本發(fā)明涉及作物選種培育技術(shù)領(lǐng)域中小麥穩(wěn)定粒重主效QTL的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

小麥?zhǔn)俏覈?guó)第三大糧食作物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有重要地位。據(jù)測(cè)算，我國(guó)要保障2020年14.5億人口的糧食安全，小麥產(chǎn)量需在現(xiàn)有基礎(chǔ)上增加28％(何中虎等，2011)。因此，超高產(chǎn)品種的選育仍是小麥育種最基本、最重要的目標(biāo)。

小麥產(chǎn)量由畝穗數(shù)、穗粒數(shù)和平均粒重組成，過(guò)去的育種實(shí)踐表明，粒重的遺傳改良是提高小麥產(chǎn)量潛力的有效途徑之一。李月華等(1993)對(duì)我國(guó)上個(gè)世紀(jì)80年代以前的1400多個(gè)小麥育成品種的千粒重進(jìn)行了分析，結(jié)果表明小麥千粒重從50年代以前的31g增加到了80年代的42g，平均增加了33.8％，其中小麥千粒重在45g以上的品種占到了總數(shù)的42％。趙倩等(2013)運(yùn)用相關(guān)和通徑分析方法，對(duì)2006年-2012年山東省審定的38個(gè)高產(chǎn)小麥品種的產(chǎn)量及其構(gòu)成三因素進(jìn)行的統(tǒng)計(jì)分析顯示，產(chǎn)量構(gòu)成因素中以千粒重與產(chǎn)量的相關(guān)系數(shù)最大且呈顯著正相關(guān)。高產(chǎn)小麥品種的單位面積穗數(shù)相對(duì)較高，千粒重是產(chǎn)量的主要制約因素，因此針對(duì)目前的單產(chǎn)水平，應(yīng)主要通過(guò)增加千粒重獲得小麥的高產(chǎn)。

在產(chǎn)量構(gòu)成因素中，千粒重的直接貢獻(xiàn)最大且它的增加是相對(duì)獨(dú)立的，主要受加性效應(yīng)的控制，其廣義遺傳力高達(dá)59％-80％(莊巧生，2003)，比較適合進(jìn)行遺傳分析和研究，也是目前的研究熱點(diǎn)。在粒重QTL(quantitative trait locus，數(shù)量性狀位點(diǎn))定位上，前人已進(jìn)行了大量的研究。Giura and Saulescu(1996)利用單體在4A、6D染色體上發(fā)現(xiàn)存在增加粒重的位點(diǎn)，5B、5D染色體上存在降低粒重的位點(diǎn)。Campbell等(1999)利用軟麥和硬麥雜交構(gòu)建的重組自交系，在4個(gè)環(huán)境下檢測(cè)到5個(gè)控制千粒重的QTL，分別位于1A、1B、3B、3DL和7A染色體上，每個(gè)QTL所解釋的表型變異為5.8％-12.2％。Varshney等(2000)利用高粒重材料Rye Selection111和低粒重的中國(guó)春雜交衍生的100個(gè)重組自交系，在1A、1D、2B、4B、5B、6B、7A和7D共8條染色體上均檢測(cè)到控制粒重的QTL，其中1A、2B和7A染色體上的QTL能顯著提高粒重。Groos等(2003)研究了以Rena和Récital為親本構(gòu)建的群體，在6個(gè)環(huán)境下共檢測(cè)到9個(gè)控制粒重的QTL，其中位于2B、5B和7A染色體上的3個(gè)QTL在6個(gè)環(huán)境中穩(wěn)定存在且2B染色體上的QTL效應(yīng)最強(qiáng)，可解釋20％的表型變異。Kumar等(2006)同樣利用高粒重材料Rye Selection111和低粒重中國(guó)春為親本構(gòu)建重組自交系群體，在6個(gè)環(huán)境下檢測(cè)控制粒重的QTL，在1AS、2BS和7AS染色體上檢測(cè)到多環(huán)境下穩(wěn)定存在且顯著提高粒重的QTL，每個(gè)QTL所解釋的表型變異為9.06％-19.85％；其中，7AS染色體上的QTL同時(shí)控制抽穗期， 說(shuō)明該QTL是具有多效性的正向位點(diǎn)。張坤普等(2009)以小麥品種花培3號(hào)和豫麥57雜交獲得的DH群體，將控制千粒重的3個(gè)加性QTL定位于3B、4B和6A染色體上，它們可分別解釋的表型變異為3.36％、4.39％和14.64％；其中，位于6A染色體上的QTgw-6Ab對(duì)千粒重的遺傳貢獻(xiàn)率最大且在3個(gè)環(huán)境中穩(wěn)定表達(dá)，可用于分子標(biāo)記輔助選擇。Maria等(2014)利用構(gòu)建的小麥高密度SNP遺傳連鎖圖譜，在3B、4B染色體上也檢測(cè)到千粒重QTL。

目前，粒重QTL的定位涉及幾乎小麥全部的21條染色體。許多研究發(fā)現(xiàn)，部分控制粒寬、粒長(zhǎng)和粒重的QTL重疊在一起(Ramya et al.,2010；Sun et al.,2009；王瑞霞等，2009)。對(duì)于以上產(chǎn)量相關(guān)性狀QTL集中的染色體部分，研究推測(cè)其可能是因?yàn)閱蝹€(gè)基因控制多個(gè)性狀抑或是與不同性狀相關(guān)的多個(gè)基因連鎖在一起，也可能受復(fù)雜的遺傳性狀影響所引起，但這些推測(cè)仍需要深入的研究去證實(shí)。另外，通過(guò)對(duì)以上多個(gè)產(chǎn)量相關(guān)性狀QTL重疊的染色體區(qū)域的進(jìn)一步研究，特別是在多個(gè)環(huán)境都被檢測(cè)到的QTL，還可以幫助人們更有效地利用分子標(biāo)記，通過(guò)標(biāo)記輔助育種途徑，將控制多個(gè)重要性狀的基因聚合起來(lái)，從而獲得高產(chǎn)品種。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供與小麥粒重相關(guān)的引物對(duì)、小麥粒重相關(guān)的數(shù)量性狀位點(diǎn)及它們?cè)谳o助選育高粒重小麥中的應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明首先提供了鑒定或輔助鑒定小麥粒重性狀的引物對(duì)Xcau1087。

本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定小麥粒重性狀的引物對(duì)Xcau1087，由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的兩條單鏈DNA組成。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了制備所述鑒定或輔助鑒定小麥粒重性狀的引物對(duì)Xcau1087的方法。

本發(fā)明所提供的制備所述鑒定或輔助鑒定小麥粒重性狀的引物對(duì)Xcau1087的方法，包括將所述的兩條單鏈DNA分別單獨(dú)包裝的步驟。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了鑒定或輔助鑒定小麥粒重性狀的產(chǎn)品。

本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定小麥粒重性狀的產(chǎn)品，含有所述鑒定或輔助鑒定小麥粒重性狀的引物對(duì)Xcau1087。

上述產(chǎn)品可為試劑或試劑盒，還可為由試劑或試劑盒與儀器組成的系統(tǒng)，如由上述鑒定或輔助鑒定小麥粒重性狀的引物對(duì)Xcau1087和下述至少一種試劑和/或儀器組成的系統(tǒng)：進(jìn)行PCR擴(kuò)增所需的其它試劑、進(jìn)行凝膠電泳所需的試劑、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)和照相機(jī)。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了鑒定或輔助鑒定小麥粒重性狀的方法。

本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定小麥粒重性狀的方法，包括如下步驟：

1)分別以待測(cè)小麥、小麥A和小麥B的基因組DNA為模板，用所述引物對(duì)Xcau1087分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到所述待測(cè)小麥PCR產(chǎn)物、所述小麥A PCR產(chǎn)物和所述小麥B PCR產(chǎn)物；所述待測(cè)小麥?zhǔn)撬鲂←淎與所述小麥B進(jìn)行雜交得到的雜交后代；所述小麥B的粒重高于所述小麥A的粒重；

2)將所述待測(cè)小麥PCR產(chǎn)物、所述小麥A PCR產(chǎn)物和所述小麥B PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，根據(jù)電泳結(jié)果確定所述待測(cè)小麥的粒重性狀：如果電泳結(jié)果顯示為所述待測(cè)小麥PCR產(chǎn)物含有與所述小麥B PCR產(chǎn)物大小相同的條帶，所述待測(cè)小麥為高粒重小麥或候選為高粒重小麥；如果電泳結(jié)果顯示為所述待測(cè)小麥PCR產(chǎn)物不含有與所述小麥B PCR產(chǎn)物大小相同的條帶，所述待測(cè)小麥為非高粒重小麥或候選為非高粒重小麥。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了鑒定或輔助鑒定小麥粒重性狀的方法。

本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定小麥粒重性狀的方法，包括如下步驟：

1)分別以待測(cè)小麥、小麥A和小麥B的基因組DNA為模板，用所述引物對(duì)Xcau1087分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到所述待測(cè)小麥PCR產(chǎn)物、所述小麥A PCR產(chǎn)物和所述小麥B PCR產(chǎn)物；所述待測(cè)小麥?zhǔn)撬鲂←淎與所述小麥B進(jìn)行雜交得到的雜交后代；所述小麥B的粒重高于所述小麥A的粒重；

2)將所述待測(cè)小麥PCR產(chǎn)物、所述小麥A PCR產(chǎn)物和所述小麥B PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，根據(jù)電泳結(jié)果確定所述待測(cè)小麥的粒重性狀：電泳結(jié)果顯示為PCR產(chǎn)物含有與所述小麥B PCR產(chǎn)物大小相同條帶的待測(cè)小麥的粒重高于或候選高于PCR產(chǎn)物不含有與所述小麥B PCR產(chǎn)物大小相同條帶的待測(cè)小麥的粒重。

上文中，所述小麥A具體可為小麥?zhǔn)?185，所述小麥B具體可為小麥輻4185。

上文中，所述待測(cè)小麥具體可為以所述小麥A為母本，以所述小麥B為父本進(jìn)行雜交得到的雜交后代，具體可為以小麥?zhǔn)?185為母本，以小麥輻4185為父本進(jìn)行雜交得到的F₂代或其衍生的后代，如F₂代分離群體或F_2:3家系。

上文中，所述PCR擴(kuò)增采用的引物退火條件為58℃退火30s。

上文中，所述PCR擴(kuò)增中，用所述引物對(duì)Xcau1087進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的PCR反應(yīng)溫度程序如下：94℃預(yù)變性5min，然后進(jìn)行如下36個(gè)循環(huán)：94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s；最后72℃延伸10min，12℃保存。

上文中，所述電泳具體可為聚丙烯酰胺凝膠電泳，所述聚丙烯酰胺凝膠電泳中，所述聚丙烯酰胺凝膠的濃度為8％(質(zhì)量百分含量)。

所述鑒定或輔助鑒定小麥粒重性狀的引物對(duì)Xcau1087中或所述鑒定或輔助鑒定小麥粒重性狀的產(chǎn)品中，所述小麥可為上述小麥A、上述小麥B，或上述小麥A與上述小麥B進(jìn)行雜交得到的雜交后代；所述小麥A具體可為小麥?zhǔn)?185，所述小麥B具體 可為小麥輻4185；所述小麥A與所述小麥B進(jìn)行雜交得到的雜交后代可為以所述小麥A為母本，以所述小麥B為父本進(jìn)行雜交得到的雜交后代，具體可為以小麥?zhǔn)?185為母本，以小麥輻4185為父本進(jìn)行雜交得到的F₂代或其衍生的后代，如F₂代分離群體或F_2:3家系。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了下述1)-4)中任一種的應(yīng)用：

1)所述鑒定或輔助鑒定小麥粒重性狀的引物對(duì)Xcau1087在鑒定或輔助鑒定小麥粒重性狀中的應(yīng)用；

2)所述鑒定或輔助鑒定小麥粒重性狀的引物對(duì)Xcau1087在小麥育種中的應(yīng)用；

3)所述鑒定或輔助鑒定小麥粒重性狀的引物對(duì)Xcau1087在獲取小麥粒重相關(guān)的DNA分子中的應(yīng)用；

4)所述鑒定或輔助鑒定小麥粒重性狀的引物對(duì)Xcau1087在獲取小麥粒重相關(guān)分子標(biāo)記中的應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了下述1)-4)中任一種的應(yīng)用：

1)所述鑒定或輔助鑒定小麥粒重性狀的產(chǎn)品在鑒定或輔助鑒定小麥粒重性狀中的應(yīng)用；

2)所述鑒定或輔助鑒定小麥粒重性狀的產(chǎn)品在小麥育種中的應(yīng)用；

3)所述鑒定或輔助鑒定小麥粒重性狀的產(chǎn)品在獲取小麥粒重相關(guān)的DNA分子中的應(yīng)用；

4)所述鑒定或輔助鑒定小麥粒重性狀的產(chǎn)品在獲取小麥粒重相關(guān)分子標(biāo)記中的應(yīng)用。

本發(fā)明所提供的所述鑒定或輔助鑒定小麥粒重性狀的方法在小麥育種中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

上文中，所述粒重具體可為千粒重。

實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明在小麥5DL染色體上定位到一個(gè)環(huán)境穩(wěn)定且與小麥耐熱性相關(guān)的粒重主效QTL，名稱為QTgw.cau-5D，并開發(fā)獲得其緊密連鎖的SSR標(biāo)記Xcau1087，可解釋的表型變異為3.18％-13.55％，其加性效應(yīng)為-2.87g至-0.59g，增效位點(diǎn)來(lái)自父本輻4185。另外，利用該緊密連鎖的SSR標(biāo)記Xcau1087可快速有效地篩選出具有輻4185基因型的高千粒重小麥，從而應(yīng)用于小麥的分子標(biāo)記輔助育種，為小麥粒重性狀的改良及高產(chǎn)育種提供有力的技術(shù)支持，加速小麥高產(chǎn)育種的進(jìn)程。本發(fā)明SSR標(biāo)記Xcau1087在小麥粒重性狀的分子標(biāo)記輔助育種及粒重性狀改良中具有重要應(yīng)用。

附圖說(shuō)明

圖1為利用引物對(duì)Xbarc239經(jīng)克隆、測(cè)序后獲得的石4185和輻4185的部分序列及其與小麥5AL、5BL和5DL染色體的序列比對(duì)結(jié)果。

圖2為利用小麥缺體四體系將Xbarc239定位在5DL染色體上。

圖3為初定位的粒重主效QTgw.cau-5D附近的遺傳連鎖圖譜及其與水稻、短柄草的共線性比對(duì)結(jié)果。其中，左側(cè)數(shù)字表示各SSR標(biāo)記在5DL染色體上的相對(duì)位置(單位為cM)；右側(cè)為各分子標(biāo)記的名稱。

圖4為利用SSR標(biāo)記Xcau1087對(duì)北京春播的石4185×輻4185的F₂群體中部分單株的基因型檢測(cè)結(jié)果。其中，帶型與母本石4185相同的記為A，與父本輻4185相同的記為B，雜合帶型記為H。

圖5為2014年北京春播的石4185×輻4185的F₂群體千粒重分布圖。

圖6為2014年山西春播的石4185×輻4185的F₂群體千粒重分布圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。

下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中的輻4185為河北省石家莊市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所的產(chǎn)品。

實(shí)施例1：小麥粒重主效QTgw.cau-5D的定位

一、石4185與輻4185間的差異分析

1、材料與種植

石4185為節(jié)水高產(chǎn)型冬小麥品種；輻4185為石4185經(jīng)伽瑪射線輻射后自交8代獲得的一個(gè)純合誘變系。石4185和輻4185的種植環(huán)境見(jiàn)表1，每個(gè)種植環(huán)境均設(shè)3個(gè)重復(fù)，行長(zhǎng)1.5m，行距0.3m，株距7.5cm。

表1、小麥粒重主效QTL各定位群體的種植環(huán)境

2、千粒重的測(cè)定

小麥自然成熟后，石4185和輻4185混合收獲并脫粒后考查其千粒重；千粒重的考查均借助于杭州萬(wàn)深檢測(cè)科技有限公司的SC-G自動(dòng)種子考種分析及千粒重儀。

石4185和輻4185除千粒重外，在多個(gè)產(chǎn)量相關(guān)性狀如株高、穗長(zhǎng)、穗粒數(shù)等均 無(wú)顯著差異。石4185和輻4185的千粒重測(cè)定結(jié)果列于表2，結(jié)果表明，與石4185相比，輻4185在北京、河北、山西三個(gè)不同環(huán)境下的千粒重增加的比例為10.83％-22.44％。

表2、石4185和輻4185的千粒重測(cè)定結(jié)果

注：*和**分別表示5％和1％的顯著水平。

3、石4185與輻4185間多態(tài)性差異分析

采用改良的CTAB法(Stewart et al.，1993)分別提取石4185和輻4185幼嫩葉片的基因組DNA并以其為模板，以2019個(gè)SSR(simple sequence repeat，簡(jiǎn)單重復(fù)序列)標(biāo)記引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增；同時(shí)，利用Infinium 90K基因芯片中的SNP(Single Nucleotide Polymorphism，單核苷酸多態(tài)性)標(biāo)記，分析石4185和輻4185在全基因組水平上的遺傳差異。結(jié)果如表3所示，石4185與輻4185間只有5.4％的SSR標(biāo)記和2.0％的SNP標(biāo)記存在多態(tài)性，遠(yuǎn)低于普通小麥品種間20％-30％的多態(tài)性，這說(shuō)明輻4185為石4185的輻射誘變系。

表3、石4185與輻4185間多態(tài)性標(biāo)記統(tǒng)計(jì)結(jié)果

二、小麥粒重主效QTgw.cau-5D的檢測(cè)

石4185×輻4185的F₂群體及母本石4185和父本輻4185均于2011年10月在北京種植，石4185×輻4185的F_2:3家系及母本石4185和父本輻4185于2012年10月分別在河北、山西種植，石4185×輻4185的F₂群體及母本石4185和父本輻4185于2014年3月和2月分別在北京、山西種植。其中，F(xiàn)_2:3家系的種植采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)種植環(huán)境均設(shè)3個(gè)重復(fù)，行長(zhǎng)1.5m，行距0.3m，株距7.5cm。

1、采用改良的CTAB法(Stewart et al.，1993)分別提取2011年北京種植的石4185×輻4185的F₂群體中各單株及母本石4185和父本輻4185的幼嫩葉片的基因組DNA。分別以母本石4185的基因組DNA、父本輻4185的基因組DNA和石4185×輻4185的F₂群體的部分單株的基因組DNA為模板，以表3中在母本石4185和父本輻4185間 具有多態(tài)性的110對(duì)SSR標(biāo)記為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)8％聚丙烯酰胺凝膠電泳后，篩選統(tǒng)計(jì)出能夠明顯區(qū)分石4185×輻4185的F₂群體中的三種基因型的多態(tài)性SSR標(biāo)記，共58對(duì)。

2、分別以石4185×輻4185的F₂群體中各單株的基因組DNA、母本石4185的基因組DNA和父本輻4185的基因組DNA為模板，利用步驟1得到的58對(duì)SSR標(biāo)記為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)8％聚丙烯酰胺凝膠電泳后，鑒定統(tǒng)計(jì)石4185×輻4185的F₂群體中各單株的基因型。

3、待小麥材料自然成熟后，按照千粒重的測(cè)定方法，借助于千粒重儀分別考察并統(tǒng)計(jì)石4185×輻4185的F₂群體及F_2:3家系的千粒重表型。F₂群體單株收獲并脫粒后考查其千粒重；對(duì)于F_2:3家系，從每個(gè)株系中選取中間10株混合脫粒后考查其千粒重。千粒重的考查均借助于杭州萬(wàn)深檢測(cè)科技有限公司的SC-G自動(dòng)種子考種分析及千粒重儀。表4為不同環(huán)境下石4185×輻4185的F₂群體及F_2:3家系的千粒重?cái)?shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，在石4185×輻4185的F₂群體及F_2:3家系中，其千粒重性狀表現(xiàn)出一定的分離，其變異率分別為9.77％-11.82％和3.91％-4.72％。與表2中相應(yīng)環(huán)境下的兩個(gè)親本的千粒重相比發(fā)現(xiàn)，千粒重在石4185×輻4185的F₂群體及F_2:3家系中表現(xiàn)出一定的超親分離，表明控制千粒重的QTL基因主要分布在高千粒重父本輻4185中。另外，在各群體中，千粒重均呈正態(tài)分布，表明了千粒重性狀的數(shù)量遺傳特征。

表4、不同環(huán)境下石4185×輻4185的F₂群體及F_2:3家系的千粒重統(tǒng)計(jì)結(jié)果

4、根據(jù)步驟2得到的石4185×輻4185的F₂群體中各單株的基因型，結(jié)合步驟3中2011年北京種植的石4185×輻4185的F₂群體及2012年河北、山西種植的F_2:3家系的千粒重的考查數(shù)據(jù)，通過(guò)單標(biāo)記方差分析法，對(duì)千粒重進(jìn)行單標(biāo)記分析。其結(jié)果如表5所示，利用單標(biāo)記方差分析法在2011年北京石4185×輻4185的F₂群體及2012年河北、山西F_2:3家系共兩個(gè)世代三個(gè)環(huán)境下均檢測(cè)到粒重QTL，且與已公布的SSR標(biāo)記Xbarc239緊密連鎖，達(dá)到0.01％的極顯著水平。

表5、利用單標(biāo)記法對(duì)千粒重的分析結(jié)果

注：***和****分別表示0.1％和0.01％的顯著水平。

5、分別以石4185的基因組DNA和輻4185的基因組DNA為模板，以引物對(duì)Xbarc239(http://wheat.pw.usda.gov/GG2/index.shtmL)為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并經(jīng)克隆、測(cè)序后，借助國(guó)際小麥基因組測(cè)序協(xié)會(huì)的BLAST工具(https://urgi.versailles.inra.fr/blast/blast.php)，將獲得的石4185和輻4185的序列信息與小麥全基因組序列信息進(jìn)行比對(duì)分析。結(jié)果見(jiàn)圖1，經(jīng)克隆測(cè)序后將SSR標(biāo)記Xbarc239定位到小麥5DL染色體上，其具體位置為chr5DL_ab_k71_contigs_4520158，同源性達(dá)98.6％，這與圖2中Yang等(2005)利用小麥缺體四體系將Xbarc239定位在5DL染色體上的結(jié)果是一致的。因此，將該粒重主效QTL命名為QTgw.cau-5D。

實(shí)施例2：小麥粒重主效QTL緊密連鎖標(biāo)記Xcau1087的獲得

具體方法如下：

1、下載國(guó)際小麥基因組測(cè)序協(xié)會(huì)(http://www.wheatgenome.org/)發(fā)布的5DL染色體上的所有contig序列，利用BatchPrimer3v1.0(http://probes.pw.usda.gov/batchprimer3/)搜索兩個(gè)堿基重復(fù)次數(shù)大于30，三個(gè)堿基重復(fù)大于21次所在的序列并設(shè)計(jì)引物，經(jīng)親本間PCR擴(kuò)增和8％的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)及小群體驗(yàn)證，最終開發(fā)出5DL染色體上多態(tài)性明顯且?guī)颓逦亩鄬?duì)SSR標(biāo)記。

2、根據(jù)國(guó)際小麥基因組測(cè)序協(xié)會(huì)(http://www.wheatgenome.org/)發(fā)布的genome zipper及PNAS發(fā)表的文章“A 4-gigabase physical map unlocks the structure and evolution of the complex genome of Aegilops tauschi i,the wheat D-genome progenitor”里的genome zipper，進(jìn)行千粒重主效QTL附近小麥與粗山羊草、水稻和短柄草的染色體共線性關(guān)系比對(duì)。根據(jù)同源性關(guān)系比對(duì)結(jié)果，利用該區(qū)間內(nèi)所包含的粗山羊草探針延伸序列、水稻基因序列和短柄草基因序列，從小麥基因組測(cè)序協(xié)會(huì)數(shù)據(jù)庫(kù)中提取獲得小麥粒重主效QTL附近的基因組序列。在此基礎(chǔ)上，利用步驟1中同樣的方法，借助BatchPrimer3v1.0進(jìn)行粒重主效QTL附近特異SSR標(biāo)記的開發(fā)。

3、以實(shí)施例1中步驟二的2011年北京種植的石4185×輻4185的F₂群體中各單 株的基因組DNA、母本石4185的基因組DNA及父本輻4185的基因組DNA為模板，以步驟1和步驟2中得到的SSR標(biāo)記為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)8％聚丙烯酰胺凝膠電泳后，鑒定統(tǒng)計(jì)出石4185×輻4185的F₂群體中各單株的基因型。其中，帶型與母本石4185相同的記為A，與父本輻4185相同的記為B，雜合帶型記為H，缺失記為“-”，應(yīng)用JoinMap 4.0軟件進(jìn)行粒重主效QTL，名稱為QTgw.cau-5D區(qū)間的遺傳連鎖圖譜構(gòu)建，所得結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，共有5對(duì)新開發(fā)的SSR標(biāo)記Xcau1022、Xcau1053、Xcau1087、Xcau1118和Xcau1132被加密到Xbarc239附近，且Xcau1087距離Xbarc239最近。

4、根據(jù)步驟3得到的石4185×輻4185的F₂群體中各單株的基因型，結(jié)合實(shí)施例1中步驟二的2011年北京種植的石4185×輻4185的F₂群體及實(shí)施例1中步驟二的2012年河北、山西種植的F_2:3家系的千粒重的考查數(shù)據(jù)，參照Ajay Kumar(2013)的方法，使用QTL Cartographer V2.5軟件(Wang S.2012)，通過(guò)復(fù)合區(qū)間作圖法(Composite Interval Mapping，CIM)對(duì)小麥粒重主效QTL進(jìn)行定位，其結(jié)果如表6所示。由表6可知，通過(guò)復(fù)合區(qū)間作圖法(CIM)在實(shí)施例1中步驟二的2011年北京石4185×輻4185的F₂群體及實(shí)施例1中步驟二的2012年河北、山西F_2:3家系共兩個(gè)世代三個(gè)環(huán)境下均能在SSR標(biāo)記Xcau1087附近檢測(cè)到控制粒重的主效QTL，其加性效應(yīng)分別為-2.87g、-0.59g和-0.81g，可解釋的表型變異為3.18％-13.55％，且其增效位點(diǎn)均來(lái)源于父本輻4185。

表6、利用石4185×輻4185的F₂群體及F_2:3群體檢測(cè)到的粒重QTL

注：標(biāo)記區(qū)間是QTL所在位置(峰值)兩側(cè)的標(biāo)記所在的區(qū)間；位置是指QTL所在位置(峰值)距離標(biāo)記區(qū)間的第一個(gè)標(biāo)記的距離；加性效應(yīng)中，正值表明增效基因來(lái)源于母本石4185，負(fù)值表明增效基因來(lái)源于父本輻4185。

實(shí)施例3：緊密連鎖標(biāo)記Xcau1087在小麥粒重選擇上的應(yīng)用

2014年2月、3月，分別在北京、山西兩點(diǎn)通過(guò)春播的方式種植母本石4185、父本輻4185和石4185×輻4185的F₂群體。苗期對(duì)母本石4185、父本輻4185和石4185×輻4185的F₂群體單株掛牌取樣，分別提取兩個(gè)春播環(huán)境下母本石4185(小麥A)、父本輻4185(小麥B)和石4185×輻4185的F₂群體中各單株(待測(cè)小麥)的基因組DNA并以其為模板，利用SSR標(biāo)記Xcau1087為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到母本石4185PCR產(chǎn)物、父本輻4185PCR產(chǎn)物和待測(cè)小麥PCR產(chǎn)物；進(jìn)行8％(質(zhì)量百分含量)的聚丙 烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)電泳結(jié)果確定所述待測(cè)小麥的粒重性狀：如果電泳結(jié)果顯示為待測(cè)小麥PCR產(chǎn)物含有與父本輻4185PCR產(chǎn)物大小相同的條帶，待測(cè)小麥為高粒重小麥或候選為高粒重小麥；如果待測(cè)小麥PCR產(chǎn)物的電泳中顯示為不含有與父本輻4185PCR產(chǎn)物大小相同的條帶，待測(cè)小麥為非高粒重小麥或候選為非高粒重小麥。

電泳結(jié)果中，將母本石4185PCR產(chǎn)物的電泳帶型的記為A，父本輻4185PCR產(chǎn)物的電泳帶型的記為B，待測(cè)小麥PCR產(chǎn)物的電泳帶型與母本石4185相同的記為A，與父本輻4185相同的記為B，雜合帶型(由母本石4185PCR產(chǎn)物的電泳帶型和父本輻4185PCR產(chǎn)物的電泳帶型組成)記為H，缺失記為“-”。檢測(cè)并統(tǒng)計(jì)兩個(gè)春播環(huán)境下石4185×輻4185的F₂群體中各單株的基因型(PCR產(chǎn)物的電泳帶型)，Xcau1087的正向引物序列如SEQ ID No.1所示，Xcau1087的反向引物序列如SEQ ID No.2所示。

PCR反應(yīng)體系(10μL體系)如下：

PCR反應(yīng)程序(10μL體系)如下：

電泳：在擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物中加入2.0μL的6×Loading Buffer(100mL中含有濃度為0.5M，pH8.0的EDTA溶液2mL，去離子甲酰胺98mL，溴酚蘭0.05g，二甲苯氰0.05g)，離心后，每孔分別點(diǎn)樣4μL,其中一孔點(diǎn)4μL的100bp DNA Ladder。常溫下，在GT核酸電泳系統(tǒng)(Bio-Rad,USA)中200V預(yù)電泳2min，然后在120V恒壓下電泳5h左右；

銀染：

1)染色：將膠板卸下，剝膠放入0.1％(質(zhì)量百分比)染色液(將0.50g的AgNO₃加入到500mL去離子水中，混勻)中，然后在搖床上輕輕搖動(dòng)，染色15min；

2)顯色：待染色15min后，小心倒掉染色液并用去離子水快速漂洗30s，每盆加入顯色液(NaOH 10.00g，無(wú)水Na₂CO₃0.20g-0.30g，去離子水500mL，甲醛750μL)500mL，繼續(xù)放在搖床上，輕輕搖動(dòng)10min左右；

3)拍照：待凝膠變成淺黃色，DNA條帶完全顯現(xiàn)時(shí)，倒掉顯色液，用清水沖洗，并用照相機(jī)記錄每板膠的條帶情況，以便讀取帶型。

圖4為利用SSR標(biāo)記Xcau1087對(duì)北京石4185×輻4185的F₂群體中部分單株的基因型檢測(cè)結(jié)果。同時(shí)，待小麥成熟后，考查并統(tǒng)計(jì)北京、山西兩點(diǎn)石4185×輻4185的F₂群體中各單株的千粒重?cái)?shù)據(jù)。

首先，結(jié)合2014年兩個(gè)春播環(huán)境下的石4185×輻4185的F₂群體的基因型及千粒重?cái)?shù)據(jù)，同樣參照利用QTL Cartographer V2.5軟件，通過(guò)復(fù)合區(qū)間作圖法對(duì)小麥粒重主效QTL進(jìn)行定位(表7)，發(fā)現(xiàn)再次在SSR標(biāo)記Xcau1087附近檢測(cè)到控制粒重的主效QTL，其加性效應(yīng)分別為-1.70g、-1.54g，平均可解釋12.23％的表型變異，且其增效位點(diǎn)也均來(lái)源于父本輻4185。

表7、利用2014年春播的石4185×輻4185的F₂群體檢測(cè)到的粒重QTL

最后，對(duì)兩個(gè)春播環(huán)境下母本石4185、父本輻4185和石4185×輻4185的F₂群體中各單株的基因型及千粒重?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(表8)發(fā)現(xiàn)，利用SSR標(biāo)記Xcau1087，在北京春播環(huán)境下的石4185×輻4185的F₂群體(231株)中共篩選出163株含有父本輻4185的帶型(B和H)，其中千粒重超過(guò)該F₂群體的平均千粒重(37.56g)的有100株，占61.35％(圖5)；千粒重超過(guò)表2中母本石4185的平均千粒重(33.76g)的共有147株，占90.18％。在山西春播環(huán)境下的石4185×輻4185的F₂群體，由于自然災(zāi)害對(duì)結(jié)實(shí)率的影響，僅考查獲得131個(gè)單株的千粒重，其中有100株含有父本輻4185的帶型(B和H)，千粒重超過(guò)該F₂群體平均千粒重(34.64g)的有58株，占58.00％(圖6)；千粒重超過(guò)表2中相應(yīng)環(huán)境下母本石4185的平均千粒重(29.90g)的共有94株，占94.00％。由此可以看出，利用新開發(fā)的SSR標(biāo)記Xcau1087，可以在苗期有效篩選出高千粒重的小麥，節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本，提高選擇效率，從而快速篩選出高千粒重的株系，用于小麥的高產(chǎn)育種。

表8、北京、山西兩點(diǎn)石4185×輻4185的F₂群體的千粒重統(tǒng)計(jì)結(jié)果

另外，小麥為喜涼作物，籽粒灌漿期時(shí)若遇到高溫環(huán)境則易導(dǎo)致產(chǎn)量減少和品質(zhì)降低(Asseng et al.,2011；Kumar and Rai,2014)。隨著全球氣候變暖，耐熱小麥品種的選育對(duì)于實(shí)現(xiàn)小麥高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)具有重要的理論和實(shí)踐意義。以上春播環(huán)境將小麥的成熟期推遲(表9)，實(shí)現(xiàn)了石4185×輻4185的F₂群體在灌漿期的高溫處理，說(shuō)明該粒重主效QTL還可能與小麥的耐熱性相關(guān)。

表9、不同播種方式下小麥成熟期的比較結(jié)果

綜合以上結(jié)果，本發(fā)明在小麥5DL染色體上定位到一個(gè)環(huán)境穩(wěn)定且與小麥耐熱性相關(guān)的粒重主效QTL，名稱為QTgw.cau-5D，并開發(fā)獲得其緊密連鎖的SSR標(biāo)記Xcau1087，可解釋的表型變異為3.18％-13.55％，其加性效應(yīng)為-2.87g至-0.59g，增效位點(diǎn)來(lái)自父本輻4185。另外，利用該緊密連鎖的SSR標(biāo)記Xcau1087可快速有效地篩選出具有輻4185基因型的高千粒重小麥，從而應(yīng)用于小麥的分子標(biāo)記輔助育種，為小麥粒重性狀的改良及高產(chǎn)育種提供有力的技術(shù)支持，加速小麥高產(chǎn)育種的進(jìn)程。