本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種穩(wěn)定表達(dá)H1N1流感病毒RNPs的Hela細(xì)胞株的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

流感病毒屬于正粘病毒科的單股、負(fù)鏈RNA包膜病毒,可分為甲(A)、乙(B)、丙(C)三型。流感病毒亞型眾多，且不斷發(fā)生變異，使經(jīng)典的抗流感病毒藥物容易產(chǎn)生耐藥和交叉耐藥性,像2013年H7N9流感病毒對金剛烷胺產(chǎn)生耐藥就是由該病毒M2蛋白氨基酸殘基S31N變異所致；而且對于重癥流感患者幾乎無有效藥物。目前，已上市的抗流感病毒藥物主要包括M2離子通道阻斷劑和病毒神經(jīng)氨酸抑制劑(NAI)兩類。然而隨著流感病毒的不斷進(jìn)化,相應(yīng)基因序列發(fā)生突變,導(dǎo)致其對藥物產(chǎn)生耐藥、交叉耐藥，是流感治療的主要難題。因此迫切開發(fā)出更高效、特異性的抗流感病毒新藥物。

甲型流感病毒的核糖核蛋白(RNP)由病毒RNA、RNA聚合酶(RdRp)復(fù)合體以及核蛋白(NP)組成，是病毒的最小復(fù)制單位,病毒蛋白在該結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上才能表達(dá)。vRNPs結(jié)構(gòu)中的RdRp由3個(gè)亞基(PA、PB2、PB1)組成，PB1位于三聚體的核心，其N末端和C末端分別與PA亞基的C末端以及PB2亞基的N末端通過非共價(jià)鍵(如疏水作用、氫鍵、范德華力等)形成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)復(fù)合物。vRNPs在流感病毒的生命周期中發(fā)揮著重要作用,且三聚體中不同亞基相互作用區(qū)域具有很高的保守性，隨著對流感病毒RNP結(jié)構(gòu)和功能的深入研究，發(fā)現(xiàn)流感病毒RNP結(jié)構(gòu)中的RdRp三聚體相互作用區(qū)域是極具潛力的抗流感病毒藥物新靶標(biāo)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種穩(wěn)定表達(dá)H1N1流感病毒RNPs的Hela細(xì)胞株的構(gòu)建方法，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)不存在以RdRp三聚體相互作用區(qū)域?yàn)榘悬c(diǎn)研究抗病毒藥物的Hela-RNP細(xì)胞株的問題。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種穩(wěn)定表達(dá)H1N1流感病毒RNPs的Hela細(xì)胞株的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

分別設(shè)計(jì)H1N1流感病毒核糖核蛋白R(shí)NPs的擴(kuò)增引物，PCR擴(kuò)增目的片段PB1、PB2、PA和NP，構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1/Zeo-PB1、pcDNA3.1/Hygro-PB2、pcDNA3.1/Neo-PA、pEF6/V5-HisA-NP；

提供Hela細(xì)胞，分別使用四種抗生素Zeocin、Hygromycin B、Geneticin、Blasticidin S HCl感染所述Hela細(xì)胞，獲取所述四種抗生素Zeocin、Hygromycin B、Geneticin、Blasticidin S HCl的最佳篩選濃度；

提供Hela細(xì)胞，將所述重組質(zhì)粒pcDNA3.1/Zeo-PB1、pcDNA3.1/Hygro-PB2、pcDNA3.1/Neo-PA、pEF6/V5-HisA-NP分次轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)H1N1流感病毒RNPs的Hela細(xì)胞株。本研究將重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1/Zeo-PB1、pcDNA3.1/Hygro-PB2、pcDNA3.1/Neo-PA、pEF6/V5-HisA-NP分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白為指示蛋白，建立穩(wěn)定表達(dá)H1N1流感病毒RNP的Hela細(xì)胞株,為以RdRp三聚體間相互作用區(qū)域?yàn)榘悬c(diǎn)的抗流感病毒藥物的篩選研究提供了細(xì)胞模型。

本發(fā)明提供的穩(wěn)定表達(dá)H1N1流感病毒RNPs的Hela細(xì)胞株的構(gòu)建方法，使用重組質(zhì)粒pcDNA3.1/Zeo-PB1、pcDNA3.1/Hygro-PB2、pcDNA3.1/Neo-PA、pEF6/V5-HisA-NP分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，建立穩(wěn)定表達(dá)H1N1流感病毒RNPs的Hela細(xì)胞株,為以RdRp三聚體間相互作用區(qū)域?yàn)榘悬c(diǎn)的抗流感病毒藥物的篩選研究提供了細(xì)胞模型。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的將所述PCR擴(kuò)增的目的片段PB1、PB2、PA和NP進(jìn)行1％瓊脂凝膠電泳圖；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的對所述重組質(zhì)粒pcDNA3.1/Zeo-PB1、pcDNA3.1/Hygro-PB2、pcDNA3.1/Neo-PA、pEF6/V5-HisA-NP進(jìn)行PCR擴(kuò)增后測序得到的1％瓊脂凝膠電泳圖；

圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的所述四種抗生素Zeocin、Hygromycin B、Geneticin、Blasticidin S HCl感染所述Hela細(xì)胞的死亡曲線圖；

圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的Hela-RNP細(xì)胞株的RT-PCR擴(kuò)增PB1、PB2基因片段1％瓊脂凝膠電泳圖；

圖5是本發(fā)明實(shí)施例提供的Hela-RNP細(xì)胞株的RT-PCR擴(kuò)增PA、NP基因片段1％瓊脂凝膠電泳圖；

圖6是本發(fā)明實(shí)施例提供的POL I系統(tǒng)轉(zhuǎn)染Hela-RNP細(xì)胞株48h的綠色熒光蛋白表達(dá)(×100)的熒光圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明要解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

本發(fā)明實(shí)施例提供了一種穩(wěn)定表達(dá)H1N1流感病毒RNPs的Hela細(xì)胞株的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

S01.分別設(shè)計(jì)H1N1流感病毒核糖核蛋白R(shí)NPs的擴(kuò)增引物，PCR擴(kuò)增目的片段PB1、PB2、PA和NP，構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1/Zeo-PB1、pcDNA3.1/Hygro-PB2、pcDNA3.1/Neo-PA、pEF6/V5-HisA-NP；

S02.提供Hela細(xì)胞，分別使用四種抗生素Zeocin、Hygromycin B、Geneticin、Blasticidin S HCl感染所述Hela細(xì)胞，獲取所述四種抗生素Zeocin、Hygromycin B、Geneticin、Blasticidin S HCl的最佳篩選濃度；

S03.提供Hela細(xì)胞，將所述重組質(zhì)粒pcDNA3.1/Zeo-PB1、pcDNA3.1/Hygro-PB2、pcDNA3.1/Neo-PA、pEF6/V5-HisA-NP分次轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)H1N1流感病毒RNPs的Hela細(xì)胞株，即Hela-RNP細(xì)胞株。

具體的，上述步驟S01中，分別設(shè)計(jì)H1N1流感病毒核糖核蛋白R(shí)NPs的擴(kuò)增引物、PCR擴(kuò)增目的片段PB1、PB2、PA和NP的方法，其中，H1N1流感病毒核糖核蛋白R(shí)NPs的擴(kuò)增引物可以包括所有能實(shí)現(xiàn)目的片段PB1、PB2、PA和NP擴(kuò)增的擴(kuò)增引物。作為優(yōu)選實(shí)施例，根據(jù)Genbank中H1N1分離株A/Puerto Rico/8/34的PB1、PB2、PA、NP基因序列以及pcDNA3.1/Zeo(+)、pcDNA3.1/Hygro(+)、pcDNA3.1/Neo(+)、pEF6/V5-His A質(zhì)粒載體序列，所述H1N1流感病毒核糖核蛋白R(shí)NPs的擴(kuò)增引物分別設(shè)計(jì)為下表1所示，其中F表示上游引物，R表示下游引物。由此獲得的引物，具有更好的PCR跨增效率。

表1

進(jìn)一步的，所述H1N1流感病毒核糖核蛋白R(shí)NPs的擴(kuò)增引物的酶切位點(diǎn)分別為上表1所述H1N1流感病毒核糖核蛋白R(shí)NPs的擴(kuò)增引物的下劃線序列取，具體為：

PB1上游引物酶切位點(diǎn)：5’AAGCTT3’；

PB1下游引物酶切位點(diǎn)：5’GCGGCCGC3’；

PB2上游引物酶切位點(diǎn)：5’GGATCC3’；

PB2下游引物酶切位點(diǎn)：5’GCGGCCGC3’；

PA上游引物酶切位點(diǎn)：5’GGATCC3’；

PA下游引物酶切位點(diǎn)：5’GCGGCCGC3’；

NP上游引物酶切位點(diǎn)：5’GAATTC3’；

NP下游引物酶切位點(diǎn)：5’GCGGCCGC3’。

作為優(yōu)選實(shí)施例，所述PCR擴(kuò)增的方法為：

94℃,5min 1個(gè)循環(huán)；

94℃,0.5min；57℃，0.5min；72℃,2.5min 30個(gè)循環(huán)；

72℃,2min 1個(gè)循環(huán)。

該優(yōu)選的PCR擴(kuò)增的方法，有效地保證了所述重組質(zhì)粒pcDNA3.1/Zeo-PB1、pcDNA3.1/Hygro-PB2、pcDNA3.1/Neo-PA、pEF6/V5-HisA-NP序列的正確性。

進(jìn)一步的，可以對上述步驟S01中，所述PCR擴(kuò)增目的片段PB1、PB2、PA和NP的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。所述驗(yàn)證可采用凝膠電泳的方式實(shí)現(xiàn)，具體的，將所述PCR擴(kuò)增的目的片段PB1、PB2、PA和NP進(jìn)行1％瓊脂凝膠電泳，結(jié)果如圖1所示。由圖1可見，1％瓊脂凝膠電泳結(jié)果在1000bp-2500bp間均有明亮的條帶，這與所述PB1、PB2、PA、NP基因片段大小一致。由此可知，所述PCR擴(kuò)增目的片段PB1、PB2、PA和NP具有很高的正確性。

更進(jìn)一步地，可以對構(gòu)建的所述重組質(zhì)粒pcDNA3.1/Zeo-PB1、pcDNA3.1/Hygro-PB2、pcDNA3.1/Neo-PA、pEF6/V5-HisA-NP進(jìn)行PCR擴(kuò)增后測序鑒定，測序結(jié)果如圖2所示。由圖2可見，PA、PB1、PB2、NP序列完全正確，說明pcDNA3.1/Neo-PA、pcDNA3.1/Zeo-PB1、pcDNA3.1/Hygro-PB2、pEF6/V5-HisA-NP四種表達(dá)載體構(gòu)建成功。由此，說明了本發(fā)明實(shí)施例提供的重組質(zhì)粒pcDNA3.1/Zeo-PB1、pcDNA3.1/Hygro-PB2、pcDNA3.1/Neo-PA、 pEF6/V5-HisA-NP構(gòu)建方法的準(zhǔn)確性。

上述步驟S02中，提供Hela細(xì)胞。所述Hela細(xì)胞可以采用下述方法培養(yǎng)獲得：用含體積分?jǐn)?shù)為10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％的CO₂條件下培養(yǎng)。

本發(fā)明實(shí)施例中，使用四種抗生素Zeocin、Hygromycin B、Geneticin、Blasticidin S HCl感染所述Hela細(xì)胞的方法具體可為：使用一種所述抗生素感染Hela細(xì)胞后，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，生長液將細(xì)胞濃度稀釋為8000cell/ml，每個(gè)六孔板加100ul細(xì)胞稀釋液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，更換為含有不同濃度梯度抗生素的生長液，培養(yǎng)12天，每3-4天更換一次含抗生素的生長液。第12天時(shí)，用終濃度為0.04％臺(tái)盼藍(lán)對細(xì)胞進(jìn)行染色，死細(xì)胞被染成藍(lán)色，活細(xì)胞不被染色，計(jì)算含不同濃度梯度抗生素的六孔板中單克隆細(xì)胞存活率，繪制細(xì)胞死亡曲線。將添加低濃度抗生素的六孔板中生長良好的Hela細(xì)胞消化下來進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),進(jìn)行下一種抗生素的最小致死濃度實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明實(shí)施例所述四種抗生素Zeocin、Hygromycin B、Geneticin、Blasticidin S HCl感染所述Hela細(xì)胞的死亡曲線如圖3所示。有圖可見，所述Zeocin(圖A)、Hygromycin B(圖B)、Geneticin(G418)(圖C)、Blasticidin S HCl(圖D)的最佳篩選濃度分別為：150ug/ml、300ug/ml、750ug/ml、2ug/ml。

作為優(yōu)選實(shí)施例，使用四種抗生素Zeocin、Hygromycin B、Geneticin、Blasticidin S HCl感染所述Hela細(xì)胞的步驟中，感染順序依次為Zeocin、Hygromycin B、Geneticin和Blasticidin S HCl。上述優(yōu)選感染順序，可以篩選獲得更為穩(wěn)定的感染細(xì)胞。

上述步驟S03中，提供Hela細(xì)胞，作為一種具體實(shí)施例，所述Hela細(xì)胞可以采用下述方法培養(yǎng)獲得：將細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的Hela細(xì)胞用胰酶消化傳代，按每孔約1×10⁶細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，至細(xì)胞匯合率約90％時(shí)(18-24小時(shí))，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS清洗2遍，每孔加入2ml Opti-MEM I培養(yǎng)液。

作為具體實(shí)施例，將所述重組質(zhì)粒pcDNA3.1/Zeo-PB1、 pcDNA3.1/Hygro-PB2、pcDNA3.1/Neo-PA、pEF6/V5-HisA-NP分次轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞的方法可為(本發(fā)明實(shí)施例設(shè)置有實(shí)驗(yàn)組和對照組，所述對照組采用正常Hela細(xì)胞)：據(jù)Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染所述Hela細(xì)胞；轉(zhuǎn)染完6h后更換含血清的DMEM完全培養(yǎng)基；轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，每孔細(xì)胞按1：12傳代；傳代24h后添加含有相應(yīng)最佳篩選濃度抗生素的完全培養(yǎng)基進(jìn)行篩選；2-3天更換一次培養(yǎng)液，當(dāng)對照組(正常Hela細(xì)胞)大量細(xì)胞死亡時(shí)，抗生素濃度減半進(jìn)行篩選；經(jīng)過12天培養(yǎng)后，少量細(xì)胞克隆產(chǎn)生,采用無限稀釋法篩選含有相應(yīng)抗生素抗性的細(xì)胞克隆。擴(kuò)增培養(yǎng)后,一部分細(xì)胞用液氮保存，其余細(xì)胞繼續(xù)實(shí)驗(yàn)，待細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)，再進(jìn)行第二個(gè)重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的篩選。

作為優(yōu)選實(shí)施例，將所述重組質(zhì)粒pcDNA3.1/Zeo-PB1、pcDNA3.1/Hygro-PB2、pcDNA3.1/Neo-PA、pEF6/V5-HisA-NP分次轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞的步驟中，轉(zhuǎn)染順序依次為pcDNA3.1/Zeo-PB1、pcDNA3.1/Hygro-PB2、pcDNA3.1/Neo-PA、pEF6/V5-HisA-NP。上述優(yōu)選轉(zhuǎn)染順序，可以篩選獲得更為穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

本發(fā)明實(shí)施例可以通過RT-PCR鑒定RNP基因片段是否穩(wěn)定整合在宿主基因組中，具體方法為：根據(jù)RNeasy Mini kit試劑盒(Qiagen)說明提取Hela-RNP細(xì)胞株以及正常未處理Hela細(xì)胞(對照)的總RNA，核酸檢測儀測得總RNA濃度分別為590ng/ul、538ng/ul。分別取1.5ul的總RNA進(jìn)行RT-PCR。所述RT-PCR的方法為：

50℃,30min 1個(gè)循環(huán)；

94℃,2min 1個(gè)循環(huán)；

94℃,0.5min；57℃，0.5min；72℃,2.5min 30個(gè)循環(huán)；

72℃,2min 1個(gè)循環(huán)。

對所述RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行核酸電泳分析，結(jié)果如圖4、圖5所示。圖4、5顯示成功擴(kuò)增出PB1、PB2、PA、NP基因片段，表明重組質(zhì)粒pcDNA3.1/Neo-PA、pcDNA3.1/Zeo-PB1、pcDNA3.1/Hygro-PB2、pEF6/V5-HisA-NP已經(jīng)穩(wěn)定整合在 Hela細(xì)胞基因組中。

進(jìn)一步的，還包括對獲得穩(wěn)定表達(dá)H1N1流感病毒RNPs的Hela細(xì)胞株是否獲得功能性表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證，所述驗(yàn)證采用含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因的POL I系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。所述POL I系統(tǒng)(pBluescript II sk(+)-t_I-EGFP-P_Ih)含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因，作為鑒定Hela細(xì)胞內(nèi)RNP是否獲得功能性表達(dá)的報(bào)告系統(tǒng)。該系統(tǒng)只有在流感病毒結(jié)構(gòu)完整的RNP協(xié)同作用下可表達(dá)綠色熒光蛋白，因此可作為RNP是否在Hela細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)的篩選系統(tǒng)。將POL I系統(tǒng)轉(zhuǎn)染Hela-RNP細(xì)胞株，同時(shí)分別將pEGFP-N1和pBluescript II sk(+)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela-RNP細(xì)胞株作為陽性和陰性對照。另外將POL I系統(tǒng)轉(zhuǎn)染正常Hela細(xì)胞也作為陰性對照。轉(zhuǎn)染24h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。本發(fā)明實(shí)施例POL I系統(tǒng)轉(zhuǎn)染Hela-RNP細(xì)胞株24h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察。由圖6可知，部分細(xì)胞可見綠色熒光，轉(zhuǎn)染48h后熒光最強(qiáng)，如圖6所示(其中A、B、C、D分別表示(pBluescript II sk(+)-t_I-EGFP-P_Ih)、pEGFP-N1、pBluescript II sk(+)、Hela cells were transfected with POL I system(pBluescript II sk(+)-t_I-EGFP-P_Ih)的轉(zhuǎn)染48h后表達(dá)結(jié)果圖),轉(zhuǎn)染72h后熒光開始變?nèi)酢OL I系統(tǒng)轉(zhuǎn)染進(jìn)入正常Hela細(xì)胞后未見明顯熒光出現(xiàn)，說明RNP在Hela細(xì)胞中得到表達(dá)，并具有流感病毒RNP活性功能。

本發(fā)明實(shí)施例提供的穩(wěn)定表達(dá)H1N1流感病毒RNPs的Hela細(xì)胞株的構(gòu)建方法，使用重組質(zhì)粒pcDNA3.1/Zeo-PB1、pcDNA3.1/Hygro-PB2、pcDNA3.1/Neo-PA、pEF6/V5-HisA-NP分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，建立穩(wěn)定表達(dá)H1N1流感病毒RNPs的Hela細(xì)胞株,為以RdRp三聚體間相互作用區(qū)域?yàn)榘悬c(diǎn)的抗流感病毒藥物的篩選研究提供了細(xì)胞模型。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。