌的方法,其特征在于,通過(guò)攜帶所述蘇氨酸脫氨酶、轉(zhuǎn)氨酶及谷氨酸脫氫酶基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化所述出發(fā)菌來(lái)增加所述出發(fā)菌中蘇氨酸脫氨酶、轉(zhuǎn)氨酶及谷氨酸脫氫酶基因的拷貝數(shù);優(yōu)選地,所述質(zhì)粒為pET28a。
8.如權(quán)利要求5所述的制備生產(chǎn)L-2-氨基丁酸的重組菌的方法,其特征在于,所述蘇氨酸脫氨酶的基因序列為SEQ ID No.1中10~1554位或SEQ ID No.3中10~999位所示,所述轉(zhuǎn)氨酶的基因序列為SEQ ID No.6中22~951位、SEQ ID No.8中15~1208位、SEQ ID No.10中9~1388位或SEQ ID No.12中9~1262位所示,所述谷氨酸脫氫酶的基因序列為SEQ ID No.14中177~1520位所示。
9.如權(quán)利要求5所述的制備L-2-氨基丁酸的重組菌的方法,其特征在于,所述出發(fā)菌為選自埃希氏菌屬的細(xì)菌,優(yōu)選為大腸桿菌(Escherichia coli),更優(yōu)選為E.coli BL21(DE3)。
10.一種利用權(quán)利要求1~3中任意一項(xiàng)所述的重組菌生產(chǎn)L-2-氨基丁酸的方法,其特征在于,包括如下步驟:
A)培養(yǎng)重組菌,在所述重組菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的中期,進(jìn)行異丙基硫代半乳糖苷誘導(dǎo),異丙基硫代半乳糖苷誘導(dǎo)濃度為0.01mmol/L~1mmol/L,繼續(xù)培養(yǎng)至菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期或穩(wěn)定期前期對(duì)培養(yǎng)的菌體進(jìn)行離心,收集菌體;
B)以緩沖液攪拌懸浮步驟A)中收集的重組菌,直接利用菌體細(xì)胞在底物蘇氨酸和氨基供體谷氨酸存在下進(jìn)行催化生產(chǎn);
其中,所述底物蘇氨酸濃度為0.1~300.0g/L,谷氨酸為5.0~150.0g/L,催化條件為37℃、pH為6.0~7.5、DO為20%~60%。