本發(fā)明屬于生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高丁醇發(fā)酵總?cè)軇┊a(chǎn)量的方法。

背景技術(shù)：

隨著汽油和化石燃料存儲(chǔ)的消耗，生物丁醇作為一種新的可再生資源越來越受到人們的關(guān)注。丁醇的熱值、辛烷值與汽油相當(dāng)，蒸汽壓低，可與汽油任意比混溶，使用安全性能高；不會(huì)腐蝕管道、不易吸水、便于管道運(yùn)輸，是一種非常理想的能源替代品。此外，丁醇也是一種重要的化工原料，廣泛用于各種塑料和橡膠制品的制造和丁醛、丁酸、丁胺和乳酸丁酯等化學(xué)品的合成。近年來，隨著下游產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，丁醇的市場需求直線上升，2011年我國丁醇的進(jìn)口量在49萬噸左右，成為世界最大的丁醇進(jìn)口國。

現(xiàn)階段，微生物發(fā)酵生產(chǎn)丁醇作為重要的生物轉(zhuǎn)化技術(shù)極具發(fā)展和產(chǎn)業(yè)化的潛力。微生物發(fā)酵生產(chǎn)工藝主要包括批次發(fā)酵工藝，連續(xù)發(fā)酵工藝及批次補(bǔ)料發(fā)酵工藝。其中，批次補(bǔ)料發(fā)酵工藝是指在微生物批次發(fā)酵過程中，以某種方式向發(fā)酵系統(tǒng)中補(bǔ)加一定物料，但并不連續(xù)地向外放出發(fā)酵液的發(fā)酵技術(shù)，發(fā)酵液的體積隨時(shí)間逐漸增加，是介于批次發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵之間的一種發(fā)酵技術(shù)。

目前提到的丁醇發(fā)酵批次補(bǔ)料工藝中，發(fā)酵培養(yǎng)基的補(bǔ)加均采用恒流速補(bǔ)加方式或者多批次直接補(bǔ)加方式，無法最大限度滿足菌種生長發(fā)酵的需要，發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量受到一定的限制。

CN200510122181.6公開了一種補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)D-核糖的方法，在發(fā)酵培養(yǎng)期間采用間歇遞減流加方式和間歇定量流加的方式流加葡萄糖補(bǔ)料液和硫酸銨補(bǔ)料液，其中葡萄糖補(bǔ)料是在發(fā)酵培養(yǎng)進(jìn)行到25-45小時(shí)時(shí)開始采用間歇遞減流加方式，每隔5小時(shí)流加濃度為400-1000g/L的葡萄糖補(bǔ)料液，共流加3次，每次分別為50mL、40mL和30mL， 硫酸銨補(bǔ)料是在發(fā)酵培養(yǎng)進(jìn)行到30-40小時(shí)，在葡萄糖補(bǔ)料的同時(shí)，采用間歇定量流加的方式，開始每隔5小時(shí)流加濃度為200-300g/L的硫酸銨補(bǔ)料液，共流加 2次，每次流加12mL補(bǔ)料液，最終得到D-核糖產(chǎn)物。該方法采用補(bǔ)料法發(fā)酵生產(chǎn)D-核糖，發(fā)酵結(jié)束時(shí)葡萄糖基本被耗盡，與不補(bǔ)料相比，D-核糖產(chǎn)量提高了95.9%。

CN200810162759.4公開了一種補(bǔ)料發(fā)酵法生產(chǎn)輔酶Q10，采用紅色酵母菌HY-05用于發(fā)酵生長輔酶Q10，從發(fā)酵第24h開始，在減速流加蔗糖的同時(shí)以7.5mL/(L·h)的速度流加玉米漿，CoQ₁₀的積累可達(dá)到最大為156.2mg/L，與不補(bǔ)料相比產(chǎn)量提高了58.1%。采用補(bǔ)料分批發(fā)酵方式不僅可減少底物的反饋抑制，而且可增大發(fā)酵過程中的溶氧，進(jìn)一步提高CoQ₁₀的合成量。

Xue等（Xue C, Zhao J B, Lu C C, et al. BioetchBioeng, 2012, 109, 2746-2756.）。將批次補(bǔ)料的工藝方法應(yīng)用在在丁醇發(fā)酵中，從而得到了相對(duì)于分批發(fā)酵更高的丁醇產(chǎn)量和產(chǎn)率。

上述批次補(bǔ)料工藝都是根據(jù)不同發(fā)酵菌株、發(fā)酵底物和發(fā)酵產(chǎn)物的特性研究出的相關(guān)補(bǔ)料工藝過程，在用于丁醇發(fā)酵時(shí)，總?cè)軇┊a(chǎn)量提高并不顯著。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種提高丁醇發(fā)酵總?cè)軇┊a(chǎn)量的方法。本發(fā)明在丁醇發(fā)酵菌的生長對(duì)數(shù)期，通過勻減速補(bǔ)加高pH值培養(yǎng)基的方式，促進(jìn)菌種的二次生長，延長了產(chǎn)酸期的時(shí)間，在碳源用量相同的條件下，提高了發(fā)酵周期內(nèi)溶劑的產(chǎn)率，增加了發(fā)酵的總?cè)軇┊a(chǎn)量。

為了達(dá)到上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案。

一種提高丁醇發(fā)酵總?cè)軇┊a(chǎn)量的方法，包括以下步驟：

（1）將丁醇發(fā)酵菌的孢子液接種到RCM培養(yǎng)基中，得到發(fā)酵菌種子液；

（2）制備P2發(fā)酵培養(yǎng)基，其中初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的總糖濃度為30-60g/L，pH自然；補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基中的總糖濃度為70-100g/L，pH為7.0-9.0；

（3）在發(fā)酵罐中，預(yù)先裝入1/4-1/2發(fā)酵罐有效體積（可加入發(fā)酵培養(yǎng)基的總體積，V）的初始發(fā)酵培養(yǎng)基，按照體積比2%-5%的接種量接入發(fā)酵菌種子液，當(dāng)發(fā)酵菌生長至對(duì)數(shù)期，按照流加時(shí)間16-24h勻減速流加3/4-1/2發(fā)酵罐有效體積（V）的補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基，流加結(jié)束后繼續(xù)發(fā)酵60-72h。

本發(fā)明步驟（1）所述的丁醇發(fā)酵菌為丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum)或拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii），優(yōu)選丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) ATCC 824，購于美國模式菌種收集中心；或者采用CN201410731297.9所述的拜氏梭菌CM20，其分類命名為拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii），已于2014年06月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.9354。本發(fā)明提供的拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）CM20菌株，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所；保藏編號(hào)：CGMCC No. 9354；保藏日期： 2014年06月17日。本發(fā)明優(yōu)選使用拜氏梭菌CM20，該菌株由于自身的特異性，在該發(fā)酵體系中適應(yīng)性更好，總?cè)軇┊a(chǎn)量更高。

本發(fā)明步驟（1）所述的RCM培養(yǎng)基的具體配方，以g/L計(jì)為：蛋白胨10，牛肉粉10，酵母粉 3.0，葡萄糖5，可溶性淀粉 1.0，氯化鈉5.0，醋酸鈉 3.0，L-半胱氨酸鹽酸鹽 0.5，瓊脂 0.5，以純水配置，115℃滅菌20min。

本發(fā)明步驟（1）所述的發(fā)酵菌種子液是在RCM培養(yǎng)基中接入丁醇發(fā)酵菌的孢子液，厭氧環(huán)境下于36-38℃下培養(yǎng)16-24h獲得的。

本發(fā)明步驟（2）所述的P2培養(yǎng)基為本領(lǐng)域人員所熟知的用于丁醇發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方以g/L計(jì)為：總糖60-80，酵母1.0，CH₃COONH₄ 2.2，KH₂PO₄ 0.5，K₂HPO₄ 0.5，MnSO₄ 0.01，NaCl 0.01，MgSO₄?7H₂O 0.2，F(xiàn)eSO₄ 0.01，對(duì)氨基苯甲酸 0.001，維生素B1 0.001，生物素0.001e-3。

本發(fā)明步驟（2）所述的糖可以為葡萄糖、蔗糖、木糖等中的一種或幾種，也可以使用纖維素、半纖維素等的水解糖液，優(yōu)選葡萄糖或含葡萄糖的水解糖液。

本發(fā)明步驟（2）所述的發(fā)酵培養(yǎng)基制備好后，初始發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為自然，通常為6.0左右；補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為7.0-9.0，優(yōu)選為7.0-8.0。調(diào)節(jié)pH可以采用無機(jī)堿或有機(jī)堿調(diào)節(jié)pH，如無機(jī)堿可以采用氫氧化鈉等，優(yōu)選采用有機(jī)堿三羥甲基氨基甲烷（Tris），不僅能夠調(diào)節(jié)pH，而且有助于增強(qiáng)發(fā)酵體系的緩沖能力，有助于延長產(chǎn)酸期的時(shí)間，提高糖轉(zhuǎn)化率。

本發(fā)明步驟（3）所述的初始發(fā)酵液在攪拌條件下，36-38℃厭氧培養(yǎng)18-24h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期。本發(fā)明首先根據(jù)加入的補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基體積（1/4V-1/2V）以及補(bǔ)料所需流加時(shí)間（16-24h），確定培養(yǎng)基流加的加速度k，然后根據(jù)流速v=v₀-kt的方式設(shè)定泵的流加速度，使其以勻減速方式流加，其中v₀為初始流加速度，t為流加時(shí)間，流加完畢后，繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵60-72h結(jié)束。發(fā)酵過程中攪拌轉(zhuǎn)速為100-200rpm。

本發(fā)明步驟（3）的發(fā)酵過程中，發(fā)酵培養(yǎng)基中總糖的投放量不因批次補(bǔ)料的工藝的不同而產(chǎn)生變化，即使初始發(fā)酵培養(yǎng)基和補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基的體積及糖濃度不同，但是總糖量為固定量，優(yōu)選為60V-80V(g)，也就是說在總糖量相同的條件下進(jìn)行發(fā)酵過程的調(diào)控，從而可以增加了發(fā)酵的總?cè)軇┊a(chǎn)量。

本發(fā)明在丁醇發(fā)酵菌的生長對(duì)數(shù)期，通過勻減速一次性補(bǔ)加高pH值培養(yǎng)基的方式，最大限度地滿足菌種生長發(fā)酵的需要，從而更好地解決了批次發(fā)酵中發(fā)酵底物抑制及菌種代謝產(chǎn)物阻遏等問題，促進(jìn)菌種的二次生長，延長了產(chǎn)酸期的時(shí)間，在總糖量相同的條件下，提高了糖轉(zhuǎn)化率，顯著增加了發(fā)酵的總?cè)軇┊a(chǎn)量。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，通常丁醇發(fā)酵中溶劑生成比例為：丁醇:丙酮:乙醇=6:3:1，經(jīng)本發(fā)明處理后，在提升丁醇和丙酮產(chǎn)量的同時(shí)，大大提高了乙醇的產(chǎn)量，乙醇與丙酮的比例從1:3提高為接近1:1。本發(fā)明方法提高了發(fā)酵周期內(nèi)總?cè)軇┊a(chǎn)量，降低了發(fā)酵工藝的成本。

生物材料保藏說明

本發(fā)明提供的拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）CM20菌株，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所；保藏編號(hào)：CGMCC No. 9354；保藏日期： 2014年06月17日。

具體實(shí)施方式

以下參照具體的實(shí)施例來說明本發(fā)明。實(shí)施例中所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

以下各實(shí)施例中的RCM培養(yǎng)基（g/L）組成如下：蛋白胨10，牛肉粉10，酵母粉 3.0，葡萄糖 5，可溶性淀粉 1.0，氯化鈉5.0，醋酸鈉 3.0，L-半胱氨酸鹽酸鹽 0.5，瓊脂 0.5，以純水配置，115℃滅菌20min。

以下各實(shí)施例中所采用的P2發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）組成如下：總糖（根據(jù)不同實(shí)施例具體確定），酵母1.0，CH₃COONH₄ 2.2，KH₂PO₄ 0.5，K₂HPO₄ 0.5，MnSO₄ 0.01，NaCl 0.01，MgSO₄?7H₂O 0.2，F(xiàn)eSO₄ 0.01，對(duì)氨基苯甲酸 0.001，維生素B1 0.001，生物素0.001e-3，以純水配置，其中糖和酵母粉115℃滅菌30min，其他物質(zhì)用0.22μm的濾膜過濾添加。

以下各實(shí)施例中采用的發(fā)酵罐有效體積為4L，雖然丁醇發(fā)酵菌的發(fā)酵工藝不同，但發(fā)酵所投放的總糖量控制為65×V =65×4 =260(g)。

實(shí)施例1

（1）將丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) ATCC 824菌株孢子液接種到RCM培養(yǎng)基中，厭氧環(huán)境下于37℃下培養(yǎng)20h獲得發(fā)酵菌種子液。

（2）制備初始發(fā)酵培養(yǎng)基，采用葡萄糖，糖濃度為30g/L；制備補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基，糖濃度為100g/L，采用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為7.5。

（3）采用發(fā)酵罐有效體積4L的發(fā)酵罐，預(yù)先裝入2L的初始發(fā)酵培養(yǎng)基，按照體積比4%的接種量接入發(fā)酵菌種子液，發(fā)酵溫度37℃，攪拌速率100rpm，在發(fā)酵20h后，發(fā)酵菌進(jìn)入對(duì)數(shù)期。開始流加補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基，體積為2L，流加時(shí)間為24h，計(jì)算得到k=1.93×10^-3ml?(min)^-2，初始流加速度v₀=2.78mL/min，勻減速流加完畢后，繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵72h。

發(fā)酵液中的糖含量及丁醇含量通過高效液相色譜法分析測(cè)定，丙酮含量通過氣相色譜法分析測(cè)定，乙醇含量通過生物傳感分析儀（乙醇酶膜）測(cè)定，總?cè)軇┖繛橐掖肌⒈?、丁醇三者含量的總和。?jīng)檢測(cè)，發(fā)酵液中丁醇、丙酮及乙醇的產(chǎn)量分別為11.041g/L、5.021g/L及4.9g/L，總?cè)軇┊a(chǎn)量為20.962g/L，溶劑轉(zhuǎn)化率（糖轉(zhuǎn)化溶劑量與糖加入量的比例，下同）為32.25%。

實(shí)施例2

（1）將丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) ATCC 824菌株孢子液接種到RCM培養(yǎng)基中，厭氧環(huán)境下于37℃下培養(yǎng)20h獲得發(fā)酵菌種子液。

（2）制備初始發(fā)酵培養(yǎng)基，采用葡萄糖，糖濃度為30g/L；制備補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基，糖濃度為100g/L，采用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為7.0。

（3）采用發(fā)酵罐有效體積4L的發(fā)酵罐，預(yù)先裝入2.0L的初始發(fā)酵培養(yǎng)基，按照體積比4%的接種量接入發(fā)酵菌種子液，發(fā)酵溫度37℃，攪拌速率100rpm，在發(fā)酵20h后，發(fā)酵菌進(jìn)入對(duì)數(shù)期。開始流加補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基，體積為2.0L，流加時(shí)間為20h，計(jì)算得到k=2.78×10^-3ml?(min)^-2，初始流加速度v₀=3.33mL/min，勻減速流加完畢后，繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵60h。

發(fā)酵液中的糖含量及丁醇含量通過高效液相色譜法分析測(cè)定，丙酮含量通過氣相色譜法分析測(cè)定，乙醇含量通過生物傳感分析儀（乙醇酶膜）測(cè)定，總?cè)軇┖繛橐掖肌⒈?、丁醇三者含量的總和。?jīng)檢測(cè)，發(fā)酵液中丁醇、丙酮及乙醇的產(chǎn)量分別為11.224 g/L、5.031g/L及4.5g/L，溶劑總產(chǎn)量為20.755g/L，溶劑轉(zhuǎn)化率為31.9%。

實(shí)施例3

（1）將丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) ATCC 824菌株孢子液接種到RCM培養(yǎng)基中，厭氧環(huán)境下于37℃下培養(yǎng)20h獲得發(fā)酵菌種子液。

（2）制備初始發(fā)酵培養(yǎng)基，采用葡萄糖，糖濃度為40g/L；制備補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基，糖濃度為80g/L，采用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為8.0。

（3）采用發(fā)酵罐有效體積4L的發(fā)酵罐，預(yù)先裝入1.5L的初始發(fā)酵培養(yǎng)基，按照體積比3%的接種量接入發(fā)酵菌種子液，發(fā)酵溫度37℃，攪拌速率100rpm，在發(fā)酵20h后，發(fā)酵菌進(jìn)入對(duì)數(shù)期。開始流加補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基，體積為2.5L，流加時(shí)間為24h，計(jì)算得到k=2.41×10^-3ml?(min)^-2，初始流加速度v₀=3.47mL/min，勻減速流加完畢后，繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵72h。

發(fā)酵液中的糖含量及丁醇含量通過高效液相色譜法分析測(cè)定，丙酮含量通過氣相色譜法分析測(cè)定，乙醇含量通過生物傳感分析儀（乙醇酶膜）測(cè)定，總?cè)軇┖繛橐掖?、丙酮、丁醇三者含量的總和。?jīng)檢測(cè)，發(fā)酵液中丁醇、丙酮及乙醇的產(chǎn)量分別為11.388g/L、5.161g/L及4.7/L，溶劑總產(chǎn)量為21.199g/L，溶劑轉(zhuǎn)化率為32.6%。

實(shí)施例4

處理流程及操作條件同實(shí)施例1，不同之處在于：采用CN201410731297.9所述的拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）CM20。發(fā)酵結(jié)束后，經(jīng)檢測(cè)，發(fā)酵液中丁醇、丙酮及乙醇的產(chǎn)量分別為11.579 g/L、5.267g/L及5.0g/L，溶劑總產(chǎn)量為21.846g/L，溶劑轉(zhuǎn)化率為33.6%。

實(shí)施例5

處理流程及操作條件同實(shí)施例1，不同之處在于：采用有機(jī)堿三羥甲基氨基甲烷（Tris）調(diào)節(jié)pH。發(fā)酵結(jié)束后，經(jīng)檢測(cè)，發(fā)酵液中丁醇、丙酮及乙醇的產(chǎn)量分別為11.885 g/L、5.324g/L及5.1g/L，溶劑總產(chǎn)量為22.309g/L，溶劑轉(zhuǎn)化率為34.3%。

實(shí)施例6

處理流程及操作條件同實(shí)施例4，不同之處在于：采用有機(jī)堿三羥甲基氨基甲烷（Tris）調(diào)節(jié)pH。發(fā)酵結(jié)束后，經(jīng)檢測(cè)，發(fā)酵液中丁醇、丙酮及乙醇的產(chǎn)量分別為12.127g/L、5.504g/L及5.2g/L，溶劑總產(chǎn)量為22.831g/L，溶劑轉(zhuǎn)化率為35.1%。

比較例1

處理流程及操作條件同實(shí)施例1，不同之處在于：采用恒流速流加葡萄糖濃度為100g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基，流速始終為1.39mL/min，流加時(shí)間24h，流加完畢后，繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵72 h。經(jīng)檢測(cè)，發(fā)酵液中丁醇、丙酮及乙醇的產(chǎn)量分別為10.896 g/L、3.925g/L及3.4g/L，溶劑總產(chǎn)量為18.221g/L，溶劑轉(zhuǎn)化率為28.0%。

比較例2

處理流程及操作條件同實(shí)施例1，不同之處在于：補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為自然的6.2，不進(jìn)行調(diào)節(jié)。經(jīng)檢測(cè)，發(fā)酵液中丁醇、丙酮及乙醇的產(chǎn)量分別為10.871g/L、3.911g/L及2.9g/L，溶劑總產(chǎn)量為17.682g/L，溶劑轉(zhuǎn)化率為27.2%。