背景技術(shù)：
：在心臟外科領(lǐng)域，目前使用的各種補(bǔ)片、管道都沒(méi)有生長(zhǎng)能力，無(wú)法輔助心臟功能，遠(yuǎn)期還會(huì)出現(xiàn)感染、血栓形成、毀損等。同時(shí)，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病發(fā)病率高，心肌梗死后再生能力非常有限，因此尋找一種新的更好的治療手段已成為臨床及基礎(chǔ)研究熱點(diǎn)，細(xì)胞移植或體外構(gòu)建組織工程心肌將是一個(gè)很有前景的治療選擇。臍帶干細(xì)胞易于獲取，體外增殖分化能力強(qiáng)，利用臍帶干細(xì)胞分化來(lái)的心肌細(xì)胞體外構(gòu)建組織工程心肌，植入后能與機(jī)體發(fā)生電機(jī)械耦連，并且能夠隨機(jī)體生長(zhǎng)而生長(zhǎng)，是非常理想的細(xì)胞來(lái)源?；诖耍覀儾捎妹赶?，成功從臍帶組織中分離出干細(xì)胞(武開(kāi)宏，莫緒明，劉迎龍，盧士紅，韓忠朝。酶消化法分離臍帶干細(xì)胞。中華小兒外科雜志。2008；29(3)：159-162)。我們研究發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)劑5-氮胞苷(5μmol/L)的作用下，臍帶干細(xì)胞能夠分化為心肌細(xì)胞，但是分化效率較低，只有約30％的臍帶干細(xì)胞能夠分化為心肌細(xì)胞(武開(kāi)宏，莫緒明，盧士紅，周斌，韓忠朝。臍帶干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞樣的實(shí)驗(yàn)研究。中華小兒外科雜志2009；30(10)：33-6)。仍然無(wú)法滿足體外組織工程心肌研究的需要。進(jìn)一步，我們經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)劑中加入堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1，能明顯提高臍帶干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的效率，分化效率由30％提高到50-70％，為體外組織工程心肌研究提供了一個(gè)新的快速獲取心肌細(xì)胞的方法，也可為心肌細(xì)胞損傷后提供補(bǔ)充來(lái)源，為干細(xì)胞移植治療心肌梗死及晚期心功能不全等奠定了基礎(chǔ)，具有很好的臨床應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
：采用膠原酶消化法分離臍帶干細(xì)胞。取培養(yǎng)分離的臍帶干細(xì)胞，接種于24孔培養(yǎng)板，心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化液含DF12培養(yǎng)基，胎牛血清和5-氮胞苷。4周后，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測(cè)心肌特異性基因肌鈣蛋白T，免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定心肌特異性肌球蛋白Myosin抗體和連接蛋白Connexin43抗體及細(xì)胞透射電鏡檢查。在心肌誘導(dǎo)培養(yǎng)液中加入堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1，采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)細(xì)胞分化效率，并與單純心肌細(xì)胞誘導(dǎo)進(jìn)行對(duì)比研究。同時(shí)確定誘導(dǎo)分化時(shí)間，為實(shí)際應(yīng)用中的濃度和時(shí)間提供參考基礎(chǔ)。確定可以用20ng/ml濃度的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和2.5ng/ml轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1，能夠明顯提高臍帶干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的效率。

本發(fā)明為體外組織工程心肌研究提供了一個(gè)新的快速獲取心肌細(xì)胞的方法，也為缺血性心血管疾病的細(xì)胞治療研究，提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)資料。本發(fā)明內(nèi)容未公開(kāi)發(fā)表，本領(lǐng)域的相關(guān)技術(shù)人員如不花費(fèi)創(chuàng)造性勞動(dòng)根本不可能根據(jù)現(xiàn)有的技術(shù)推斷得到本發(fā)明的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法。

附圖說(shuō)明：

圖1：分離培養(yǎng)的臍帶干細(xì)胞，細(xì)胞增殖能力旺盛，呈旋渦狀生長(zhǎng)。

圖2：誘導(dǎo)2周后，細(xì)胞的形態(tài)不斷發(fā)生變化一些細(xì)胞的體積增大，空泡樣改變。

圖3：4周后，免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示心肌特異性肌球蛋白陽(yáng)性，誘導(dǎo)分化效率30％。

圖4：加入堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1，免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)心肌特異性肌球蛋白示心肌細(xì)胞分化效率為50-70％。

具體實(shí)施方式：

實(shí)施例1.臍帶干細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定及心肌細(xì)胞分化

取無(wú)污染的足月剖宮產(chǎn)健康胎兒臍帶，采用酶消化法分離臍帶干細(xì)胞并進(jìn)行鑒定。流式細(xì)胞分析臍帶干細(xì)胞表達(dá)CD13、CD29、CD44、CD90、CD105、CD166和MHC-I，而不表達(dá)CD31、CD34和CD106，MHC-II。誘導(dǎo)前臍帶干細(xì)胞形態(tài)成典型的成纖維樣細(xì)胞形態(tài)，誘導(dǎo)2周后，細(xì)胞的形態(tài)不斷發(fā)生變化一些細(xì)胞的體積增大，空泡樣改變。

取培養(yǎng)分離的臍帶干細(xì)胞，以5×10⁴/cm²細(xì)胞接種在T25培養(yǎng)瓶中，6h后細(xì)胞貼壁，按5μmol/L加入誘導(dǎo)劑5-氮胞苷，孵育24h，之后去除誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以PBS溶液充分沖洗2次，改普通培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)基組成：DF12培養(yǎng)基，5％胎牛血清，10μg/ml胰島素，100U/ml青、鏈霉素，5ng/ml表皮生長(zhǎng)因子。細(xì)胞達(dá)80-90％融合后，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)4周。4周后，RT-PCR檢測(cè)心肌特異性肌鈣蛋白T基因陽(yáng)性，免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定心肌特異性肌球蛋白Myosin抗體和連接蛋白Connexin43抗體陽(yáng)性，心肌細(xì)胞分化效率為30％，細(xì)胞透射電鏡檢查示細(xì)胞質(zhì)膜下及胞質(zhì)中有散在小片或小束微肌絲樣結(jié)構(gòu)出現(xiàn)。

實(shí)施例2.提高臍帶干細(xì)胞的心肌細(xì)胞分化效率

在心肌細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液中加入堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1，培養(yǎng)方法同實(shí)施例1，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)分化后的臍帶干細(xì)胞表達(dá)心肌特異性肌球蛋白Myosin抗體和連接蛋白Connexin43抗體，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞分化的效率提高到50-70％。同時(shí)，確定可以用20ng/ml濃度的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和2.5ng/ml轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1來(lái)提高臍帶干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的效率。