本發(fā)明涉及一種菌絲體的制備方法、菌絲體萃取物及菌絲體萃取物的制備方法，特別涉及一種黑柄炭角菌菌絲體的制備方法、黑柄炭角菌菌絲體萃取物及黑柄炭角菌菌絲體萃取物的制備方法。

背景技術(shù)：

生物體在代謝過程中會(huì)產(chǎn)生許多自由基及活性氧物質(zhì)(Reaction Oxygen Species,ROS)，其中包含過氧化氫(Hydrogen peroxide,H₂O₂)、超氧陰離子(Superoxide anion radical,·O₂^-)、羥基自由基(Hydroxyl radical,·OH^-)及其所衍生的氧化活性分子，例如脂質(zhì)過氧化自由基(Lipid peroxide,ROO·)及單重態(tài)氧(singlet oxygen,O-O:)的產(chǎn)生，這些具有未成對電子的自由基其化學(xué)性質(zhì)相當(dāng)活潑，很容易與體內(nèi)許多分子如DNA、蛋白質(zhì)及生物膜上的多元不飽和脂肪酸反應(yīng)，造成細(xì)胞組織的傷害，引發(fā)冠狀動(dòng)脈粥狀硬化、心血管疾病、癌癥及腫瘤等疾病，并加速生物體的老化甚至死亡。

生物在演化的過程中，為了利用氧氣作為能量的來源，又要避免活性氧物質(zhì)對細(xì)胞產(chǎn)生傷害，生物體內(nèi)便發(fā)展出抗氧化的防御機(jī)制，來避免或修補(bǔ)自由基造成的損害，其中可大致分為酵素性及非酵素性的抗氧化機(jī)制。但老化、飲食、生活習(xí)慣、疾病及環(huán)境污染等外在因素會(huì)造成氧化與抗氧化平衡系統(tǒng)失衡，促使生物體內(nèi)氧化壓力增加。因此由飲食中增加抗氧化物質(zhì)的攝取，以補(bǔ)強(qiáng)抗氧化防御能力，可減緩生物體內(nèi)的氧化傷害。

黑柄炭角菌(Xylaria nigripe)隸屬于炭角菌目(Xylariales)、炭角菌科(Xylariaceae)及炭角菌屬(Xylaria)，是一種中國傳統(tǒng)的藥用真菌，通常生長在 廢棄白蟻巢穴，其菌絲體形成的菌核即是中國傳統(tǒng)的中藥材料“烏靈參”，又稱作烏靈菌、雷震子等。根據(jù)四川《中藥志》記載，烏靈參有“補(bǔ)心腎、治失眠”療效的描述，具有補(bǔ)氣固腎、健脾除濕及鎮(zhèn)定安神等多種生理活性。

由于野生資源逐漸匱乏，黑柄炭角菌有采集不易與品質(zhì)不穩(wěn)定的問題。因此，目前發(fā)展以人工液態(tài)培養(yǎng)黑柄炭角菌菌絲體的技術(shù)，是解決天然黑柄炭角菌產(chǎn)量不足和品質(zhì)不穩(wěn)定等問題的一種方法。而液態(tài)培養(yǎng)的過程中，黑柄炭角菌除了合成自身生長所需的有機(jī)物質(zhì)外，還會(huì)分泌代謝產(chǎn)物，其中也可能包含具抗氧化功能的化合物，因此以液態(tài)培養(yǎng)黑柄炭角菌具有發(fā)展天然抗氧化物質(zhì)的潛力。但不同的培養(yǎng)方式，菌體生長型態(tài)不同，其基因表達(dá)也不盡相同，所產(chǎn)出的代謝產(chǎn)物也必然有所差異，在功效上也不同，或可能產(chǎn)生新的功效與用途。因此，需要一種有效提升黑柄炭角菌中抗氧化的代謝產(chǎn)物含量的培養(yǎng)和萃取方法，用于發(fā)展抗氧化物質(zhì)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一在于，提供一種黑柄炭角菌菌絲體的制備方法、黑柄炭角菌菌絲體萃取物、其制備方法及其抗氧化組合物，以克服天然黑柄炭角菌產(chǎn)量不足和品質(zhì)不穩(wěn)定等問題。

本發(fā)明的一個(gè)方面在于提供一種黑柄炭角菌菌絲體的制備方法，其包含以下步驟：提供基質(zhì)，基質(zhì)實(shí)質(zhì)是由0.5～5％重量比的糙米粉、0.1～1％重量比的麥芽萃出物以及99.4～94％重量比的水所組成。接著進(jìn)行發(fā)酵工藝過程，在基質(zhì)中接種黑柄炭角菌，并在發(fā)酵溫度下培養(yǎng)一發(fā)酵時(shí)間，以獲得發(fā)酵物質(zhì)。最后進(jìn)行分離工藝過程，將發(fā)酵物質(zhì)分離為固體部分和液體部分，其中固體部分包含黑柄炭角菌菌絲體。

依據(jù)前述的黑柄炭角菌菌絲體的制備方法，前述的基質(zhì)由2％重量比的糙米粉、0.5％重量比的麥芽萃出物以及97.5％重量比的水所組成。

依據(jù)前述的黑柄炭角菌菌絲體的制備方法，其中發(fā)酵溫度可為22℃至 30℃之間，優(yōu)選為25℃。

依據(jù)前述的黑柄炭角菌菌絲體的制備方法，其中發(fā)酵時(shí)間可為5天至15天，優(yōu)選為10天。

借此，本發(fā)明的黑柄炭角菌菌絲體的制備方法，以人工發(fā)酵培養(yǎng)黑柄炭角菌菌絲體，其制備方法可后續(xù)進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化的生產(chǎn)，因可控制起始產(chǎn)物和發(fā)酵條件等生產(chǎn)工藝過程，使所生產(chǎn)的黑柄炭角菌菌絲體品質(zhì)穩(wěn)定，且培養(yǎng)時(shí)間較短，因此可解決天然黑柄炭角菌產(chǎn)量不足和品質(zhì)不穩(wěn)定的問題。

本發(fā)明的另一個(gè)方面在于提供一種黑柄炭角菌菌絲體萃取物的制備方法，其包含下列步驟：提供黑柄炭角菌菌絲體，黑柄炭角菌菌絲體是利用前述的黑柄炭角菌菌絲體的制備方法所制得。干燥黑柄炭角菌菌絲體，以獲得菌絲體粉末。進(jìn)行萃取工藝過程，萃取工藝過程利用溶劑與菌絲體粉末以重量比10：1至30：1的比例混合成混合物后，將混合物攪拌萃取時(shí)間。最后，去除混合物的固體成分，以獲得上清液，其中上清液包含黑柄炭角菌菌絲體萃取物。

依據(jù)前述的黑柄炭角菌菌絲體萃取物的制備方法，其中溶劑可為80℃至100℃的熱水，萃取時(shí)間可為0.5小時(shí)至2小時(shí)，優(yōu)選為1小時(shí)。

依據(jù)前述的黑柄炭角菌菌絲體萃取物的制備方法，其中溶劑可為70％重量比的乙醇，萃取時(shí)間可為22小時(shí)至26小時(shí)，優(yōu)選為24小時(shí)。

依據(jù)前述的黑柄炭角菌菌絲體萃取物的制備方法，其中混合物的固體成分可利用離心方式、過濾方式或上述方式的組合而去除。

借此，本發(fā)明的黑柄炭角菌菌絲體萃取物的制備方法，可萃取黑柄炭角菌菌絲體中具有功能性的成分，并去除黑柄炭角菌菌絲體中的固體部分，以利后續(xù)使用。

本發(fā)明的另一個(gè)方面在于提供一種黑柄炭角菌菌絲體萃取物，其利用前述黑柄炭角菌菌絲體萃取物的制備方法所制得，且黑柄炭角菌菌絲體萃取物 具有抗氧化活性。

依據(jù)前述的黑柄炭角菌菌絲體萃取物，黑柄炭角菌菌絲體萃取物可用以清除DPPH自由基或用以抑制脂質(zhì)氧化。

依據(jù)前述的黑柄炭角菌菌絲體萃取物，黑柄炭角菌菌絲體萃取物具有還原力活性。

本發(fā)明的另一個(gè)方面在于提供一種抗氧化的組合物，該組合物包含有效劑量的黑柄炭角菌菌絲體萃取物，其中黑柄炭角菌菌絲體萃取物是利用前述黑柄炭角菌菌絲體萃取物的制備方法所制得。

依據(jù)前述的抗氧化的組合物，組合物選自以下群組中的一種形式：醫(yī)藥組合物、化妝品組合物、飼料組合物、飲料組合物、營養(yǎng)補(bǔ)充組合物、食用組合物以及保健食用組合物。

借此，本發(fā)明的黑柄炭角菌菌絲體萃取物因具有清除DPPH自由基能力、抑制脂質(zhì)氧化及還原力等抗氧化活性，故本發(fā)明的黑柄炭角菌菌絲體可用于抗氧化目的的醫(yī)藥組合物、化妝品組合物、飼料組合物、飲料組合物、營養(yǎng)補(bǔ)充組合物、食用組合物以及保健食用組合物上，具有運(yùn)用于生醫(yī)保健市場的潛能。

上述發(fā)明內(nèi)容旨在提供本技術(shù)方案內(nèi)容的簡化摘要，以使閱讀者對本技術(shù)方案內(nèi)容具備基本的理解。此發(fā)明內(nèi)容并非本技術(shù)方案內(nèi)容的完整概述，且其用意并非在指出本發(fā)明實(shí)施例的重要/關(guān)鍵元件或界定本發(fā)明的范圍。

附圖說明

為讓本發(fā)明的上述和其他目的、特征、優(yōu)點(diǎn)與實(shí)施例能更明顯易懂，附圖說明如下:

圖1為本發(fā)明一實(shí)施方式的黑柄炭角菌菌絲體的制備方法的步驟流程圖；以及

圖2為本發(fā)明另一實(shí)施方式的黑柄炭角菌菌絲體萃取物的制備方法的步驟流程圖。

具體實(shí)施方式

<黑柄炭角菌菌絲體的制備方法>

請參照圖1，其為依照本發(fā)明一實(shí)施方式的黑柄炭角菌菌絲體的制備方法100的步驟流程圖。圖1中，黑柄炭角菌菌絲體的制備方法100包含步驟110、步驟120與步驟130。

步驟110是提供基質(zhì)，基質(zhì)實(shí)質(zhì)是由0.5～5％重量比的糙米粉、0.1～1％重量比的麥芽萃出物以及99.4～94％重量比的水所組成。優(yōu)選地，基質(zhì)由2％重量比的糙米粉、0.5％重量比的麥芽萃出物以及97.5％重量比的水所組成。以提供碳源、氮源及水分讓后續(xù)黑柄炭角菌能進(jìn)行液態(tài)培養(yǎng)。

步驟120是進(jìn)行發(fā)酵工藝過程，在基質(zhì)中接種黑柄炭角菌，并在發(fā)酵溫度下培養(yǎng)一發(fā)酵時(shí)間，以獲得發(fā)酵物質(zhì)。發(fā)酵工藝過程通過調(diào)節(jié)溫度、通氣量等條件，使黑柄炭角菌菌絲體生長。更進(jìn)一步的說，黑柄炭角菌菌絲體的發(fā)酵工藝過程的發(fā)酵溫度為22℃至30℃之間，優(yōu)選為25℃。發(fā)酵時(shí)間為5天至15天，優(yōu)選為10天。

步驟130是分離工藝過程，將發(fā)酵物質(zhì)分離為固體部分和液體部分，其中固體部分包含黑柄炭角菌菌絲體。在發(fā)酵工藝過程完成后，因發(fā)酵物質(zhì)中已充滿黑柄炭角菌菌絲體，因此將發(fā)酵物質(zhì)中的液體部分和固體部分分離后，即可在固體部分中獲得黑柄炭角菌菌絲體。而分離方式可為過濾方式、離心方式或上述方式的組合。

<黑柄炭角菌菌絲體萃取物的制備方法>

請參照圖2，其為依照本發(fā)明另一實(shí)施方式的黑柄炭角菌菌絲體萃取物的制備方法200的步驟流程圖。圖2中，黑柄炭角菌菌絲體萃取物的制備方法200包含步驟210、步驟220、步驟230與步驟240。

步驟210是提供黑柄炭角菌菌絲體，黑柄炭角菌菌絲體是利用前述的黑柄炭角菌菌絲體的制備方法所制得。

步驟220是干燥黑柄炭角菌菌絲體，以獲得菌絲體粉末。而干燥方式可利用低溫真空干燥法或冷凍真空干燥法，以確保黑柄炭角菌菌絲體中的成分不會(huì)因干燥過程受熱而變性。

步驟230是進(jìn)行萃取工藝過程，利用溶劑與菌絲體粉末以重量比10：1至30：1的比例混合成混合物后，將混合物攪拌一萃取時(shí)間。在萃取工藝過程中，溶劑可為80℃至100℃的熱水，優(yōu)選為90℃的熱水，萃取時(shí)間可為0.5小時(shí)至2小時(shí)，優(yōu)選為1小時(shí)?；蛉軇┛蔀?0％重量比的乙醇，萃取時(shí)間可為22小時(shí)至26小時(shí)，優(yōu)選為24小時(shí)。

步驟240是去除混合物的固體成分，以獲得上清液，其中上清液包含黑柄炭角菌菌絲體萃取物。經(jīng)過萃取工藝過程后，黑柄炭角菌菌絲體萃取物已溶解至溶劑中，其中包含具有功能性的成分，因此去除混合物中固體部分后，所獲得的上清液中包含黑柄炭角菌菌絲體萃取物。而混合物的固體部分可利用離心方式、過濾方式或上述方式的組合而去除。

現(xiàn)在以下列具體試驗(yàn)例進(jìn)一步示范說明本發(fā)明，用以使得本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域通常知識(shí)的人員，可在不需過度解讀的情形下完整利用并實(shí)踐本發(fā)明，而不應(yīng)將這些試驗(yàn)例視為對本發(fā)明范圍的限制，但用于說明如何實(shí)施本發(fā)明的材料及方法。

<試驗(yàn)例>

一、制備黑柄炭角菌菌絲體

在本試驗(yàn)例中，使用菌株為黑柄炭角菌Xylaria nigripes BCRC34219，購自食品工業(yè)發(fā)展研究所生物資源保存與研究中心(臺(tái)灣，新竹)，黑柄炭角菌Xylaria nigripes BCRC34219為分離自臺(tái)灣本土的菌株。首先將黑柄炭角菌培養(yǎng)及保存在含麥芽萃出物的洋菜培養(yǎng)基(malt-extract agar plate)。將培養(yǎng)在含麥芽萃出物洋菜培養(yǎng)基的黑柄炭角菌切下大小為5mm×5mm的菌絲塊，接種至 裝有含麥芽萃出物的培養(yǎng)液(malt-extract broth)的搖瓶，在25℃下以60rpm進(jìn)行震蕩培養(yǎng)7天，作為后續(xù)液態(tài)培養(yǎng)的種菌。其中含麥芽萃出物的培養(yǎng)液的組成分為20g/L麥芽萃出物以及10g/L葡萄糖。

進(jìn)行黑柄炭角菌菌絲體制備時(shí)，使用的基質(zhì)的組成分為20g/L糙米粉與5g/L麥芽萃出物。使用的發(fā)酵槽為5公升的攪拌式發(fā)酵槽(stirred-tank fermentor)，工作體積為3公升。而黑柄炭角菌菌絲體制備的發(fā)酵工藝過程的步驟如下：先將黑柄炭角菌種菌接種至基質(zhì)中，接種量為300mL。再以攪拌轉(zhuǎn)速為100rpm、通氣量為1vvm及發(fā)酵溫度為25℃等發(fā)酵條件培養(yǎng)10天后，可獲得發(fā)酵物質(zhì)，而發(fā)酵物質(zhì)中已長滿黑柄炭角菌菌絲體。將發(fā)酵物質(zhì)進(jìn)行過濾以分離固體部分和液體部分，固體部分中包含黑柄炭角菌菌絲體，故留下發(fā)酵物質(zhì)固體部分即可獲得黑柄炭角菌菌絲體。

二、制備黑柄炭角菌菌絲體萃取物

進(jìn)行黑柄炭角菌菌絲體萃取物制備時(shí)，先使用水清洗由前述黑柄炭角菌菌絲體的制備方法所制得的黑柄炭角菌菌絲體數(shù)次，再利用冷凍干燥機(jī)干燥黑柄炭角菌菌絲體，制成菌絲體粉末，菌絲體粉末樣品保存在密閉容器內(nèi)。

再將菌絲體粉末與90℃熱水以重量比1：10至1：30的比例混合成混合物后，將混合物攪拌1小時(shí)以萃取其中具有功能性的成分?；蚴菍⒕z體粉末與70％重量比的乙醇以重量比1：10至1：30的比例混合成混合物后，將混合物攪拌24小時(shí)以萃取其中具有功能性的成分。萃取后的樣品經(jīng)過濾與離心步驟，取上清液進(jìn)行濃縮，再使用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行干燥，即得黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物和黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物。

三、黑柄炭角菌菌絲體萃取物的多酚化合物及黃酮類物質(zhì)含量測定

多酚類化合物(polyphenols)是一類具有機(jī)能性的植物化學(xué)物質(zhì)，可作為氫提供者，而達(dá)到清除自由基的效應(yīng)，因此這類物質(zhì)可以延緩食品或生物體中碳水化合物、脂質(zhì)等物質(zhì)的氧化，所以被視為重要的天然抗氧化劑。其中，黃酮類化合物(flavonoid，又稱類黃酮)是酚類化合物中種類較多的一類。一些 真菌菌絲體也具有多酚類化合物與黃酮類物質(zhì)，因此在本試驗(yàn)例中，將測定黑柄炭角菌菌絲體萃取物所具有多酚類化合物與黃酮類物質(zhì)的含量。

福林-西奧卡特(Folin-Ciocalteu)化學(xué)反應(yīng)呈色法是最普遍測定總多酚化合物含量的方法，使用沒食子酸(gallic acid，GA)當(dāng)作標(biāo)準(zhǔn)品，定量上總多酚化合物含量以沒食子酸當(dāng)量表示。Folin-Ciocalteu試劑中的鎢鉬酸可以將多酚化合物定量，自身被還原(Mo⁶⁺變?yōu)镸o⁵⁺)生成藍(lán)色化合物，顏色的深淺與總多酚含量呈正相關(guān)。

實(shí)驗(yàn)上先以去離子水配制濃度2mg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，將其依次稀釋至濃度分別為200、160、120、80、40、20μg/mL，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線用。另將7.42g Na₂CO₃溶于100mL去離子水，以配得700mM Na₂CO₃溶液。進(jìn)行分析時(shí)，分別取100μL的黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物和黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物樣品，加入200μL的10％Folin-Ciocalteu試劑混合均勻后，再加入800μL的700mM Na₂CO₃混合均勻，室溫下避光靜置2小時(shí)后，使用分光光度計(jì)，在波長765nm下測定其吸光值，最后數(shù)據(jù)依標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成沒食子酸當(dāng)量mg GA/g。

黃酮類物質(zhì)的含量分析方法也采用化學(xué)反應(yīng)呈色法，使用蘆丁(Rutin)當(dāng)作標(biāo)準(zhǔn)品，定量上黃酮類物質(zhì)的含量以蘆丁當(dāng)量表示。實(shí)驗(yàn)上先以95％甲醇溶液配制濃度500μg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，將其依次稀釋至濃度分別為50、40、30、20、10、5、2.5μg/mL，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線用。另外配制2％AlCl₃溶液，其配制方法為取98％AlCl₃溶液1.021g溶于50mL的95％甲醇溶液。進(jìn)行分析時(shí)，分別取0.5mL的黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物和黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物樣品，加入0.5mL的2％AlCl₃溶液混合均勻，避光靜置15分鐘后，在波長430nm下測定其吸光值，最后數(shù)據(jù)依標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成標(biāo)準(zhǔn)單位mg Rutin/g。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在總多酚化合物含量的部分，以黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物含量較高，為19.3mg GA/g，而黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物為14.1mg GA/g。在黃酮類化合物含量的部分，以黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物中含量較高，為4.64mg Rutin/g，而黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物中為1.97mg GA/g。結(jié)果顯示，不論是黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物或黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃 取物，皆含有多酚類化合物和黃酮類物質(zhì)，皆具有作為抗氧化劑的潛力。

四、黑柄炭角菌菌絲體萃取物抗氧化能力

本試驗(yàn)進(jìn)一步分析黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物和黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物的抗氧化活性，使用DPPH自由基的清除能力、抑制脂質(zhì)氧化和還原力的活性三種方法進(jìn)行分析。

1.黑柄炭角菌菌絲體萃取物DPPH自由基清除能力測定

DPPH(α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl)為一種十分安定的自由基，在抗氧化物質(zhì)的抗氧化活性的研究上，常使用DPPH來評估抗氧化物質(zhì)的供氫能力。DPPH/乙醇溶液為藍(lán)紫色，在波長517nm下有較強(qiáng)的吸光值，當(dāng)DPPH被抗氧化劑還原或與另一個(gè)自由基結(jié)合時(shí)，在波長517nm的吸光值會(huì)降低，故吸光值越低代表樣品對DPPH自由基的清除能力越好，提供氫質(zhì)子能力越強(qiáng)，亦即DPPH自由基清除活性較高，則抗氧化物質(zhì)的抗氧化活性較強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)上分別取100μL不同濃度的黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物、黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物和Trolox樣品，加入400μL濃度為100mM的Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)，再加入500μL濃度為250μM的DPPH/乙醇溶液，震蕩20秒后在暗室靜置20分鐘，測定樣品在波長517nm下吸光值，并將同一樣品在不同濃度下對自由基清除率作圖，DPPH自由基清除能力的計(jì)算公式如下：

求得受測物清除50％DPPH自由基時(shí)所需的濃度即為DPPH EC₅₀。其中Trolox為水溶性維生素E，已知其具有抗氧化活性，故在本試驗(yàn)例中以Trolox作為正控制組。

請參照下表一，為黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物和黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物的DPPH自由基清除能力(DPPH EC₅₀)。

表一

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正控制組Trolox的EC₅₀為0.35±0.10mg/mL，而黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物的DPPH自由基清除能力的EC₅₀為11.32±0.33mg/mL，黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物的DPPH自由基清除能力的EC₅₀為20.43±0.65mg/mL。顯示不論是黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物或黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物皆具有DPPH自由基清除能力，但黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物的DPPH自由基清除能力優(yōu)選。

2.黑柄炭角菌菌絲體萃取物抑制脂質(zhì)氧化能力測定

本試驗(yàn)例是以測定脂質(zhì)過氧化作用中的終產(chǎn)物丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的產(chǎn)量，作為測量脂質(zhì)過氧化作用的指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)上利用氯仿、甲醇與卵磷脂作用所形成微脂粒(liposome)來模擬體內(nèi)細(xì)胞膜的系統(tǒng)，并在此系統(tǒng)中，以維生素C將Fe³⁺還原成Fe²⁺，F(xiàn)e²⁺再將微粒脂的脂質(zhì)氧化。脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物MDA會(huì)與硫代巴比妥酸(Thiobarituric acid,TBA)在酸性與高溫反應(yīng)下生成粉紅色復(fù)合物TBARS(thiobarbituric acid reactive substances)，TBARS在波長535nm下具有強(qiáng)烈吸光值。故通過吸光值推算TBARS生成量以定量MDA濃度，吸光值越高，表示MDA產(chǎn)物越多。在此狀態(tài)下脂質(zhì)容易被氧化，因此若樣品可降低此系統(tǒng)的吸光值，則表示其具有抑制脂質(zhì)過氧化的作用。

實(shí)驗(yàn)上取1公克的卵磷脂加入6ml氯仿及4ml甲醇混勻，將上述卵磷脂混合液置入圓底燒瓶以氮?dú)獯蹈桑尤隤BS(Phosphate buffered saline，磷酸鹽緩沖生理鹽水)洗出微脂粒，即為微脂粒溶液，置于4℃?zhèn)溆?。依序加?00μL的微脂粒溶液、165μL的PBS、15μL濃度為25mM的FeCl₃溶液與15μL濃度為25mM的維生素C(ascorbic acid)溶液以及15μL的黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物 或黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物樣品。將上述反應(yīng)液在37℃干浴1小時(shí)后，取200μL反應(yīng)液，加入60μL濃度為0.2％的丁基化羥基甲苯(Butylated Hydroxytoluene,BHT)溶液及400μL濃度為0.4％的TBA溶液，在100℃加熱20分鐘后，立即中止反應(yīng)。以等體積的正丁醇(n-butanol)萃取，再以3000rpm離心5分鐘，取上清液在波長535nm下讀取吸光值，若樣品能使OD₅₃₅吸光值降低，表示樣品具有抑制脂質(zhì)過氧化的能力。并將同一樣品在不同濃度下對脂質(zhì)過氧化抑制率作圖，抑制脂質(zhì)氧化能力的計(jì)算公式如下：

求得受測物抑制50％脂質(zhì)氧化時(shí)所需的濃度即為Liposome IC₅₀。

請參照下表二，為黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物和黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物的抑制脂質(zhì)氧化活性。

表二

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物的抑制脂質(zhì)氧化測定的IC50為10.8±0.4mg/mL，黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物的抑制脂質(zhì)氧化測定的IC50為43.5±0.9mg/mL。顯示不論是黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物或黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物皆具有抑制脂質(zhì)氧化活性，但黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物的抑制脂質(zhì)氧化活性優(yōu)選。

3.黑柄炭角菌菌絲體萃取物的還原力測定

對于還原力的分析，是以普魯士藍(lán)[Fe₄(Fe(CN)₆)₃]的生成量作為指標(biāo)。抗氧化劑會(huì)將赤血鹽[K₃Fe(CN)₆]還原成黃血鹽[K₄Fe(CN)₆]，黃血鹽再與Fe³⁺作用，形成普魯士藍(lán)，可以在波長700nm測定吸光值，以檢測普魯士藍(lán)的生成 量，作為抗氧化劑的還原力，吸光值越高，表示抗氧化劑的還原力越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)上分別取0.25mL黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物和黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物樣品，加入等體積濃度為0.2M的磷酸鈉緩沖液及濃度為1％的鐵氰化鉀溶液混合均勻，在50℃水浴加熱20分鐘后，冰浴冷卻，再加入0.25mL濃度為10％的三氯乙酸溶液混合，以離心力4500xg離心10分鐘。取0.5mL上清液，加入0.5mL去離子水及0.1mL濃度為0.1％的氯化鐵溶液反應(yīng)，靜置10分鐘后，在波長700nm下測定吸光值。吸光值越高，表示樣品還原力越強(qiáng)。最后數(shù)據(jù)以O(shè)D₇₀₀為0.5時(shí)所需的樣品濃度作為樣品的還原力能力依據(jù)，所需濃度越低表示樣品的還原力越強(qiáng)。而在本試驗(yàn)例中以維生素C作為正控制組。

請參照下表三，為黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物和黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物的還原力能力。

表三

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在還原力測定時(shí)，正控制組維生素C在OD₇₀₀達(dá)0.5時(shí)，其濃度為0.03±0.01mg/mL，黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物在OD₇₀₀達(dá)0.5時(shí)，其濃度為2.02±0.01mg/mL，而黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物在OD₇₀₀達(dá)0.5時(shí)其濃度為10.45±1.17mg/mL。顯示不論是黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物或黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物皆具有還原力活性，但黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物的還原力活性優(yōu)選。

由上所述，經(jīng)本發(fā)明所揭露黑柄炭角菌菌絲體的制備方法，以人工發(fā)酵培養(yǎng)黑柄炭角菌菌絲體，使黑柄炭角菌菌絲體的生產(chǎn)可后續(xù)進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化的生產(chǎn)，而生產(chǎn)工藝過程因?yàn)榭煽刂?，使所制備出的黑柄炭角菌菌絲體品質(zhì)穩(wěn)定，另因培養(yǎng)時(shí)間較短，可解決天然黑柄炭角菌產(chǎn)量不足和品質(zhì)不穩(wěn)定 的問題。而本發(fā)明所揭露黑柄炭角菌菌絲體萃取物的制備方法所制得的黑柄炭角菌菌絲體萃取物，含有大量的總多酚化合物和黃酮類化合物，并在抗氧化活性分析結(jié)果顯示，其具有清除DPPH自由基能力及抑制脂質(zhì)氧化等抗氧化活性。故本發(fā)明的黑柄炭角菌菌絲體萃取物可用于抗氧化目的的醫(yī)藥組合物、化妝品組合物、飼料組合物、飲料組合物、營養(yǎng)補(bǔ)充組合物、食用組合物以及保健食用組合物上，具有運(yùn)用于生醫(yī)保健市場的潛能。

雖然本發(fā)明已經(jīng)以實(shí)施方式公開如上，然其并非用以限定本發(fā)明，任何本領(lǐng)域技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，當(dāng)可作各種變動(dòng)與潤飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)視權(quán)利要求所界定者為準(zhǔn)。