本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種阿爾茲海默癥關(guān)鍵致病因子app的基因工程細(xì)胞株，該細(xì)胞株可用于阿爾茲海默癥的診斷試劑盒開發(fā)和藥物篩選。

背景技術(shù)：

阿爾茲海默癥(Alzheimer’s Disease,AD)與肌萎縮側(cè)索硬化癥、亨廷頓舞蹈癥、帕金森癥，并稱為四大神經(jīng)退行性疾病。AD病人在發(fā)病過程中逐漸喪失記憶及其它認(rèn)知能力，由最初的記憶減退發(fā)展為重度癡呆，生活無法自理且死于并發(fā)癥。該病進(jìn)展緩慢，嚴(yán)重影響了患者的身心健康。AD疾病給患者、家庭及社會(huì)帶來了巨大的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，目前世界上已經(jīng)確診的AD病例約為3600萬，據(jù)推測(cè)，到2050年AD患者將為目前的3倍^[1]。迄今為止，人們?nèi)匀徊涣私釧D的發(fā)病機(jī)理，缺乏有效的診斷、治療方法。

神經(jīng)元細(xì)胞外大量的β淀粉樣蛋白(Amyloidβ，Aβ)沉積是AD主要病理特征^[2]，Aβ由前體APP經(jīng)蛋白酶剪切形成^[3]。通過對(duì)APP功能研究，從而為揭示AD疾病致病機(jī)制、針對(duì)APP開發(fā)有效的藥物及治療方法提供重要的線索。

CRISPR/Cas技術(shù)是最近興起的一項(xiàng)基因組編輯技術(shù)。CRISPR/Cas系統(tǒng)包含具有核酸酶活性的CRISPR相關(guān)(Cas)基因和crRNA和tracrRNA這兩種決定切割位點(diǎn)特異性的非編碼RNA^[4]。crRNA和tracrRNA相互堿基配對(duì)形成tracrRNA/crRNA復(fù)合物引導(dǎo)核酸酶Cas9蛋白在與crRNA配對(duì)的序列靶位點(diǎn)剪切雙鏈DNA。我們通過人工設(shè)計(jì)這兩種RNA，改造形成具有引導(dǎo)作用的sgRNA(short guide RNA)，來實(shí)現(xiàn)Cas9蛋白對(duì)DNA的定點(diǎn)切割^[5‐6]。目前尚未見相關(guān)報(bào)道利用CRISPR/Cas技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)阿爾茲海默癥app基因的敲除，以獲得體外培養(yǎng)的人類細(xì)胞app基因缺失的細(xì)胞株。

參考文獻(xiàn)

[1]Wimo,A.,and Prince,M.(2010).World Alzheimer Report 2010:The Global Economic Impact of Dementia(London:Alzheimer’s Disease International),pp.1–56.

[2]John Hardy,Dennis J.Selkoe.The Amyloid Hypothesis of Alzheimer's Disease:Progress and Problems on the Road to Therapeutics.Science 2002；297:353-356

[3]Clive Ballard,Serge Gauthier,Anne Corbett,Carol Brayne,Dag Aarsland,Emma Jones.Alzheimer’s disease.Lancet 2011；377:1019–31

[4]Cong L,Ran FA,Cox D,Lin S,Barretto R,Habib N,et al.Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.Science 2013；339(6121):819-23.

[5]Jinek M,Chylinski K,Fonfara I,Hauer M,Doudna JA,Charpentier E.A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.Science 2012；337(6096):816-21.

[6]Mali P,Yang L,Esvelt KM,Aach J,Guell M,DiCarlo JE,et al.RNA-guided human genome engineering via Cas9.Science 2013；339(6121):823-6.

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種阿爾茲海默癥致病基因app的基因工程細(xì)胞株及藥物篩選模型，可用于阿爾茲海默癥的診斷試劑盒開發(fā)和藥物篩選。

進(jìn)一步地，所述的質(zhì)粒是指用于阿爾茲海默癥致病基因app敲除的插入有如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示堿基序列的Cas9敲除質(zhì)粒。

進(jìn)一步地，本發(fā)明基因工程細(xì)胞株是指app基因純合缺失，雜合缺失的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。

本發(fā)明應(yīng)用Cas9技術(shù)敲除app基因，采用DNA-Lipofectamine^TM 2000轉(zhuǎn)染方法，實(shí)現(xiàn)了阿爾茲海默癥app基因缺失細(xì)胞株的構(gòu)建，可以應(yīng)用在app基因在細(xì)胞中的相關(guān)功能及導(dǎo)致AD的分子機(jī)制的研究中。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，具體步驟如下：

1、app基因敲除Cas9質(zhì)粒的構(gòu)建：

2、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：用DNA-Lipofectamine^TM 2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法將基因跨膜結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)敲除的Cas9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，用抗生素進(jìn)行篩選并用有限稀釋法將細(xì)胞進(jìn)行單克隆化。

所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞為HeLa、K562、HEK293、A549、MCF-7、LNCap、N2a SH-SY5Y或者其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的任一種。

附圖說明

圖1 Cas9結(jié)合區(qū)域。

圖2 Cas9質(zhì)粒載體的圖譜。

圖3 Cas9蛋白表達(dá)質(zhì)粒載體PX335結(jié)構(gòu)示意圖。

圖4直接測(cè)序檢測(cè)Cas9表達(dá)載體對(duì)app基因的敲除的有效性。

圖5 Cas9敲除后的APP蛋白表達(dá)檢測(cè)。

具體實(shí)施方式

下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例結(jié)合附圖作詳細(xì)說明。本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下實(shí)施，給出了具體實(shí)施方式和具體操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述實(shí)施例。凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容所進(jìn)行的任何本領(lǐng)域等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

主要試劑及檢測(cè)試劑盒：HeLa細(xì)胞，Cas9敲除載體質(zhì)粒PX335，購自addgene公司；轉(zhuǎn)染試劑lipofectin2000購自Invitrogen公司；DMEM、胎牛血清FBS購自Hyclone公司；APP抗體購于Sangon，二抗Anti-Rabbit IgG為美國(guó)GE公司產(chǎn)品；其他試劑均為進(jìn)口和國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?shí)施例中，酶切、連接、回收、轉(zhuǎn)化、PCR擴(kuò)增等常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作步驟詳見《分子克隆(第三版)》。

實(shí)施例1 app基因的敲除

一、Cas9技術(shù)敲除HeLa細(xì)胞app基因

本實(shí)施方式根據(jù)app基因的外顯子序列設(shè)計(jì)并構(gòu)建Cas9載體，如圖1，選擇的Cas9序列SEQ ID NO.1對(duì)應(yīng)app基因的第2號(hào)外顯子上。下劃線的部分為Cas9的識(shí)別部位，小寫部分是Cas9中的Cas9蛋白的切割位點(diǎn)。在選定Cas9以后對(duì)全基因組進(jìn)行查重，確認(rèn)本Cas9位點(diǎn)是唯一的，保證了基因敲除的可控性并降低了基因敲除脫靶率。

CCCACTGATGGTAATGCTGGCCTgctggctgaaCCCCAGATTGCCATGTTCTGTGG

SEQ ID NO.1

PX335質(zhì)粒是一種Cas9蛋白表達(dá)載體，如圖2所示。限制性內(nèi)切酶BbsI酶切后會(huì)產(chǎn)生粘性末端GTGG和粘性末端GTTT。借助這一特性，我們?cè)O(shè)計(jì)產(chǎn)生sgRNA的引物兩條鏈后面分別加上了CACC和CAAA，與BbsI消化后的PX335質(zhì)粒產(chǎn)生的粘性末端堿基互補(bǔ)，如圖3所示。具體為：

二、app基因Cas9敲除質(zhì)粒的構(gòu)建

將設(shè)計(jì)好的引物委托生物技術(shù)公司合成。引物合成后SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3退火反應(yīng)，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5退火反應(yīng)，使其分別成為帶有粘性末端的雙鏈DNA片段。退火程序如下：

95℃，5min；95℃-25℃梯度降溫，-5℃/min；12℃，∞。利用BbsI酶切位點(diǎn)將雙鏈DNA片段分別克隆到載體質(zhì)粒PX335上。轉(zhuǎn)化至DH10B中，37℃過夜擴(kuò)增培養(yǎng)，得到含有完整Cas9質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子。提取質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序正確，確認(rèn)所得Cas9質(zhì)粒為所設(shè)計(jì)的質(zhì)粒。

二、編碼序列Cas9敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

(1)接種細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前一天將HeLa細(xì)胞接種至六孔板內(nèi)。細(xì)胞接種數(shù)量視其生長(zhǎng)速度而定，一般為1×10⁶個(gè)細(xì)胞。轉(zhuǎn)染時(shí)要求細(xì)胞匯合度為80～90％。

(2)將分別取實(shí)施例1中得到的Cas9敲除質(zhì)粒載體DNA 4μg加至OPTI-MEM培養(yǎng)基使其終體積為250μl，混勻，得到DNA懸液。

(3)將Lipofectamine2000放置于4℃冰盒架子或者冰上，使用前低轉(zhuǎn)速離心，取10μl的Lipofectamine2000加至另外240μl的OPTI-MEM中，輕輕混勻，此步驟操作要迅速以免脂質(zhì)體在室溫下暴露時(shí)間過長(zhǎng)影響后面轉(zhuǎn)染效率，而后將混合物室溫靜置5分鐘。

(4)將DNA懸液(250μl)和Lipofectamine2000(250μl)懸液混合，總體積500μl，輕輕混勻，室溫靜置20分鐘。

(5)將DNA和Lipofectamine2000混合液加至六孔板的孔內(nèi)，前后左右晃動(dòng)孔板混勻，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(6)轉(zhuǎn)染4～6小時(shí)后細(xì)胞換液，換成含抗生素正常培養(yǎng)基，六孔板容量每孔2ml培養(yǎng)基。

(7)轉(zhuǎn)染細(xì)胞48～72h后，收集5/6的細(xì)胞，用于基因敲除驗(yàn)證的基因組提取。剩余部分直接分散為細(xì)胞懸液，分入96孔板中分離單克隆。

實(shí)施例2 Cas9敲除app基因有效性的檢測(cè)

針對(duì)Cas9特異敲除位點(diǎn)上下游設(shè)計(jì)引物，其序列為：

引物F 5’-GATAGTTATCCCTGTTCTTCCTCCA-3’ SEQ ID NO.6

引物R 5’-CATTTATATGTATATCATAGGGTAATGC-3’ SEQ ID NO.7

收集轉(zhuǎn)染48～72小時(shí)的Hela細(xì)胞，提取到的轉(zhuǎn)染細(xì)胞基因組，使用引物F和引物R引物進(jìn)行PCR，其擴(kuò)增條件為：

94℃5min；

94℃45s，56℃30s，72℃45s，(30～35個(gè)循環(huán))；

72℃5min。

3％瓊脂糖凝膠電泳后經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)，PCR擴(kuò)增Cas9作用靶位點(diǎn)片段長(zhǎng)度約為425bp，經(jīng)瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的片段連接T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coli.DH5α，12h后測(cè)定靶序列以統(tǒng)計(jì)PCR產(chǎn)物片段中的突變比例和突變類型。如附圖4所示，片段測(cè)序出現(xiàn)套峰，認(rèn)為Cas9在此過程中對(duì)靶基因產(chǎn)生切割作用，說明在靶向敲出區(qū)域存在著敲出后的移碼突變修復(fù)。

再通過有限稀釋法進(jìn)行單克隆分離。

實(shí)施例3 Western blot檢測(cè)APP蛋白表達(dá)

對(duì)于得到的實(shí)施例2中得到的單克隆細(xì)胞株待其在60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中長(zhǎng)至80～90％時(shí)，胰酶消化，裂解細(xì)胞，提取蛋白，用酶標(biāo)儀測(cè)定蛋白濃度，取45ug上樣SDS-PAGE電泳，用10％分離膠，5％濃縮膠，PVDF膜濕轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)膜時(shí)間1h，Sangon#AB60097b孵育1h，Goat-Anti-rabbit二抗孵育1h，ECL熒光檢測(cè)，顯影定影并拍照。如附圖5所示，跟正常HeLa細(xì)胞比較，31^#，34^#，35^#細(xì)胞株中APP蛋白缺失。