本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及圓紅冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)的啟動(dòng)子終止子及其用途，包括基因工程菌株構(gòu)建所必需的轉(zhuǎn)化方法等。

背景技術(shù)：

微生物是自然界中分布最廣泛的物種之一，具有卓越的生物合成能力，幾乎能合成地球上所有的有機(jī)化學(xué)品。與多細(xì)胞生物相比，微生物的代謝途徑雖然相對(duì)簡(jiǎn)單，但其化合物的生產(chǎn)高效、快捷，具有反應(yīng)條件溫和、可控性強(qiáng)、易于大規(guī)模生產(chǎn)等特點(diǎn)，可作為一個(gè)優(yōu)良的細(xì)胞工廠。

自然界中一部分微生物在特定條件下(如氮源缺乏)能在胞內(nèi)貯存超過(guò)其細(xì)胞干重20％的油脂，其中以甘油三酯為主，具有這種表型的微生物稱為產(chǎn)油微生物，包括細(xì)菌、酵母、霉菌、藻類(lèi)等(Ratledge,C.and Wynn,J.P.Adv Appl Microbiol,2002,51,1-51.)。利用微生物轉(zhuǎn)化生物質(zhì)資源生產(chǎn)油脂，可發(fā)展成基本不依賴耕地、可連續(xù)生產(chǎn)、降低農(nóng)業(yè)污染、資源綜合利用的新技術(shù)，是形成化學(xué)品的石化資源替代品新的生產(chǎn)途徑(趙宗保.中國(guó)生物工程雜志,2005,25,8-11.)。做為某一化學(xué)品的天然生產(chǎn)菌株或環(huán)境治理應(yīng)用菌株，其特定的生產(chǎn)性能往往并非最優(yōu)化。如何優(yōu)化或改變工業(yè)菌株的代謝網(wǎng)絡(luò)和表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以提高生物基產(chǎn)品的積累速度或定向控制靶產(chǎn)品的質(zhì)量，是當(dāng)今生物技術(shù)領(lǐng)域基因工程改造的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。雖然對(duì)于一些常規(guī)酵母的基因工程改造已經(jīng)較為成熟(Alper H,Stephanopoulos G.Nat Rev Microbiol,2009,7,715-723.)，但是對(duì)于這些非常規(guī)產(chǎn)油酵母的遺傳操作尚處于起步階段，許多非常規(guī)產(chǎn)油酵母沒(méi)有合適的基因操作平臺(tái)。開(kāi)發(fā)合適的基因操作方法，對(duì)于這些非常規(guī)微生物的應(yīng)用意義重大。

圓紅冬孢酵母屬于擔(dān)子菌門(mén)異宗配合型真菌，是發(fā)酵工業(yè)中一種極為重要的微生物，可利用源于生物質(zhì)的己糖和戊糖為原料生產(chǎn)重要的生物基產(chǎn)品：微生物油脂，胞內(nèi)油脂可達(dá)細(xì)胞干重的60％以上(Ratledge C,Wynn J P.Adv.Appl.Microbiol.2002,51:1-51；Li Y,Zhao Z,Bai F.Enzyme Microb.Technol.2007,41(3):312-317)；工業(yè)用酶或藥物合成用酶如磷酸二酯酶、苯丙氨酸解氨酶(Hodgins D S.J Biol.Chem.1971,246(9):2977-2985；Gilbert H J,Clarke I N,Gibson R K,et al.J Bacteriol.1985,161(1):314-320)、D氨基酸氧化酶(Gadda G,Negri A,Pilone M S.J Biol.Chem.1994,269(27):17809-17814；Liao G J,Lee Y J,Lee Y H,et al.Biotechnol.Appl.Biochem.1998,27(Pt 1):55-61)等以及β-胡蘿卜素和胞外多糖；并在污水處理和生物制藥中有較廣泛的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該菌可同時(shí)利用五碳糖和六碳糖為底物，抗逆性好，能直接以玉米秸稈酸水解液為碳源積累油脂，可實(shí)現(xiàn)生物質(zhì)到生物基產(chǎn)品的高效轉(zhuǎn)化(李永紅,劉波,孫艷,等.中國(guó)生物工程雜志,2005,25(12):39-44)。目前R.toruloides功能基因的研究主要通過(guò)基因克隆、異源表達(dá)和釀酒酵母功能互補(bǔ)分析來(lái)進(jìn)行(Gilbert H J,Clarke I N,Gibson R K,et al.J Bacteriol.1985,161(1):314-320；Liao G J,Lee Y J,Lee Y H,et al.Biotechnol.Appl.Biochem.1998,27(Pt 1):55-61)。但要從分子水平上進(jìn)行R.toruloides油脂積累機(jī)制、遺傳發(fā)育、生長(zhǎng)代謝和菌株遺傳改造研究，必須具備相應(yīng)的遺傳操作系統(tǒng)。然而對(duì)于廣泛分布、工業(yè)應(yīng)用前景良好的R.toruloides而言，由于其特殊分類(lèi)地位和生化特性以及遺傳操作系統(tǒng)的缺乏，使得其遺傳改良和分子機(jī)制研究進(jìn)展緩慢，目前有效的遺傳操作系統(tǒng)是基于其自身3-磷酸甘油酸激酶啟動(dòng)子pPGK和甘油醛-3-磷酸脫氫酶GPD啟動(dòng)子的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系(Lin XP,Wang YN,Zhang SF,et al.Fems Yeast Res.2014,14:547–555)。但使用的組成型啟動(dòng)子無(wú)法選擇性調(diào)控某一基因轉(zhuǎn)錄，不適合細(xì)胞毒性基因的過(guò)表達(dá)；同時(shí)，代謝工程也需要更多的啟動(dòng)子和終止子元件可供選擇，以實(shí)現(xiàn)某一代謝途徑各基因表達(dá)水平的精確調(diào)控。

誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在特定的物理或化學(xué)信號(hào)的刺激下，調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)和關(guān)閉，對(duì)一些細(xì)胞毒性基因的遺傳操作尤為重要。半乳糖激酶Gal1，其轉(zhuǎn)錄受葡萄糖的嚴(yán)格抑制和半乳糖、棉籽糖等的誘導(dǎo)激活。非常適用于目的基因的精確表達(dá)調(diào)控。雖然曾有眾多研究者分離釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或其它子囊酵母的半乳糖激酶啟動(dòng)子、或其它半乳糖誘導(dǎo)啟動(dòng)子用于自身的基因工程操作(劉巍峰,高東,王祖農(nóng).菌物系統(tǒng),1998,17(3),256-261.；CN201410143885.0；CN201180008591.1； Schultz LD,Hofmann KJ,Mylin LM,et al.Gene.1987,61(2):123-133.；Choi ES1,Sohn JH,Rhee SK.Appl Microbiol Biotechnol.1994,42(4):587-594.；Li J,Wang S,VanDusen WJ,et al.Biotechnol Bioeng.2000,70(2):187-196.)，但未見(jiàn)該類(lèi)啟動(dòng)子用于紅冬孢酵母屬(Rhodosoporidium)、鎖擲酵母屬(Sporidiobolus)、擲孢酵母屬(Sporobolomyces)和紅酵母屬(Rhodotorula)中基因表達(dá)、遺傳工程操作和菌株改良的基因工程操作的報(bào)道。同時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員周知“不同的微生物在遺傳背景、基因表達(dá)模式、生理生化特征方面存在大的差異，即使同為酵母，不同的種屬間也存在很大的差異，例如，同屬子囊菌門(mén)的釀酒酵母、畢赤酵母、耶氏解脂酵母，必須分別構(gòu)建其遺傳體系，選擇自身來(lái)源啟動(dòng)子”。然而，啟動(dòng)子對(duì)于遺傳操作系統(tǒng)來(lái)說(shuō)必不可少。因此，分離能夠在這些紅酵母中啟動(dòng)報(bào)告基因表達(dá)的半乳糖激酶啟動(dòng)子成為目前研究的焦點(diǎn)。

終止子序列，是給予RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的DNA序列，同時(shí)也決定mRNA的穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄效率和mRNA從轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的釋放。商業(yè)化酵母表達(dá)載體和報(bào)道的合成生物學(xué)文獻(xiàn)中，多選擇高表達(dá)基因的終止子做為轉(zhuǎn)錄終止元件。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)瓶頸，本發(fā)明的主要目的是提供可通用于紅冬孢酵母屬(Rhodosoporidium)、鎖擲酵母屬(Sporidiobolus)、擲孢酵母屬(Sporobolomyces)和紅酵母屬(Rhodotorula)中基因表達(dá)、遺傳工程操作和菌株改良的中外源基因表達(dá)的啟動(dòng)子和終止子，及采用合適的轉(zhuǎn)化技術(shù)對(duì)這些紅酵母菌株進(jìn)行改良的方法。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明通過(guò)對(duì)圓紅冬孢酵母的基因組序列進(jìn)行分析，獲得響應(yīng)半乳糖誘導(dǎo)的半乳糖激酶啟動(dòng)子(GAL1p)序列，并進(jìn)一步通過(guò)PCR技術(shù)從圓紅冬孢酵母染色體DNA中成功分離了包含有效啟動(dòng)子的DNA片段，采用合適的轉(zhuǎn)化方法將含有圓紅冬孢酵母半乳糖激酶啟動(dòng)子(GAL1p)的外源DNA片段分別導(dǎo)入紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬中，成功實(shí)現(xiàn)了外源基因的表達(dá)，完成了本發(fā)明。

本發(fā)明成功分離了能夠在紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬酵母中啟動(dòng)報(bào)告基因表達(dá)的圓紅冬孢酵母半乳糖激酶啟動(dòng)子(GAL1p)啟動(dòng)子，并構(gòu)建了其表達(dá)載體。

具體講，本發(fā)明包含下述技術(shù)方案(A)到(H)：

(A)本發(fā)明涉及一種具有紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子活性的DNA片段，所述DNA片段：

(1)具有如SEQ ID NO：1所示DNA序列的全部序列或包含該DNA序列自3’-末端起500bp以內(nèi)的部分序列，

(2)具有可與如SEQ ID NO：1所示序列的全部或其DNA序列3’-末端起500bp以內(nèi)的部分序列雜交的、且保持轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子活性的序列，或

(3)對(duì)SEQ ID NO：1所示的脫氧核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或或50個(gè)堿基以內(nèi)的取代、缺失、插入或添加所獲得的，與SEQ ID NO：1所示序列具有70％以上同源性、且具有啟動(dòng)子活性的序列。

(B)一種來(lái)自圓紅冬孢酵母的DNA片段，所述DNA片段可作為終止子，并且：(1)具有如SEQ ID NO：2所示的DNA序列的全部或包含該DNA序列5’-末端的部分序列；或(2)具有可與如(1)所示序列雜交的、且保持如(1)所述序列活性的序列。

(C)一種可完成靶基因在紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬酵母中轉(zhuǎn)錄起始和轉(zhuǎn)錄終止的DNA分子，它具有上述(A)所述的具有紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬酵母轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子活性的DNA序列，或同時(shí)具有上述(A)所述的具有紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬酵母轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子活性的DNA序列，和(B)所述的DNA片段，且(B)所述的DNA片段位于(A)所述的DNA序列的下游，與其相鄰1-10000個(gè)核苷酸的DNA片段。

(D)一種可將靶基因與(A)-(C)任一種所述的DNA分子連接的DNA表達(dá)盒，以便于所述靶基因能夠在紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬酵母中表達(dá)的重組DNA。所述靶基因?yàn)榈鞍拙幋a核酸或反義核酸編碼核酸。優(yōu)選地，所述目的基因的cDNA序列具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列(半乳糖激酶cDNA)。

(E)一種攜帶(A)-(D)所述的的DNA分子中的任意一個(gè)的重組載體。所述載體可以是游離型載體或整合型載體，所述游離型載體例如，但不限于，pMD18-T、pUC18、pYES2c/t或pYX212等，所述整合型載體為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的雙元表達(dá)載體，例如，但不限于，PZPK或pZP2000等。

(F)一種將如(D)所述的DNA分子或如(E)所述的載體的轉(zhuǎn)入紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬菌株的轉(zhuǎn)化方法。

(G)一種轉(zhuǎn)入了如(D)所述的DNA表達(dá)盒或如(E)所述的重組載體的紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬的基因工程菌株。

(H)半乳糖激酶(Gal1)啟動(dòng)子，其特征在于：其來(lái)源為圓紅冬孢酵母，可啟動(dòng)目的基因在紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬酵母中的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，所述啟動(dòng)子：(1)具有如SEQ ID NO：1所示DNA序列的全部序列或包含該DNA序列自3’-末端起500bp以內(nèi)的部分序列，(2)具有可與如SEQ ID NO：1所示序列的全部或其DNA序列3’-末端起500bp以內(nèi)的部分序列雜交的、且保持轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子活性的序列，或(3)對(duì)SEQ ID NO：1所示的脫氧核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或50個(gè)堿基以內(nèi)的取代、缺失、插入或添加所獲得的，與SEQ ID NO：1所示序列具有70％以上同源性、且具有啟動(dòng)子活性的序列；

本發(fā)明所述的半乳糖激酶終止子，其特征在于：其來(lái)源為圓紅冬孢酵母，可終止目的基因在紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬酵母中的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，所述終止子：(1)具有如SEQ ID NO：2所示的DNA序列的全部或包含該DNA序列5’-末端的部分序列，(2)具有可與如SEQ ID NO：2所示序列的全部或其DNA序列5’-末端的部分序列雜交的、且保持轉(zhuǎn)錄終止子活性的序列，或(3)對(duì)SEQ ID NO：2所示的脫氧核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或50個(gè)堿基以內(nèi)的取代、缺失、插入或添加所獲得的，與SEQ ID NO：2所示序列具有70％以上同源性、且具有終止子活性的序列。

使用本發(fā)明的具有啟動(dòng)子活性的DNA分子和具有轉(zhuǎn)錄終止子活性的DNA，可實(shí)現(xiàn)外源基因或內(nèi)源基因在紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬酵母中的表達(dá)。

本發(fā)明提供了用于紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬酵母菌株遺傳工程改造的啟動(dòng)子、終止子和載體。為紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬酵母菌株開(kāi)啟了一條育種新途徑，并因此可以提供具有工業(yè)用途的新型酵母菌株。

綜上所述，本發(fā)明提供下述技術(shù)方案：

1.半乳糖激酶啟動(dòng)子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.第1項(xiàng)所述的半乳糖激酶(Gal1)啟動(dòng)子用于構(gòu)建能夠在c(Rhodosoporidium)、鎖擲酵母屬(Sporidiobolus)、擲孢酵母屬(Sporobolomyces)和紅酵母屬(Rhodotorula)的酵母菌株中表達(dá)的重組表達(dá)載體的應(yīng)用，其中克隆了包含所述半乳糖激酶(Gal1)啟動(dòng)子的重組表達(dá)載體的紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬和紅酵母屬酵母菌株構(gòu)成紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬遺傳操作系統(tǒng)。

3.一種DNA表達(dá)盒，其含有SEQ ID NO：1所示的半乳糖激酶啟動(dòng)子的核苷酸序列。

4.第3項(xiàng)所述的表達(dá)盒，其還含有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列作為終止子，其中SEQ ID NO：1所示的序列位于SEQ ID NO：2所示的序列的上游，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2之間為編碼目的基因的開(kāi)放閱讀框架。

5.第4項(xiàng)所述的DNA表達(dá)盒，其特征在于：所述編碼目的基因的開(kāi)放閱讀框架的cDNA序列具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

6.一種包含第3-5項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的DNA表達(dá)盒的重組載體。

7.第6項(xiàng)所述的重組載體，其特征在于：所述載體為游離型或者整合型載體。

8.第7項(xiàng)所述的重組載體，其中所述整合型載體為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的雙元表達(dá)載體，例如PZPK或pZP2000，并且，所述游離型載體選自pMD18-T、pUC18、pYES2c/t或pYX212。

9.包含第6-8項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的重組載體的宿主細(xì)胞。

10.第9項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞。

11.一種用于產(chǎn)油酵母遺傳表達(dá)的表達(dá)系統(tǒng)，所述表達(dá)系統(tǒng)包含：

(1)能夠在紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬屬菌株中表達(dá)的改良載體，所述改良載體通過(guò)在能夠在紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬中整合表達(dá)或游離表達(dá)的質(zhì)粒中插入SEQ ID NO：1所示的啟動(dòng)子序列和SEQ ID NO：2所示的終止子序列構(gòu)建獲得，其中SEQ ID NO：1所示的啟動(dòng)子序列位于SEQ ID NO：2所示的終止子序列的上游，SEQ ID NO：1所示的序列與SEQ ID NO：2所示的序列之間為多克隆位點(diǎn)，并且所述載體還包含選擇性標(biāo)記基因；

(2)目的基因開(kāi)放閱讀框序列，其能夠可操作性地插入到(1)所述的改良載體中，并使所述目的基因與(1)所述的改良載體中的啟動(dòng)子和終止子符合閱讀框地連接，和

(3)紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬菌株。

12.第11項(xiàng)的用于產(chǎn)油酵母遺傳表達(dá)的表達(dá)系統(tǒng)，其中(1)所述的改良載體通過(guò)在能夠在紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬中表達(dá)的質(zhì)粒中插入SEQ ID NO：1所示的啟動(dòng)子序列和SEQ ID NO：2所示的終止子序列構(gòu)建獲得。

13.第12項(xiàng)的用于產(chǎn)油酵母遺傳表達(dá)的表達(dá)系統(tǒng)，其中所述質(zhì)粒為游離型或者整合型質(zhì)粒，并且，其中所述整合型質(zhì)粒為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的雙元表達(dá)質(zhì)粒，例如PZPK或pZP2000，并且，所述游離型質(zhì)粒選自pMD18-T、pUC18、pYES2c/t或pYX212。

14.第11項(xiàng)的用于產(chǎn)油酵母遺傳表達(dá)的表達(dá)系統(tǒng)，其中(3)所述的圓紅冬孢酵母菌株選自圓紅冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、貝吉維紅冬孢酵母(Rhodosporidium babjevae)，所述鎖擲酵母屬(Sporidiobolus)菌株選自擬粉紅鎖擲孢酵母(Sporidiobolus pararoseus)，所述擲孢酵母屬(Sporobolomyces)菌株選自粉紅擲孢酵母(Sporobolomyces roseus)，所述紅酵母屬(Rhodotorula)菌株選自深紅酵母(Rhodotorula rubra)、膠紅酵母(Rhodotorula mucilaqinosa)、海濱紅酵母(Rhodotorula marina)、禾本紅酵母(Rhodotorula graminis)和粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)。

15.第11項(xiàng)的用于產(chǎn)油酵母遺傳表達(dá)的表達(dá)系統(tǒng)，其中(2)所述的目的基因開(kāi)放閱讀框序列具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，術(shù)語(yǔ)“表達(dá)系統(tǒng)”是指包括重組載體、待表達(dá)的目標(biāo)蛋白的編碼核苷酸序列、適合的宿主細(xì)胞或宿主菌株等的組合物體系，用來(lái)在所述宿主細(xì)胞或宿主菌株中表達(dá)所述目標(biāo)蛋白。

本發(fā)明的有益效果是：

為紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬和紅酵母屬的酵母菌提供了啟動(dòng)子、終止子遺傳轉(zhuǎn)化方法，將有力促進(jìn)今后的紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬酵母菌的菌株改良和代謝工程研究。

附圖說(shuō)明

圖1、GAL1簡(jiǎn)并PCR產(chǎn)物(泳道1)的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，泳道M為分子量標(biāo)準(zhǔn)。

圖2、PZPK-GAL1p-hyg-GAL1t載體的結(jié)構(gòu)示意圖，LB，T-DNA左邊界；RB，T-DNA右邊界。

圖3、使用HYG基因轉(zhuǎn)化R.babjevae NCYC 2630獲得重組子的PCR鑒定結(jié)果，泳道M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1-6分別表示不同的Hyg抗性轉(zhuǎn)化子，7為野生型對(duì)照。

圖4、表示HYG的表達(dá)檢測(cè)——Western blot分析結(jié)果圖，泳道1-3為R.babjevae NCYC 2630潮霉素轉(zhuǎn)化子1-3號(hào)總蛋白；泳道4為作為陰性對(duì)照的出發(fā)菌株R.babjevae NCYC 2630總蛋白樣品。

圖5、BLE抗性Ura3營(yíng)養(yǎng)缺陷圓紅冬孢酵母重組菌株的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)分析——RT-PCR結(jié)果圖，泳道1-6為BLE抗性Ura3營(yíng)養(yǎng)缺陷圓紅冬孢酵母ATCC 10788重組菌株1-6，泳道7為對(duì)照菌株圓紅冬孢酵母ATCC 10788。

圖6、PZPK-GAL1p-hyg-Thsp載體的結(jié)構(gòu)示意圖，LB，T-DNA左邊界；RB，T-DNA右邊界。

圖7、pZPK-GAL1p-MCS-Thsp載體的結(jié)構(gòu)示意圖，LB，T-DNA左邊界；RB，T-DNA右邊界。

圖8、PZPK-HYG-GAL1p-MCS-Thsp載體的結(jié)構(gòu)示意圖，LB，T-DNA左邊界；RB，T-DNA右邊界。

圖9、pZPK-HYG-GAL1p-CpFAH-Thsp載體的結(jié)構(gòu)示意圖，LB，T-DNA左邊界；RB，T-DNA右邊界。

圖10、表示CpFAH的表達(dá)檢測(cè)——Western blot分析結(jié)果圖，泳道1-3為擬粉紅鎖擲孢酵母JCM 3765潮霉素轉(zhuǎn)化子1-3號(hào)總蛋白；泳道4為作為陰性對(duì)照的出發(fā)菌株擬粉紅鎖擲孢酵母JCM 3765總蛋白樣品。

圖11、pZPK-HYG-GAL1p-ME-Thsp載體的結(jié)構(gòu)示意圖，LB，T-DNA左邊界；RB，T-DNA右邊界。

圖12、表示RtME的表達(dá)檢測(cè)——Western blot分析結(jié)果圖，泳道1-3為粉紅擲孢酵母S.roseus JCM 8242潮霉素轉(zhuǎn)化子1-3號(hào)總蛋白；泳道4為作為陰性對(duì)照的出發(fā)菌株粉紅擲孢酵母S.roseus JCM 8242總蛋白樣品。

圖13、pZPK-HYG-GAL1p-GFP-Thsp載體的結(jié)構(gòu)示意圖，LB，T-DNA左邊界；RB，T-DNA右邊界。

圖14、表示GFP的表達(dá)檢測(cè)——Western blot分析結(jié)果圖，泳道1-3為重組深紅酵母CGMCC 2.279潮霉素轉(zhuǎn)化子1-3號(hào)總蛋白；泳道4為作為陰性對(duì)照的出發(fā)菌株重組深紅酵母CGMCC 2.279總蛋白樣品。

圖15、表示GFP的表達(dá)檢測(cè)——Western blot分析結(jié)果圖，泳道1-3為重組膠紅酵母CGMCC 2.22潮 霉素轉(zhuǎn)化子1-3號(hào)總蛋白；泳道4為作為陰性對(duì)照的出發(fā)菌株重組膠紅酵母CGMCC 2.22總蛋白樣品。

圖16、pZPK-HYG-GAL1p-INU-Thsp載體的結(jié)構(gòu)示意圖，LB，T-DNA左邊界；RB，T-DNA右邊界。

序列表說(shuō)明

具體實(shí)施方式

在本文中，“啟動(dòng)子”是指能夠被RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合并能啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列。術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”還可理解為：包括5’非編碼區(qū)、順式作用元件(如增強(qiáng)子)以及其它能與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的核苷酸序列。

啟動(dòng)子的存在或強(qiáng)度通常是通過(guò)啟動(dòng)子活性表示，其測(cè)定方法：將報(bào)告基因(如抗性基因)連接于所述啟動(dòng)子的下游，并將該DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化相應(yīng)宿主細(xì)胞，檢測(cè)報(bào)告基因是否表達(dá)。如果人們觀察到連接于所述啟動(dòng)子下游報(bào)告基因的表達(dá)，就可以認(rèn)為所述啟動(dòng)子在它所轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞內(nèi)有活性。

在本文中，“終止子”是指染色體上提供終止信號(hào)使RNA聚合酶與DNA模板分離而使轉(zhuǎn)錄終止的一段DNA序列?？梢酝ㄟ^(guò)“啟動(dòng)子-報(bào)告基因-終止子”構(gòu)建體使報(bào)告基因有效表達(dá)而確定終止子的活性。

本發(fā)明中的“圓紅冬孢酵母”，包括屬于該“物種”的任何二倍體和單倍體，野生型菌株和營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株。本發(fā)明中的“紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬”，沒(méi)有具體限制，其實(shí)例包括圓紅冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、貝吉維紅冬孢酵母(Rhodosporidium babjevae)，粉紅鎖擲孢酵母(Sporidiobolus pararoseus)，粉紅擲孢酵母(Sporobolomyces roseus)，深紅酵母(Rhodotorula rubra)，膠紅酵母(Rhodotorula mucilaqinosa)，海濱紅酵母(Rhodotorula marina)，禾本紅酵母(Rhodotorula graminis)和粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)。

本發(fā)明的“目的基因”，包括能夠在紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬屬菌株中表達(dá)的蛋白編碼序列、反義RNA編碼序列和核酸酶編碼序列。能夠在紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬菌株中表達(dá)的蛋白編碼序列的例子包括源于這兩類(lèi)菌屬中的蛋白或者核酸序列，且并不局限于此，還包括來(lái)源于其它微生物、植物和動(dòng)物的蛋白或者核酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)任意應(yīng)該理解，當(dāng)使用來(lái)源于其它微生物、植物和動(dòng)物的蛋白編碼序列作為目的基因(即，外源目的基因)時(shí)，為優(yōu)化在紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬菌株中的表達(dá)，通常需要針對(duì)紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬菌株的密碼子優(yōu)先性對(duì)所述目的基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化。而密碼子優(yōu)化屬于本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)手段。

本發(fā)明中的啟動(dòng)子：(1)具有如SEQ ID NO：1所示DNA序列的全部序列或包含該DNA序列自3’-末端起500bp以內(nèi)的部分序列，(2)具有可與如SEQ ID NO：1所示序列的全部或其DNA序列3’-末端起500bp以內(nèi)的部分序列雜交的、且保持轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子活性的序列，或(3)對(duì)SEQ ID NO：1所示的 脫氧核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或50個(gè)堿基以內(nèi)的取代、缺失、插入或添加所獲得的，與SEQ ID NO：1所示序列具有70％以上同源性、且具有啟動(dòng)子活性的序列。

本發(fā)明中的終止子：(1)具有如SEQ ID NO：2所示的DNA序列的全部或包含該DNA序列5’-末端的部分序列，(2)具有可與如SEQ ID NO：2所示序列的全部或其DNA序列5’-末端的部分序列雜交的、且保持轉(zhuǎn)錄終止子活性的序列，或(3)對(duì)SEQ ID NO：2所示的脫氧核苷酸序列進(jìn)行一個(gè)或50個(gè)堿基以內(nèi)的取代、缺失、插入或添加所獲得的，與SEQ ID NO：2所示序列具有70％以上同源性、且具有終止子活性的序列。

本發(fā)明中的啟動(dòng)子-目的基因的構(gòu)建體、目的基因-終止子的構(gòu)建體或啟動(dòng)子-目的基因-終止子的構(gòu)建體，可以直接或經(jīng)載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化紅冬孢酵母屬、鎖擲酵母屬、擲孢酵母屬和紅酵母屬菌株，以便于目的基因表達(dá)，可以優(yōu)選質(zhì)粒載體作為介導(dǎo)載體。

下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，將有助于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。下述實(shí)施例中所有引物合成及測(cè)序工作，如無(wú)特別說(shuō)明則均由大連TakaRa公司完成。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑公司購(gòu)買(mǎi)得到的。

R.toruloides CGMCC 2.1389：中國(guó)普通微生物菌種保藏中心(CGMCC)，源自東京大學(xué)應(yīng)用微生物研究所(IFO 8766)，由IFO 0559和IFO 0880經(jīng)配合而成的二倍體，等同于CBS 6016或NBRC 8766或NRRL Y-6987。

R.toruloides ATCC 10788：美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(ATCC)，源自CBS-KNAW fungal biodiversity centre，等同于IFO 0559或JCM 3792或CCRC 20306或DBVPG 6740或IAM 13469或IGC 4416或MUCL 30249或NCYC 921或NRRL Y-1091或VKM Y-334或PYCC 4416。

Rhodosporidium babjevae NCYC 2630購(gòu)自英國(guó)國(guó)家酵母菌種保藏中心(National Collection of Yeast Cultures，NCYC)。

擬粉紅鎖擲孢酵母(Sporidiobolus pararoseus)JCM 3765購(gòu)自于購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。

粉紅擲孢酵母(Sporobolomyces roseus)JCM 8242購(gòu)自于日本微生物菌種保藏中心(JCM)。

深紅酵母(Rhodotorula rubra)CGMCC 2.279購(gòu)自于酵母菌種保藏中心(購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。

膠紅酵母CGMCC 2.22購(gòu)自于酵母菌種保藏中心(購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。

海濱紅酵母(Rhodotorula marina)CGMCC 2.4203購(gòu)自于酵母菌種保藏中心(購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。

粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)NCYC 2666購(gòu)自于英國(guó)國(guó)家酵母菌種保藏中心(National Collection of Yeast Cultures，NCYC)。

實(shí)施例1:圓紅冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)CGMCC 2.1389總RNA的提取

將圓紅冬孢酵母(R.toruloides)CGMCC 2.1389(購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC))由斜面接種到10mL YEPD液體培養(yǎng)基(葡萄糖20.0g/L，酵母提取物10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，pH 6.0)中，于30℃搖床培養(yǎng)24h，再以1:50的體積比例將菌液分別轉(zhuǎn)接到100mL YEPD液體培養(yǎng)基中，于30℃搖床培養(yǎng)14h達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。在4℃下，5000rpm離心4min，收集菌體，用液氮迅速冷凍菌體，研磨破壁(Yang F,Tan HD,Zhou YJ,et al.Mol.Biotechnol.2010,47(2):144–151.)。使用TakaRa公司RNAiso試劑盒，并按照其標(biāo)準(zhǔn)步驟提取總RNA。

RNA進(jìn)行1.5％(質(zhì)量/體積濃度)瓊脂糖凝膠電泳，使用熒光-紫外分析儀觀察鑒定，可見(jiàn)清晰的兩條帶。用紫外/可見(jiàn)光光譜儀分析總RNA樣品，測(cè)得OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.99，表明總RNA質(zhì)量很好?？俁NA樣品凍存于-80℃，備用。

實(shí)施例2:圓紅冬孢酵母CGMCC 2.1389 cDNA第一鏈合成和GAL1簡(jiǎn)并PCR

以圓紅冬孢酵母CGMCC 2.1389總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。首先，將1.0μL總RNA(約2μg)，1.0μL引物SMART IV： 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG-3′和1.0μL oligo dT-接頭引物CDSⅢ/3'：5′-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)_30N-1N-3′，2.0μL DEPC處理水(焦碳酸二乙酯處理水，購(gòu)自大連TakaRa公司)，加入到PCR管中混勻，于72℃保溫2min，立即置于冰上冷卻2min，將2.0μL 5×第一鏈緩沖液(Clontech公司)，1.0μL DTT(20mM)，1.0μL dNTP(10mM)，1.0μLpowerscript反轉(zhuǎn)錄酶(Clontech公司)加入到體系中，混勻。于42℃延伸反應(yīng)60min，最后4℃結(jié)束反應(yīng)，存于-20℃，備用。

設(shè)計(jì)合成兩條簡(jiǎn)并引物GAL1-sense:5′-ATGCC(AGCT)TC(AGCT)CTCGAGAC(AGCT)TCGCC-3′(括號(hào)內(nèi)堿基在此位置隨機(jī)出現(xiàn)，為簡(jiǎn)并堿基)和GAL1-anti:5′-TCA(AG)TCCGAGTT(CT)TGGAA(AGCT)AGCAG-3′(括號(hào)內(nèi)堿基在此位置隨機(jī)出現(xiàn)，為簡(jiǎn)并堿基)，以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一鏈為模板，進(jìn)行GAL1基因的簡(jiǎn)并PCR擴(kuò)增，5×PCR緩沖液10.0μL，dNTPs(10mM)1.0μL，上游引物(50mmol/l)1.0μL，下游引物(50mmol/l)1.0ul，PrimeSTAR DNA聚合酶(大連TakaRa)0.5μL，合成的cDNA第一鏈模板1.0μL，ddH₂O補(bǔ)加至50μL，于94℃保溫3min，然后于98℃10s，62℃10s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)，72℃10min，4℃結(jié)束反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％(質(zhì)量/體積濃度)瓊脂糖凝膠電泳，觀察到1.8kb左右的條帶(圖1)，利用DNA回收試劑盒(購(gòu)自上海生工)，按照供應(yīng)商建議步驟純化PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物參照大連TakaRa公司提供的方法克隆到pMD18-T載體(購(gòu)自大連TakaRa)，轉(zhuǎn)化入E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，其中感受態(tài)細(xì)胞按氯化鈣法(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第三版，薩姆布魯克著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社出版)制備。挑選Amp抗性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行增菌培養(yǎng)、質(zhì)粒提取。重組質(zhì)粒樣品送至大連TakaRa公司測(cè)序，序列結(jié)果推測(cè)出的氨基酸序列經(jīng)Blastp分析，證實(shí)為半乳糖激酶序列(RtGAL1氨基酸序列)，如SEQ ID NO：5所示。半乳糖激酶cDNA序列(RtGAL1 cDNA)如SEQ ID NO：4序列所示。

實(shí)施例3：圓紅冬孢酵母CGMCC 2.1389RtGAL1CDS的擴(kuò)增

圓紅冬孢酵母CGMCC 2.1389的基因組DNA提取采用玻璃珠破壁法(精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南第三版第13章，奧斯伯等著，顏?zhàn)臃f等譯，科學(xué)出版社出版)。制備好的基因組DNA，利用Nanodrop ND-1000測(cè)定，測(cè)得OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.85，表明基因組DNA質(zhì)量很好。濃度為280ng/μL，共500μL，基因組DNA樣品凍存于-20℃，備用。

根據(jù)實(shí)施例2中獲得的半乳糖激酶(RtGal1)cDNA序列，設(shè)計(jì)1對(duì)基因特異性引物，GAL1-p1:5’-atgccctcgctcgagacgtcgccgctc-3’和GAL1-p2:5’-tcaatccgagttctggaagaggagtgc-3’，以圓紅冬孢酵母CGMCC 2.1389的基因組DNA為模板，按照常規(guī)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約2.3kb的PCR產(chǎn)物(未顯示)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物按照實(shí)施例2的操作步驟回收、克隆到pMD18-T載體，并進(jìn)行測(cè)序，得到如序列表SEQ ID NO：3所示的DNA序列(RtGAL1編碼區(qū))。經(jīng)與實(shí)施例2中獲得的半乳糖激酶cDNA序列比對(duì)，證實(shí)該基因片段為其半乳糖激酶編碼區(qū)序列，其中含有6個(gè)內(nèi)含子和7個(gè)外顯子。

實(shí)施例4：染色體步移獲得RtGAL1基因5’翼側(cè)序列(啟動(dòng)子)

本實(shí)施例利用Genome Walking Kit(購(gòu)自大連TakaRa)完成。

根據(jù)實(shí)施例3中得到的RtGAL1CDS序列，設(shè)計(jì)3條Specific Primer(基因特異性引物)，分別為GAL1-SP1：5’-ctcgcctgcaaagtgcaagtacaaacact-3’，GAL1-SP2:5’-cgtctcgagagcaacgagggacgcaccgat-3’和GAL1-SP3:5’-cgagagtgcagcctgggtgtagacctggtc-3’，做為下游引物，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行以下操作。

1.1^st PCR反應(yīng)

以實(shí)施例3中精制的基因組DNA為模板，進(jìn)行第一輪擴(kuò)增。反應(yīng)體系50μL：10×LA PCR buffer II(Mg²⁺plus,大連TakaRa)5.0μL，dNTPs(2.5mmol/l)8.0μL，LA Taq DNA聚合酶(5U/μL,大連TakaRa)1.0μL，AP1Primer(100μmol/l，大連TakaRa)1.0μL，GAL1-SP1(10μmol/l)1.0μL，圓紅冬孢酵母CGMCC 2.1389基因組DNA模板(120ng/μL)1.0μL，ddH₂O加至50μL。反應(yīng)條件：先進(jìn)行5個(gè)高溫退火溫度的高特異性反應(yīng)，然后進(jìn)行1個(gè)極低退火溫度的低特異性反應(yīng)；然后進(jìn)行熱不對(duì)稱PCR：2個(gè)高退火溫度(65℃)的高特異性反應(yīng)和1個(gè)低退火溫度(44℃)的低特異性反應(yīng)交替循環(huán)，共15次。具體參數(shù)如下：94℃1min，98℃1min；94℃30s，65℃1min,72℃2min,共5個(gè)循環(huán)；94℃30s，25℃3min，72℃2min；94℃30s,65℃1min,72℃2min,94℃30s,65℃1min,72℃2min,94℃30s,44℃1min,72℃2min,共15個(gè)循環(huán)；72℃10min,結(jié)束反應(yīng)。

2.2^nd巢式PCR反應(yīng)

反應(yīng)體系50μL：10×LA PCR buffer II(Mg²⁺plus,大連TakaRa)5.0μL，dNTPs(2.5mmol/l)8.0μL，LA Taq DNA聚合酶(5U/μL,大連TakaRa)1.0μL，AP1Primer(100μmol/l，大連TakaRa)1.0μL，1^stPCR反應(yīng)產(chǎn)物1.0μL，GAL1-SP2(10μmol/l)1.0μL，ddH₂O加至50μL。反應(yīng)條件：94℃30s,65℃1min,72℃2min,94℃30s,65℃1min,72℃2min,94℃30s,44℃1min,72℃2min,共15個(gè)循環(huán)；72℃10min,結(jié)束反應(yīng)。

3.3^rd巢式PCR反應(yīng)

反應(yīng)體系50μL：10×LA PCR buffer II(Mg²⁺plus,大連TakaRa)5.0μL，dNTPs(2.5mmol/l)8.0μL，LA Taq DNA聚合酶(5U/μL,大連TakaRa)1.0μL，AP1Primer(100μmol/l，大連TakaRa)1.0μL，2^nd巢式PCR反應(yīng)產(chǎn)物1.0μL，GAL1-SP3(10μmol/l)1.0μL，ddH₂O加至50μL。反應(yīng)條件：94℃30s,65℃1min,72℃2min,94℃30s,65℃1min,72℃2min,94℃30s,44℃1min,72℃2min,共15個(gè)循環(huán)；72℃10min,結(jié)束反應(yīng)。

3^rd巢式PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1％(質(zhì)量/體積濃度)瓊脂糖凝膠電泳后切割目的條帶，利用DNA片段凝膠純化試劑盒(購(gòu)自碧云天)進(jìn)行純化。純化后的DNA片段經(jīng)TA克隆插入pMD18-T載體(購(gòu)自大連TakaRa公司)，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞；其中感受態(tài)細(xì)胞按氯化鈣法(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第三版，薩姆布魯克著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社出版)制備。挑選Amp抗性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行增菌培養(yǎng)、質(zhì)粒提取。重組質(zhì)粒樣品送至大連TakaRa公司測(cè)序，得到如SEQ ID NO：1所示的DNA序列，證實(shí)為預(yù)期的RtGAL1啟動(dòng)子序列。

實(shí)施例5：染色體步移獲得RtGAL1基因3’翼側(cè)序列(終止子)

本實(shí)施例也是利用Genome Walking Kit(購(gòu)自大連TakaRa)完成。

根據(jù)實(shí)施例3中得到的GAL1DNA序列，設(shè)計(jì)3條Specific Primer(基因特異性引物)分別為GAL1-SP11：5’-gtgtcccgagttggacgagttggtctc-3’，GAL1-SP22:5’-gtgcgggatggggaggcgcgaccgtct-3’和GAL1-SP33:5’-tcgcgactaagccggaacacggggcactcc-3’，做為上游引物，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行3’翼側(cè)染色體步移操作，除Specific Primer分別由GAL1-SP1，GAL1-SP2，GAL1-SP3依次更換為GAL1-SP11，GAL1-SP22，GAL1-SP33外，其它同實(shí)施例4。

3^rd巢式PCR反應(yīng)產(chǎn)物(未顯示)利用DNA片段凝膠純化試劑盒(購(gòu)自碧云天)進(jìn)行純化，經(jīng)TA克隆插入pMD18-T載體(購(gòu)自大連TakaRa公司)，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞；其中感受態(tài)細(xì)胞按氯化鈣法(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第三版，薩姆布魯克著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社出版)制備。挑選Amp抗性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行增菌培養(yǎng)、質(zhì)粒提取。重組質(zhì)粒樣品送至大連TakaRa公司測(cè)序，得到如SEQ ID NO：2所示的DNA序列，證實(shí)為預(yù)期的半乳糖激酶編碼基因的終止子序列。

實(shí)施例6：RtGAL1啟動(dòng)子-開(kāi)放閱讀框架-終止子全長(zhǎng)基因獲得

根據(jù)實(shí)施例4和實(shí)施例5中獲得的啟動(dòng)子和終止子序列，重新設(shè)計(jì)一對(duì)引物進(jìn)行RtGAL“啟動(dòng)子-開(kāi)放閱讀框架-終止子”全長(zhǎng)基因的擴(kuò)增。Pgal1-p1:5’-aggcgaatggatcggaaggcatggtcg-3’，gal1t-p2:5’-gggcgttgcgaacgtcctccaatcaag-3’。以實(shí)施例3中制備的圓紅冬孢酵母CGMCC 2.1389基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系(50μL)：10×Speed buffer(大連TakaRa)5.0μL，dNTPs(10mmol/l)1.0μL，上游引物(10μmol/l)2.0μL，下游引物(10μmol/l)2.0μL，SpeedSTAR^TM HS DNA聚合酶(擴(kuò)增速度快，1kb/10s，購(gòu)自大連TakaRa公司)0.5μL，基因組DNA模板(120ng/μL)2μL，ddH₂O加至50μL。反應(yīng)條件：98℃1min，98℃10s，65℃1.0min，35個(gè)循環(huán)，72℃10min，4℃結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％(質(zhì)量/體積濃度)瓊脂糖凝膠電泳分析后利用PCR片段純化試劑盒(購(gòu)自碧云天)進(jìn)行純化。片段經(jīng)TA克隆插入pMD18-T載體(購(gòu)自大連TakaRa公司)，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞；其中感受態(tài)細(xì)胞按氯化鈣法(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第三版，薩姆布魯克著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社出版)制備。挑選Amp抗性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行增菌培養(yǎng)、質(zhì)粒提取。重組質(zhì)粒樣品送至大連TakaRa公司測(cè)序，證實(shí)為預(yù)期的半乳糖激酶基因全長(zhǎng)序列pGAL1t，該重組載體命名為T(mén)-pGAL1t。

實(shí)施例7：RF克隆法構(gòu)建潮霉素蛋白表達(dá)盒GAL1p-hyg-GAL1t

根據(jù)NCBI報(bào)道的HYG蛋白質(zhì)序列委托上海生工公司全基因合成HYG基因(如SEQ ID NO：6所示)。以合成的基因?yàn)槟０?，參照文獻(xiàn)方法(van den Ent F,Lowe J J.Biochem Biophys Methods,2006,67,67-74.)，設(shè)計(jì)RF克隆引物：HYG-RF-p1： 5’-GATTCGCTTGCTGTGCGCTGTGAGACGatgccggagctcacggcgacgtcggtc-3′和HYG-RF-p2:5’-CTTCTCCTCCTCGTCCTTGCTCGCCGCctattctttcgcccgcgggcgcgtcga-3’為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。進(jìn)行RF第一輪擴(kuò)增。體系(50μL)：5×Prime buffer(大連TakaRa)10.0μL，dNTPs(2.5mmol/l)4.0μL，上游引物(10μmol/l)2.0μL，下游引物(10μmol/l)2.0μL，PrimeSTAR HS DNA聚合酶(大連TakaRa)1.0μL，T-GFPuv質(zhì)粒(100ng/μL)1μL，ddH₂O加至50μL。反應(yīng)條件：95℃3min，98℃8s，49℃15s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)，72℃10min，4℃結(jié)束反應(yīng)。RF I反應(yīng)產(chǎn)物利用DNA片段膠回收純化試劑盒純化，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

RF II反應(yīng)：5×Prime buffer(大連TakaRa)10.0μL，dNTPs(2.5mmol/l)4.0μL，實(shí)施例6中構(gòu)建的T-pGal1t質(zhì)粒(100ng/μL)1.0μL，本實(shí)施例前述步驟中RF I反應(yīng)產(chǎn)物(200ng/μL)5.0μL，PrimeSTAR HS DNA聚合酶(大連TakaRa)1.0μL，ddH₂O加至50μL。反應(yīng)條件：95℃3min，68℃12min，之后95℃30s，65℃45s(-1℃/cyc)，68℃12min，15個(gè)循環(huán)，接下來(lái)再進(jìn)行一輪：95℃30s，55℃45s，68℃12min，20個(gè)循環(huán)，72℃10min，4℃結(jié)束反應(yīng)。

DpnI消化和電擊轉(zhuǎn)化：取8μL RF II反應(yīng)產(chǎn)物加入1μL DpnI(購(gòu)自TaKaRa)和1μL DpnI buffer，混勻后在37℃作用120min去除原T-pGal1t質(zhì)粒后，取2μL電擊轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，感受態(tài)細(xì)胞按標(biāo)準(zhǔn)方法制備(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第三版，薩姆布魯克著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社出版)，電擊轉(zhuǎn)化參數(shù)：2200-2500V，400Ω，25μF，0℃，4-8ms。挑選Amp抗性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行增菌培養(yǎng)、質(zhì)粒提取，并利用RF I反應(yīng)所用引物HYG-RF-p1和HYG-RF-p2進(jìn)行菌落PCR鑒定，鑒定陽(yáng)性的重組載體送大連TakaRa進(jìn)行測(cè)序，得到5’端和3’端分別為GAL1啟動(dòng)子和GAL1終止子的“GAL1p-hyg-GAL1t”表達(dá)盒，同時(shí)，該重組載體命名為T(mén)-GAL1p-hyg-GAL1t。完整的“GAL1p-hyg-GAL1t”表達(dá)盒如SEQ ID NO：7所示。

實(shí)施例8：hyg在貝吉維紅冬孢酵母(Rhodosporidium babjevae)NCYC 2630中的誘導(dǎo)表達(dá)

根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)在自然條件下可以通過(guò)病斑或傷口進(jìn)入寄主組織，將其體內(nèi)的一段DNA轉(zhuǎn)入植物基因組中，最終刺激寄主在侵染部位形成冠癭瘤。農(nóng)桿菌這種特性最早被應(yīng)用于植物基因組的改造，稱為ATMT技術(shù)。隨后ATMT技術(shù)廣泛應(yīng)用于多種真菌和酵母遺傳改造和T-DNA插入突變文庫(kù)構(gòu)建。

ATMT轉(zhuǎn)化過(guò)程大致可以分為載體構(gòu)建、農(nóng)桿菌活化、宿主材料制備、共轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化子篩選這五個(gè)步驟。首先在雙元載體的T-DNA區(qū)域間插入合適的選擇標(biāo)記，并轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌；含有雙元載體的農(nóng)桿菌工程菌株活化后用乙酰丁香酮(AS)誘導(dǎo)；宿主菌株經(jīng)過(guò)活化后稀釋到一定的濃度；將活化并誘導(dǎo)后的農(nóng)桿菌與宿主材料混合，涂布于鋪有載體介質(zhì)的共培養(yǎng)平板上，在適宜的溫度下進(jìn)行共轉(zhuǎn)化；將共培養(yǎng)的混菌轉(zhuǎn)移到篩選平板上，置于宿主菌最適宜的溫度下培養(yǎng)，至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。

1.雙元載體PZPK-GAL1p-hyg-GAL1t的構(gòu)建

PZPK骨架載體來(lái)源于中科院大連化學(xué)物理研究所趙宗保研究員實(shí)驗(yàn)室(Lin XP,Wang YN,Zhang SF,et al.Fems Yeast Res.2014,14:547–555)，PZPK-GAL1p-hyg-GAL1t載體的構(gòu)建則采用GAL1-HYG-RF-p1：5’-CCGAATTGAATTCGAGCTCGCTCGGTACCCGGaggcgaatggatcggaaggcatggtcg-3′和GAL1-HYG-RF-p2：5’-GCTTGCATGCTGCAGGTCGACTCTAGA gggcgttgcgaacgtcctccaatcaagt-3′為引物，以實(shí)施例7構(gòu)建的T-GAL1p-hyg-GAL1t為模板擴(kuò)增獲得“GAL1p-hyg-GAL1t”片段，PCR膠回收后采用RF克隆方法(如實(shí)施例7中所示)將“GAL1p-hyg-GAL1t”片段插入PZPK雙元載體的LB和RB之間。所獲得的載體命名為PZPK-GAL1p-hyg-GAL1t，結(jié)構(gòu)如圖2所示。

2.含有PZPK-GAL1p-hyg-GAL1t質(zhì)粒的農(nóng)桿菌工程菌株的構(gòu)建

所獲得的PZPK-GAL1p-hyg-GAL1t雙元載體采用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciems)AGL1(購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(ATCC))中，于含有50ng/μL卡那霉素的LB平板上挑取轉(zhuǎn)化子。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子首先采用菌落PCR的方法進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子，提取其中的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中。雙元載體通過(guò)大腸桿菌大量富集后送測(cè)序驗(yàn)證。含有測(cè)序正確質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株為工程菌株，保存?zhèn)溆谩?/p>

3. HYG基因在Rhodosporidium babjevae NCYC 2630中的誘導(dǎo)表達(dá)

R.babjevae NCYC 2630購(gòu)自英國(guó)國(guó)家酵母菌種保藏中心(National Collection of Yeast Cultures，NCYC)。取一環(huán)活化后的R.babjevae NCYC 2630，接于5mL YEPD(葡萄糖20.0g/L，酵母提取物 10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，pH 6.0)培養(yǎng)液中，30℃，200r/min培養(yǎng)12h。用無(wú)菌水洗滌一遍后，調(diào)節(jié)至OD₆₀₀＝0.1-0.8，備用。含有PZPK-GAL1p-hyg-GAL1t質(zhì)粒的農(nóng)桿菌活化后，接于5mL含有卡那霉素(50ng/μL)和利福平(50ng/μL)的LB液體中，30℃，200r/min培養(yǎng)8h。用無(wú)菌水洗滌一遍，調(diào)節(jié)至OD₆₀₀＝0.1-1.6，備用。

取上述酵母及農(nóng)桿菌稀釋液各400μL，混勻，直接滴于誘導(dǎo)平板(5mmol/l葡萄糖，0.5％甘油，1.45g/L磷酸二氫鉀，2.05g/L磷酸氫二鉀，0.15g/L氯化鈉，0.5g/L七水硫酸鎂，66mg/L二水氯化鈣，2.48g/L七水硫酸鐵，0.5g/L硫酸銨，40mmol/l MES(2-(N-嗎啡啉)乙磺酸)，2％瓊脂粉，200μmol/L乙酰丁香酮)上(Bundock P,den Dulk-Ras A,Beijersbergen A,et al.EMBO J,1995,14,3206-3214.)，24-25℃，培養(yǎng)4天。用10mL左右的無(wú)菌水將混合菌苔洗下，3000r/min離心5min，棄去上層主要含有農(nóng)桿菌的液體，剩余的細(xì)胞用800μL無(wú)菌水重懸，取50-200μL涂布于YPGR(半乳糖)培養(yǎng)基(50ng/μL潮霉素、300μg/mL頭孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，瓊脂粉1.5g/L，PH 6.0)上，于30℃進(jìn)行培養(yǎng)，直至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。

4. R.babjevae NCYC 2630潮霉素轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定

隨機(jī)挑取6個(gè)潮霉素抗性R.babjevae轉(zhuǎn)化子，接入含有50ng/μL潮霉素的YPGR液體培養(yǎng)基(50ng/μL潮霉素、300μg/mL頭孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，PH 6.0)中，于30℃搖床培養(yǎng)36h。參考實(shí)施例3中所述玻璃珠破壁法提取重組R.babjevae菌株基因組DNA，采用HYG-RF-p1和HYG-RF-p2為引物，進(jìn)行PCR鑒定。PCR體系(50μL)：10×PCR buffer(大連TakaRa)5.0μL，dNTPs(2.5mmol/l)4.0μL，上游引物(10μmol/l)2.0μL，下游引物(10μmol/l)2.0μL，rTaq DNA聚合酶(大連TakaRa)1.0μL，基因組DNA(30ng/μL)1μL，ddH₂O加至50μL。反應(yīng)條件：95℃3min，98℃10s，55℃15s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)，72℃10min，4℃結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％(質(zhì)量/體積濃度)瓊脂糖凝膠電泳分析。結(jié)果如圖3所示?？梢?jiàn)，外源HYG片段成功整合進(jìn)入R.babjevae NCYC 2630基因組中。

5. R.babjevae NCYC 2630潮霉素轉(zhuǎn)化子的Western blot分析

除了直接利用潮霉素抗性表型來(lái)確定圓紅冬孢酵母GAL1啟動(dòng)子可以啟動(dòng)潮霉素抗性基因在R.babjevae NCYC 2630的表達(dá)外，由于潮霉素抗性基因表達(dá)產(chǎn)物的C-端攜帶6×His Tag，還可利用抗His Tag抗體通過(guò)Western blot分析確定相應(yīng)蛋白的表達(dá)。上述PCR鑒定正確的6個(gè)轉(zhuǎn)化子，隨機(jī)挑取3個(gè)轉(zhuǎn)化子，接入10mL含有50ng/μL潮霉素的YPGR液體培養(yǎng)基中，于30℃搖床培養(yǎng)48h，4000r/min離心10min收集菌株。獲得的菌體用無(wú)菌水洗滌一遍后，加入400μL的蛋白提取緩沖液(8M尿素,65mM DTT,0.1％Triton X-100,100mM NaCl,50mM Tris-Cl,1mM PMSF,1mM EGTA,1mM EDTA，pH為7.4)重懸，再加入同等體積的酸洗玻璃珠。采用玻璃珠破壁法破碎細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白(精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南第三版第13章，奧斯伯等著，顏?zhàn)臃f等譯，科學(xué)出版社出版)。細(xì)胞總蛋白在12％SDS-PAGE膠上進(jìn)行分離后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上(Solarbio,Beijing,China)，采用小鼠抗His-tag抗體(購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司)和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司)作為一抗和二抗，DAB辣根過(guò)氧化物酶顯色試劑盒(購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行顯色，均可觀察到潮霉素基因的表達(dá)(圖4)。

實(shí)施例9：利用GAL1p-hyg-GAL1t表達(dá)盒進(jìn)行圓紅冬孢酵母ATCC 10788的URA3基因敲除兼BLE的誘導(dǎo)表達(dá)

在此利用圓紅冬孢酵母URA3基因作為整合位點(diǎn)，通過(guò)RF克隆方法，使得“GAL1p-hyg-GAL1t”表達(dá)盒的5’和3’末端攜帶有約1500bp的圓紅冬孢酵母URA3基因同源重組臂，利用BLE抗性篩選標(biāo)記進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的篩選。

1.圓紅冬孢酵母URA3基因的獲得

根據(jù)圓紅冬孢酵母URA3(orotidine-5'-phosphate decarboxylase)基因序列(NCBI登錄號(hào)：KB722658.1,EU693529.1)，設(shè)計(jì)特異引物：URA3-P1：5’-TGGCTCCAATGAGTCGTTGCTTCCAGCGC-3′和URA3-P2:5’-CAAGGAGAGAGGCGTTAAGCCTAAAG-3’，以圓紅冬孢酵母ATCC 10788基因組為模板，擴(kuò)增獲得含有URA3啟動(dòng)子、閱讀框架和終止子的全長(zhǎng)基因組序列。利用DNA回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物后，克隆到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑選Amp抗性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行增菌培養(yǎng)、質(zhì)粒提取。重組質(zhì)粒樣品送至大連TakaRa公司測(cè)序，序列結(jié)果與基因組測(cè)序結(jié)果比對(duì)，證 實(shí)包含URA3啟動(dòng)子，終止子和閱讀框架的DNA序列(如SEQ ID NO：8所示，URA3p-URA3-URA3t)。該質(zhì)粒命名為T(mén)-URA3。

2. RF克隆方法構(gòu)建GALp-BLE-GAL1t表達(dá)盒

以pPICZαA(購(gòu)自Invitrogen)為模板，利用一對(duì)引物BLE-RF-p1：5’-GATTCGCTTGCTGTGCGCTGTGAGACGatggccaagttgaccagtgccgttccg-3′和BLE-RF-p2:5’-CTTCTCCTCCTCGTCCTTGCTCGCCGCtcagtcctgctcctcggccacgaagtg-3’，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。依照實(shí)施例7中所述的RF克隆方法，以T-GALp-hyg-GAL1t為骨架，將BLE(SEQ ID NO：9)插入pRtGAL1和RtGAL1t之間，構(gòu)建成的質(zhì)粒命名為T(mén)-GALp-BLE-GAL1t。

3. URA3-BLE敲除盒的構(gòu)建

采用引物URA3-GAL1-BLE-RF-P1：5’-CTTGTCTTCTACAGTATATCCCTAAATTaggcgaatggatcggaaggcatggtcg-3′和URA3-GAL1-BLE-RF-P2:5’-CTGCCCTTCACTCATCAATTACCAgggcgttgcgaacgtcctccaatcaagt-3’為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。依照實(shí)施例3中所述的RF克隆方法，以T-URA3為骨架，將“GALp-BLE-GAL1t”表達(dá)盒插入RtURA3中，所得的序列經(jīng)過(guò)Takara測(cè)序后如SEQ ID NO：10所示(pURA3-GAL1-BLE-URA3t)，構(gòu)建成的質(zhì)粒命名為T(mén)-URA3-GAL1-BLE，結(jié)構(gòu)如圖7所示。重組質(zhì)粒樣品送至大連TakaRa公司測(cè)序，序列結(jié)果與基因組測(cè)序結(jié)果比對(duì)，證實(shí)該基因片段為兩端帶有1500bp URA3重組臂的“URA3-GAL1-BLE-URA3”敲除盒。

4. URA3-GAL1-BLE-URA3敲除盒的大量制備

以T-URA3-GAL1-BLE質(zhì)粒為模板，以URA3-P1和URA3-P2為引物，進(jìn)行“URA3-GAL1-BLE-URA3”敲除盒的大量制備。PCR體系(500μL)：10×Speed buffer(大連TakaRa)50.0μL，dNTPs(10mmol/l)10.0μL，上游引物(10μmol/l)20.0μL，下游引物(10μmol/l)20.0μL，SpeedSTAR HS DNA聚合酶(擴(kuò)增速度快，1kb/10s，購(gòu)自大連TakaRa公司)5.0μL，基因組DNA模板(120ng/μL)15.0μL，ddH₂O加至500μL，混勻后分裝。反應(yīng)條件：98℃1min，98℃10s，65℃60s，35個(gè)循環(huán)，72℃10min，4℃結(jié)束反應(yīng)。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1％(質(zhì)量/體積濃度)瓊脂糖凝膠電泳分析后利用PCR片段純化試劑盒(購(gòu)自生工)進(jìn)行純化。純化后的DNA片段濃度為500ng/μL，共60μL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

5.圓紅冬孢酵母ATCC 10788感受態(tài)細(xì)胞制備

圓紅冬孢酵母ATCC 10788感受態(tài)細(xì)胞的制備：圓紅冬孢酵母ATCC 10788挑菌落接種10mLYEPD培養(yǎng)基(葡萄糖20.0g/L，酵母提取物10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，pH 6.0)，30℃，200rpm，培養(yǎng)20h；培養(yǎng)物1:50比例轉(zhuǎn)接新鮮YEPD培養(yǎng)基，100mL(500mL錐形瓶，裝液量100mL)，30℃，200rpm，培養(yǎng)6-9h，OD值達(dá)到0.6-1.2；培養(yǎng)物冰浴10-30min，4℃，4000r/min離心5min，棄上清；0℃無(wú)菌Milli-Q水洗1次；0℃1mol/l山梨醇洗滌2次；冰浴，備用。取100μL圓紅冬孢酵母ATCC 10788感受態(tài)細(xì)胞，加入“URA3-GAL1-BLE-URA3”敲除盒10μL(總共5μg)，混勻后移入預(yù)冷至0℃的電擊杯中，參數(shù)：電壓0.8-2.0千伏，電阻200Ω，電容25μF，時(shí)間4-8ms；電擊后立即加入1mL含1M山梨醇的YEPD，30℃溫育1-2h；涂布含1M山梨醇的YPGR培養(yǎng)基(50ng/μL博來(lái)霉素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，1.5瓊脂粉，PH 6.0)，30℃培養(yǎng)5天以上，待轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。

6.轉(zhuǎn)化子的菌落PCR鑒定

博來(lái)霉素抗性轉(zhuǎn)化子接種10mL YPGR液體培養(yǎng)基(50ng/μL博來(lái)霉素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，PH 6.0)。參照實(shí)施例3中玻璃珠破壁法提取基因組DNA，采用BLE-RF-p1和BLE-RF-p2進(jìn)行PCR鑒定。PCR體系(25μL)：10×PCR buffer(大連TakaRa)2.5μL，dNTPs(2.5mmol/l)2.0μL，上游引物(10μmol/l)1.0μL，下游引物(10μmol/l)21.0μL，rTaq DNA聚合酶(大連TakaRa)0.5μL，基因組DNA(20ng/μL)1μL，ddH₂O加至25μL。反應(yīng)條件：95℃3min，95℃30s，55℃30s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)，72℃10min，4℃結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％(質(zhì)量/體積濃度)瓊脂糖凝膠電泳分析。結(jié)果顯示，所有圓紅冬孢酵母ATCC 10788重組菌株均可擴(kuò)增出外源BLE基因片段，而對(duì)照菌株圓紅冬孢酵母ATCC 10788則無(wú)相應(yīng)PCR產(chǎn)物(未顯示)。

進(jìn)一步對(duì)上述鑒定正確的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行表型驗(yàn)證。5’-FOA抗性表型分析結(jié)果顯示，此尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型圓紅冬孢酵母工程菌株在含有5’-FOA的半乳糖SD培養(yǎng)基(0.1％5’-FOA，半乳糖20g/L，(NH₄)₂SO₄0.1g/L，酵母粉0.75g/L，KH₂PO₄0.06g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5g/L，pH 6.0)上能夠正常生 長(zhǎng)，而野生型的R.toruloides ATCC 10788則在含有5’-FOA的培養(yǎng)基中無(wú)法生長(zhǎng)。

因此，從基因型到表型，均驗(yàn)證圓紅冬孢酵母ATCC 10788重組菌株URA3基因的缺失。

7. Ble基因的表達(dá)分析(轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)分析，RT-PCR)

除了直接利用博萊霉素抗性表型來(lái)確定圓紅冬孢酵母FBA啟動(dòng)子可以啟動(dòng)博萊霉素抗性基因在圓紅冬孢酵母的表達(dá)(博萊霉素抗性表型決定于萊霉素抗性基因的表達(dá))外，還利用RT-PCR方法檢測(cè)了博萊霉素抗性基因ble的轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。

隨機(jī)挑取2株菌落PCR鑒定和表型分析均正確的博來(lái)霉素抗性轉(zhuǎn)化子接種10mL YPGR液體培養(yǎng)基(50ng/μL博來(lái)霉素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，PH 6.0)，誘導(dǎo)培養(yǎng)48h。參照實(shí)施例1方法提取細(xì)胞總RNA，參照實(shí)施例2方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(RT)，以所合成的cDNA第一鏈為模板，利用BLE-p1:ATGGCCAAGTTGACCAGTGCCG和BLE-p2:TCAGTCCTGCTCCTCGGCCACG為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系(25μL)：10×Ex Taq buffer(大連TakaRa)2.5μL，dNTPs(10mmol/l)0.5μL，上游引物BLE-p1(10μmol/l)1.0μL，下游引物BLE-p2(10μmol/l)1.0μL，Ex Taq DNA聚合酶0.25μL，cDNA第一鏈模板1.0μL，ddH₂O加至25μL。反應(yīng)條件：98℃1min，98℃10s，65℃60s，35個(gè)循環(huán)，72℃10min，4℃結(jié)束反應(yīng)。結(jié)果顯示，所有圓紅冬孢酵母ATCC 10788重組菌株均可擴(kuò)增出0.3kb BLE基因片段，而對(duì)照菌株圓紅冬孢酵母ATCC 10788則無(wú)相應(yīng)PCR產(chǎn)物(圖5)。

實(shí)施例10：雙表達(dá)盒GAL1啟動(dòng)子載體的構(gòu)建

1. pZPK-GAL1p-hyg-Thsp單表達(dá)盒載體的構(gòu)建

以實(shí)施例3中制備的R.toruloides CGMCC2.1389基因組DNA為模板，利用引物HSPt-H1：CGAAAGAACACCACCATCACCATCACTAGacgattccgcccc gtctcacctcgcat和HSPt-H2：GCATGCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCC cgcgcacttctctgcactgcatctttg，擴(kuò)增獲得Thsp終止子序列(SEQ ID NO：11)，PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA膠回收試劑盒(購(gòu)自生工)純化后采用RF克隆方法(如實(shí)施例7中所示)將Thsp終止子片段置換PZPK-GAL1p-hyg-GAL1t載體的GAL1終止子，所獲得的載體命名為PZPK-GAL1p-hyg-Thsp，結(jié)構(gòu)如圖6所示。

2.多克隆位點(diǎn)的引入和pZPK-GAL1p-MCS-Thsp單表達(dá)盒載體的構(gòu)建

選擇pZPK-pPGK-hyg-Tnos載體(Lin XP,Wang YN,Zhang SF,et al.Fems Yeast Res.2014,14:547–555)和上一步驟構(gòu)建的PZPK-GAL1p-HYG-Thsp載體中均不含有的3個(gè)酶切位點(diǎn)EcoR V、Nco I、Spe I設(shè)計(jì)多克隆位點(diǎn)MCS(Multiple Cloning Site)。參考RF克隆原理，直接設(shè)計(jì)兩條完全反向互補(bǔ)且含EcoR V、Nco I、Spe I酶切位點(diǎn)的長(zhǎng)鏈引物GAL1-HSPt-H1：5’-cttgctgtgcgctgtgagacgGATATCCCATGGACTAGTacgattccgccccgtctca-3’和GAL1-HSPt-H1：5’-tgagacggggcggaatcgtACTAGTCCATGGGATATCcgtctcacagcgcacagcaag-3’作為大引物(mega-primer)，等摩爾比加入RFII反應(yīng)體系，以PZPK-GAL1p-HYG-Thsp載體為出發(fā)載體，直接進(jìn)行RF II克隆(如實(shí)施例7中所示)將MCS片段置換上一步驟構(gòu)建的PZPK-GAL1p-HYG-Thsp載體的hyg ORF，所構(gòu)建的載體命名為pZPK-GAL1p-MCS-Thsp。結(jié)構(gòu)如圖7所示。

3.基于GAL1啟動(dòng)子的雙表達(dá)盒誘導(dǎo)表達(dá)載體的構(gòu)建

以pZPK-GAL1p-MCS-Thsp載體為模板，利用引物GAL1-HSPt-p1：5’-AGCTTGAGCTTGGATCAGATTGTCGAGGCGAATGGATCGGAAGGCATGGTCG-3’和GAL1-HSPt-p1：5’-CAAACACTGATAGTTTAAACTGAAGGCGGCGCGCACTTCTCTGCACTGCATC-3’進(jìn)行“GAL1p-MCS-Thsp”表達(dá)盒的擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA膠回收純化試劑盒(購(gòu)自生工)純化后采用RF克隆方法(如實(shí)施例7中所示)將“GAL1p-MCS-Thsp”表達(dá)盒同方向插入在pZPK-pPGK-hyg-Tnos載體(Lin XP,Wang YN,Zhang SF,et al.Fems Yeast Res.2014,14:547–555)的“pPGK-hyg-Tnos”表達(dá)盒與RB之間，“pPGK-hyg-Tnos”表達(dá)盒(簡(jiǎn)稱HYG)和“GAL1p-MCS-Thsp”之間有100bp左右的間隔序列，所獲得的載體命名為PZPK-HYG-GAL1p-MCS-Thsp，結(jié)構(gòu)如圖8所示。該載體的“pPGK-hyg-Tnos”表達(dá)盒用于篩選重組子，“GAL1p-MCS-Thsp”則用于目的基因的插入克隆和誘導(dǎo)表達(dá)。

實(shí)施例11：脂肪酸羥化酶在鎖擲孢酵母屬S.pararoseus JCM 3765中的表達(dá)

蓖麻油酸(12-hydroxy-octadeca-cis-9-enoic acid:C18:1-OH)是一類(lèi)十分有價(jià)值的重要工業(yè)原料?，F(xiàn)有來(lái)源主要為植物榨取，但是資源受到限制。來(lái)源于病原性真菌——麥角菌(Claviceps purpurea)油酸羥化酶基因(CpFAH，Genbank登記號(hào):EU661785)在微生物中的表達(dá)可為蓖麻油酸的供應(yīng)提供一條新的途徑。利用PGAL1啟動(dòng)子進(jìn)行油酸羥化酶基因CpFAH的誘導(dǎo)表達(dá)，以實(shí)現(xiàn)在圓紅冬孢酵母中合成蓖麻油酸的目的。

1. CpFAH半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)載體的構(gòu)建

依據(jù)NCBI上報(bào)道的CpFAH(EU661785)基因委托上海生工全基因合成此基因，序列如SEQ ID NO：12所示(CpFAH)。引物CpFAH-NcoI-E1：5’-cggCCATGGACatggcttccgctactcctgcaatg-3′和CpFAH-NcoI-E2:5’-CCGACTAGTctaGTGGTGGTGGTGGTGGTGctgagtcttcattgaaat-3’為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物利用DNA膠回收純化試劑盒(購(gòu)自生工)進(jìn)行純化，并利用Nco I、Spe I進(jìn)行雙酶切，并連接入同樣Nco I、Spe I處理的pZPK-HYG-GAL1p-MCS-Thsp，插入在啟動(dòng)子GAL1p和終止子Thsp之間，成功構(gòu)建脂肪酸羥化酶的半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)載體pZPK-HYG-GAL1p-CpFAH-Thsp，結(jié)構(gòu)如圖9所示。重組表達(dá)脂肪酸羥化酶的C端引入6×His Tag，可用于Western blot操作。

2.含有pZPK-HYG-GAL1p-CpFAH-Thsp載體的農(nóng)桿菌工程菌株的構(gòu)建

所構(gòu)建的pZPK-HYG-GAL1p-CpFAH-Thsp載體采用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌AGL1中，于含有50ng/μL卡那霉素的LB平板上挑取轉(zhuǎn)化子。卡那霉素抗性農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子首先采用菌落PCR的方法進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子，命名為AGL1/ZPK-HYG-GAL1p-CpFAH-Thsp，保存?zhèn)溆谩?/p>

3. CpFAH經(jīng)ATMT整合入鎖擲孢酵母屬S.pararoseus JCM 3765染色體

擬粉紅鎖擲孢酵母(S.pararoseus)JCM 3765購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。取一環(huán)活化后的S.pararoseus JCM 3765，接種于5mL YEPD(葡萄糖20.0g/L，酵母提取物10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，pH 6.0)中，25℃，200r/min過(guò)夜培養(yǎng)。用無(wú)菌水洗滌一遍后，調(diào)節(jié)至OD₆₀₀＝1-2，備用。

步驟2獲得的重組農(nóng)桿菌AGL1/ZPK-HYG-GAL1p-CpFAH-Thsp接種于5mL含有卡那霉素(100ng/μL)和利福平(80ng/μL)的LB液體中，250℃，200r/min培養(yǎng)過(guò)夜。用無(wú)菌水洗滌一遍，調(diào)節(jié)至OD₆₀₀＝1-3，備用。

取上述擬粉紅鎖擲孢酵母JCM 3765及農(nóng)桿菌稀釋液各200μL，混勻，直接滴于誘導(dǎo)平板(5mmol/l葡萄糖，0.5％甘油，1.45g/L磷酸二氫鉀，2.05g/L磷酸氫二鉀，0.15g/L氯化鈉，0.5g/L七水硫酸鎂，66mg/L二水氯化鈣，2.48g/L七水硫酸鐵，0.5g/L硫酸銨，40mmol/l MES(2-(N-嗎啡啉)乙磺酸)，2％瓊脂粉，200μmol/L乙酰丁香酮)表面的濾膜上，25℃，培養(yǎng)2天。無(wú)菌鑷子將濾膜從IM誘導(dǎo)平板上轉(zhuǎn)移到半乳糖誘導(dǎo)篩選平板(50ng/μL潮霉素、300μg/mL頭孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，1.5瓊脂粉，PH 6.0)上，30℃倒置培養(yǎng)48h，直至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。

4.擬粉紅鎖擲孢酵母JCM 3765潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子的菌落PCR鑒定

隨機(jī)挑取6個(gè)遺傳霉素抗性S.pararoseus JCM 3765轉(zhuǎn)化子接入50mL含有50μg/mL潮霉素的半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL頭孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，PH 6.0)中，參考實(shí)施例3中所述玻璃珠破壁法提取基因組DNA，采用CpFAH-NcoI-E1和CpFAH-NcoI-E2為引物，進(jìn)行PCR鑒定。結(jié)果證明，CpFAH成功整合進(jìn)入S.pararoseus JCM 3765基因組(未顯示)。

5.重組擬粉紅鎖擲孢酵母JCM 3765生產(chǎn)蓖麻油酸的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

挑取3個(gè)菌落PCR鑒定正確的擬粉紅鎖擲孢酵母JCM 3765轉(zhuǎn)化子單菌落接于5mL YEPD培養(yǎng)基(葡萄糖20.0g/L，酵母提取物10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，pH 6.0)中。培養(yǎng)24h，以1:50的接種量接于50mL含有50μg/mL潮霉素的半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL頭孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，PH 6.0)中，作為二級(jí)種子。二級(jí)種子培養(yǎng)24h后，取5mL加入45mL的半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。培養(yǎng)96h后結(jié)束發(fā)酵。取40mL發(fā)酵菌液置于50mL圓底離心管，8000r/min室溫離心5min收集菌體，用去離子水洗滌2次，105℃烘24h至恒重。取出后于干燥器中冷卻，然后稱量記錄，稱量后按1g干菌體加入6mL 4mol/l鹽酸的比例，每管加入4mL 4mol/l鹽酸，78℃水浴消化1h，冷卻后加入2倍體積的氯仿/甲醇(1:1，v/v)，充分振蕩混勻，萃取1h后離心，取氯仿層放入一個(gè)新的離心管中。水相以等體積氯仿再次萃取一次，充分振蕩后離心，取氯仿層放入上述新的離心管中合并，并加入等體積0.1％氯化鈉溶液，振蕩混勻后離心。用注射器將下層有機(jī)相小心抽取并注入事先準(zhǔn)備好的玻璃漏斗中(漏斗預(yù)先塞入脫脂棉花，并加入適量無(wú)水硫酸鈉)， 待漏斗中有機(jī)溶液基本流入下方的玻璃油瓶中，加入適量的氯仿沖洗漏斗4遍，一并流入下方油瓶中，萃取有油脂的氯仿采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行油脂收集，將收集了油脂的油瓶放入烘箱烘干24h。

對(duì)菌油進(jìn)行甲酯化：稱取70.0mg的待測(cè)油脂，加入含5％KOH的CH₃OH溶液0.5mL，加熱回流50min，然后加入BF₃的甲醇溶液(V_{BF3乙醚溶液}：V_CH3OH＝4:10)0.7mL，繼續(xù)回流10min。冷卻后加入1mL去離子水和0.7mL正己烷，混勻后吸出有機(jī)相，經(jīng)去離子水洗滌兩遍后用于氣相色譜分析。

6.重組擬粉紅鎖擲孢酵母JCM 3765生產(chǎn)蓖麻油酸的檢測(cè)

將步驟5轉(zhuǎn)酯化得到的樣品溶解于正己烷中，采用文獻(xiàn)(Meesapyodsuk,D.,and Qiu,X.Plant Physiol.,2008,147,1325-1333.)中的方法進(jìn)行檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)品為蓖麻油酸甲酯(CAS:141-24-2)，負(fù)對(duì)照為野生型擬粉紅鎖擲孢酵母JCM 3765的油脂轉(zhuǎn)酯化產(chǎn)物。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)入CpFAH基因的擬粉紅鎖擲孢酵母JCM3765中確有蓖麻油酸產(chǎn)生，含量為280μg/mL，總量占總體游離脂肪酸含量的62％以上。

7.重組擬粉紅鎖擲孢酵母JCM 3765中CpFAH表達(dá)分析——Western blot

除了直接通過(guò)蓖麻油酸生產(chǎn)表型來(lái)確定圓紅冬孢酵母GAL1p啟動(dòng)子可以啟動(dòng)油酸羥化酶基因在鎖擲孢酵母屬的表達(dá)外，由于油酸羥化酶基因表達(dá)產(chǎn)物的C-端攜帶6×His Tag，還可利用抗His Tag抗體通過(guò)免疫印跡分析油酸羥化酶基因的表達(dá)。上述步驟4中PCR鑒定正確的6個(gè)轉(zhuǎn)化子，隨機(jī)挑取3個(gè)，接入10mL的半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL頭孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，PH 6.0)中，于30℃搖床培養(yǎng)48h，4000r/min離心10min收集菌株。菌體用無(wú)菌水洗滌一遍后，加入400μL的蛋白提取緩沖液(8M尿素,65mM DTT,0.1％Triton X-100,100mM NaCl,50mM Tris-Cl,1mM PMSF,1mM EGTA,1mM EDTA，pH為7.4)重懸，按實(shí)施例8的步驟5進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot分析，均可觀察到油酸羥化酶的表達(dá)(圖10)。

實(shí)施例12：蘋(píng)果酸酶在擲孢酵母屬Sporobolomyces roseus中的表達(dá)

蘋(píng)果酸酶(Malic enzyme,ME)是NADPH的主要產(chǎn)生酶，為油脂合成提供還原力。如果在油脂積累期時(shí)過(guò)表達(dá)蘋(píng)果酸酶增加NADPH的供應(yīng)，理論上可提高菌株的胞內(nèi)油脂含量。

1.圓紅冬孢酵母蘋(píng)果酸酶RtME的半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)圓紅冬孢酵母ME基因所在Scaffold序列(NCBI登錄號(hào)：KB722664.1)，設(shè)計(jì)特異引物：ME-P1：5’-atgcccgcacactttgccccctcccagc-3′和ME-P2:5’-atgcccgcacactttgccccctcccagccc-3’，以實(shí)施例1獲得的圓紅冬孢酵母CGMCC 2.1389總RNA為模板，按實(shí)施例2所示方法進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增獲得含有ME的全長(zhǎng)cDNA序列。利用DNA回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物后，克隆到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑選Amp抗性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行增菌培養(yǎng)、質(zhì)粒提取。重組質(zhì)粒樣品送至大連TakaRa公司測(cè)序，序列結(jié)果與基因組測(cè)序結(jié)果比對(duì)，證實(shí)包含ME編碼基因全長(zhǎng)，其序列如SEQ ID NO：13所示，(RtME)。該質(zhì)粒命名為T(mén)-ME。

設(shè)計(jì)引物ME-NcoI-E1：5’-cggCCATGGACatgcccgcacactttgccccctccca gcccctcca-3′和ME-NcoI-E2:5’-CCGACTAGTctaGTGATGGTGATGGTGGTG ctgcgcctgctgct-3’，以T-ME為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物利用DNA膠回收純化試劑盒(購(gòu)自生工)進(jìn)行純化，并利用Nco I、Spe I進(jìn)行雙酶切，并連接入同樣Nco I、Spe I處理的pZPK-HYG-GALp-MCS-Thsp，插入在啟動(dòng)子GAL1p和終止子Thsp之間，成功構(gòu)建蘋(píng)果酸酶的半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)載體pZPK-HYG-GAL1p-ME-Thsp，所示(pZPK-HYG-GAL1p-ME-Thsp)，結(jié)構(gòu)如圖11所示。重組表達(dá)脂肪酸羥化酶的C端引入6×His Tag，可用于Western blot操作。

2.含有pZPK-HYG-GAL1p-ME-Thsp載體的農(nóng)桿菌工程菌株的構(gòu)建

所構(gòu)建的pZPK-HYG-GAL1p-ME-Thsp載體采用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌AGL1中，于含有50ng/μL卡那霉素的LB平板上挑取轉(zhuǎn)化子?？敲顾乜剐赞r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子首先采用菌落PCR的方法進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子，命名為AGL1/ZPK-HYG-GAL1p-ME-Thsp，保存?zhèn)溆谩?/p>

3. ME經(jīng)ATMT整合入擲孢酵母屬粉紅擲孢酵母JCM 8242染色體

粉紅擲孢酵母(Sporobolomyces roseus)JCM 8242購(gòu)自于日本微生物菌種保藏中心(JCM)。取一環(huán)活化后的S.roseus JCM 8242，接種于5mL YEPD(葡萄糖20.0g/L，酵母提取物10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，pH 6.0)中，25℃，200r/min過(guò)夜培養(yǎng)。用無(wú)菌水洗滌一遍后，調(diào)節(jié)至OD₆₀₀＝1-2，備用。

步驟2獲得的重組農(nóng)桿菌AGL1/ZPK-HYG-GAL1p-ME-Thsp接種于5mL含有卡那霉素(100ng/μL)和利福平(80ng/μL)的LB液體中，250℃，200r/min培養(yǎng)過(guò)夜。用無(wú)菌水洗滌一遍，調(diào)節(jié)至OD₆₀₀＝1-3，備用。

取上述粉紅擲孢酵母JCM 8242及農(nóng)桿菌稀釋液各200μL，混勻，按實(shí)施例13步驟3進(jìn)行ATMT操作，直至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。

4.粉紅擲孢酵母JCM 8242潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子的菌落PCR鑒定

隨機(jī)挑取6個(gè)遺傳霉素抗性S.roseus JCM 8242轉(zhuǎn)化子接入50mL含有50ng/μL遺傳霉素的半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL頭孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，PH 6.0)，參考實(shí)施例3中所述玻璃珠破壁法提取基因組DNA，采用ME-NcoI-E1和ME-NcoI-E2為引物，進(jìn)行PCR鑒定。結(jié)果證明，ME編碼基因成功整合進(jìn)入S.roseus JCM 8242基因組(未顯示)。

5.重組粉紅擲孢酵母S.roseus JCM 8242油脂發(fā)酵

挑取3個(gè)菌落PCR鑒定正確的粉紅擲孢酵母JCM 8242轉(zhuǎn)化子單菌落，按實(shí)施例11步驟5所示方法進(jìn)行發(fā)酵、胞內(nèi)油脂提取和分析。結(jié)果顯示，較之野生菌株S.roseus JCM 8242，過(guò)表達(dá)了圓紅冬孢酵母蘋(píng)果酸酶的重組S.roseus JCM 8242胞內(nèi)油脂含量由25％提高到了45％，增加了80％。

6.重組S.roseus JCM 8242中ME表達(dá)分析——Western blot

除了直接通過(guò)油脂積累增加性能來(lái)確定圓紅冬孢酵母GAL1p啟動(dòng)子可以啟動(dòng)圓紅冬孢酵母蘋(píng)果酸酶(RtME)基因在鎖擲孢酵母屬的表達(dá)外，由于RtME表達(dá)產(chǎn)物的C-端攜帶6×His Tag，還可利用抗His Tag抗體通過(guò)免疫印跡分析ME的表達(dá)。上述步驟4中PCR鑒定正確的6個(gè)轉(zhuǎn)化子，隨機(jī)挑取3個(gè)，接入10mL的半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL頭孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，PH 6.0)，于30℃搖床培養(yǎng)48h，4000r/min離心10min收集菌株。菌體用無(wú)菌水洗滌一遍后，加入400μL的蛋白提取緩沖液(8M尿素,65mM DTT,0.1％Triton X-100,100mM NaCl,50mM Tris-Cl,1mM PMSF,1mM EGTA,1mM EDTA，pH為7.4)重懸，按實(shí)施例8的步驟5進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot分析，均可觀察到RtME的表達(dá)(圖12)。

實(shí)施例13：GFP在紅酵母屬深紅酵母CGMCC 2.279中的半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)

鑒于深紅酵母遺傳背景不清晰，無(wú)法分離自身啟動(dòng)子和終止子元件進(jìn)行目的基因的表達(dá)，本技術(shù)發(fā)明利用圓紅冬孢酵母GALp啟動(dòng)子和Thsp終止子，建立了深紅酵母遺傳操作體系，實(shí)現(xiàn)了GFP在深紅酵母CGMCC 2.279中的誘導(dǎo)表達(dá)。

1. GFP半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)載體的構(gòu)建

依據(jù)NCBI上報(bào)道的GFP的氨基酸序列(AFA52654.1)，按圓紅冬孢酵母密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化，委托上海生工全基因合成其基因，序列如SEQ ID NO：16所示(GFP)。引物GFP-NcoI-E1：5’-cggCCATGGACatgtcgaagggtgaggagcttttc-3′和GFP-NcoI-E2:5’-CCGACTAGTctaGTGGTGGTGGTGGTGGTGcttgtagagttcgtccatgccgtg-3’為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物利用DNA膠回收純化試劑盒(購(gòu)自生工)進(jìn)行純化，并利用Nco I、Spe I進(jìn)行雙酶切，并連接入同樣Nco I、Spe I處理的pZPK-HYG-GAL1p-MCS-Thsp，插入在啟動(dòng)子GAL1p和終止子Thsp之間，成功構(gòu)建綠色熒光蛋白的半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)載體pZPK-HYG-GAL1p-GFP-Thsp，結(jié)構(gòu)如圖13所示。重組表達(dá)綠色熒光蛋白的C端引入6×His Tag，可用于Western blot操作。

2.含有pZPK-HYG-GAL1p-GFP-Thsp載體的農(nóng)桿菌工程菌株的構(gòu)建

所構(gòu)建的pZPK-HYG-GAL1p-GFP-Thsp載體采用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌AGL1中，于含有50ng/μL卡那霉素的LB平板上挑取轉(zhuǎn)化子?？敲顾乜剐赞r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子首先采用菌落PCR的方法進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子，命名為AGL1/ZPK-HYG-GAL1p-GFP-Thsp，保存?zhèn)溆谩?/p>

3. GFP經(jīng)ATMT整合入深紅酵母CGMCC 2.279染色體

深紅酵母(Rhodotorula rubra)CGMCC 2.279購(gòu)自于酵母菌種保藏中心(購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。取一環(huán)活化后的深紅酵母CGMCC 2.279，接種于5mL YEPD(葡萄糖20.0g/L，酵母提取物10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，pH 6.0)中，25℃，200r/min過(guò)夜培養(yǎng)。用無(wú)菌水洗滌一遍后，調(diào)節(jié)至OD₆₀₀＝1-2，備用。

步驟2獲得的重組農(nóng)桿菌AGL1/ZPK-HYG-GAL1p-GFP-Thsp接種于5mL含有卡那霉素(100ng/μL)和利福平(80ng/μL)的LB液體中，250℃，200r/min培養(yǎng)過(guò)夜。用無(wú)菌水洗滌一遍，調(diào)節(jié)至OD₆₀₀＝1-3，備用。

取上述深紅酵母CGMCC 2.279及農(nóng)桿菌稀釋液各200μL，混勻，按實(shí)施例13步驟3進(jìn)行ATMT操作，直至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。

4.深紅酵母CGMCC 2.279潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子的菌落PCR鑒定

隨機(jī)挑取6個(gè)遺傳霉素抗性深紅酵母CGMCC 2.279轉(zhuǎn)化子接入50mL含有50ng/μL遺傳霉素的半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL頭孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，PH 6.0)，參考實(shí)施例3中所述玻璃珠破壁法提取基因組DNA，采用GFP-NcoI-E1和GFP-NcoI-E2為引物，進(jìn)行PCR鑒定。結(jié)果證明，GFP基因成功整合進(jìn)入深紅酵母CGMCC 2.279基因組(未顯示)。

5.深紅酵母CGMCC 2.279潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子的熒光觀察

挑取3個(gè)菌落PCR鑒定正確的深紅酵母CGMCC 2.279潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子單菌落接于5mL YEPD培養(yǎng)基(葡萄糖20.0g/L，酵母提取物10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，pH 6.0)中。培養(yǎng)24h，以1:50的接種量接于50mL含有50ng/μL潮霉素的半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL頭孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，PH 6.0)，作為二級(jí)種子。二級(jí)種子培養(yǎng)24h后，取5mL加入45mL的半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。培養(yǎng)48h后結(jié)束發(fā)酵。取菌液10μL點(diǎn)于載玻片，蓋上蓋玻片后置于熒光顯微鏡進(jìn)行綠色熒光觀察，激發(fā)波長(zhǎng)498nm，發(fā)射波長(zhǎng)516，GFP重組深紅酵母可觀察到綠色熒光，而對(duì)照野生型深紅酵母CGMCC 2.279則無(wú)熒光出現(xiàn)(未顯示)。

6.重組深紅酵母CGMCC 2.279中GFP表達(dá)分析——Western blot

除了直接通過(guò)綠色熒光表型來(lái)確定圓紅冬孢酵母GAL1p啟動(dòng)子可以啟動(dòng)GFP在紅酵母屬深紅酵母的表達(dá)外，由于重組GFP的C-端攜帶6×His Tag，還可利用抗His Tag抗體通過(guò)免疫印跡分析GFP的表達(dá)。上述步驟4中PCR鑒定正確的6個(gè)轉(zhuǎn)化子，隨機(jī)挑取3個(gè)，接入10mL的半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL頭孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，PH 6.0)，于30℃搖床培養(yǎng)48h，4000r/min離心10min收集菌株。菌體用無(wú)菌水洗滌一遍后，加入400μL的蛋白提取緩沖液(8M尿素,65mM DTT,0.1％Triton X-100,100mM NaCl,50mM Tris-Cl,1mM PMSF,1mM EGTA,1mM EDTA，pH為7.4)重懸，按實(shí)施例8的步驟5進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot分析，均可觀察到GFP的表達(dá)(圖14)。

實(shí)施例14：GFP在紅酵母屬膠紅酵母CGMCC 2.22中的半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)

鑒于膠紅酵母(Rhodotorula mucilaqinosa)遺傳背景不清晰，無(wú)法分離自身啟動(dòng)子和終止子元件進(jìn)行目的基因的表達(dá)，本技術(shù)發(fā)明利用圓紅冬孢酵母GAL1p啟動(dòng)子和Thsp終止子，建立了深紅酵母遺傳操作體系，實(shí)現(xiàn)了GFP在膠紅酵母CGMCC 2.22中的誘導(dǎo)表達(dá)。

1. GFP經(jīng)ATMT整合入膠紅酵母CGMCC 2.22染色體

實(shí)施例13步驟2獲得的重組農(nóng)桿AGL1/ZPK-HYG-GAL1p-GFP-Thsp接種于5mL含有卡那霉素(100ng/μL)和利福平(80ng/μL)的LB液體中，250℃，200r/min培養(yǎng)過(guò)夜。用無(wú)菌水洗滌一遍，調(diào)節(jié)至OD₆₀₀＝1-3，備用。

膠紅酵母CGMCC 2.22購(gòu)自于酵母菌種保藏中心(購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。取一環(huán)活化后的膠紅酵母CGMCC 2.22，接種于5mL YEPD(葡萄糖20.0g/L，酵母提取物10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，pH 6.0)中，25℃，200r/min過(guò)夜培養(yǎng)。用無(wú)菌水洗滌一遍后，調(diào)節(jié)至OD₆₀₀＝1-2，備用。

取上述膠紅酵母CGMCC 2.22及農(nóng)桿菌稀釋液各200μL，混勻，按實(shí)施例13步驟3進(jìn)行ATMT操作，直至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。

2.膠紅酵母CGMCC 2.22潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子的菌落PCR鑒定

隨機(jī)挑取6個(gè)遺傳霉素抗性深紅酵母CGMCC 2.279轉(zhuǎn)化子接入50mL含有50ng/μL遺傳霉素的半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL頭孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，PH 6.0)，參考實(shí)施例3中所述玻璃珠破壁法提取基因組DNA，采用GFP-NcoI-E1和GFP-NcoI-E2為引物，進(jìn)行PCR鑒定。結(jié)果證明，GFP基因成功整合進(jìn)入膠紅酵母CGMCC 2.22基因組(未顯示)。

3.膠紅酵母CGMCC 2.22潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子的熒光觀察

挑取3個(gè)菌落PCR鑒定正確的膠紅酵母CGMCC 2.22潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子單菌落按實(shí)施例13步驟5進(jìn)行菌株培養(yǎng)和顯微鏡觀察，GFP重組膠紅酵母可觀察到綠色熒光，而對(duì)照野生型膠紅酵母CGMCC 2.22則無(wú)熒光出現(xiàn)(未顯示)。

4.重組膠紅酵母CGMCC 2.22中GFP表達(dá)分析——Western blot

除了直接通過(guò)綠色熒光表型來(lái)確定圓紅冬孢酵母PGAL1啟動(dòng)子可以啟動(dòng)GFP在紅酵母屬膠紅酵 母CGMCC 2.22的表達(dá)外，由于重組GFP的C-端攜帶6×His Tag，還可利用抗His Tag抗體通過(guò)免疫印跡分析GFP的表達(dá)。上述步驟3中PCR鑒定正確的6個(gè)轉(zhuǎn)化子，隨機(jī)挑取3個(gè)，接入10mL的半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL頭孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，PH 6.0)，于30℃搖床培養(yǎng)48h，4000r/min離心10min收集菌株。菌體用無(wú)菌水洗滌一遍后，加入400μL的蛋白提取緩沖液(8M尿素,65mM DTT,0.1％Triton X-100,100mM NaCl,50mMTris-Cl,1mM PMSF,1mM EGTA,1mM EDTA，pH為7.4)重懸，按實(shí)施例8的步驟5進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot分析，均可觀察到GFP的表達(dá)(圖15)。

實(shí)施例15：脂肪酸羥化酶在紅酵母屬海濱紅酵母中的表達(dá)

來(lái)源于麥角菌的油酸羥化酶基因(CpFAH，Genbank登記號(hào):EU661785)在PGAL1啟動(dòng)子啟動(dòng)下實(shí)現(xiàn)了蓖麻油酸在海濱紅酵母中的合成。

1. CpFAH經(jīng)ATMT整合入海濱紅酵母CGMCC 2.4203染色體

實(shí)施例11步驟2獲得的AGL1/ZPK-HYG-GAL1p-CpFAH-Thsp重組農(nóng)桿菌，接種于5mL含有卡那霉素(100ng/μL)和利福平(80ng/μL)的LB液體中，250℃，200r/min培養(yǎng)過(guò)夜。用無(wú)菌水洗滌一遍，調(diào)節(jié)至OD₆₀₀＝1-3，備用。

海濱紅酵母(Rhodotorula marina)CGMCC 2.4203購(gòu)自于酵母菌種保藏中心(購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。取一環(huán)活化后的海濱紅酵母CGMCC 2.4203，接種于5mL YEPD(葡萄糖20.0g/L，酵母提取物10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，pH 6.0)中，25℃，200r/min過(guò)夜培養(yǎng)。用無(wú)菌水洗滌一遍后，調(diào)節(jié)至OD₆₀₀＝1-2，備用。

取上述擬海濱紅酵母CGMCC 2.4203及農(nóng)桿菌稀釋液各200μL，按實(shí)施例13步驟3進(jìn)行ATMT操作，直至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。

2.海濱紅酵母CGMCC 2.4203潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子的菌落PCR鑒定

隨機(jī)挑取6個(gè)遺傳霉素抗性海濱紅酵母CGMCC 2.4203轉(zhuǎn)化子接入50mL含有50ng/μL潮霉素的半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL頭孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，PH 6.0)，參考實(shí)施例3中所述玻璃珠破壁法提取基因組DNA，采用CpFAH-NcoI-E1和CpFAH-NcoI-E2為引物，進(jìn)行PCR鑒定。結(jié)果證明，CpFAH成功整合進(jìn)入海濱紅酵母CGMCC 2.4203基因組(未顯示)。

3.重組海濱紅酵母CGMCC 2.4203生產(chǎn)蓖麻油酸的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

挑取3個(gè)菌落PCR鑒定正確的海濱紅酵母CGMCC 2.4203轉(zhuǎn)化子單菌落接于5mL YEPD培養(yǎng)基(葡萄糖20.0g/L，酵母提取物10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，pH 6.0)中。培養(yǎng)24h，以1:50的接種量接于50mL含有50ng/μL潮霉素的半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL頭孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，PH 6.0)，作為二級(jí)種子。二級(jí)種子培養(yǎng)24h后，取5mL加入45mL的半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。培養(yǎng)96h后結(jié)束發(fā)酵。取40mL發(fā)酵菌液置于50mL圓底離心管，8000r/min室溫離心5min收集菌體，用去離子水洗滌2次，105℃烘24h至恒重。取出后按實(shí)施例11所示方法進(jìn)行油脂提取和菌油轉(zhuǎn)酯化。

4.重組海濱紅酵母CGMCC 2.4203生產(chǎn)蓖麻油酸的檢測(cè)

將步驟7轉(zhuǎn)酯化得到的樣品溶解于正己烷中，采用文獻(xiàn)(Meesapyodsuk,D.,and Qiu,X.Plant Physiol.,2008,147,1325-1333.)中的方法進(jìn)行檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)品為蓖麻油酸甲酯(CAS:141-24-2)，負(fù)對(duì)照為野生型海濱紅酵母CGMCC 2.4203的油脂轉(zhuǎn)酯化產(chǎn)物。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)入CpFAH基因的海濱紅酵母中確有蓖麻油酸產(chǎn)生，含量為292μg/mL，總量占總體游離脂肪酸含量的63％以上。

5.重組海濱紅酵母CGMCC 2.4203中CpFAH表達(dá)分析——Western blot

除了直接通過(guò)蓖麻油酸生產(chǎn)表型來(lái)確定圓紅冬孢酵母GAL1p啟動(dòng)子可以啟動(dòng)油酸羥化酶基因在海濱紅酵母CGMCC 2.4203的表達(dá)外，由于油酸羥化酶基因表達(dá)產(chǎn)物的C-端攜帶6×His Tag，還可利用抗His Tag抗體通過(guò)免疫印跡分析油酸羥化酶基因的表達(dá)。上述步驟4中PCR鑒定正確的6個(gè)轉(zhuǎn)化子，隨機(jī)挑取3個(gè)，接入10mL的半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL頭孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，PH 6.0)，于30℃搖床培養(yǎng)48h，4000r/min離心10min收集菌株。菌體用無(wú)菌水洗滌一遍后，加入400μL的蛋白提取緩沖液(8M尿素,65mM DTT,0.1％Triton X-100,100mM NaCl,50mM Tris-Cl,1mM PMSF,1mM EGTA,1mM EDTA，pH為7.4)重懸，按實(shí)施例8的步驟5進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot分析，均可觀察到油酸羥化酶的表達(dá)(未顯示)。

實(shí)施例16：菊粉酶在紅酵母屬禾本紅酵母CGMCC 2.4202中的表達(dá)

菊粉為多聚果糖，自然界中約有30000多種植物均含有菊粉多糖，菊粉的世界年產(chǎn)量可達(dá)350000噸，是僅次于淀粉的第二大植物碳水化合物。在工業(yè)中以及做為生物質(zhì)原料應(yīng)用較多的產(chǎn)菊粉植物為菊苣和菊芋。這些生物質(zhì)經(jīng)過(guò)外切菊粉酶處理生成可被多種微生物利用的果糖和少量的葡萄糖。本技術(shù)發(fā)明利用圓紅冬孢酵母GAL1p啟動(dòng)子和Thsp終止子，建立了禾本紅酵母遺傳操作體系，實(shí)現(xiàn)了外切菊粉酶在禾本紅酵母(Rhodotorula graminis)CGMCC 2.4202中的誘導(dǎo)表達(dá)。

1.菊粉酶半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)ZL 2007100159198.8專利中馬克斯克魯維酵母外切菊粉酶氨基酸序列，按照?qǐng)A紅冬孢酵母密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化，委托上海生工進(jìn)行全基因合成，序列如SEQ ID NO：17所示(INU)。設(shè)計(jì)引物INU-NcoI-E1：5’-cggCCATGGACatgcgcttcgcgtactccctcttgctc-3′和INU-NcoI-E2:5’-CCGACTAGTctaGTGATGGTGATGGTGGTGgaggttgaactgggtgacgttg-3’，以全合成INU基因?yàn)槟０澹M(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物利用DNA膠回收純化試劑盒(購(gòu)自生工)進(jìn)行純化，并利用Nco I、Spe I進(jìn)行雙酶切，并連接入同樣Nco I、Spe I處理的pZPK-HYG-GAL1p-MCS-Thsp，插入在啟動(dòng)子GAL1p和終止子Thsp之間，成功構(gòu)建菊粉酶的半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)載體pZPK-HYG-GAL1p-INU-Thsp，結(jié)構(gòu)如圖16所示。重組表達(dá)脂肪酸羥化酶的C端引入6×His Tag，可用于Western blot操作。

2.含有pZPK-HYG-GAL1p-INU-Thsp載體的農(nóng)桿菌工程菌株的構(gòu)建

所構(gòu)建的pZPK-HYG-GAL1p-INU-Thsp載體采用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌AGL1中，于含有50ng/μL卡那霉素的LB平板上挑取轉(zhuǎn)化子。卡那霉素抗性農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子首先采用菌落PCR的方法進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子，命名為AGL1/ZPK-HYG-GAL1p-INU-Thsp，保存?zhèn)溆谩?/p>

3. INU經(jīng)ATMT整合入禾本紅酵母CGMCC 2.4202染色體

禾本紅酵母CGMCC 2.4202購(gòu)自于日本微生物菌種保藏中心(JCM)。取一環(huán)活化后的禾本紅酵母CGMCC 2.4202，接種于5mL YEPD(葡萄糖20.0g/L，酵母提取物10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，pH 6.0)中，25℃，200r/min過(guò)夜培養(yǎng)。用無(wú)菌水洗滌一遍后，調(diào)節(jié)至OD₆₀₀＝1-2，備用。

步驟2獲得的重組農(nóng)桿菌AGL1/ZPK-HYG-PGAL1-INU-Thsp接種于5mL含有卡那霉素(100ng/μL)和利福平(80ng/μL)的LB液體中，250℃，200r/min培養(yǎng)過(guò)夜。用無(wú)菌水洗滌一遍，調(diào)節(jié)至OD₆₀₀＝1-3，備用。

取上述禾本紅酵母CGMCC 2.4202及農(nóng)桿菌稀釋液各200μL，混勻，按實(shí)施例13步驟3進(jìn)行ATMT操作，直至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。

4.禾本紅酵母CGMCC 2.4202潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子的菌落PCR鑒定

隨機(jī)挑取6個(gè)遺傳霉素抗性禾本紅酵母CGMCC 2.4202轉(zhuǎn)化子接入50mL含有50ng/μL潮霉素的半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL頭孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，PH 6.0)，參考實(shí)施例3中所述玻璃珠破壁法提取基因組DNA，采用INU-NcoI-E1和INU-NcoI-E2為引物，進(jìn)行PCR鑒定。結(jié)果證明，ME編碼基因成功整合進(jìn)入禾本紅酵母CGMCC 2.4202基因組(未顯示)。

5.以菊粉為碳源進(jìn)行重組禾本紅酵母油脂發(fā)酵

挑取3個(gè)菌落PCR鑒定正確的禾本紅酵母CGMCC 2.4202轉(zhuǎn)化子單菌落接于5mL YEPD培養(yǎng)基(葡萄糖20.0g/L，酵母提取物10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，pH 6.0)中。培養(yǎng)24h，以1:50的接種量接于50mL含有50ng/μL潮霉素的半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL頭孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，PH 6.0)，作為二級(jí)種子。二級(jí)種子培養(yǎng)24h后，取10mL加入45mL的菊粉/半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL頭孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，4％菊粉，2％半乳糖，PH 6.0)中。培養(yǎng)96h后結(jié)束發(fā)酵。取40mL發(fā)酵菌液置于50mL圓底離心管，8000r/min室溫離心5min收集菌體，用去離子水洗滌2次，105℃烘24h至恒重。之后按實(shí)施例11的步驟5進(jìn)行油脂提取。結(jié)果顯示，野生菌株禾本紅酵母CGMCC 2.4202在利用菊粉為唯一碳源進(jìn)行發(fā)酵96h時(shí)可積累21％的胞內(nèi)油脂，而過(guò)表達(dá)了外切菊粉酶的重組禾本紅酵母利用菊粉為唯一碳源進(jìn)行發(fā)酵96h時(shí)胞內(nèi)油脂含量則為52％，可直接轉(zhuǎn)換菊粉為胞內(nèi)油脂。

6.重組禾本紅酵母CGMCC 2.4202中INU表達(dá)分析——Western blot

除了直接通過(guò)菊粉利用表型來(lái)確定圓紅冬孢酵母PGAL1啟動(dòng)子可以啟動(dòng)外切菊粉酶在紅酵母屬的表達(dá)外，由于重組INU表達(dá)產(chǎn)物的C-端攜帶6×His Tag，還可利用抗His Tag抗體通過(guò)免疫印跡分 析ME的表達(dá)。上述步驟4中PCR鑒定正確的6個(gè)轉(zhuǎn)化子，隨機(jī)挑取3個(gè)，接入10mL的半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL頭孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，PH 6.0)，于30℃搖床培養(yǎng)48h，4000r/min離心10min收集菌株。菌體用無(wú)菌水洗滌一遍后，加入400μL的蛋白提取緩沖液(8M尿素,65mM DTT,0.1％Triton X-100,100mM NaCl,50mM Tris-Cl,1mM PMSF,1mM EGTA,1mM EDTA，pH為7.4)重懸，按實(shí)施例8的步驟5進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot分析，均可觀察到INU的表達(dá)(未顯示)。

實(shí)施例17：GFP在紅酵母屬粘紅酵母中的半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)

本技術(shù)發(fā)明利用圓紅冬孢酵母GAL1p啟動(dòng)子和Thsp終止子，建立了粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)遺傳操作體系，實(shí)現(xiàn)了GFP在粘紅酵母NCYC 2666中的誘導(dǎo)表達(dá)。

1. GFP經(jīng)ATMT整合入粘紅酵母NCYC 2666染色體

實(shí)施例13步驟2獲得的重組農(nóng)桿AGL1/ZPK-HYG-GAL1p-GFP-Thsp接種于5mL含有卡那霉素(100ng/μL)和利福平(80ng/μL)的LB液體中，250℃，200r/min培養(yǎng)過(guò)夜。用無(wú)菌水洗滌一遍，調(diào)節(jié)至OD₆₀₀＝1-3，備用。

粘紅酵母NCYC 2666購(gòu)自于英國(guó)國(guó)家酵母菌種保藏中心(National Collection of Yeast Cultures，NCYC)。取一環(huán)活化后的粘紅酵母NCYC 2666，接種于5mL YEPD(葡萄糖20.0g/L，酵母提取物10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，pH 6.0)中，25℃，200r/min過(guò)夜培養(yǎng)。用無(wú)菌水洗滌一遍后，調(diào)節(jié)至OD₆₀₀＝1-2，備用。

取上述粘紅酵母NCYC 2666及農(nóng)桿菌稀釋液各200μL，混勻，按實(shí)施例13步驟3進(jìn)行ATMT操作，直至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。

2.粘紅酵母NCYC 2666潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子的菌落PCR鑒定

隨機(jī)挑取6個(gè)遺傳霉素抗性粘紅酵母NCYC 2666轉(zhuǎn)化子接入50mL含有50ng/μL潮霉素的半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL頭孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，PH 6.0)，參考實(shí)施例3中所述玻璃珠破壁法提取基因組DNA，采用GFP-NcoI-E1和GFP-NcoI-E2為引物，進(jìn)行PCR鑒定。結(jié)果證明，GFP基因成功整合進(jìn)入粘紅酵母NCYC 2666基因組(未顯示)。

3.粘紅酵母NCYC 2666潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子的熒光觀察

挑取3個(gè)菌落PCR鑒定正確的粘紅酵母NCYC 2666潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子單菌落接于5mL YEPD培養(yǎng)基(葡萄糖20.0g/L，酵母提取物10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，pH 6.0)中。培養(yǎng)24h，以1:50的接種量接于50mL含有50ng/μL潮霉素的半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL頭孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，PH 6.0)，作為二級(jí)種子。二級(jí)種子培養(yǎng)24h后，取5mL加入45mL的半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。培養(yǎng)48h后結(jié)束發(fā)酵。取菌液10μL點(diǎn)于載玻片，蓋上蓋玻片后置于熒光顯微鏡進(jìn)行綠色熒光觀察，激發(fā)波長(zhǎng)498nm，發(fā)射波長(zhǎng)516，GFP重組粘紅酵母NCYC2666可觀察到綠色熒光，而對(duì)照野生型粘紅酵母NCYC 2666則無(wú)熒光出現(xiàn)(未顯示)。

4.重組膠紅酵母CGMCC 2.22中GFP表達(dá)分析——Western blot

除了直接通過(guò)綠色熒光表型來(lái)確定圓紅冬孢酵母GAL1p啟動(dòng)子可以啟動(dòng)GFP在紅酵母屬膠紅酵母CGMCC 2.22的表達(dá)外，由于重組GFP的C-端攜帶6×His Tag，還可利用抗His Tag抗體通過(guò)免疫印跡分析GFP的表達(dá)。上述步驟4中PCR鑒定正確的6個(gè)轉(zhuǎn)化子，隨機(jī)挑取3個(gè)，接入10mL的半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL頭孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％棉籽糖，2％半乳糖，PH 6.0)，于30℃搖床培養(yǎng)48h，4000r/min離心10min收集菌株。菌體用無(wú)菌水洗滌一遍后，加入400μL的蛋白提取緩沖液(8M尿素,65mM DTT,0.1％Triton X-100,100mM NaCl,50mMTris-Cl,1mM PMSF,1mM EGTA,1mM EDTA，pH為7.4)重懸，按實(shí)施例8的步驟5進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot分析，均可觀察到GFP的表達(dá)(未顯示)。