一種從銀杏葉提取物中制備槲皮素-3-o-葡萄糖苷的方法與流程

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導(dǎo)航： X技術(shù)> 最新專利>有機(jī)化合物處理,合成應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明涉及銀杏葉提取物中一有效成分的提取制備方法，具體涉及一種從銀杏葉提取物中制備槲皮素-3-o-葡萄糖苷的方法，屬于化合物制備技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

銀杏葉為銀杏科植物銀杏的干燥葉，銀杏葉提取物是經(jīng)現(xiàn)代提取工藝從銀杏葉中提取的活性物質(zhì)的富集產(chǎn)品，可用于阿爾茨海默病、抑郁癥、糖尿病、神經(jīng)疾病、陽(yáng)痿、記憶障礙、外周血管疾病、間歇性跛行、腦轉(zhuǎn)耳鳴等疾病的治療。其主要活性成分為黃酮類和萜類。黃酮類成分包括單黃酮、黃酮醇苷、乙?；S酮醇苷、雙黃酮、黃烷-3-醇類以及原花色素等。萜類銀杏內(nèi)酯有銀杏內(nèi)酯A、B、C、J、M及白果內(nèi)酯。

國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局(CFDA)目前批準(zhǔn)了數(shù)十種銀杏葉提取物劑型，包括銀杏葉片、膠囊、顆粒、軟膠囊、分散片、丸、酊、滴劑、口服液、銀杏葉提取物注射液等，上述制劑及銀杏葉提取物的質(zhì)量控制多采用指紋圖譜的方法進(jìn)行，國(guó)際上一般公認(rèn)的銀杏葉提取物的質(zhì)量指標(biāo)為含黃酮24％以上，內(nèi)酯6％以上，國(guó)內(nèi)藥典委員會(huì)頒布的以銀杏葉提取物為原料的舒血寧注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定總黃酮醇苷的量不少于24％，銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C和白果內(nèi)酯4種成分的總含量不少于6％。但是銀杏葉提取物是一個(gè)非常復(fù)雜的化合物富集產(chǎn)品，含有從無(wú)機(jī)物到有機(jī)物、從極性到非極性、從小分子到生物大分子的各種成分，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)銀杏葉中含有240多個(gè)化學(xué)成分，而普通的銀杏葉提取物的指紋圖譜中卻只有十幾個(gè)峰，從而無(wú)法準(zhǔn)確又確切的反映產(chǎn)品的物質(zhì)基礎(chǔ)。眾所周知的是，銀杏葉提取物的提取方法不同，其得到的提取物中有效化合物及其含量不同，則其藥效也不相同，由其制備得到的藥品的適用癥狀及功能必不完全相同；嚴(yán)格來(lái)講，即使提取方法相同，由于銀杏葉原料批次不同、產(chǎn)物不同，其最終得到的提取物中化學(xué)成分的含量也不盡相同，而上述因素終會(huì)對(duì)藥品的藥效產(chǎn)生不同程度的影響，因此，僅以現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)銀杏葉提取物及其制劑進(jìn)行質(zhì)量控制的效果不甚嚴(yán)格與規(guī)范，大量不明物質(zhì)的存在影響了對(duì)其含量的準(zhǔn)確測(cè)定，更制約了藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于對(duì)銀杏葉提取物中的化學(xué)成分進(jìn)行分離和制備，進(jìn)一步確認(rèn)和高純度提取一種化學(xué)成分-槲皮素-3-O-葡萄糖苷，以期對(duì)銀杏葉提取物及其制劑中藥用成分的含量測(cè)定提供依據(jù)。

為此，本申請(qǐng)采取的技術(shù)方案為，

一種從銀杏葉提取物中制備槲皮素-3-O-葡萄糖苷的方法，包括，

(1)將銀杏葉提取物溶于體積濃度為40-80％的乙醇-水溶液中，制備得到銀杏葉提取物的濃度為10-1000mg/mL的提取物溶液；(2)對(duì)所述步驟(1)得到的提取物溶液進(jìn)行一維液相色譜分離，得到一維粗產(chǎn)品；(3)將步驟(2)得到的一維粗產(chǎn)品溶解在體積濃度為40-80％的甲醇-水溶液或乙醇-水溶液中，得到所述一維粗產(chǎn)品的濃度為20-200mg/mL的粗產(chǎn)品溶液；(4)對(duì)所述步驟(3)得到的粗產(chǎn)品溶液進(jìn)行二維液相色譜制備，得到槲皮素-3-O-葡萄糖苷。

上述從銀杏葉提取物中制備槲皮素-3-O-葡萄糖苷的方法中，所述步驟(2)中一維液相色譜分離的條件為，色譜柱采用以硅膠為基質(zhì)的親水型色譜填料；流動(dòng)相中的有機(jī)相為乙醇或甲醇，水相為水；洗脫條件以0-15min有機(jī)相95％降至90％梯度進(jìn)行或等度進(jìn)行；收集保留時(shí)間為15～20min的組分，干燥得到所述一維粗產(chǎn)品。

上述從銀杏葉提取物中制備槲皮素-3-O-葡萄糖苷的方法中，所述步驟 (2)中一維液相色譜分離，有機(jī)相還含有甲酸，甲酸體積濃度為0.1％；水相中還含有甲酸，甲酸體積濃度為0.1％。

上述從銀杏葉提取物中制備槲皮素-3-O-葡萄糖苷的方法中，所述步驟(4)中二維液相色譜條件為，色譜柱采用以硅膠為基質(zhì)鍵合C18反相填料；流動(dòng)相中的有機(jī)相為乙醇或甲醇，水相為水；洗脫條件以0-60min有機(jī)相15％增至80％梯度進(jìn)行或等度進(jìn)行；收集保留時(shí)間為30-40min的組分，干燥得到槲皮素-3-O-葡萄糖苷。

上述從銀杏葉提取物中制備槲皮素-3-O-葡萄糖苷的方法中，所述步驟(4)二維液相色譜制備，流動(dòng)相中還含有甲酸，甲酸體積濃度為0.1％；水相中還含有甲酸，甲酸體積濃度為0.1％。

上述從銀杏葉提取物中制備槲皮素-3-O-葡萄糖苷的方法中，所述步驟(4)中二維液相色譜制備，流動(dòng)相中的有機(jī)相為甲醇，水相為水。

上述從銀杏葉提取物中制備槲皮素-3-O-葡萄糖苷的方法中，所述步驟(1)中，將銀杏葉提取物溶于體積濃度為50-60％的乙醇-水溶液中，制備得到銀杏葉提取物的濃度為250-550mg/mL的提取物溶液。

上述從銀杏葉提取物中制備槲皮素-3-O-葡萄糖苷的方法中，所述步驟(3)中，將步驟(2)得到的一維粗產(chǎn)品溶解在體積濃度為50-60％的甲醇-水溶液或乙醇-水溶液，所述粗產(chǎn)品溶液濃度為60-100mg/mL。

上述從銀杏葉提取物中制備槲皮素-3-O-葡萄糖苷的方法中，一維液相色譜，流動(dòng)相流速為60-120mL/min，柱溫為室溫或25-40℃，進(jìn)樣量為200-3000μL/針，檢測(cè)器為DAD紫外檢測(cè)器；

二維液相色譜，流動(dòng)相流速為60-120mL/min，柱溫為室溫或25-40℃，進(jìn)樣量為1000-3000μL/針，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為360nm。

上述從銀杏葉提取物中制備槲皮素-3-O-葡萄糖苷的方法中，二維液相色譜，流動(dòng)相流速為80-100mL/min，柱溫為室溫或25-40℃，進(jìn)樣量為 2000-2500μL/針，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為360nm。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)，

(1)本申請(qǐng)從銀杏葉提取物中制備得到一種明確的藥用化合物-槲皮素-3-O-葡萄糖苷，其制備方法簡(jiǎn)單，分離操作方便，采用二維液相色譜法分離出一特定的化合物，從而在銀杏葉提取物質(zhì)量控制的研究中增加了指標(biāo)成分，豐富了活性物質(zhì)的檢測(cè)對(duì)象，利于銀杏葉提取物及其藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高，尤其提高現(xiàn)行廣泛使用的舒血寧注射液的質(zhì)量。

(2)申請(qǐng)人通過對(duì)一維液相色譜與二維液相色譜的結(jié)合應(yīng)用，分別對(duì)流動(dòng)相、色譜柱及洗脫條件進(jìn)行選擇，避免了銀杏葉提取物中多種成分對(duì)槲皮素-3-O-葡萄糖苷的干擾，制備得到純度在90％以上的槲皮素-3-O-葡萄糖苷。

附圖說(shuō)明

為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被清楚的理解，下面根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例并結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明，其中

圖1本發(fā)明實(shí)施例1中制備得到的化合物的質(zhì)譜；

圖2本發(fā)明實(shí)施例1中制備得到的化合物的H譜；

圖3本發(fā)明實(shí)施例1中制備得到的化合物的C譜。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明實(shí)施例中出現(xiàn)的百分?jǐn)?shù)％，如無(wú)特殊說(shuō)明表示的是體積百分?jǐn)?shù)，例如，“40％的乙醇－水溶液”表示乙醇的水溶液其中乙醇的體積百分?jǐn)?shù)為40％；“40％的甲醇－水溶液”表示甲醇的水溶液其中甲醇的體積百分?jǐn)?shù)為40％；“乙醇(含0.1％甲酸)”表示乙醇與甲酸的混合溶液其中甲酸的體積百分?jǐn)?shù)為0.1％； “水(含0.1％甲酸)”表示水與甲酸的混合溶液其中甲酸的體積百分?jǐn)?shù)為0.1％；

實(shí)施例1

稱取銀杏葉提取物10g，溶于50mL 40％的乙醇－水溶液，制得銀杏葉提取物溶液，濃度為200mg/mL，過0.45μm微孔濾膜，進(jìn)行一維液相色譜分離。一維液相色譜采用以硅膠為基質(zhì)的親水型色譜填料50×250mm，10μm(華譜新創(chuàng)科技有限公司)，流動(dòng)相采用含0.1％體積濃度甲酸的甲醇為有機(jī)相，含0.1％體積濃度甲酸的水為水相，梯度洗脫方式：0-15min有機(jī)相濃度從95％降至90％臺(tái)階梯度進(jìn)行。采用DAD紫外檢測(cè)器360nm選擇吸收波長(zhǎng)，制備溫度為室溫，進(jìn)樣量為500μL/針，流動(dòng)相流速為90mL/min，收集15～20分鐘的餾分，進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，為一維制備槲皮素-3-O-葡萄糖苷粗品。用50％的乙醇－水溶液溶解槲皮素-3-O-葡萄糖苷粗品，濃度為80mg/mL，經(jīng)微孔濾膜過濾，進(jìn)行二維液相色譜制備，色譜柱為以硅膠為基質(zhì)的親水型色譜填料(50×150mm，5μm，華譜新創(chuàng)科技有限公司)流動(dòng)相選擇含0.1％體積濃度甲酸的甲醇為有機(jī)相，含0.1％體積濃度甲酸的水為水相，采用0-60min的15-80％有機(jī)相梯度洗脫。采用DAD紫外檢測(cè)器360nm選擇吸收波長(zhǎng)，制備溫度為室溫，進(jìn)樣量為1000μL/針，流動(dòng)相流速為90mL/min，收集保留時(shí)間在30-40min的餾分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，得到槲皮素-3-O-葡萄糖苷化合物，經(jīng)液相色譜分析，純度為95.5％，一維制備槲皮素-3-O-葡萄糖苷粗品中槲皮素-3-O-葡萄糖苷的含量為30％。

分別采用質(zhì)譜、¹H-NMR和¹³C-NMR(MeOD)對(duì)得到的終產(chǎn)物進(jìn)行分析，其中質(zhì)譜、¹H-NMR譜圖如圖1和2所示，

¹³C-NMR(MeOD)解析如下，

槲皮素母環(huán)：157.64(C2)，134.24(C3)，178.10(C4)，161.64(C5)，98.49(C6)，164.60(C7)，93.32(C8)，157.07(C9)，104.31(C10)，121.69(C1’)，114.61(C2’)，144.51(C3’)，148.45(C4’)，116.18(C5’)，121.81(C6’)

3-O-葡萄糖：102.95(C1)，74.34(C2”)，76.98(C3”)，69.83(C4”)，76.72(C5”)，61.17(C6”)。

綜合鑒定為槲皮素-3-O-葡萄糖苷，化合物的分子式為C₂₁H₂₀O₁₂，分子量464.0959，結(jié)構(gòu)式如下

實(shí)施例2

稱取銀杏葉提取物1g，溶于100mL體積濃度80％的乙醇－水溶液，制得銀杏葉提取物溶液，濃度為10mg/mL，過0.45μm微孔濾膜，進(jìn)行一維液相色譜制備。一維液相色譜采用以硅膠為基質(zhì)的親水型色譜填料(50×250mm，10μm，華譜新創(chuàng)科技有限公司)，流動(dòng)相采用乙醇為有機(jī)相，水為水相，有機(jī)相濃度為90％等度，采用DAD紫外檢測(cè)器360nm選擇吸收波長(zhǎng)，制備溫度為40℃，進(jìn)樣量為200μL/針，流動(dòng)相流速為60mL/min，收集15～20分鐘的餾分，進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，為一維制備槲皮素-3-O-葡萄糖苷粗品。用40％的乙醇－水溶液溶解槲皮素-3-O-葡萄糖苷粗品，濃度為20mg/mL，經(jīng)微孔濾膜過濾，進(jìn)行二維液相色譜制備，色譜柱為以硅膠為基質(zhì)鍵合C18反相填料(50×150mm，10μm，華譜新創(chuàng)科技有限公司)，流動(dòng)相選擇含0.1％體積濃度甲酸的乙醇為有機(jī)相，含0.1％體積濃度甲酸的水為水相，采用等度洗脫方式，有機(jī)相濃度為20％共60分鐘。采用DAD紫外檢測(cè)器360nm選擇吸收波長(zhǎng)，制備溫度為室溫，進(jìn)樣量為1000μL/針，流動(dòng)相流速為100mL/min，收集保留時(shí)間30-40min的餾分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，得到槲皮素-3-O-葡萄糖苷化合物，經(jīng)液相色譜分析，二維制備的槲皮素-3-O-葡萄糖苷粗品中槲皮素-3-O-葡萄糖苷的含量為94.0％，一維制備槲皮素-3-O-葡萄糖苷粗品中槲皮素-3-O-葡萄糖苷的含量為32％。