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人工半合成染色體的整合方法及含有完整合成染色體的微生物與流程

文檔序號(hào):12577548閱讀:來(lái)源:國(guó)知局

技術(shù)特征:

1.一種人工半合成染色體的整合方法,其特征在于,包括以下步驟:

(1)分別提供第一人工半合成染色體和第二人工半合成染色體,

其中,

所述第一人工半合成染色體和所述第二人工半合成染色體均包括合成染色體部分和野生型部分,

所述第一人工半合成染色體和所述第二人工半合成染色體之間具有整合同源區(qū),

所述第一人工半合成染色體和所述第二人工半合成染色體均攜帶預(yù)定酶切位點(diǎn),

其中,所述預(yù)定酶切位點(diǎn)在所述第一人工半合成染色體和所述第二人工半合成染色體上的位置被配置為適于在所述第一人工半合成染色體和所述第二人工半合成染色體之間基于所述整合同源區(qū)發(fā)生同源重組;

(2)將所述第一人工半合成染色體和所述第二人工半合成染色體在表達(dá)預(yù)定酶的菌株中進(jìn)行同源重組,以便獲得完整合成染色體,其中,所述預(yù)定酶能夠特異性識(shí)別所述預(yù)定酶切位點(diǎn)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述整合同源區(qū)為的長(zhǎng)度大于1k。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述預(yù)定酶切位點(diǎn)為選自I-SceI、I-CeuI、PI-PspI和PI-SceI酶切位點(diǎn)的至少一種,優(yōu)選I-SceI酶切位點(diǎn)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述第一人工半合成染色體和所述第二人工半合成染色體均攜帶第一抗性標(biāo)記,所述第一抗性標(biāo)記用于篩選在所述預(yù)定酶切位點(diǎn)發(fā)生酶切與重組后具有所述完整合成染色體的菌株。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法,其特征在于,所述第一抗性標(biāo)記為選自URA3、URA5、LYS2、LYS5和CAN1的至少一種,優(yōu)選URA3。

6.根據(jù)權(quán)利要求1、4或5任一項(xiàng)所述的方法,其特征在于,所述第二人工半合成染色體攜帶第二抗性標(biāo)記,所述第二抗性標(biāo)記用于篩選具有所述完整合成染色體的孢子。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法,其特征在于,所述第二抗性標(biāo)記為選自LEU2、URA3、URA5、LYS2、LYS5、HIS3、HIS4、MET4、MET13、MET15、ADE2、ADE8、MAL、GAL2、TRP1和HOM3的至少一種,優(yōu)選LEU2抗性標(biāo)記。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,步驟(2)進(jìn)一步包括:

a.將攜帶第一人工半合成染色體的菌株和攜帶第二人工半合成染色體的菌株進(jìn)行雜交,并挑選單克?。灰约?/p>

b.向所述單克隆導(dǎo)入所述預(yù)定酶的表達(dá)質(zhì)粒,并誘導(dǎo)所述預(yù)定酶的表達(dá),進(jìn)行酶切處理,以便獲得在所述預(yù)定酶切位點(diǎn)發(fā)生酶切與重組后具有所述完整合成染色體的菌株,

任選地,步驟(2)進(jìn)一步包括:

c.將經(jīng)過(guò)酶切處理的菌液誘導(dǎo)產(chǎn)孢,并篩選孢子,即得完整合成染色體,

任選地,通過(guò)醋酸鋰法導(dǎo)入所述預(yù)定酶的表達(dá)質(zhì)粒,

任選地,利用半乳糖培養(yǎng)基誘導(dǎo)所述預(yù)定酶的表達(dá),進(jìn)行酶切處理。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述染色體為真核細(xì)胞,優(yōu)選酵母細(xì)胞,更優(yōu)選釀酒酵母細(xì)胞的染色體。

10.一種含有完整合成染色體的微生物,其特征在于,所述完整合成染色體是通過(guò)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的方法,由人工半合成染色體整合獲得的,

任選地,所述微生物為工業(yè)生產(chǎn)用微生物,優(yōu)選真菌,更優(yōu)選酵母。

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