本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及來(lái)源于大米草(Spartina anglica)的液泡膜焦磷酸酶的一個(gè)編碼基因SaVP1的序列和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

大米草(Spartina anglica)屬于禾本科米草屬，為多年生濕生草本植物，適宜在海灘中潮帶生長(zhǎng)。作為一種鹽生植物，大米草耐鹽能力很強(qiáng)，能夠在高達(dá)3％-3.5％鹽度的海水中正常生長(zhǎng)。在沿海灘涂引種后，一旦形成密集草叢，即可抗較大風(fēng)浪，具有促淤造陸、消浪抗蝕、保護(hù)海堤，提高海灘土壤肥力的作用。大米草葉的背腹面均有鹽腺，根吸收的鹽分可以由此排出體外，顯示大米草的耐鹽機(jī)理不同于雙子葉甜土植物擬南芥，也不同于禾本科甜土植物水稻，也不同于真鹽生植物?？寺〈竺撞莸哪望}相關(guān)基因有利于進(jìn)一步研究大米草獨(dú)特的耐鹽機(jī)理和應(yīng)用基因工程手段改良甜土植物的耐鹽能力。

土壤鹽漬化是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境的一個(gè)非常重要的非生物脅迫因素。全世界約有10億hm²土地具有不同程度的鹽漬化，其中，我國(guó)鹽漬土地面積超過(guò)1億hm²。隨著我國(guó)人口的劇增及工業(yè)的高速發(fā)展，可耕地急劇下降，不合理灌溉、耕作又造成了大量良田的次生鹽漬化。如何利用大面積的鹽堿地,提高作物耐鹽性已經(jīng)成為生產(chǎn)上迫切需要解決的問(wèn)題。

在鹽脅迫條件下，植物通常通過(guò)滲透機(jī)制的調(diào)節(jié)、抗氧化防御系統(tǒng)、拒鹽和對(duì)離子的選擇吸收、代謝途徑的改變、離子區(qū)隔化等途徑耐鹽。近年來(lái)的研究表明，在諸多途徑中，鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)引起離子區(qū)隔化在植物耐鹽機(jī)理中的作用猶為突出。Apse等(1999)從擬南芥克隆到液泡膜Na⁺/H⁺反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(NHX1)，并在擬南芥中過(guò)量表達(dá)，獲得耐1/2海水澆灌的植株，其耐鹽能力的提高程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于以往所報(bào)道的其它耐鹽基因。這表明，通過(guò)基因工程將Na⁺/H⁺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因轉(zhuǎn)入植物，加強(qiáng)鈉離子區(qū)隔化的能力，將可以顯著改良植物的耐鹽能力。

另外的一些研究指出，質(zhì)膜和液泡膜上的Na⁺/H⁺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其跨膜的Na⁺/H⁺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)與膜上的質(zhì)子泵是偶聯(lián)的。液泡膜的H⁺-ATPase和H⁺-PPiase產(chǎn)生跨液泡膜的H⁺電化學(xué)勢(shì)梯度，為Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白提供驅(qū)動(dòng)力，從而進(jìn)行離子的電化學(xué)運(yùn)輸，實(shí)現(xiàn)鈉離子的區(qū)隔化。這說(shuō)明如果通過(guò)相關(guān)基因的過(guò)量表達(dá)增加跨液泡膜的H⁺電化學(xué)勢(shì)梯度，將有利于Na⁺/H⁺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將更多的Na⁺轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡內(nèi)，增強(qiáng)鈉離子的區(qū)隔化作用，提高耐鹽能 力。

從理論上講，液泡膜H⁺-ATPase和液泡膜H+-PPase這2個(gè)H⁺泵中的任何一個(gè)過(guò)量表達(dá)，都有可能提高H⁺的利用率，增大H⁺跨膜梯度。但是，液泡膜H⁺-ATPase是由許多亞基組成的，只有當(dāng)編碼這些亞基的若干個(gè)基因都達(dá)到超表達(dá)的水平時(shí)，液泡膜H⁺-ATPase才能實(shí)現(xiàn)超表達(dá)，就目前的技術(shù)水平而言，難以實(shí)現(xiàn)。液泡膜H⁺-PPase只由一條受單基因編碼的多肽組成，因此，液泡膜H⁺-PPase超量表達(dá)就簡(jiǎn)單多了。

Gaxiola等的研究結(jié)果表明，擬南芥液泡膜焦磷酸酶(H⁺-PPase)AVP1基因的過(guò)量表達(dá)，明顯地增加了跨液泡膜的H+電化學(xué)勢(shì)梯度，促進(jìn)了液泡膜Na⁺/H⁺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NHX1的活性，使Na⁺區(qū)隔化至液泡中，明顯地增強(qiáng)了植物的耐鹽、耐旱能力。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，AVP1基因還能通過(guò)改變液泡中的pH值，調(diào)控植物體內(nèi)生長(zhǎng)激素的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而促進(jìn)植物器官頂端的細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)，使植物高產(chǎn)、抗旱、抗土壤瘠薄。隨后另外一些學(xué)者的研究結(jié)果也顯示，將H⁺-PPase基因轉(zhuǎn)入煙草、擬南芥、玉米、水稻，轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽性和耐旱性顯著提高。

液泡膜焦磷酸酶可以提供膜內(nèi)外質(zhì)子梯度，除了促進(jìn)Na⁺轉(zhuǎn)運(yùn)的外，還可能促進(jìn)其它重金屬離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而促進(jìn)重金屬離子的累積。液泡中某些溶質(zhì)的積累，也可以有益于植物抗寒能力的提高。酶水解焦磷酸的活性，有利于植物體內(nèi)的蔗糖合成代謝，從而促進(jìn)產(chǎn)量的增加。

因此，構(gòu)建適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)盒，可以將該基因應(yīng)用于植物耐鹽、耐旱、耐寒、高產(chǎn)、重金屬離子富集等性狀的改良。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的在于提供一種來(lái)源于大米草的液泡膜焦磷酸酶SaVP1基因序列及其應(yīng)用。該基因在植物耐鹽、耐旱、耐寒、高產(chǎn)、重金屬離子富集等性狀改良上的應(yīng)用。

本發(fā)明的大米草液泡膜焦磷酸酶基因cDNA全長(zhǎng)序列由2506個(gè)核苷酸組成，該序列具有如SEQ ID No.1所述的核苷酸序列，其所對(duì)應(yīng)的氨基酸序列如SEQ ID No.3所述。相應(yīng)的基因命名為SaVP1。SaVP1基因cDNA全長(zhǎng)序列中含一個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框，位置為第192-2195核苷酸，開(kāi)放閱讀框的長(zhǎng)度為2004個(gè)核苷酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA，編碼667個(gè)氨基酸。

本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

大米草液泡膜焦磷酸酶SaVP1基因，該基因核苷酸全長(zhǎng)序列中含有SEQ ID NO.2所示的開(kāi)放閱讀框。

上述的大米草液泡膜焦磷酸酶SaVP1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。cDNA全長(zhǎng)序列由2506個(gè)核苷酸組成，cDNA全長(zhǎng)序列中含一個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框，位置為第192-2195核苷酸，開(kāi)放閱讀框的長(zhǎng)度為2004個(gè)核苷酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA。

上述的SaVP1基因編碼的蛋白，其氨基酸序列為SEQ ID NO.3。

用于擴(kuò)增上述SaVP1基因全長(zhǎng)的引物，它包括：(1)用于5’RACE擴(kuò)增的第一輪巢式RCR引物對(duì)UPM和GSP1以及第二輪巢式PCR引物對(duì)NUP和GSP2；(2)用于3’RACE擴(kuò)增的第一輪巢式RCR引物對(duì)UPM和GSP3以及第二輪巢式PCR引物對(duì)NUP和GSP4；

其中，各引物對(duì)的序列如下所示：

所述的UPM為由UPML和UPMS按照1:5的體積比混合后稀釋而成，

UPML:CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT

UPMS:CTAATACGACTCACTATAGGGC

NUP:AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT

GSP1:CCCATAACAGCACCAGAGCGGAAAGC

GSP2:AAATGCCTTCCCAACACC

GSP3:ATCAGTGACAATGCTGGTGG

GSP4:TGTCAGCAGAGCTGGAGTG

用于克隆上述SaVP1基因的開(kāi)放閱讀框的引物對(duì)P3、P4，(SaVP1基因全長(zhǎng)是由5‘端、中間段(P3、P4擴(kuò)的開(kāi)放閱讀框)、3‘端拼接而成，做P3、P4擴(kuò)增是為了確保開(kāi)放閱讀框的序列的準(zhǔn)確性這是核心的部分，而P3、P4引物對(duì)是在簡(jiǎn)并引物擴(kuò)出來(lái)最早的中間序列后與3’、5‘端序列拼接得到的初步的全長(zhǎng)序列基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的，實(shí)際上是做了核對(duì)工作，最后得到了核對(duì)過(guò)的全長(zhǎng))，所述P3、P4引物對(duì)的序列為：

P3：CCATGGACCATGGCGATCTTTGCTGTTGTTATC

P4：GGTCACCTTAGAATAGCTTGAAGAGCAG。

含有上述SaVP1基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或轉(zhuǎn)基因重組菌。

所述的重組表達(dá)載體為將上述的SaVP1基因插入到pCAMBIA1301的NcoI和BstEII位點(diǎn)之間得到的重組表達(dá)載體pCAMBIA1301-SaVP1。

上述的SaVP1基因在提高植物耐受性上的應(yīng)用

上述的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或轉(zhuǎn)基因重組菌在提高植物耐受性上的應(yīng)用。

所述的耐受性優(yōu)選為耐鹽性、耐旱性、耐寒性、高產(chǎn)性和重金屬離子富集中的至少一 種。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明所述的SaVP1基因應(yīng)用基因工程手段改良植物的耐逆性尤其是耐鹽性效果顯著。

附圖說(shuō)明：

圖1大米草總RNA的提取與鑒定。

圖2大米草SaVP1中間片段PCR擴(kuò)增結(jié)果。

M:分子量標(biāo)準(zhǔn)MarkerIII；1:PCR產(chǎn)物

圖3.大米草5’RACE巢式PCR電泳結(jié)果。

M:分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1:PCR產(chǎn)物

圖4.大米草3’RACE巢式PCR電泳結(jié)果。

M:分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1:PCR產(chǎn)物

圖5大米草SaVP1全長(zhǎng)的克隆電泳結(jié)果。

M:分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1:PCR產(chǎn)物

圖6大米草SaVP1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。

Hh:α-螺旋；Ee:β-折疊；Tt:β-轉(zhuǎn)角；Cc:無(wú)規(guī)則卷曲

圖7大米草SaVP1蛋白的疏水性預(yù)測(cè)。

圖8大米草SaVP1蛋白的親水性預(yù)測(cè)。

圖9大米草SaVP1蛋白的跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)(TMpred)。

圖10大米草SaVP1蛋白的跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)(TMHMM)。

圖11大米草SaVP1蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)(神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法)。

圖12大米草SaVP1蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)(馬科夫模型)。

圖13植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-SaVP1的構(gòu)建。

圖14pCAMBIA1301-SaVP1酶切分析。

M:DL2000；1:pCAMBIA1301；2:pCAMBIA1301NcoI/BstEII雙酶切；3:pMD18-T-SaVP1；4:pMD18-T-SaVP1NcoI/BstEII雙酶切

圖15陽(yáng)性克隆的PCR檢測(cè)。

M:分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1-3:陽(yáng)性克隆

圖16煙草轉(zhuǎn)化。

A:愈傷組織B:分化的愈傷組織C:再生植株

圖17轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草的基因組DNA的提取。

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-10：煙草DNA

圖18轉(zhuǎn)基因煙草的PCR檢測(cè)。

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；CK+：陽(yáng)性對(duì)照；CK－：陰性對(duì)照；1-8：轉(zhuǎn)基因煙草

圖19NaCl脅迫14天后的轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1大米草液泡膜焦磷酸酶SaVP1基因序列的獲得和耐鹽性鑒定

1.材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1植物材料

大米草(Spartina anglica)采自江蘇啟東海邊，野生型煙草，溫室中培養(yǎng)。

1.1.2菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌(Escheriachia coli)DH5α、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404、植物表達(dá)載體pCAMBIA1301由本實(shí)驗(yàn)室保存。以上均是常規(guī)菌株質(zhì)粒，也可以通過(guò)購(gòu)買獲得。

1.1.3試劑

BU-SuperScript RT KIT、IPTG和X-Gal購(gòu)自Biouniquer；pMD^TM18-T Vector購(gòu)自TaKaRa；限制性內(nèi)切酶NcoI和BstEII，T4DNA連接酶，Phusion High-Fidelity DNA Polymerase購(gòu)自NEB(北京)有限公司；膠回收試劑盒，Marker購(gòu)自北京天根生化；RNA提取試劑盒，加A反應(yīng)液購(gòu)自蓋寧生物科技(北京)有限公司。

1.1.4引物

根據(jù)液泡膜H⁺-PPase基因的保守序列設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物：

P1:NAGRAARGGTGTYGGVAAG

P2:GAGAACCARTANGGRAGC

RACE的接頭引物：

UPML:CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT

UPMS:CTAATACGACTCACTATAGGGC

NUP:AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT

UPM為16μl UPML和80μl UPMS用無(wú)菌去離子水定容到400μl配制而成。

SMART:AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG

3-CDS:AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)₃₀V N

(N＝A,C,G,or T；V＝A,G,or C)

5-CDS:(T)₂₅V N

(N＝A,C,G,or T；V＝A,G,or C)

大米草SaVP1基因5’端巢式PCR特異性引物為：

GSP1:CCCATAACAGCACCAGAGCGGAAAGC

GSP2:AAATGCCTTCCCAACACC

大米草SaVP1基因3’端巢式PCR特異性引物為：

GSP3:ATCAGTGACAATGCTGGTGG

GSP4:TGTCAGCAGAGCTGGAGTG

大米草SaVP1基因開(kāi)放閱讀框克隆引物為：

P3：CCATGGACCATGGCGATCTTTGCTGTTGTTATC

P4：GGTCACCTTAGAATAGCTTGAAGAGCAG

大米草pCAMBIA1301-SaVP1重組體檢測(cè)引物：

SaVP1P1:AAGATTCAAATAGAGGACCTAACAG

SaVP1P2:GATAAATGCTTTCCCAACACC

以上引物均由有南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.1.5培養(yǎng)基

1)LB培養(yǎng)基

2)MS₀：MS+蔗糖(30g/L)pH＝5.8

MS₁：MS+蔗糖(30g/L)+瓊脂(5.2g/L)pH＝5.8

MS₂：MS+蔗糖(30g/L)+6-BA(1mg/L)+NAA(0.1mg/L)+瓊脂(5.2g/L)+Hyg(20mg/L)+Amp(500mg/L)pH＝5.8

MS₃：1/2MS+蔗糖(15g/L)+NAA(0.2mg/L)+瓊脂(2.6g/L)+Amp(250mg/L)pH＝5.8

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1大米草RNA的提取及RNA質(zhì)量檢測(cè)

依據(jù)天根公司的RNApure超純總RNA快速提取試劑盒的提取大米草的RNA。具體方法如下：

1)勻漿處理。采取大米草葉片50～100mg，用液氮研磨成細(xì)粉，加入1ml裂解液RL。

2)將勻漿樣品劇烈震蕩混勻，在15-30℃條件下孵育5分鐘以使核蛋白體完全分解。

3)每1ml RL加0.2ml氯仿。蓋緊樣品管蓋，劇烈振蕩15秒并將其在室溫下孵育3分鐘。

4)于4℃12000rpm離心10分鐘，樣品會(huì)分為三層：下層有機(jī)相，中間層和上層無(wú)色的 水相，RNA存在于水相中。水相層的容量大約為所加RL體積的60％，把水相轉(zhuǎn)移到新管中，進(jìn)行下一步操作。

5)加入1倍體積70％乙醇，顛倒混勻(此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)沉淀)。得到的溶液和可能沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱RA中(吸附柱套在收集管內(nèi))。

6)12000rpm離心45秒，棄掉廢液，將吸附柱重新套回收集管。

7)加500μl去蛋白液RE，12000rpm離心45秒，棄掉廢液。

8)加入500μl漂洗液RW，12000rpm離心45秒，棄掉廢液。

9)加入500μl漂洗液RW，12000rpm離心45秒，棄掉廢液。

10)將吸附柱RA放回空收集管中，13000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。

11)取出吸附柱RA，放入一個(gè)RNase free離心管中，根據(jù)預(yù)期RNA產(chǎn)量在吸附膜的中間部位加50-80μlRNase free water(事先在65-70℃水浴中加熱效果更好)，室溫放置2分鐘，12000rpm離心1分鐘。如果需要較多RNA，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，離心1分鐘，或者另外再加30μlRNase free water，離心1分鐘，合并兩次洗脫液。

12)將得到的RNA溶液于-70℃冰箱保存。

吸取5μlRNA溶液使用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)大米草的RNA質(zhì)量。

1.2.2大米草SaVP1基因片段的獲得

1.2.2.1第一條鏈的合成

參照BU-SuperScript RT KIT合成第一條鏈。

1)

混勻，短暫離心。

Total RNA:12μl

混勻，短暫離心。

2)熱循環(huán)程序

30℃，10分鐘，

42℃，60分鐘，

99℃，5分鐘，

4℃，5分鐘。

3)-20℃保存。

1.2.2.2RT-PCR

PCR反應(yīng)體系：

PCR反應(yīng)程序：

98℃1min

98℃ 20s，40℃ 45s，72℃ 1.5min，35個(gè)循環(huán)

72℃ 10min

于2％的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)并回收。

1.2.2.3膠回收

1)將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下(盡量切除多余部分)放入干凈的離心管中，稱其重量。

2)向膠塊中加入3倍體積溶膠液PN；當(dāng)回收的目的片段<150bp或瓊脂糖凝膠濃度>2％時(shí)，建議使用6倍體積溶膠液PN(如凝膠重為0.1g，其體積視為100μl，依次類推)。50℃水浴放置10分鐘，其間不斷溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解。如果還有未溶的膠塊，可再補(bǔ)加一些溶膠液或繼續(xù)放置幾分鐘，直至膠塊溶解(若膠塊的體積過(guò)大，可事先將膠塊切成碎塊)。

注意：膠塊完全溶解后最好將膠溶液溫度降至室溫再上柱，因?yàn)槲街谳^高溫度時(shí)結(jié)合DNA的能力較弱。

3)將上一步所得溶液加入一個(gè)吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm離心30秒，倒掉收集管中的溶液，將吸附柱重新放入收集管中。

4)向吸附柱中加入700μl漂洗液PW，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱重新放入收集管中。

5)向吸附柱中加入500μl漂洗液PW，12000rpm離心30秒，倒掉廢液。將離心吸附 柱CA2放回收集管中，12000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液。將吸附柱置于室溫或50℃溫箱數(shù)分鐘，徹底地晾干，以防止殘留的漂洗液影響下一步的實(shí)驗(yàn)。

6)將吸附柱放到一個(gè)干凈離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加35μl洗脫緩沖液EB，(如果回收的目的片段>4kb，則洗脫緩沖液EB應(yīng)置于65-70℃水浴預(yù)熱)，室溫放置2分鐘。12000rpm離心1分鐘收集DNA溶液。

7)為了提高DNA的回收量，可將離心得到的溶液重新加回離心吸附柱中，重復(fù)步驟6。

1.2.2.4純化后的平末端DNA片段3’末端加A

在一個(gè)0.2ml的RNase-free的離心管中加入以下試劑：

反應(yīng)條件：72℃保溫1～1.5小時(shí)。

1.2.2.5連接pMD18-T載體

pMD18-T載體的反應(yīng)體系為：

1)在微量離心管中加入下列溶液，全量為5μl。

pMD^TM18-Vector: 0.5μl

Insert DNA: 4.5μl

2)加入5μl Solution I。

3)16℃反應(yīng)過(guò)夜(12-16小時(shí))。

1.2.2.6CaCl₂法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞

1)挑取大腸桿菌DH5α單菌落，接種于50ml LB培養(yǎng)基中，37℃搖菌過(guò)夜。

2)吸取200μl菌液，接種于50mL LB培養(yǎng)基中搖菌3小時(shí)左右，經(jīng)常觀察菌液的生長(zhǎng)狀，至OD₆₀₀約為0.3左右。

3)將菌液倒入一個(gè)1ml的無(wú)菌離心管中，置于冰上冷卻10分鐘。

4)4℃，4000rpm離心10分鐘。

5)倒出培養(yǎng)液，將管倒置1min加入1ml冰預(yù)冷的0.1M的CaCl₂溶液輕輕地重懸菌體，冰上放置30分鐘。

6)4℃，4000rpm離心10分鐘。

7)小心倒掉上清，加入100μl冰預(yù)冷的0.1M的CaCl₂溶液，輕輕的重懸。

8)可以立即使用，也可加入1/4體積的無(wú)菌甘油，液氮冷萃，放入-70℃，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.7大腸桿菌感受態(tài)的轉(zhuǎn)化和陽(yáng)性克隆的檢測(cè)

大腸桿菌感受態(tài)的轉(zhuǎn)化過(guò)程：

1)全量的連接產(chǎn)物(10μl)加入至100μl DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30分鐘。

2)42℃熱激90秒后，冰浴3-5分鐘。

3)向離心管中加入800μl的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)。

4)取400μl LB液體培養(yǎng)基涂布在含有4μL IPTG(200mg/ml)、16μLX-Gal(50mg/ml)和Amp(50mg/ml)的LB固體培養(yǎng)基上，37℃，過(guò)夜培養(yǎng)。

5)挑選白色菌落，加入到含有Amp(50mg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。

6)使用PCR法檢測(cè)陽(yáng)性克隆。

PCR法檢測(cè)陽(yáng)性克隆的體系：

PCR反應(yīng)程序：

98℃ 1min

98℃ 20s，40℃ 45s，72℃ 1.5min，35個(gè)循環(huán)

72℃ 10min

用1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，選擇陽(yáng)性克隆子送南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3大米草SaVP1基因全長(zhǎng)的擴(kuò)增

1.2.3.1第一條鏈的合成

5'-RACE-Ready cDNA

1)在一個(gè)0.2ml的RNase-free的離心管中加入以下試劑：

混勻，短暫離心。

Total RNA:11μl

混勻，短暫離心。

2)熱循環(huán)程序

30℃，10分鐘，

42℃，60分鐘，

99℃，5分鐘，

4℃，5分鐘。

3)-20℃保存。

3'-RACE-Ready cDNA

1)在一個(gè)0.2ml的RNase-free的離心管中加入以下試劑：

混勻，短暫離心。

Total RNA:12μl

混勻，短暫離心。

2)熱循環(huán)程序

30℃，10分鐘，

42℃，60分鐘，

99℃，5分鐘，

4℃，5分鐘。

3)-20℃保存。

1.2.3.2 3'RACE

巢式PCR第一輪反應(yīng)體系：

巢式PCR第一輪反應(yīng)程序：

98℃ 1min

98℃ 20s，60℃ 45s，72℃ 1.5min，35個(gè)循環(huán)

72℃ 10min

采用熱啟動(dòng)，以減少非特異性擴(kuò)增。從第一輪的反應(yīng)液中吸取1μl作為巢式PCR第二輪反應(yīng)的模板。

巢式PCR第二輪反應(yīng)體系：

巢式PCR第二輪反應(yīng)程序：

98℃1min

98℃ 20s，55℃ 45s，72℃ 1.5min，35個(gè)循環(huán)

72℃ 10min

同樣采用熱啟動(dòng)，PCR產(chǎn)物用2％的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，回收并純化目的片段，將目的片段與pMD18-T載體連接，送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.3.3 5'RACE

巢式PCR第一輪反應(yīng)體系：

巢式PCR第一輪反應(yīng)程序：

94℃5min

5cycles:

94℃ 30s

72℃ 3min

5cycles:

94℃ 30s

70℃ 30s

72℃ 3min

25cycles:

94℃ 30s

65℃ 30s

72℃ 3min

72℃ 10min

采用熱啟動(dòng)，以減少非特異性擴(kuò)增。從第一輪的反應(yīng)液中吸取1μl作為巢式PCR第二輪反應(yīng)的模板。

巢式PCR第二輪反應(yīng)體系：

巢式PCR第二輪反應(yīng)程序：

98℃ 1min

98℃ 20s，52℃ 45s，72℃ 2min，35個(gè)循環(huán)

72℃ 10min

同樣采用熱啟動(dòng)，PCR產(chǎn)物用2％的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，回收并純化目的片段，將目的片段與pMD18-T載體連接，送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.3.4大米草SaVP1基因開(kāi)放閱讀框的擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系：

PCR反應(yīng)程序：

98℃ 1min

98℃ 20s，55℃ 45s，72℃ 1.5min，35個(gè)循環(huán)

72℃ 10min

用2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并回收。將目的片段與pMD18-T載體連接，送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.4對(duì)獲得的目的基因的生物信息學(xué)分析

使用BioEdit、ContigExpress、Clustal X、DNAstar、DNAMAN、MEGA4.0、NCBI網(wǎng)站、http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝npsa_sopma.htm網(wǎng)站、TMPRED(http://www.ch.embnet.org)、TMHMM(http://cbs.dtu.dk/services/TMHMM)、Swiss-Model等對(duì)序列進(jìn)行分析。

1.2.5植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-SaVP1的構(gòu)建

1)大米草SaVP1基因的克隆與酶切

PCR反應(yīng)體系：

PCR反應(yīng)程序：

98℃ 1min

98℃ 20s，55℃ 45s，72℃ 1.5min，35個(gè)循環(huán)

72℃ 10min

取10μl反應(yīng)液于2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并回收。將目的片段與pMD18-T載體連接，送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。

取50μl測(cè)序正確的菌液加入50ml的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，150rpm過(guò)夜培養(yǎng)。取2ml培養(yǎng)過(guò)夜的菌液進(jìn)行質(zhì)粒的提取。

2)使用限制性內(nèi)切酶NcoI和BstEII對(duì)提取的含有大米草SaVP1的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切

37℃，4h；60℃，4h；65℃，20min。反應(yīng)結(jié)束后，每管加入1μl的0.5M的EDTA滅活BstEII。將反應(yīng)液于1％的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)并回收目的條帶。

3)pCAMBIA1301的雙酶切

將含有pCAMBIA1301的菌株進(jìn)行擴(kuò)繁并使用質(zhì)粒小提試劑盒提取pCAMBIA1301的質(zhì)粒。同樣使用限制性內(nèi)切酶NcoI和BstEII對(duì)pCAMBIA1301進(jìn)行雙酶切。

37℃，4h；60℃，4h；65℃，20min。反應(yīng)結(jié)束后，每管加入1μl的0.5M的EDTA滅活BstEII。將反應(yīng)液于1％的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)并回收目的條帶。

4)連接體系：

16℃，過(guò)夜連接。

5)表達(dá)載體pCAMBIA1301-SaVP1的篩選

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中，大腸桿菌DH5α感受態(tài)的的制備與轉(zhuǎn)化參照1.2.2.6和1.2.2.7。挑選單菌落并搖菌，PCR法檢測(cè)表達(dá)載體pCAMBIA1301-SaVP1的陽(yáng)性克隆。

PCR反應(yīng)體系：

PCR反應(yīng)程序：

98℃ 1min

98℃ 20s，48℃ 45s，72℃ 1min，35個(gè)循環(huán)

72℃ 10min

取10ul反應(yīng)液進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.6重組體pCAMBIA1301-SaVP1轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌

1.2.6.1農(nóng)桿菌細(xì)胞感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化

1)挑取少許農(nóng)桿菌LBA4404，接種于5ml LB液體培養(yǎng)基(含50mg/L Rif)中，28℃、200r/mim培養(yǎng)過(guò)夜。

2)取2ml培養(yǎng)物于LB液體培養(yǎng)基(含50mg/L Rif)中繼續(xù)培養(yǎng)，直至OD₆₀₀為0.5左右。3)轉(zhuǎn)入2ml無(wú)菌離心管，4000rpm離心10min，去上清液。

4)加入1ml預(yù)冷的0.1M的CaCl₂溶液，輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置30min。4℃，4000rpm離心10min，去上清。

5)加入200μl預(yù)冷的0.1M的CaCl₂溶液，輕輕懸浮。

6)農(nóng)桿菌懸浮液分裝于無(wú)菌Eppendorf管中，立即使用或每管200μl凍存于-70℃保存。

1.2.6.2凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

1)取出1管解凍的-70℃保存或剛制備的LBA4404感受態(tài)細(xì)胞，輕輕加入10μl含有目的基因的植物表達(dá)載體質(zhì)粒，輕輕混勻，冰浴30min。

2)液氮冷凍8min。

3)37℃水浴5min。

4)冰浴5min。

5)加入800μl LB液體培養(yǎng)基與28℃，200rpm振蕩培養(yǎng)2h。

6)將復(fù)蘇后的LB液體培養(yǎng)基涂布在含有Kana(50mg/L)和Rif(50mg/L)的LB固體培養(yǎng)基上。

7)28℃倒置培養(yǎng)2天直到長(zhǎng)出菌落。

8)挑取單克隆與含有Kana(50mg/L)和Rif(50mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，采用PCR法檢測(cè)陽(yáng)性克隆子。

1.2.7葉盤法轉(zhuǎn)化煙草

1.2.7.1農(nóng)桿菌的培養(yǎng)

1)挑取單菌落，在10ml LB液體培養(yǎng)基中，28℃過(guò)夜培養(yǎng)。

2)取1ml以上培養(yǎng)物，加入50ml LB液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.1左右。

3)將50ml培養(yǎng)物離心，收集菌體，用MS₀重懸，使OD₆₀₀保持在0.1左右。

1.2.7.2共培養(yǎng)

1)取煙草無(wú)菌苗的幼嫩、健壯葉片，去主脈，將葉片剪成1cm×1cm左右的葉盤，放在MS₁培養(yǎng)基上。

2)將大約100片葉盤放入100ml含有農(nóng)桿菌的MS₀培養(yǎng)基中，190rpm，28℃搖床上共培養(yǎng)15分鐘。

3)用藥勺撈出葉盤，放在已滅菌的吸水紙上，吸干葉盤上多余的菌液。

4)將吸干的葉盤平放在加有一層濾紙的MS₁培養(yǎng)基上，用封口膜封好培養(yǎng)基，放于25℃，暗培養(yǎng)48h。

1.2.7.3誘導(dǎo)生芽

1)暗培養(yǎng)48h后，取出葉盤放在吸水紙上，吸干多余的菌液。

2)將葉盤背面朝下，放在MS₂培養(yǎng)基上，葉盤邊緣輕壓入培養(yǎng)基中。

3)將培養(yǎng)皿放于25℃左右，16h光照培養(yǎng)。

4)約兩周后，切下帶芽的葉緣，插入MS₂培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.7.4誘導(dǎo)生根

在MS₂培養(yǎng)基中培養(yǎng)約4周后，將葉緣長(zhǎng)出的幼芽從基部與葉盤切開(kāi)，將幼芽插入MS₃培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，對(duì)每一棵苗進(jìn)行編號(hào)，25℃左右，16h光照培養(yǎng)。

1.2.7.5再生植株的移栽

誘導(dǎo)生根一月后，大部分苗已長(zhǎng)出繁茂的根，可將PCR陽(yáng)性苗移入珍珠巖中培養(yǎng)。待煙草的根系較發(fā)達(dá)時(shí)移入土中栽培。

1.2.8轉(zhuǎn)基因煙草苗的PCR檢測(cè)

1.2.8.1轉(zhuǎn)基因煙草葉片DNA的提取

使用CTAB法提取煙草的DNA

1)取2g煙草的葉片，加液氮研磨成粉末狀，迅速移入1.5ml Eppendorf管中。

2)加入800μl的CTAB提取緩沖液，混勻(CTAB在65℃水浴預(yù)熱)，每5min輕輕震蕩幾次，20min后12000r/min，離心15min。

3)小心吸取上清液，加入等體積的酚：氯仿(各400μl)溶液，混勻，4℃，12000r/min，離心10min。

4)小心吸取上清液，加入等體積的氯仿，混勻，4℃，12000r/min，離心10min。

5)重復(fù)步驟(4)1-2次，以蛋白層不出現(xiàn)為止。

6)取上清，-20℃沉淀1h，4℃，12000r/min，離心10min。

7)棄去上清液，用70％乙醇洗滌沉淀2次。

8)室溫下干燥后(一般干燥5-15min)，溶于30-50μl DEPC去離子水中，于-20℃或者-70℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8.2轉(zhuǎn)基因煙草的PCR檢測(cè)

PCR反應(yīng)體系：

PCR反應(yīng)程序：

98℃ 1min

98℃ 20s，48℃ 45s，72℃ 1min，35個(gè)循環(huán)

72℃ 10min

取10ul反應(yīng)液進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.9轉(zhuǎn)基因煙草苗對(duì)鹽分的耐受性分析

把經(jīng)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因煙草分為5個(gè)轉(zhuǎn)基因株系(SaVP1-1、SaVP1-2、SaVP1-3、SaVP1-4、SaVP1-5)，每一個(gè)轉(zhuǎn)基因株系分為5個(gè)組(A、B、C、D、E)每一組均包括1棵對(duì)照組的野生型煙草和1棵轉(zhuǎn)基因煙草。A組每天澆灌濃度為0mM NaCl溶液，B-E組每天澆灌NaCl溶液的濃度依次為100mM、200mM、300mM、400mM。

2.試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1大米草RNA的鑒定

對(duì)大米草葉片進(jìn)行總RNA的提取，總RNA經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離，28S rRNA與18S rRNA的條帶清晰，OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.9，未見(jiàn)基因組DNA污染。結(jié)果顯示，提取的大米草總RNA符合實(shí)驗(yàn)要求，能夠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如圖1。

2.2大米草SaVP1基因中間片段的RT-PCR擴(kuò)增

以大米草cDNA為模板，P1，P2為引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。電泳顯示在1245bp存在一條明顯的亮帶，命名為SaVP1a。如圖2。

2.3大米草SaVP1全長(zhǎng)的擴(kuò)增

2.3.15’RACE的擴(kuò)增

以大米草5’-RACE-Ready cDNA為模板，UPM和GSP1為第一輪巢式RCR引物進(jìn)行擴(kuò)增。然后從第一輪的反應(yīng)液中吸取1μl作為巢式PCR第二輪反應(yīng)的模板，以NUP和GSP2為引物進(jìn)行巢式第二輪PCR擴(kuò)增。結(jié)果如圖3.

2.3.23’RACE的擴(kuò)增

以大米草3’-RACE-Ready cDNA為模板，UPM和GSP3為第一輪巢式RCR引物進(jìn)行擴(kuò)增。然后從第一輪的反應(yīng)液中吸取1μl作為巢式PCR第二輪反應(yīng)的模板，以NUP和GSP4為引物進(jìn)行巢式第二輪PCR擴(kuò)增。結(jié)果如圖4.

2.3.3大米草SaVP1全長(zhǎng)的克隆

設(shè)計(jì)特異性引物P3和P4，以cDNA為模板克隆大米草SaVP1的開(kāi)放閱讀框。結(jié)果如圖5所示。

對(duì)序列進(jìn)行測(cè)定和分析，大米草SaVP1的cDNA核苷酸序列全長(zhǎng)如SEQ ID NO.1所示。大米草SaVP1的編碼區(qū)核苷酸序列全長(zhǎng)如SEQ ID NO.2所示(該編碼區(qū)序列位置為SEQ ID NO.1第192-2195核苷酸，長(zhǎng)度為2004個(gè)核苷酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA，編碼667個(gè)氨基酸)。大米草SaVP1所編碼的氨基酸序列則為如SEQ ID NO.3所示，由以上可知：大米草SaVP1序列長(zhǎng)2506bp，其中ORF長(zhǎng)2004bp，共編碼667個(gè)氨基 酸。

2.4大米草SaVP1基因全長(zhǎng)的生物信息學(xué)分析

研究表明，液泡膜H⁺-PPase蛋白位于細(xì)胞質(zhì)的一側(cè)有三個(gè)高度保守區(qū)，即CS1(KAADVGADLVGKVE)、CS2(YYTS)和CS3(GDTIGD)；其中CS1被認(rèn)為是酶的催化位點(diǎn)。通過(guò)對(duì)大米草SaVP1蛋白質(zhì)氨基酸的研究發(fā)現(xiàn)，大米草SaVP1蛋白擁有完整的上述三個(gè)保守區(qū)域，其保守區(qū)CS1在151-164區(qū)域、CS2在325-328區(qū)域、CS3在623-628區(qū)域且這些區(qū)域均在細(xì)胞質(zhì)一側(cè)。由此可以推測(cè)，大米草SaVP1蛋白的酶催化位點(diǎn)在151-164區(qū)域。

2.4.1大米草SaVP1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析

通過(guò)http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝npsa_sopma.html網(wǎng)站預(yù)測(cè)大米草Savp1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖6)。由圖6的預(yù)測(cè)分析可知，大米草SaVP1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中含有8種相似閾值中的4種類型，分別是α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲。其中，α-螺旋共371個(gè)，占蛋白的55.62％；β-折疊共99個(gè)，占蛋白的14.64％；β-轉(zhuǎn)角共23個(gè)，占蛋白的3.45％；無(wú)規(guī)則卷曲共174個(gè)，占蛋白的26.09％。

2.4.2大米草SaVP1蛋白疏水性和親水性分析

疏水性是指氨基酸遠(yuǎn)離周圍水分子，包圍進(jìn)蛋白質(zhì)核心的相對(duì)趨勢(shì)，是蛋白質(zhì)三維空間構(gòu)想的影響因素之一。使用BioEdit軟件預(yù)測(cè)大米草SaVP1氨基酸的疏水性和親水性，預(yù)測(cè)的結(jié)果如圖7、8所示。通過(guò)分析圖7、圖8，大米草SaVP1蛋白質(zhì)中1-14、37-63、87-113、200-213、226-239、276-289、300-329、350-400、450-500、550-589、639-663區(qū)域出現(xiàn)疏水性的氨基酸，而親水性的氨基酸主要出現(xiàn)在20-35、165-175、335-345、430-440、525-535、590-600、610-620、630-635區(qū)域。疏水性區(qū)域在1-14、226-239、350-400出現(xiàn)較大的峰值且峰值為2.8左右，親水性區(qū)域的最大峰值出現(xiàn)在20-35。但是疏水性區(qū)域的峰值一般大于1.4而親水性區(qū)域的峰值一般小于1.4。因此，通過(guò)以上分析推測(cè)，大米草SaVP1為疏水性蛋白質(zhì)。

2.4.3大米草SaVP1跨膜結(jié)構(gòu)分析

跨膜結(jié)構(gòu)域是膜內(nèi)在蛋白與膜結(jié)合的區(qū)域，一般由20個(gè)左右的疏水氨基酸殘基組成，形成α螺旋，它固著于細(xì)胞膜上起錨定作用。借助http://www.ch.embnet.org中的TMPRED和http://cbs.dtu.dk/services中的TMHMM功能分析大米草SaVP1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)。

TMPRED從內(nèi)向外共預(yù)測(cè)到12個(gè)α螺旋，分別是1-18、36-60、92-110、130-148、229-247、266-287、303-321、360-380、443-461、477-493、548-575、644-664區(qū)域，其中在303-321區(qū)域峰值最大，477-493區(qū)域被認(rèn)為是最有可能的跨膜結(jié)構(gòu)；從外向內(nèi)共預(yù)測(cè)到13 個(gè)α螺旋，分別是1-18、40-60、92-110、127-148、227-246、266-285、305-322、360-378、443-461、476-493、543-563、548-582、640-664區(qū)域，其中305-322區(qū)域峰值最大，127-148、266-285、548-582區(qū)域被認(rèn)為是最有可能的跨膜結(jié)構(gòu)(圖9)。TMHMM共預(yù)測(cè)到12個(gè)α螺旋，分別是2-19、39-61、91-113、128-147、228-250、265-287、300-322、349-371、378-400、439-461、468-490、556-578區(qū)域(圖10)。TMPRED和TMHMM是基于不同算法的兩種軟件，但是對(duì)于大米草SaVP1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)極其相近。

2.4.4大米草SaVP1信號(hào)肽分析

信號(hào)肽位于蛋白質(zhì)的N端，是一段引導(dǎo)信合成的肽鏈進(jìn)入細(xì)胞器的識(shí)別序列，一般由16-26個(gè)氨基酸殘基組成，蛋白質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)中的核糖體上合成后，在信號(hào)肽的引導(dǎo)下，轉(zhuǎn)運(yùn)至不同的細(xì)胞器或細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的特定部位發(fā)揮作用。利用網(wǎng)絡(luò)http://www.cbs.dtu.dk/services/中的SignaIP分析大米草SaVP1蛋白質(zhì)的信號(hào)肽。

在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法中，標(biāo)記為C的列式剪切位點(diǎn)打分，標(biāo)記為S的列式信號(hào)肽打分，Y列是綜合接切點(diǎn)打分。只有C、Y、S值的計(jì)算結(jié)論為YES的預(yù)測(cè)結(jié)果較好，具有高C分值時(shí)又是S分值由高轉(zhuǎn)低的位點(diǎn)才是信號(hào)肽預(yù)測(cè)的最可能的剪切點(diǎn)。由圖11可推知，大米草SaVP1蛋白N端存在一段由18個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽，其信號(hào)肽剪切點(diǎn)最有可能在17-18區(qū)域。通過(guò)分析馬科夫模型(圖12)同樣顯示其信號(hào)肽剪切點(diǎn)最有可能在17-18區(qū)域，說(shuō)明對(duì)大米草SaVP1蛋白信號(hào)肽的預(yù)測(cè)是可信的。

2.5植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-SaVP1的構(gòu)建

整個(gè)載體構(gòu)建的過(guò)程見(jiàn)圖13。本載體構(gòu)建的思路是：首先，用帶有限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的NcoI和BstEII的引物克隆目的基因SaVP1，然后使目的基因SaVP1與克隆載體pMD18-T連接，將連接的產(chǎn)物送去測(cè)序，選擇測(cè)序正確的pMD18-T-SaVP1重組體；其次，使用限制性內(nèi)切酶NcoI和BstEII分別對(duì)pCAMBIA1301和pMD18-T-SaVP1重組體進(jìn)行雙酶切并對(duì)pCAMBIA1301的大片段即去掉GUS的片段和pMD18-T-SaVP1重組體的小片段即SaVP1回收并純化；再次，將回收的兩個(gè)片段進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α篩選陽(yáng)性單克隆重組體pCAMBIA1301-SaVP1；最后，將重組體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404并篩選重組體pCAMBIA1301-SaVP1。酶切結(jié)果如圖14，PCR檢測(cè)pCAMBIA1301-SaVP1轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌結(jié)果如圖15。

2.6葉盤法轉(zhuǎn)化煙草

2.6.1共培養(yǎng)

共培養(yǎng)48h后，可以觀察到葉盤開(kāi)始膨大。但是一些比較幼嫩、面積較小的葉盤無(wú)此變 化或開(kāi)始褐化，這些葉盤很有可能沒(méi)有轉(zhuǎn)化成功。

2.6.2誘導(dǎo)生芽

葉盤轉(zhuǎn)入MS₂培養(yǎng)基約2周后，疑似轉(zhuǎn)化成功的葉盤會(huì)繼續(xù)膨大并有愈傷長(zhǎng)出，未轉(zhuǎn)化成功的葉盤會(huì)慢慢死亡。葉盤在MS₂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)約1月左右，誘導(dǎo)的芽可轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基MS₃中誘導(dǎo)生根。

2.6.3誘導(dǎo)生根

選擇長(zhǎng)勢(shì)良好的芽，從葉盤的基部切下插入MS₃培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。試驗(yàn)共得到329顆無(wú)菌苗。2周后對(duì)生根情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，共有291顆苗生根，生根率為88.4％。

2.6.4移栽

待生根的煙草苗生長(zhǎng)健壯，經(jīng)過(guò)煉苗以后移入土中。溫室中培養(yǎng)大約2個(gè)月便可開(kāi)花結(jié)果。煙草轉(zhuǎn)化過(guò)程如圖16所示。

2.7PCR檢測(cè)

用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草的基因組DNA，使用1％的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖17所示。使用在pCAMBIA1301的35S promoter和目的基因Savp1上分別設(shè)計(jì)的引物SaVP1P1和SaVP1P2進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的PCR檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖18所示。

2.8轉(zhuǎn)基因煙草苗對(duì)鹽分的耐受性分析

選取5個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草株系中的一個(gè)株系對(duì)鹽分的耐受性分析顯示，在沒(méi)有NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草的生長(zhǎng)狀況沒(méi)有明顯的差異；當(dāng)200mMNaCl脅迫14天后，轉(zhuǎn)基因煙草仍能正常生長(zhǎng)，野生型煙草葉片開(kāi)始發(fā)黃；當(dāng)300mMNaCl脅迫14天后，轉(zhuǎn)基因煙草仍能正常生長(zhǎng)，而野生型煙草的葉片開(kāi)始枯萎，影響正常的生長(zhǎng)；但是當(dāng)使用脅迫的NaCl的濃度達(dá)到400mM時(shí)，脅迫14天后轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草均不能生長(zhǎng)。如圖19。

由表1可知，對(duì)5個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草株系進(jìn)行鹽分的耐受性試驗(yàn)結(jié)果顯示，在300mMNaCl濃度脅迫下，4個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草株系仍能生長(zhǎng)，但在400mMNaCl濃度下全部死亡；而野生型煙草在200mMNaCl濃度脅迫下不能正常生長(zhǎng)，表明SaVP1轉(zhuǎn)基因株能提高煙草耐鹽性。

表1 轉(zhuǎn)基因煙草株系的耐受性分析

注：++++：表示煙草株高大于10cm；+++：表示煙草株高大于5cm小于10cm；

+：表示煙草株高小于5cm；-：表示煙草死亡，記為0cm。

<110> 南京曉莊學(xué)院

<120> 大米草液泡膜焦磷酸酶SaVP1基因及其應(yīng)用

<160> 3

<210> 1

<211> 2506

<212> DNA

<213> 米草屬大米草（Spartina anglica）

<220>

<223> 液泡膜焦磷酸酶SaVP1基因

<400> 1

gggtgaagct ctcgcccgcc gcggccgcgt ccggcggcaa caagaacggc ggctacggcg 60

actatctcat cgaggaggag gagggcctca acgaccacaa cgtcgtcgtc aagtgcgccg 120

agatccagac cgccatctcc gaaggagcaa catcgtttct cttcactgag taccagtatg 180

ttggtatttt catgtcgatc tttgctgttg ttatctttct cttccttggt tcagttgagg 240

gattcagcac aaagagccag ccttgcacct acagcaagga caagacttgc aagccggccc 300

tgttcactgc tctcttcagc actgtgtctt tcttgcttgg agcaatcacc tctctggtct 360

ctggttttct tggaatgaag attgccacat atgccaatgc taggactacc ctggaagcta 420

ggaagggtgt tgggaaagca tttatcactg ctttccgctc tggtgctgtt atgggatttt 480

tgcttgcatc aagtgggctc gtggttctgt acattactat caacgtgttc aagttgtatt 540

acggagatga ctgggagggt ctttttgagt ccatcactgg ttatggcctt ggtggttctt 600

ccatggctct ctttggaaga gttggtggtg gtatttacac aaaggctgca gatgtgggtg 660

ctgatcttgt tggcaaagtt gagaggaaca tccccgagga tgatcctagg aacccagctg 720

tgattgcaga caacgttggt gacaatgtcg gtgacattgc tggaatggga tcagacctct 780

ttggttcata tgcagaatct tcctgcgctg cccttgttgt tgcatctatt tcatcttttg 840

gaatcaacca cgatttcacc gggatgtgct tccccctgct ggttagctct gttggtatca 900

tcgtctgctt gatcacgaca ctgtttgcaa ccgatttctt tgaggttaag gctgtggagg 960

aaatcgagcc tgcacttaag aagcagcttg tcatctccac tgttttgatg accgctggta 1020

ttgcaattat cagctggttg gcccttccag ccaagttcac tatcttcaac ttcggtgccc 1080

agaaggaagt gtctaagtgg ggtttgttct tctgtgttgc aattggtctg tgggctggtc 1140

tgattattgg atttgtgaca gaatactaca ctagcaatgc gtacagccct gtgcaagatg 1200

ttgctgattc ctgcaggacc ggtgctgcca ctaatgtcat atttggtctt gctctaggat 1260

acaagtctgt tatcatccca atttttgcaa ttgcgctcag catctttgtc agtttctcta 1320

ttgctgcaat gtacggcata gcagttgctg ctcttggtat gctaagcaca attgccactg 1380

gccttgctat tgatgcttat ggtcccatca gtgacaatgc tggtggtatt gctgagatgg 1440

ctggaatgag ccacaggatc cgtgagagaa ctgatgcact tgatgctgct ggcaacacaa 1500

cggctgccat tggaaaggga tttgcaattg gatcagctgc tcttgtgtcc cttgcacttt 1560

ttggtgcctt tgtcagcaga gctggagtgc aggttgttga tgtcttatcc cctaaggtct 1620

tcattggttt gattgttggg gccatgcttc cgtactggtt ctctgcaatg accatgaaga 1680

gtgtgggaag tgctgctctg aagatggtgg aggaggtccg caggcagttc aacaccattc 1740

ctgggctgat ggagggaact gggaaacctg actatgccac atgtgtcaag atctctaccg 1800

atgcttccat caaagagatg attcctcctg gtgcattggt catgctcaca ccccttattg 1860

ttggaaccct gtttggtgtg cagactctct ctggcgttct tgctggtgcc cttgtttctg 1920

gagtgcaggt tgccatctct gcctccaaca ctggtggtgc atgggacaat gccaagaagt 1980

acatcgaggc tggtgccagt gagcacgcta ggaccctggg ccccaaggga tctgactgcc 2040

acaaggctgc tgtgattggc gataccattg gcgaccctct gaaagacacc tctggcccct 2100

ccctcaacat cctcatcaag ctcatggccg ttgagtcact cgtgtttgct cccttctttg 2160

ccacacacgg tggcctgctc ttcaagctat tctaagcacc acaccaagcg cagcagaagt 2220

atatgattta tgggacatca caaataactc ctgccagatt gccagtccgt cgcgtgctgc 2280

attgcaccgc tgtttttttt gtttaggtat gttgttggag gattgctact ggtttcactt 2340

ttggcctcca ggaggcgtta ttttggtctt tccgcttcta gcttcatgta gaagagaaca 2400

ggtgtccccc gaccctgcgt atgtcaaatt ttctcatccc ctgatgacgg cgataataca 2460

tgattattgc attgcaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 2506

<210> 2

<211> 2004

<212> DNA

<213> 米草屬大米草（Spartina anglica）

<220>

<223> 液泡膜焦磷酸酶SaVP1基因開(kāi)放閱讀框

<400> 2

atgtcgatct ttgctgttgt tatctttctc ttccttggtt cagttgaggg attcagcaca 60

aagagccagc cttgcaccta cagcaaggac aagacttgca agccggccct gttcactgct 120

ctcttcagca ctgtgtcttt cttgcttgga gcaatcacct ctctggtctc tggttttctt 180

ggaatgaaga ttgccacata tgccaatgct aggactaccc tggaagctag gaagggtgtt 240

gggaaagcat ttatcactgc tttccgctct ggtgctgtta tgggattttt gcttgcatca 300

agtgggctcg tggttctgta cattactatc aacgtgttca agttgtatta cggagatgac 360

tgggagggtc tttttgagtc catcactggt tatggccttg gtggttcttc catggctctc 420

tttggaagag ttggtggtgg tatttacaca aaggctgcag atgtgggtgc tgatcttgtt 480

ggcaaagttg agaggaacat ccccgaggat gatcctagga acccagctgt gattgcagac 540

aacgttggtg acaatgtcgg tgacattgct ggaatgggat cagacctctt tggttcatat 600

gcagaatctt cctgcgctgc ccttgttgtt gcatctattt catcttttgg aatcaaccac 660

gatttcaccg ggatgtgctt ccccctgctg gttagctctg ttggtatcat cgtctgcttg 720

atcacgacac tgtttgcaac cgatttcttt gaggttaagg ctgtggagga aatcgagcct 780

gcacttaaga agcagcttgt catctccact gttttgatga ccgctggtat tgcaattatc 840

agctggttgg cccttccagc caagttcact atcttcaact tcggtgccca gaaggaagtg 900

tctaagtggg gtttgttctt ctgtgttgca attggtctgt gggctggtct gattattgga 960

tttgtgacag aatactacac tagcaatgcg tacagccctg tgcaagatgt tgctgattcc 1020

tgcaggaccg gtgctgccac taatgtcata tttggtcttg ctctaggata caagtctgtt 1080

atcatcccaa tttttgcaat tgcgctcagc atctttgtca gtttctctat tgctgcaatg 1140

tacggcatag cagttgctgc tcttggtatg ctaagcacaa ttgccactgg ccttgctatt 1200

gatgcttatg gtcccatcag tgacaatgct ggtggtattg ctgagatggc tggaatgagc 1260

cacaggatcc gtgagagaac tgatgcactt gatgctgctg gcaacacaac ggctgccatt 1320

ggaaagggat ttgcaattgg atcagctgct cttgtgtccc ttgcactttt tggtgccttt 1380

gtcagcagag ctggagtgca ggttgttgat gtcttatccc ctaaggtctt cattggtttg 1440

attgttgggg ccatgcttcc gtactggttc tctgcaatga ccatgaagag tgtgggaagt 1500

gctgctctga agatggtgga ggaggtccgc aggcagttca acaccattcc tgggctgatg 1560

gagggaactg ggaaacctga ctatgccaca tgtgtcaaga tctctaccga tgcttccatc 1620

aaagagatga ttcctcctgg tgcattggtc atgctcacac cccttattgt tggaaccctg 1680

tttggtgtgc agactctctc tggcgttctt gctggtgccc ttgtttctgg agtgcaggtt 1740

gccatctctg cctccaacac tggtggtgca tgggacaatg ccaagaagta catcgaggct 1800

ggtgccagtg agcacgctag gaccctgggc cccaagggat ctgactgcca caaggctgct 1860

gtgattggcg ataccattgg cgaccctctg aaagacacct ctggcccctc cctcaacatc 1920

ctcatcaagc tcatggccgt tgagtcactc gtgtttgctc ccttctttgc cacacacggt 1980

ggcctgctct tcaagctatt ctaa 2004

<210> 3

<211> 667

<212> PRT

<213> 米草屬大米草（Spartina anglica）

<220>

<223> 液泡膜焦磷酸酶SaVP1基因編碼的氨基酸序列

<400> 3

Met Ser Ile Phe Ala Val Val Ile Phe Leu Phe Leu Gly Ser Val Glu

5 10 15

Gly Phe Ser Thr Lys Ser Gln Pro Cys Thr Tyr Ser Lys Asp Lys Thr

20 25 30

Cys Lys Pro Ala Leu Phe Thr Ala Leu Phe Ser Thr Val Ser Phe Leu

35 40 45

Leu Gly Ala Ile Thr Ser Leu Val Ser Gly Phe Leu Gly Met Lys Ile

50 55 60

Ala Thr Tyr Ala Asn Ala Arg Thr Thr Leu Glu Ala Arg Lys Gly Val

65 70 75 80

Gly Lys Ala Phe Ile Thr Ala Phe Arg Ser Gly Ala Val Met Gly Phe

85 90 95

Leu Leu Ala Ser Ser Gly Leu Val Val Leu Tyr Ile Thr Ile Asn Val

100 105 110

Phe Lys Leu Tyr Tyr Gly Asp Asp Trp Glu Gly Leu Phe Glu Ser Ile

115 120 125

Thr Gly Tyr Gly Leu Gly Gly Ser Ser Met Ala Leu Phe Gly Arg Val

130 135 140

Gly Gly Gly Ile Tyr Thr Lys Ala Ala Asp Val Gly Ala Asp Leu Val

145 150 155 160

Gly Lys Val Glu Arg Asn Ile Pro Glu Asp Asp Pro Arg Asn Pro Ala

165 170 175

Val Ile Ala Asp Asn Val Gly Asp Asn Val Gly Asp Ile Ala Gly Met

180 185 190

Gly Ser Asp Leu Phe Gly Ser Tyr Ala Glu Ser Ser Cys Ala Ala Leu

195 200 205

Val Val Ala Ser Ile Ser Ser Phe Gly Ile Asn His Asp Phe Thr Gly

210 215 220

Met Cys Phe Pro Leu Leu Val Ser Ser Val Gly Ile Ile Val Cys Leu

225 230 235 240

Ile Thr Thr Leu Phe Ala Thr Asp Phe Phe Glu Val Lys Ala Val Glu

245 250 255

Glu Ile Glu Pro Ala Leu Lys Lys Gln Leu Val Ile Ser Thr Val Leu

260 265 270

Met Thr Ala Gly Ile Ala Ile Ile Ser Trp Leu Ala Leu Pro Ala Lys

275 280 285

Phe Thr Ile Phe Asn Phe Gly Ala Gln Lys Glu Val Ser Lys Trp Gly

290 295 300

Leu Phe Phe Cys Val Ala Ile Gly Leu Trp Ala Gly Leu Ile Ile Gly

305 310 315 320

Phe Val Thr Glu Tyr Tyr Thr Ser Asn Ala Tyr Ser Pro Val Gln Asp

325 330 335

Val Ala Asp Ser Cys Arg Thr Gly Ala Ala Thr Asn Val Ile Phe Gly

340 345 350

Leu Ala Leu Gly Tyr Lys Ser Val Ile Ile Pro Ile Phe Ala Ile Ala

355 360 365

Leu Ser Ile Phe Val Ser Phe Ser Ile Ala Ala Met Tyr Gly Ile Ala

370 375 380

Val Ala Ala Leu Gly Met Leu Ser Thr Ile Ala Thr Gly Leu Ala Ile

385 390 395 400

Asp Ala Tyr Gly Pro Ile Ser Asp Asn Ala Gly Gly Ile Ala Glu Met

405 410 415

Ala Gly Met Ser His Arg Ile Arg Glu Arg Thr Asp Ala Leu Asp Ala

420 425 430

Ala Gly Asn Thr Thr Ala Ala Ile Gly Lys Gly Phe Ala Ile Gly Ser

435 440 445

Ala Ala Leu Val Ser Leu Ala Leu Phe Gly Ala Phe Val Ser Arg Ala

450 455 460

Gly Val Gln Val Val Asp Val Leu Ser Pro Lys Val Phe Ile Gly Leu

465 470 475 480

Ile Val Gly Ala Met Leu Pro Tyr Trp Phe Ser Ala Met Thr Met Lys

485 490 495

Ser Val Gly Ser Ala Ala Leu Lys Met Val Glu Glu Val Arg Arg Gln

500 505 510

Phe Asn Thr Ile Pro Gly Leu Met Glu Gly Thr Gly Lys Pro Asp Tyr

515 520 525

Ala Thr Cys Val Lys Ile Ser Thr Asp Ala Ser Ile Lys Glu Met Ile

530 535 540

Pro Pro Gly Ala Leu Val Met Leu Thr Pro Leu Ile Val Gly Thr Leu

545 550 555 560

Phe Gly Val Gln Thr Leu Ser Gly Val Leu Ala Gly Ala Leu Val Ser

565 570 575

Gly Val Gln Val Ala Ile Ser Ala Ser Asn Thr Gly Gly Ala Trp Asp

580 585 590

Asn Ala Lys Lys Tyr Ile Glu Ala Gly Ala Ser Glu His Ala Arg Thr

595 600 605

Leu Gly Pro Lys Gly Ser Asp Cys His Lys Ala Ala Val Ile Gly Asp

610 615 620

Thr Ile Gly Asp Pro Leu Lys Asp Thr Ser Gly Pro Ser Leu Asn Ile

625 630 635 640

Leu Ile Lys Leu Met Ala Val Glu Ser Leu Val Phe Ala Pro Phe Phe

645 650 655

Ala Thr His Gly Gly Leu Leu Phe Lys Leu Phe

660 665 667