本發(fā)明涉及人工半合成染色體的整合方法及含有完整合成染色體的微生物。

背景技術(shù)：

釀酒酵母是一種重要的工業(yè)微生物，帶有人工合成染色體的釀酒酵母菌株比野生菌株更具優(yōu)勢(shì)，在科學(xué)研究和工業(yè)生產(chǎn)上都具有重要意義。

釀酒酵母共16條染色體，總長(zhǎng)度約為12mbp；其中最長(zhǎng)的為IV號(hào)染色體，長(zhǎng)度約為1.5mbp。Sc2.0項(xiàng)目是由美國(guó)紐約大學(xué)科學(xué)家Jef D.Beoke等人發(fā)起的旨在人工設(shè)計(jì)并從頭合成釀酒酵母全基因組的國(guó)際合作項(xiàng)目。2011年Jef D.Beoke等人在Nature雜志上發(fā)表文章提出該項(xiàng)目計(jì)劃，并合成了釀酒酵母IX號(hào)染色體右臂和VI號(hào)染色體左臂，進(jìn)行了一系列方法測(cè)試，闡述了該計(jì)劃的可行性。2014年，Jef D.Beoke實(shí)驗(yàn)室終于完成了釀酒酵母III號(hào)染色體的人工合成工作，合成染色體總長(zhǎng)度約為273kbp。目前酵母染色體合成采用的是分段合成、從左到右逐段替換掉野生染色體序列的方式，每次替換的DNA序列長(zhǎng)度約為30kbp(稱為一個(gè)megachunk)。這種合成策略雖然可行，但是也帶有一些明顯的缺陷：比如單一方向合成，用時(shí)較長(zhǎng)；如果前一段的合成序列替換失敗，后續(xù)的所有合成片段都無法進(jìn)行替換，風(fēng)險(xiǎn)較大等。

總之，目前的染色體合成方法仍有待改進(jìn)。并且，在人工染色體合成中，染色體的整合是關(guān)鍵。然而，目前尚沒有合適的染色體整合方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：

目前染色體合成采用的是分段合成、從左到右逐段替換掉野生染色體序列的方式，如果能夠?qū)⒁粭l染色體分成2段或2段以上，分別進(jìn)行替換，然后再將半合成的染色體整合成一條全合成的染色體，將大大提高酵母染色體合成的效率。染色體的長(zhǎng)度越長(zhǎng)，這種策略的優(yōu)勢(shì)就越明顯。在這個(gè)策略中，染色體整合是關(guān)鍵，所以目前急需一種可行且高效的合成染色體整合方法。

本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提出一種可行且高效的人工半合成染色體的整合方法及含有完整合成染色體的微生物。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種人工半合成染色體的整合方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括以下步驟：

(1)分別提供第一人工半合成染色體和第二人工半合成染色體，

其中，

所述第一人工半合成染色體和所述第二人工半合成染色體均包括合成染色體部分和野生型部分，

所述第一人工半合成染色體和所述第二人工半合成染色體之間具有整合同源區(qū)，

所述第一人工半合成染色體和所述第二人工半合成染色體均攜帶預(yù)定酶切位點(diǎn)，

其中，所述預(yù)定酶切位點(diǎn)在所述第一人工半合成染色體和所述第二人工半合成染色體上的位置被配置為適于在所述第一人工半合成染色體和所述第二人工半合成染色體之間基于所述整合同源區(qū)發(fā)生同源重組；

(2)將所述第一人工半合成染色體和所述第二人工半合成染色體在表達(dá)預(yù)定酶的菌株中進(jìn)行同源重組，以便獲得完整合成染色體，其中，所述預(yù)定酶能夠特異性識(shí)別所述預(yù)定酶切位點(diǎn)。

發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的方法能夠有效地將兩條人工半合成染色體進(jìn)行整合，并且步驟簡(jiǎn)單，需時(shí)短，可重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述整合同源區(qū)為的長(zhǎng)度大于1k。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述預(yù)定酶切位點(diǎn)為選自I-SceI、I-CeuI、PI-PspI和PI-SceI酶切位點(diǎn)的至少一種。從而，能夠特異性識(shí)別所述預(yù)定酶切位點(diǎn)的預(yù)定酶可以為I-SceI酶、I-CeuI酶、PI-PspI酶或PI-SceI酶。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述預(yù)定酶切位點(diǎn)為I-SceI酶切位點(diǎn)，所述預(yù)定酶為I-SceI。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述第一人工半合成染色體和所述第二人工半合成染色體均攜帶第一抗性標(biāo)記，所述第一抗性標(biāo)記用于篩選在所述預(yù)定酶切位點(diǎn)發(fā)生酶切與重組后具有所述完整合成染色體的菌株。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述第一抗性標(biāo)記為選自URA3、URA5、LYS2、LYS5和CAN1的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的另一些實(shí)施例，所述第一抗性標(biāo)記為URA3。由此，在表達(dá)預(yù)定酶的菌株中進(jìn)行酶切處理之后，通過FOA負(fù)篩選技術(shù)，可以篩選得到發(fā)生了酶切的菌株(如Ura^-菌株)，從而可以進(jìn)一步提高整合效率。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述第二人工半合成染色體攜帶第二抗性標(biāo)記，所述第二抗性標(biāo)記用于篩選具有所述完整合成染色體的孢子。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述第二抗性標(biāo)記為選自LEU2、URA3、URA5、LYS2、LYS5、HIS3、HIS4、MET4、MET13、MET15、ADE2、ADE8、MAL、GAL2、TRP1和HOM3的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的另一些實(shí)施例，所述第二抗性標(biāo)記為L(zhǎng)EU2抗性標(biāo)記。通過引入LEU2篩選標(biāo)記，可以在進(jìn)行同源重組后，通過影印SC-Leu培養(yǎng)基平板，直接篩選得到Leu^-的孢子。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，步驟(2)進(jìn)一步包括：

a.將攜帶第一人工半合成染色體的菌株和攜帶第二人工半合成染色體的菌株進(jìn)行雜交，并挑選單克??；以及

b.向所述單克隆導(dǎo)入所述預(yù)定酶的表達(dá)質(zhì)粒，并誘導(dǎo)所述預(yù)定酶的表達(dá)，進(jìn)行酶切處 理，以便獲得在所述預(yù)定酶切位點(diǎn)發(fā)生酶切與重組后具有所述完整合成染色體的菌株。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，步驟(2)進(jìn)一步包括：

c.將經(jīng)過酶切處理的菌液誘導(dǎo)產(chǎn)孢，并篩選孢子，即得完整合成染色體。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，通過醋酸鋰法導(dǎo)入所述預(yù)定酶的表達(dá)質(zhì)粒。由此，效率高，整合位置準(zhǔn)確，成本低廉。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用半乳糖培養(yǎng)基誘導(dǎo)所述預(yù)定酶表達(dá)，進(jìn)行酶切處理。由此，該預(yù)定酶表達(dá)率高，誘導(dǎo)效果好，有利于酶切處理的進(jìn)行。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述染色體為真核細(xì)胞，優(yōu)選酵母細(xì)胞，更優(yōu)選釀酒酵母細(xì)胞的染色體。也即本發(fā)明的方法適用于真核細(xì)胞，優(yōu)選適用于酵母細(xì)胞，尤其適用于釀酒酵母細(xì)胞的合成染色體的整合。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了一種含有完整合成染色體的微生物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述完整合成染色體是通過前面所述的人工半合成染色體的整合方法，由人工半合成染色體整合獲得的。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明的含有完整合成染色體的微生物，染色體完整、準(zhǔn)確。

需要說明的是，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明的方法具有下列優(yōu)點(diǎn)的至少之一：

1、本發(fā)明在實(shí)現(xiàn)合成染色體整合的同時(shí)，通過引入I-SceI等預(yù)定酶切位點(diǎn)并將半合成染色體切成2段或多段，迫使合成染色體發(fā)生同源重組，用以提高整合效率；

2、通過FOA負(fù)篩選技術(shù)，可以篩選得到發(fā)生了酶切的菌株(如：Ura^-菌株)，用以進(jìn)一步提高整合效率；

3、通過引入LEU2等第二抗性標(biāo)記，可以在隨機(jī)孢子法篩選孢子步驟中，通過影印第二抗性標(biāo)記培養(yǎng)基(如SC-Leu)平板，直接篩選得到孢子，用以在提高篩選效率的同時(shí)，還使得操作更簡(jiǎn)單，成本更低，避免了昂貴、操作復(fù)雜的四分體顯微鏡的使用。

本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。

附圖說明

本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對(duì)實(shí)施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中：

圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例，本發(fā)明的人工半合成染色體的整合方法的原理示意圖；

圖2顯示了實(shí)施例1中，抗性基因PCR產(chǎn)物及抗性插入轉(zhuǎn)化子鑒定結(jié)果；

圖3顯示了實(shí)施例1中，合成染色體整合PCR篩選結(jié)果；

圖4顯示了實(shí)施例1中，合成染色體整合PCR鑒定結(jié)果；以及

圖5-圖8分別顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例，預(yù)定酶切位點(diǎn)、第一抗性標(biāo)記和第二抗性標(biāo)記在半合成染色體上的四種位置關(guān)系。

具體實(shí)施方式

下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。下面通過參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。

需要說明的是，術(shù)語“第一”、“第二”僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相對(duì)重要性或者隱含指明所指示的技術(shù)特征的數(shù)量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隱含地包括一個(gè)或者更多個(gè)該特征。進(jìn)一步地，在本發(fā)明的描述中，除非另有說明，“多個(gè)”的含義是兩個(gè)或兩個(gè)以上。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種人工半合成染色體的整合方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括以下步驟：

(1)分別提供第一人工半合成染色體和第二人工半合成染色體，

其中，

所述第一人工半合成染色體和所述第二人工半合成染色體均包括合成染色體部分和野生型部分，

所述第一人工半合成染色體和所述第二人工半合成染色體之間具有整合同源區(qū)，

所述第一人工半合成染色體和所述第二人工半合成染色體均攜帶預(yù)定酶切位點(diǎn)，

其中，所述預(yù)定酶切位點(diǎn)在所述第一人工半合成染色體和所述第二人工半合成染色體上的位置被配置為適于在所述第一人工半合成染色體和所述第二人工半合成染色體之間基于所述整合同源區(qū)發(fā)生同源重組；

(2)將所述第一人工半合成染色體和所述第二人工半合成染色體在表達(dá)預(yù)定酶的菌株中進(jìn)行同源重組，以便獲得完整合成染色體，其中，所述預(yù)定酶能夠特異性識(shí)別所述預(yù)定酶切位點(diǎn)。

發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的方法能夠有效地將兩條人工半合成染色體進(jìn)行整合，并且步驟簡(jiǎn)單，需時(shí)短，可重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

需要說明的是，所述預(yù)定酶的要求為：在整個(gè)酵母菌野生型基因組里都沒有該預(yù)定酶的酶切位點(diǎn)。

另外，本發(fā)明所指的“完整合成染色體”是兩條人工半合成染色體基于同源重組的方式而獲得的，因此，“完整合成染色體”中的合成染色體長(zhǎng)度是不受限制的。相對(duì)于一整條野生型染色體長(zhǎng)度，“完整合成染色體”中的合成染色體的長(zhǎng)度可以是一整條野生型染色體的長(zhǎng)度(即完全合成一整條染色體)，也可以是1/100、1/90、1/80、1/70、1/60、1/50、1/40、1/30、1/20、1/10、1/5、1/2等條野生型染色體的長(zhǎng)度(即只合成一整條染色體的其中一部分)。并且，該“完整合成染色體”是以孢子或菌株形式存在的，并不是以游離形式獨(dú)立存在的。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述整合同源區(qū)為的長(zhǎng)度大于1k。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述預(yù)定酶切位點(diǎn)為選自I-SceI、I-CeuI、PI-PspI和PI-SceI酶切位點(diǎn)的至少一種。從而，能夠特異性識(shí)別所述預(yù)定酶切位點(diǎn)的預(yù)定酶可以為I-SceI酶、I-CeuI酶、PI-PspI酶或PI-SceI酶。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述預(yù)定酶切位點(diǎn)為I-SceI酶切 位點(diǎn)，所述預(yù)定酶為I-SceI。由此，能夠有效提高半合成染色體的整合效率。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述第一人工半合成染色體和所述第二人工半合成染色體均攜帶第一抗性標(biāo)記，所述第一抗性標(biāo)記用于篩選在所述預(yù)定酶切位點(diǎn)發(fā)生酶切與重組后具有所述完整合成染色體的菌株。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述第一抗性標(biāo)記為選自URA3、URA5、LYS2、LYS5和CAN1的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的另一些實(shí)施例，所述第一抗性標(biāo)記為URA3。由此，在表達(dá)預(yù)定酶的菌株中進(jìn)行酶切處理之后，通過FOA負(fù)篩選技術(shù)，可以篩選得到發(fā)生了酶切的菌株(如Ura^-菌株)，從而可以進(jìn)一步提高整合效率。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述第二人工半合成染色體攜帶第二抗性標(biāo)記，所述第二抗性標(biāo)記用于篩選具有所述完整合成染色體的孢子。也即所述第二抗性標(biāo)記用于區(qū)分孢子和二倍體細(xì)胞，從而能夠更高效率地篩選出目的孢子。

其中，需要說明的是，第一抗性標(biāo)記與第二抗性標(biāo)記可以聯(lián)合使用，也即第二人工半合成染色體同時(shí)攜帶第一抗性標(biāo)記和第二抗性標(biāo)記。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，當(dāng)?shù)诙斯ぐ牒铣扇旧w同時(shí)攜帶第一抗性標(biāo)記和第二抗性標(biāo)記時(shí)，在后續(xù)篩選具有完整合成染色體的孢子時(shí)，必須先基于第一抗性標(biāo)記篩選菌株(包括產(chǎn)孢的以及不產(chǎn)孢的)，然后再基于第二抗性標(biāo)記篩選孢子(如前所述，第二抗性標(biāo)記是用于篩選產(chǎn)孢的菌株產(chǎn)生的孢子)，由此，通過聯(lián)合使用兩個(gè)抗性標(biāo)記，大幅度地提高了篩選效率。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述第二抗性標(biāo)記為選自LEU2、URA3、URA5、LYS2、LYS5、HIS3、HIS4、MET4、MET13、MET15、ADE2、ADE8、MAL、GAL2、TRP1和HOM3的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的另一些實(shí)施例，所述第二抗性標(biāo)記為L(zhǎng)EU2抗性標(biāo)記。通過引入LEU2篩選標(biāo)記，可以在進(jìn)行同源重組后，通過影印SC-Leu培養(yǎng)基平板，直接篩選得到Leu^-的孢子。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，步驟(2)進(jìn)一步包括：

a.將攜帶第一人工半合成染色體的菌株和攜帶第二人工半合成染色體的菌株進(jìn)行雜交，并挑選單克??；以及

b.向所述單克隆導(dǎo)入所述預(yù)定酶的表達(dá)質(zhì)粒，并誘導(dǎo)所述預(yù)定酶的表達(dá)，進(jìn)行酶切處理，以便獲得在所述預(yù)定酶切位點(diǎn)發(fā)生酶切與重組后具有所述完整合成染色體的菌株。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，步驟(2)進(jìn)一步包括：

c.將經(jīng)過酶切處理的菌液誘導(dǎo)產(chǎn)孢，并篩選孢子，即得完整合成染色體。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，通過醋酸鋰法導(dǎo)入所述預(yù)定酶的表達(dá)質(zhì)粒。由此，效率高，整合位置準(zhǔn)確，成本低廉。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用半乳糖培養(yǎng)基誘導(dǎo)所述預(yù)定酶表達(dá)，進(jìn)行酶切處理。由此，該預(yù)定酶表達(dá)率高，誘導(dǎo)效果好，有利于酶切處理的進(jìn)行。

需要說明的是，通過引入I-SceI、I-CeuI、PI-PspI或PI-SceI酶切位點(diǎn)，并導(dǎo)入相應(yīng)酶的表達(dá)質(zhì)粒，誘導(dǎo)酶表達(dá)，能夠有效地將人工半合成染色體切成2段，迫使半合成染色體發(fā)生同源重組，從而能夠有效提高整合效率。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，當(dāng)所述第一抗性標(biāo)記為URA3，所述第二抗性標(biāo)記為L(zhǎng)EU2時(shí)，通過以下步驟篩選孢子：

將經(jīng)過酶切處理的菌液誘導(dǎo)產(chǎn)孢；

使用隨機(jī)孢子法，通過FOA平板篩選得到發(fā)生酶切并整合的菌株；

經(jīng)過影印SC-Leu平板將二倍體和孢子區(qū)分開來，篩選得到FOA⁺Leu^-的孢子；以及

對(duì)篩選獲得的FOA⁺Leu^-的孢子進(jìn)行PCR篩選和鑒定，以便獲得具有完整合成染色體的孢子。

由此，能夠有效地篩選并獲得具有完整合成染色體的孢子。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述染色體為真核細(xì)胞，優(yōu)選酵母細(xì)胞，更優(yōu)選釀酒酵母細(xì)胞的染色體。也即本發(fā)明的方法適用于真核細(xì)胞，優(yōu)選適用于酵母細(xì)胞，尤其適用于釀酒酵母細(xì)胞的合成染色體的整合。

根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述第一人工半合成染色體和第二人工半合成染色體均包括合成染色體部分和野生型部分其中，所述第一人工半合成染色體和所述第二人工半合成染色體的合成染色體部分之間具有整合同源區(qū)，所述第一人工半合成染色體和所述第二人工半合成染色體均攜帶預(yù)定酶切位點(diǎn)和第一抗性標(biāo)記，所述第二人工半合成染色體還攜帶有第二抗性標(biāo)記。并且，需要說明的是，所述預(yù)定酶切位點(diǎn)、第一抗性標(biāo)記、第二抗性標(biāo)記在半合成染色體上的位置不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，參照?qǐng)D5-圖8，上述三種結(jié)構(gòu)至少可以有圖5-圖8所示的四種位置關(guān)系。其中，圖5的A、B兩圖中，著絲粒在第一人工半合成染色體的合成染色體部分，以及在第二人工半合成染色體的野生型部分；圖6的A、B兩圖中，著絲粒在第一人工半合成染色體的野生型部分，以及在第二人工半合成染色體的合成染色體部分；圖7的A、B兩圖中，著絲粒同時(shí)在第一以及第二人工半合成染色體的合成染色體部分；在圖8中，著絲粒同時(shí)在第一以及第二人工半合成染色體野生型部分。

根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，本發(fā)明的人工半合成染色體的整合方法還可以包括以下步驟：

分別提供第一人工半合成染色體和第二人工半合成染色體，所述第一人工半合成染色體包括合成染色體部分和野生型部分，所述第二人工半合成染色體包括野生型部分和合成染色體部分，其中，所述第一人工半合成染色體和所述第二人工半合成染色體之間具有整合同源區(qū)，所述整合同源區(qū)分別位于所述第一人工半合成染色體的合成染色體部分下游和所述第二人工半合成染色體的合成染色體部分上游；

在第一人工半合成染色體的整合同源區(qū)下游引入預(yù)定酶切位點(diǎn)和第一抗性標(biāo)記，并在所述第二人工半合成染色體的整合同源區(qū)上游引入所述預(yù)定酶切位點(diǎn)和第一抗性標(biāo)記；

在第二人工半合成染色體的野生型部分的著絲粒上游插入第二抗性標(biāo)記；

將攜帶第一人工半合成染色體的菌株和攜帶第二人工半合成染色體的菌株進(jìn)行雜交，并挑選單克??；

向所述單克隆導(dǎo)入能夠特異性識(shí)別所述預(yù)定酶切位點(diǎn)的酶的表達(dá)質(zhì)粒，并誘導(dǎo)能夠特異性識(shí)別所述預(yù)定酶切位點(diǎn)的酶的表達(dá)，進(jìn)行酶切處理；以及

將經(jīng)過酶切處理的菌液誘導(dǎo)產(chǎn)孢，并篩選同時(shí)不具有第一抗性標(biāo)記與第二抗性標(biāo)記相應(yīng)抗性的孢子，即得完整合成染色體。

由此，能夠高效獲得完整合成染色體。

需要說明的是，本發(fā)明的方法是一種高效的合成染色體整合方法。根據(jù)本發(fā)明的另一些實(shí)施例，本發(fā)明的方法還可以包括以下步驟：

在第一人工半合成染色體(SynL)和第二人工半合成染色體(SynR)之間設(shè)計(jì)同源區(qū)H。2條半合成染色體分別合成，合成過程中在SynL同源區(qū)下游和SynR同源區(qū)上游分別引入并保留I-SceI酶切位點(diǎn)(識(shí)別序列為TAGGGATAACAGGGTAAT，釀酒酵母染色體上不存在該酶切位點(diǎn))和URA3抗性標(biāo)記，或在替換結(jié)束后單獨(dú)加入I-SceI和URA3；然后再在SynR的野生型部分的著絲粒上游插入LEU2抗性標(biāo)記；最后將2個(gè)帶有半合成染色體的菌株進(jìn)行雜交，導(dǎo)入I-SceI內(nèi)切酶的表達(dá)質(zhì)粒，誘導(dǎo)I-SceI表達(dá)，將2條半合成染色體分別各切成2段，迫使2條半合成的染色體發(fā)生同源重組整合；將得到的菌液直接誘導(dǎo)產(chǎn)生孢子，使用隨機(jī)孢子法，通過FOA平板篩選得到發(fā)生酶切并整合的菌株；再經(jīng)過影印SC-Leu平板將二倍體和孢子區(qū)分開來，篩選得到FOA⁺Leu^-的孢子；最后對(duì)孢子進(jìn)行PCR篩選和鑒定，最終得到整合成功的、具有完整合成染色體的單倍體酵母菌株SynY(如圖1所示)。

還需要說明的是，每一輪實(shí)驗(yàn)操作可以實(shí)現(xiàn)2段染色體的整合，如果染色體被分成多段，則需要進(jìn)行多次整合。例如：染色體被分成4段合成，分別得到Syn1、Syn2、Syn3、Syn4，則需要2次整合，即：首先將Syn1、Syn2整合成Syn12，將Syn3、Syn4整合成Syn34；然后再將Syn12和Syn34再整合成Syn1234。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了一種含有完整合成染色體的微生物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述完整合成染色體是通過前面所述的人工半合成染色體的整合方法，由人工半合成染色體整合獲得的。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明的含有完整合成染色體的微生物，染色體完整、準(zhǔn)確。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述微生物為工業(yè)生產(chǎn)用微生物，優(yōu)選真菌，例如：霉菌(紅曲霉、青霉、木霉、根霉、毛霉)，酵母菌(啤酒酵母、假絲酵母、類酵母)，放線菌(鏈霉菌屬、小單孢菌屬和諾卡氏菌屬)，等等。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述微生物為酵母。

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方案進(jìn)行解釋。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下面的實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品，例如可以采購(gòu)自Illumina公司。

實(shí)施例1：

本實(shí)施例以釀酒酵母II號(hào)染色體為例，構(gòu)建半合成染色體整合菌株，并進(jìn)行染色體整合。合成II號(hào)染色體總長(zhǎng)度約為770kbp，兩條人工半合成染色體SynA-R和SynR-Y的結(jié)構(gòu)如 圖1所示，其構(gòu)建方法以及半合成染色體菌株的獲得方法可參見：申請(qǐng)?zhí)枮?01510008356.4的中國(guó)專利申請(qǐng)的實(shí)施例部分，在此將其全文并入本文。

具體地，第一人工半合成染色體為SynA-R(megachunk A-megachunk R為合成序列，megachunk S-megachunk Y為野生序列)，合成序列長(zhǎng)約547kbp，megachunk R下游帶有I-SceI酶切位點(diǎn)和URA3抗性標(biāo)記；合成起始菌株為BY4741(該酵母菌株基因型為：MATa his3Δ1leu2Δ0 LYS2 met15Δ0 ura3Δ0)。第二人工半合成染色體為SynR-Y(megachunk A-megachunkQ為野生序列，megachunk R-megachunk Y為合成序列)，合成序列長(zhǎng)約253kbp，megachunkR上游帶有URA3抗性標(biāo)記和I-SceI酶切位點(diǎn)；合成起始菌株為BY4742(該酵母菌株基因型為：MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 MET15 ura3Δ0)。同源區(qū)為megachunk R，長(zhǎng)度約為30kbp。

具體步驟如下：

1.整合模型菌株構(gòu)建

根據(jù)染色體整合設(shè)計(jì)要求，使用上述的半合成的釀酒酵母II號(hào)染色體SynA-R和SynR-Y構(gòu)建待整合菌株。以URA3基因?yàn)槟０?，設(shè)計(jì)引物，并在引物末端引入30-40bp的同源區(qū)。其中，引物設(shè)計(jì)時(shí)，還需要考慮在SynA-R的megachunk R下游加入I-SceI酶切位點(diǎn)，在SynR-Y的megachunk R上游加入I-SceI酶切位點(diǎn)。然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到帶有酵母染色體目標(biāo)位置同源區(qū)以及I-SceI酶切位點(diǎn)的URA3抗性標(biāo)記基因。由于在引物末端引入30-40bp的同源區(qū)，因此可以通過同源重組的方式將篩選標(biāo)記插入到酵母染色體目標(biāo)位置上。具體操作步驟如下。

1.1PCR獲得插入片段

1.1.1PCR擴(kuò)增

以URA3基因?yàn)槟０澹謩e用引物A-R+URA+I-SceI-F、A-R+URA+I-SceI-R和R-Y+URA+I-SceI-F、R-Y+URA+I-SceI-R(序列如表1所示)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到插入序列。PCR體系：Phusion DNA聚合酶0.2μL，5×HF緩沖液4μL，dNTPs 1.6μL，MgCl₂0.6μL，模板DNA 1μL，上述引物各1μL，ddH₂O 10.6μL。PCR程序：98攝氏度30sec；98攝氏度10sec，55攝氏度30sec，72攝氏度1min，35個(gè)循環(huán)；72攝氏度5min。電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物(PCR產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)中包含：URA3基因、I-SceI基因及同源區(qū))，結(jié)果見圖2A和2C。

1.1.2PCR產(chǎn)物純化

使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，用NanoDrop 2000測(cè)定純化的PCR產(chǎn)物DNA濃度。

1.2酵母轉(zhuǎn)化

使用醋酸鋰法將擴(kuò)增的抗性基因分別轉(zhuǎn)化到帶有半合成染色體酵母細(xì)胞中。挑半合成染 色體菌株單克隆，接種至3mL YPD液體培養(yǎng)基中，30攝氏度200rpm搖培過夜；接1mL菌液至40mL YPD液體培養(yǎng)基中，30攝氏度200rpm搖培至OD₆₀₀＝0.6-1.0，3000rpm離心5min收集菌體，分別用40mL無菌水和20mL 0.1mol/L醋酸鋰洗滌沉淀一次，用1mL 0.1mol/L醋酸鋰懸浮菌體；取100μL菌液，依次加入10μL PCR產(chǎn)物、25μL變性ssDNA、41μL 1mol/L醋酸鋰、312μL 50％ PEG3350，渦旋混勻，30℃靜置30min；加50μL二甲亞砜，渦旋混勻，42℃靜置15min；3000rpm離心1.5min收集菌體，加1mL 5mmol/L CaCl₂洗滌沉淀一次，用100μL 5mmol/L CaCl₂懸浮沉淀，取適量菌液涂SC-Ura培養(yǎng)基平板，30攝氏度培養(yǎng)至長(zhǎng)出單克隆。

1.3轉(zhuǎn)化子PCR鑒定

使用玻璃珠法提取轉(zhuǎn)化子的基因組DNA。挑轉(zhuǎn)化子單克隆，接種至3mL YPD液體培養(yǎng)基中，30攝氏度200rpm搖培過夜，取1mL菌液，12000rpm離心收集菌體，依次加100μL裂解液、0.1g酸洗玻璃珠(0.5mm)、200μL PCI，渦旋儀最大轉(zhuǎn)速振蕩3min，補(bǔ)加100μL ddH₂O，混勻，12000rpm離心5min，取150μL上層液體作為PCR模板。

分別使用設(shè)計(jì)的2對(duì)引物：(A-R+URA+I-SceI-VF與A-R+URA+I-SceI-VR)和(A-R+URA+I-SceI-VF與URA-R-1)，(R-Y+URA+I-SceI-VF與R-Y+URA+I-SceI-VR)和(R-Y+URA+I-SceI-VF與URA-R-1)對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR鑒定，確定抗性標(biāo)記插入成功。其中，上述引物序列如表1所示。PCR反應(yīng)體系：TAKARA Taq DNA聚合酶0.1μL，10×PCR緩沖液1.25μL，dNTPs 1μL，模板DNA 1μL，上述引物各0.5μL，ddH₂O 8.15μL。PCR反應(yīng)程序：94攝氏度5min；94攝氏度30sec，55攝氏度30sec，72攝氏度30sec，30個(gè)循環(huán)；72攝氏度5min。電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，結(jié)果見圖2B和2D。得到的新菌株分別命名為SynA-R+URA和SynR-Y+URA。

2.合成染色體整合

2.1加入LEU2抗性標(biāo)記

在SynR-Y+URA菌株的合成染色體端粒上游插入LEU2抗性標(biāo)記(插入方法參考上述步驟1.1，其中所使用的引物為表1中的R-Y+LEU-F與R-Y+LEU-FR)。轉(zhuǎn)化后同樣通過PCR進(jìn)行鑒定(轉(zhuǎn)化以及鑒定方法參考上述步驟1.2與1.3，其中鑒定所使用的引物為表1中的R-Y+LEU-VF與R-Y+LEU-VR、R-Y+LEU-VF與LEU-R)，確定插入成功，結(jié)果見圖2E和2F。得到的菌株命名為SynR-Y+URA+LEU。

2.2雜交

將半合成染色體模型菌株SynA-R+URA和SynR-Y+URA+LEU接種至同一管YPD液體培養(yǎng)基中，30攝氏度200rpm搖培過夜。取適量菌液涂SC-Lys-Met培養(yǎng)基平板，30攝氏度 培養(yǎng)至長(zhǎng)出單克隆。

2.3導(dǎo)入I-SceI表達(dá)載體

在雜交平板上挑單克隆，使用醋酸鋰法將I-SceI表達(dá)質(zhì)粒pRS413-I-SceI(由美國(guó)紐約大學(xué)Jef D.Boeke教授提供)導(dǎo)入上述合成染色體雜交菌株細(xì)胞中，涂SC-His培養(yǎng)基平板篩選單克隆。

2.4誘導(dǎo)酶切

在SC-His平板上挑單克隆，接種至3mL SC-His液體培養(yǎng)基中，30℃ 200rpm搖培過夜。取適量菌液接種至20mL SC-His(棉籽糖)培養(yǎng)基中，菌體終濃度為OD600＝0.1，30℃200rpm搖培至OD600＝0.4。8000rpm離心收集菌體，用20mL SC-His(半乳糖)培養(yǎng)基重新懸浮菌體，30℃ 200rpm搖培誘導(dǎo)2h。

2.5誘導(dǎo)產(chǎn)孢

取20μL誘導(dǎo)酶切菌液接種至3mL YPD液體培養(yǎng)基中，30℃ 200rpm搖培過夜。取1mL菌液涂SPOR培養(yǎng)基平板，室溫培養(yǎng)1d，30℃培養(yǎng)至產(chǎn)孢率達(dá)到5％以上(約3-7d)。

2.6孢子篩選

采用隨機(jī)孢子法。在產(chǎn)孢平板上刮取適量菌體，用25μL酵母細(xì)胞壁裂解酶Zymolyase20T(25mg/mL)懸浮菌體，37℃處理30min。加入500μL ddH₂O，渦旋儀振蕩混勻，取適量菌液涂SC+FOA培養(yǎng)基平板，30攝氏度下培養(yǎng)3d。將FOA篩選平板分別影印至SC-Leu和YPD培養(yǎng)基平板，30攝氏度培養(yǎng)1d。

2.7整合菌株鑒定

在YPD培養(yǎng)基上挑Leu^-克隆(在SC-Leu培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)的克隆)，用玻璃珠法提取基因組DNA，進(jìn)行PCR鑒定。鑒定引物共25組，分別編號(hào)為A-Y，具體序列見表1中的Syn A-F/Syn A-R……Syn Y-F/Syn Y-R，以及WT A-F/WT A-R……WT Y-F/WT Y-R。每組鑒定引物均包括Syn(合成)和WT(野生)鑒定引物各一對(duì)。當(dāng)一組鑒定引物中Syn引物有帶，并且WT引物無帶時(shí)，則認(rèn)為該組引物鑒定正確，當(dāng)25組鑒定引物均為正確帶型時(shí)，則認(rèn)為該菌株為整合成功的菌株。

2.7.1PCR篩選

首先選取引物組A和Y對(duì)挑取的克隆進(jìn)行PCR篩選。PCR體系、程序同URA3抗性標(biāo)記插入菌株鑒定，電泳檢測(cè)PCR篩選結(jié)果。每2個(gè)泳道為一組鑒定引物，Syn型在前，WT型在后。引物組A和Y均為正確帶型的克隆則為篩選得到的正確克隆。整合克隆1-17PCR篩選結(jié)果見圖3(框中7、11、12、16、17號(hào)克隆為篩選得到的正確克隆)。

2.7.2PCR鑒定

將篩選得到的正確克隆再選取鑒定引物組B-X進(jìn)行最終的PCR鑒定。23組引物均為正確帶型的克隆為整合成功的菌株。整合菌株7、11、12、16、17號(hào)克隆的PCR鑒定結(jié)果見圖4。從圖中可以看出，12、17號(hào)克隆均為合成染色體整合成功的菌株。

此外，本實(shí)施例中采用的試劑配方如下：

裂解液：Tris-HCl pH 8.0 10mmol/L，EDTA 1mmol/L，NaCl 0.1mol/L，Triton x-100 2％，SDS 1％。

PCI：Tris飽和酚250mL，三氯甲烷240mL，異戊醇10mL。

YPD培養(yǎng)基：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L；固體培養(yǎng)基加瓊脂粉15g/L。

-5氨基酸混合粉末：腺嘌呤1.5g，丙氨酸6g，精氨酸6g，天冬氨酸6g，天冬酰胺6g，半胱氨酸6g，谷氨酸6g，谷氨酰胺6g，甘氨酸6g，異亮氨酸6g，苯丙氨酸6g，脯氨酸6g，絲氨酸6g，蘇氨酸6g，色氨酸6g，酪氨酸6g，纈氨酸6g。

100×Ura：尿嘧啶2.24g/L。

50×Leu：亮氨酸13g/L。

100×Met：甲硫氨酸7.5g/L。

100×Lys：賴氨酸18.3g/L。

333×His：組氨酸21g/L。

SC-Ura培養(yǎng)基：-5氨基酸混合粉末2g/L，酵母基礎(chǔ)氮源(不含氨基酸、硫酸銨)1.7g/L，硫酸銨5g/L，葡萄糖20g/L，50×Leu 20mL/L，100×Met 10mL/L，100×Lys 10mL/L，333×His3mL/L，瓊脂粉30g/L。

SC-Leu培養(yǎng)基：-5氨基酸混合粉末2g/L，酵母基礎(chǔ)氮源(不含氨基酸、硫酸銨)1.7g/L，硫酸銨5g/L，葡萄糖20g/L，100×Ura 10mL/L，100×Met 10mL/L，100×Lys 10mL/L，333×His3mL/L，瓊脂粉30g/L。

SC-Lys-Met培養(yǎng)基：-5氨基酸混合粉末2g/L，酵母基礎(chǔ)氮源(不含氨基酸、硫酸銨)1.7g/L，硫酸銨5g/L，葡萄糖20g/L，100×Ura 10mL/L，50×Leu 20mL/L，333×His 3mL/L，瓊脂粉30g/L。

SC+FOA培養(yǎng)基：-5氨基酸混合粉末2g/L，酵母基礎(chǔ)氮源(不含氨基酸、硫酸銨)1.7g/L，硫酸銨5g/L，葡萄糖20g/L，100×Ura 10mL/L，50×Leu 20mL/L，100×Met 10mL/L，100×Lys 10mL/L，333×His 3mL/L，5-氟乳清酸1g/L，瓊脂粉30g/L。

SC-His培養(yǎng)基：-5氨基酸混合粉末2g/L，酵母基礎(chǔ)氮源(不含氨基酸、硫酸銨)1.7g/L，硫酸銨5g/L，葡萄糖20g/L，100×Ura 10mL/L，50×Leu 20mL/L，100×Met 10mL/L，100×Lys 10mL/L；固體培養(yǎng)基加瓊脂粉30g/L。

SC-His(棉籽糖)培養(yǎng)基：-5氨基酸混合粉末2g/L，酵母基礎(chǔ)氮源(不含氨基酸、硫酸銨)1.7g/L，硫酸銨5g/L，葡萄糖1g/L，棉籽糖20g/L，100×Ura 10mL/L，50×Leu 20mL/L，100×Met 10mL/L，100×Lys 10mL/L。

SC-His(半乳糖)培養(yǎng)基：-5氨基酸混合粉末2g/L，酵母基礎(chǔ)氮源(不含氨基酸、硫酸銨)1.7g/L，硫酸銨5g/L，半乳糖20g/L，100×Ura 10mL/L，50×Leu 20mL/L，100×Met10mL/L，100×Lys 10mL/L。

SPOR培養(yǎng)基：醋酸鉀10g/L，酵母粉1.25g/L，葡萄糖1g/L，瓊脂粉15g/L。

各引物序列如表1所示：

表1

實(shí)施例2含有人工合成染色體微生物的獲得

按照以下步驟獲得含有人工合成染色體的微生物：

(1)參照專利申請(qǐng)CN 201510008356.4所述的合成人工半合成染色體的方法，合成第一/二人工半合成染色體；

(2)參照實(shí)施例1中所述的人工半合成染色的整合方法，將步驟(1)中的第一/二人工半合成染色體進(jìn)行同源重組，以便獲得含有完整人工合成染色體的微生物。

其中，本實(shí)施例適用的微生物為工業(yè)生產(chǎn)用微生物，例如真菌：霉菌(紅曲霉、青霉、木霉、根霉、毛霉)，酵母菌(啤酒酵母、假絲酵母、類酵母)，放線菌(鏈霉菌屬、小單孢菌屬和諾卡氏菌屬)，等等。

在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說明書中，對(duì)上述術(shù)語的示意性表述不一定指的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任何的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。

盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。