本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及水稻SNB基因在增加穗粒數(shù)和降低株高中的應(yīng)用。通過轉(zhuǎn)基因的方法，在水稻中超量表達(dá)microRNA172結(jié)合位點(diǎn)突變的rSNB基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)顯著的增加了穗粒數(shù)和降低了株高，表明SNB基因在水稻遺傳改良中具有重要的利用價值。

背景技術(shù)：

隨著全球人口的不斷增長以及人類消費(fèi)方式的改變，全球的糧食危機(jī)日益嚴(yán)峻。水稻是全球最重要的糧食作物之一，我國有超過一半的人口以稻谷為主糧，因此提高水稻的產(chǎn)量對保障國家的糧食安全具有重要的戰(zhàn)略意義。

水稻的單株產(chǎn)量是由分蘗數(shù)、每穗穎花數(shù)和粒重共同決定的，其中每穗穎花數(shù)的多少取決于穗型的形成過程。水稻的穗是在進(jìn)入生殖生長以后由花序分生組織分化而來的，在最終形成花器官之前，水稻的穗部會逐漸產(chǎn)生一次枝梗分生組織、二次枝梗分生組織和小穗分生組織，這些不同分生組織之間轉(zhuǎn)變的時間在很大程度上決定了水稻的穗型(Kyozuka et al.,Control of grass inflorescence form by the fine-tuning of meristem phase change.Curr Opin Plant Biol,2014,17:110-115)。如果小穗分生組織的分化被推遲的話，則可能產(chǎn)生更多的二次枝梗甚至三次枝梗，從而可以提高最終的穗粒數(shù)。鑒于在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有重要的利用價值，有關(guān)穗型的研究長期以來都是植物學(xué)研究的熱門領(lǐng)域，科學(xué)家已經(jīng)通過各種手段，分離克隆了多個參與穗型形成決定的基因，并且一些基因已經(jīng)在育種實(shí)踐中得到了應(yīng)用(Zhang and Yuan,Molecular control of grass inflorescence development.Annu Rev Plant Biol,2014,65:553-578)。從目前分離到的基因來看，轉(zhuǎn)錄因子在其中占了很大的一部分，表明基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控對穗型的形成具有重要的決定作用。申請人通過分析水稻多個連續(xù)發(fā)育階段的幼穗的全基因組轉(zhuǎn)錄組也發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)模式在不同的發(fā)育時期差別很大，這也進(jìn)一步暗示轉(zhuǎn)錄因子在修飾穗型中發(fā)揮著核心的作用(Wang et al.,A dynamic gene expression atlas covering the entire life cycle of rice.Plant J,2010,61:752-766)。

株高是決定水稻產(chǎn)量的另外一個重要的因素。上個世紀(jì)以降低株高為目標(biāo)的第一次“綠色革命”培育的半矮稈品種，極大的增加了全球農(nóng)作物的產(chǎn)量。因?yàn)樗局旮吆椭仓甑牡狗允敲芮邢嚓P(guān)的，株高矮化，可以提高作物的耐肥性，增加抗倒伏性，提高收獲指數(shù)，從而可以大幅度增加產(chǎn)量。2002年水稻綠色革命基因SD1被成功克隆，其編碼的是一種赤霉素氧化酶，控制赤霉素的合成(Sasaki et al.,Green revolution:a mutant gibberellins-synthesis gene in rice.Nature,2002,416:701-702)。除了赤霉素，油菜素甾醇、生長素、獨(dú)腳金內(nèi)酯和細(xì)胞分裂素等多種植物激素也參與決定植物的株高(Wang and Li，Molecular basis of plant architecture.Annu Rev Plant Biol,2008,59:253-279)。

MicroRNA172是一類在不同植物中高度保守的非編碼小RNA，其通過調(diào)節(jié)AP2類的轉(zhuǎn)錄因子來發(fā)揮作用。AP2是最早被鑒定的參與花器官模式建成的A類基因，因此microRNA172和AP2之間的調(diào)控作用對花器官的形態(tài)建成具有重要的調(diào)節(jié)作用(Chen,A microRNA as a translational repressor of APETALA2 in Arabidopsis flower development.Science,2004,303:2022-2025)。此外，受microRNA172調(diào)節(jié)的AP2類基因 還在植物多個發(fā)育過程中發(fā)揮作用，比如參與玉米的性別決定過程，也與大麥的閉花受精和密穗的形成過程密切相關(guān)(Chuck et al.,The maize tasselseed4microRNA controls sex determination and meristem cell fate by targeting Tasselseed6/indeterminate spikelet1.Nat Genet,2007,39:1517-1521；Houston et al.,Variation in the interaction between alleles of HvAPETALA2and microRNA172determines the density of grains on the barley inflorescence.Proc Natl Acad Sci U S A,2013,110:16675-16680；Nair et al.,Cleistogamous flowering in barley arises from the suppression of microRNA-guided HvAP2mRNA cleavage.Proc Natl Acad Sci U S A,2010,107:490-495)。在水稻中已有兩個受microRNA172調(diào)節(jié)的AP2類基因(SNB和OsIDS1)被報道參與花器官的發(fā)育，在它們的雙突變體中，穗部分枝和穎花數(shù)會嚴(yán)重減少，因此這些基因的突變體等遺傳材料無法直接用于水稻的育種(Lee and An,Two AP2family genes,SUPERNUMERARY BRACT(SNB)and OsINDETERMINATE SPIKELET 1(OsIDS1),synergistically control inflorescence architecture and floral meristem establishment in rice.Plant J,2012,69:445-461)。本發(fā)明通過超量表達(dá)microRNA172識別位點(diǎn)突變的rSNB基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)增加了水稻穗粒數(shù)和降低了水稻的株高，為在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上利用SNB基因來對水稻進(jìn)行遺傳改良提供了新的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種SNB基因在增加水稻穗粒數(shù)和降低株高中的應(yīng)用。本發(fā)明的另外一個目的是提供一種突變SNB基因中microRNA172結(jié)合位點(diǎn)的方法，以及超量表達(dá)microRNA172結(jié)合位點(diǎn)突變的rSNB基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)的載體和含有該載體的轉(zhuǎn)基因水稻。同時本發(fā)明還提供了一種通過SNB及microRNA172結(jié)合位點(diǎn)突變的rSNB基因來增加水稻穗粒數(shù)和降低株高的方法。所述的SNB基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，microRNA172結(jié)合位點(diǎn)突變的rSNB基因具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，它們編碼的蛋白質(zhì)序列如SEQ ID NO:3所示。本發(fā)明也包括其他改變microRNA172結(jié)合位點(diǎn)而得到的rSNB的等位基因或衍生物。本發(fā)明通過超量表達(dá)microRNA172結(jié)合位點(diǎn)突變的rSNB基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)顯著增加了水稻的穗粒數(shù)和降低了水稻的株高，這些結(jié)果表明SNB基因在水稻育種中可能具有重要的利用價值。SNB和microRNA172結(jié)合位點(diǎn)突變的rSNB基因可用于與其它調(diào)控元件，如組成型啟動子或器官特異性啟動子融合以構(gòu)建基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻而改良重要的農(nóng)藝性狀。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：

1、分離水稻SNB基因的編碼區(qū)的cDNA；具體方法在實(shí)施例1中有詳細(xì)描述。

2、以上述cDNA作為模板，利用重疊延伸PCR的方法突變SNB基因中的microRNA172的識別位點(diǎn)；具體的方法在實(shí)施例2中有詳細(xì)描述。

3、將microRNA172結(jié)合位點(diǎn)突變的rSNB基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)連接到pCAMBIA1301S載體上，構(gòu)建超量表載體35S:rSNBOE；具體方法在實(shí)施例3中有詳細(xì)描述。

4、利用優(yōu)化過的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法(Lin and Zhang,Optimising the tissue culture conditions forhigh efficiency transformation of indica rice.Plant Cell Rep,2005,23:540-548)將載體35S:rSNBOE導(dǎo)入水稻受體中花11(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所)，獲得轉(zhuǎn)化植株；具體方法在實(shí)施例4中有詳細(xì)描述。

5、借助PCR的方法分析鑒定陽性轉(zhuǎn)基因植株和共分離檢測，并對T1代單株進(jìn)行表型鑒定和統(tǒng)計分析；具體方法在實(shí)施例5中有詳細(xì)描述。

6、利用擬南芥原生質(zhì)體瞬時表達(dá)系統(tǒng)，檢測SNB蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄活性；具體方法在實(shí)施例6中有詳細(xì) 描述。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下：

1、本發(fā)明克隆的SNB基因具有增加水稻穗粒數(shù)和降低株高的功能。

2、本發(fā)明將microRNA172識別位點(diǎn)突變的rSNB基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)導(dǎo)入水稻，實(shí)現(xiàn)了對水稻穗粒數(shù)和株高的遺傳改良。

3、本發(fā)明建立了一種利用SNB基因來對水稻穗粒數(shù)和株高進(jìn)行遺傳改良的方法。

附圖說明

序列表SEQ ID NO:1是SNB基因(原基因)的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO:2是microRNA172識別位點(diǎn)被人工同義突變的rSNB基因(突變后的基因)的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO:3是SNB基因和rSNB基因編碼的蛋白質(zhì)序列(雖然rSNB相對于SNB有核苷酸突變，但是它們編碼的氨基酸是不變的，最大的區(qū)別就在于，突變后的rSNB基因與突變前的SNB基因相比活性有明顯不同，這是本發(fā)明的顯著特點(diǎn))。

圖1：SNB基因與microRNA172(有時簡稱miR172)的核苷酸配對示意圖。附圖標(biāo)記說明：

圖中紅色字母表示SNB基因中microRNA172的結(jié)合位點(diǎn)突變后的序列，相對于SNB基因的序列，突變后形成的rSNB將不再受microRNA172調(diào)控，但是所編碼的蛋白質(zhì)依然與SNB基因是一樣。

圖2：利用重疊延伸PCR方法突變SNB基因中的microRNA172結(jié)合位點(diǎn)的示意圖。

附圖標(biāo)記說明：紅色、綠色和紫色片段代表SNB基因中用于設(shè)計引物的區(qū)段；藍(lán)色片段代表SNB基因中的microRNA172的結(jié)合位點(diǎn)；橙色的片段代表SNB基因中的microRNA172的結(jié)合位點(diǎn)被突變后形成的序列。

圖3：表達(dá)載體35S:rSNBOE構(gòu)建過程示意圖。附圖標(biāo)記說明：

圖3中的A圖：插入表達(dá)載體35S:rSNBOE的包含有rSNB蛋白質(zhì)編碼區(qū)的DNA片段示意圖。

圖3中的B圖：用于構(gòu)建表達(dá)載體35S:rSNBOE的空載體pCAMBIA1301S的結(jié)構(gòu)示意圖。

本發(fā)明將圖3中的A圖所示的片段通過BamHI和XbaI雙酶切插入圖3中的B圖所示的載體pCAMBIA1301S的BamHI和XbaI酶切位點(diǎn)中間形成轉(zhuǎn)化用的表達(dá)載體35S:rSNBOE。

圖4：本發(fā)明構(gòu)建的表達(dá)載體35S:rSNBOE結(jié)構(gòu)示意圖。

圖5：35S:rSNBOE轉(zhuǎn)基因T1代單株的基因型檢測結(jié)果。附圖標(biāo)記說明：

圖5中的A圖：35S:rSNBOE轉(zhuǎn)基因第一個家系的T1代植株基因型檢測。所用的引物是SNBOEJCF和SNBOEJCR，612bp大小的產(chǎn)物是該引物對擴(kuò)增的基因組DNA片段，196bp大小的產(chǎn)物是該引物對擴(kuò)增的轉(zhuǎn)入的rSNB基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)的片段。出現(xiàn)196bp大小的擴(kuò)增產(chǎn)物的單株是轉(zhuǎn)基因陽性單株。第一個泳道是DNA marker。

圖5中的B圖：35S:rSNBOE轉(zhuǎn)基因第二個家系的T1代植株基因型檢測。所用的引物是SNBOEJCF和SNBOEJCR，612bp大小的產(chǎn)物是該引物對擴(kuò)增的基因組DNA片段，196bp大小的產(chǎn)物是該引物對擴(kuò)增的轉(zhuǎn)入的rSNB基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)的片段。出現(xiàn)196bp大小的擴(kuò)增產(chǎn)物的單株是轉(zhuǎn)基因陽性單株。第一個泳道是DNA marker。

圖5中的C圖：35S:rSNBOE轉(zhuǎn)基因第三個家系的T1代植株基因型檢測。所用的引物是SNBOEJCF 和SNBOEJCR，612bp大小的產(chǎn)物是該引物對擴(kuò)增的基因組DNA片段，196bp大小的產(chǎn)物是該引物對擴(kuò)增的轉(zhuǎn)入的rSNB基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)的片段。出現(xiàn)196bp大小的擴(kuò)增產(chǎn)物的單株是轉(zhuǎn)基因陽性單株。第一個泳道是DNA marker。

圖6：野生型中花11(WT)與35S:rSNBOE超量表達(dá)(rSNBOE)的植株的表型比較。附圖標(biāo)記說明：

圖6中的A圖：野生型中花11(WT)與35S:rSNBOE超量表達(dá)(rSNBOE)的植株的株高和分蘗的形態(tài)比較。

圖6中的B圖：野生型中花11(WT)與35S:rSNBOE超量表達(dá)(rSNBOE)的植株的穗型比較。

圖6中的C圖：野生型中花11(WT)與35S:rSNBOE超量表達(dá)(rSNBOE)的植株的一次枝梗形態(tài)比較。

圖7：SNB基因的轉(zhuǎn)錄活性檢測所用的載體示意圖。附圖標(biāo)記說明：

圖7中的A圖：用于SNB基因轉(zhuǎn)錄活性檢測的效應(yīng)子對照35S:GAL4的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖7中的B圖：用于SNB基因轉(zhuǎn)錄活性檢測的效應(yīng)子35S:GAL4-SNB的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖7中的C圖：用于SNB基因轉(zhuǎn)錄活性檢測的報告子4×UAS:mini35S:LUC的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖7中的D圖：用于SNB基因轉(zhuǎn)錄活性檢測的內(nèi)參35S:GUS的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖8：SNB基因的轉(zhuǎn)錄活性檢測的結(jié)果。

將報告子、效應(yīng)子和內(nèi)參的質(zhì)粒按照5:4:1的比例通過聚乙二醇介導(dǎo)共轉(zhuǎn)化進(jìn)入擬南芥原生質(zhì)體，并于24h后測量酶活。利用內(nèi)參的GUS活性來平衡化各個轉(zhuǎn)化之間的系統(tǒng)誤差，并將與效應(yīng)子GAL4共轉(zhuǎn)化的熒光素酶酶活設(shè)置為相對活性1。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：水稻SNB基因的克隆

本發(fā)明采用水稻葉片的RNA經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，利用SNB基因(LOC_Os07g13170,其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)的特異引物，通過PCR的方法分離克隆SNB基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)，具體的操作如下：

(1)提取水稻葉片RNA

抽提水稻品種中花11(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所)植株分蘗期葉片的RNA，RNA抽提用的試劑購采用Invitrogen公司生產(chǎn)的Trizol抽提試劑盒(具體操作步驟按照試劑盒提供的說明書操作)。

(2)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈

步驟如下：1)取抽提的總RNA 2μg，加入DNaseI 1μl,10xDNaseI buffer 1μl，加DEPC(焦碳酸二乙酯，RNA酶的強(qiáng)烈抑制劑，工作濃度為0.01％)處理過的水到10μl，混勻后于室溫放置15min以去除殘留的基因組DNA；2)15min后加入0.2M EDTA 1μl，并于65℃水浴中孵育10min以去除DNaseI的活性；3)加入1μl引物oligo(dT)₁₅，并于65℃水浴中孵育10min以破壞RNA的二級結(jié)構(gòu)，然后冰上放置5min；4)加入5x first strand buffer 4μl，0.1M DTT(巰基乙醇)2μl，10mM dNTP mixture 1μl，反轉(zhuǎn)錄酶1μl，混勻后置于42℃水浴鍋內(nèi)溫浴1.5h；5)反應(yīng)結(jié)束后將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于90℃干浴3min以滅活反轉(zhuǎn)錄酶；6)向反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中加入120μl水，混勻后-20℃保存反應(yīng)最終產(chǎn)物。反應(yīng)中用到的試劑全部購自Invitrogen公司。

(3)擴(kuò)增SNB基因的編碼區(qū)的mRNA

為了擴(kuò)增SNB基因編碼區(qū)的mRNA，本發(fā)明設(shè)計如下引物：

SNBOEF(正向引物):5'-GGATCCATGGTGCTGGATCTCAATGTGG-3'(下劃線序列為BamHI識別位點(diǎn))；

SNBOER(反向引物):5'-TCTAGATTAGGCGGTCGGGGGGAAGTAGA-3'(下劃線序列為XbaI識別位點(diǎn))；

該引物對可以擴(kuò)增出SNB基因的起始密碼子到終止密碼子之間的蛋白質(zhì)編碼區(qū)段。

以步驟(2)反轉(zhuǎn)錄而來的cDNA為模板，用引物SNBOEF和SNBOER進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)總體積為20μl，包含cDNA模板1μl，10xPCR buffer 2μl，10mM dNTP 2μl，10mM引物SNBOEF和SNBOER各0.3μl，ExTaq酶0.2μl,加去離子水至20μl(所用到的PCR buffer、dNTP、rTaq酶等均購自寶生物工程大連有限公司)。PCR反應(yīng)條件如下：①94℃4min，②94℃40s，③58℃40s，④72℃2min，⑤從②－④循環(huán)38次，⑥72℃7min，⑦4℃保存。PCR產(chǎn)物在1％(質(zhì)量/體積)的TBE瓊脂糖凝膠上電泳檢測，回收長度為1323bp(1311bp的目標(biāo)DNA區(qū)段加上引物上附加的兩個限制性酶切位點(diǎn)12bp)的DNA片段。

實(shí)施例2：SNB中microRNA172結(jié)合位點(diǎn)的突變

因?yàn)镾NB受到microRNA172的調(diào)控(如圖1所示)，因此為了超量表達(dá)SNB，本發(fā)明采用重疊延伸PCR的方法突變掉SNB基因中的microRNA172的結(jié)合位點(diǎn)(重疊延伸PCR方法參考薩姆布魯克，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版，科學(xué)出版社，2002年；基本流程如圖2所示)。SNB中microRNA172的結(jié)合位點(diǎn)序列為TGCAGCATCATCAGGATTCT，本發(fā)明將該結(jié)合位點(diǎn)突變?yōu)镃GCCGCCAGCAGCGGCTTTT，突變后的SNB基因命名為rSNB基因。rSNB基因?qū)⒉辉偈躮icroRNA172調(diào)控，但是該突變是同義突變，因此并不改變SNB編碼的蛋白質(zhì)的序列。

為實(shí)現(xiàn)以上目標(biāo)，設(shè)計以下引物：

MSNBF(正向引物):5'-CCTACCGCCGCCAGCAGCGGCTTTTCTACGGGCACCGTCGCC-3'(下劃線序列為microRNA172結(jié)合位點(diǎn)被突變以后的序列)；

MSNBR(反向引物):5'-CCGTAGAAAAGCCGCTGCTGGCGGCGGTAGGGAGTAATGGCA-3'(下劃線序列為microRNA172結(jié)合位點(diǎn)被突變以后的互補(bǔ)序列)。

以實(shí)施例1中所得PCR產(chǎn)物為模板再進(jìn)行PCR。分別以引物SNBOEF和MSNBR，MSNBF和SNBOER為組合進(jìn)行兩組PCR，PCR體系及程序與實(shí)施例1中所述的PCR體系及程序一致。從以上2組PCR反應(yīng)產(chǎn)物中各取0.5μl混合后作為下一輪重疊延伸PCR的模板，以引物SNBOEF和SNBOER為組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR體系及程序與實(shí)施例1中所述的PCR體系及程序一致。最終得到的PCR產(chǎn)物就是microRNA172結(jié)合位點(diǎn)被突變掉的rSNB基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)，其序列如SEQ ID NO:2所示，所編碼的蛋白質(zhì)的序列如SEQ ID NO:3所示。將該P(yáng)CR產(chǎn)物在1％(質(zhì)量/體積)的TBE瓊脂糖凝膠上電泳檢測，并將回收的PCR產(chǎn)物連接到T-A克隆載體pGEMT-vector上(購自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司，即美國Promega公司)，利用載體上T7和SP6引物對該P(yáng)CR產(chǎn)物進(jìn)行測序驗(yàn)證。將包含該P(yáng)CR產(chǎn)物的重組質(zhì)粒命名為質(zhì)粒TA-rSNB。

實(shí)施例3：microRNA172識別位點(diǎn)突變的rSNB基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)的超量表達(dá)載體構(gòu)建

用BamHI和XbaI雙酶切質(zhì)粒TA-rSNB(所述的BamHI和XbaI購買自寶生物工程大連有限公司，具 體用法與用量參考該公司相應(yīng)產(chǎn)品的說明書，質(zhì)粒TA-rSNB來自實(shí)施例2，如圖3中的A圖所示)，回收包含rSNB的1323bp的DNA片段，然后與經(jīng)過BamHI和XbaI雙酶切的載體質(zhì)粒pCAMBIA1301S[該載體被公開報道:Zhou et al.,Over-expression of aspartate aminotransferase genes in rice resulted in altered nitrogen metabolism and increased amino acid content in seeds.Theor Appl Genet,2009,118:1381-1390；其基本骨架起源于澳大利亞的CAMBIA實(shí)驗(yàn)室(http://www.cambia.org/daisy/cambia/materials/overview.html)的pCAMBIA1301，通過加入35S啟動子實(shí)現(xiàn)對轉(zhuǎn)化基因的表達(dá)調(diào)控，其結(jié)構(gòu)如圖3中的B圖所示]利用T4DNA連接酶(購自Promega公司，具體用法與用量參考該公司產(chǎn)品的說明書)進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物通過電轉(zhuǎn)化的方法(電轉(zhuǎn)化儀為eppendorf公司產(chǎn)品，本發(fā)明所用電壓為1800V，具體操作參考該儀器的使用說明書)導(dǎo)入大腸桿菌DH10B(購自Promega公司)中，加400μl LB培養(yǎng)基復(fù)蘇45min，涂于含50mg/L的卡那霉素的LA培養(yǎng)基平板上，37℃溫箱培養(yǎng)14-16h(LA與LB配方參考：薩姆布魯克，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版，科學(xué)出版社，2002年)。挑取單克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒，通過BamHI和XbaI雙酶切篩選陽性克隆，并將所得的表達(dá)載體命名為35S:rSNBOE，其結(jié)構(gòu)如圖4所示。

實(shí)施例4：轉(zhuǎn)基因水稻的獲得

將表達(dá)載體35S:rSNBOE(來自實(shí)施例3)通過農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入水稻品種中花11的愈傷組織，經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)、篩選具有潮霉素(用于篩選陽性的轉(zhuǎn)基因愈傷的一種抗生素，購買自丹麥的羅氏制藥有限公司)抗性的愈傷組織、分化、生根及煉苗移栽大田，得到轉(zhuǎn)基因植株。農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化的方法和所用的試劑及配方是根據(jù)Hiei等人的報道優(yōu)化而來(Hiei et al.,Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.Plant J,1994,6:271-282；Lin and Zhang,Optimising the tissue culture conditions for high efficiency transformation of indica rice.Plant Cell Rep,2005,23:540-548)。

本發(fā)明所涉及到的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化試劑及配方如下：

(1)試劑和溶液縮寫

6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-芐基腺嘌呤)；KT(Kinetin，激動素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2,4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亞砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6min(N6小量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmin(MS小量成分溶液)

(2)主要溶液配方

1)N6max母液[10倍濃縮液(10X)]

逐一溶解，然后室溫下定容至1000ml。

2)N6min母液[100倍濃縮液(100X)]

室溫下溶解并定容至1000ml。

3)Fe₂-EDTA貯存液(100X)

在一個大三角瓶中加入300ml蒸餾水和硫酸鐵(FeSO₄·7H₂O)2.78g

在另一個大三角瓶中加入300ml蒸餾水并加熱至70℃，然后加入乙二銨四乙酸二鈉(Na₂EDTA·2H₂O)3.73g

在它們都溶解后混合在一起，70℃水浴中保持2h，定容至1000ml，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4)維生素貯存液(100X)

加水定容至1000ml，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

5)MSmax母液(10X)

室溫下溶解并定容至1000ml。

6)MSmin母液(100X)

室溫下溶解并定容至1000ml。

7)2,4-D貯存液(1mg/ml)

2,4-D 100mg.

1ml 1N氫氧化鉀溶解5min，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，室溫保存。

8)6-BA貯存液(1mg/ml)

6-BA 100mg.

1ml 1N氫氧化鉀溶解5min，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，室溫保存。

9)NAA貯存液(1mg/ml)

NAA 100mg.

1ml 1N氫氧化鉀溶解5min，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

10)IAA貯存液(1mg/ml)

IAA 100mg.

1ml 1N氫氧化鉀溶解5min，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

11)葡萄糖貯存液(0.5g/ml)

葡萄糖 125g

蒸餾水溶解定容至250ml，滅菌后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

12)AS貯存液

AS 0.392g

DMSO 10ml

分裝至1.5ml離心管內(nèi)，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

13)1N氫氧化鉀貯存液

氫氧化鉀(KOH)5.6g

蒸餾水溶解定容至100ml，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

14)KT貯存液(1mg/ml)

KT 100mg.

1ml 1N氫氧化鉀溶解5min，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，室溫保存。

(3)培養(yǎng)基配方

1)誘導(dǎo)培養(yǎng)基

加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。

2)繼代培養(yǎng)基

加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。

3)預(yù)培養(yǎng)基

加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.6，封口滅菌。

使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250μl AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。

4)共培養(yǎng)基

加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.6，封口滅菌。

使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250μl AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。

5)懸浮培養(yǎng)基

加蒸餾水至100ml，調(diào)節(jié)pH值到5.4，分裝到兩個100ml的三角瓶中，封口滅菌。

使用前加入1ml葡萄糖貯存液和100μlAS貯存液。

6)選擇培養(yǎng)基

加蒸餾水至250ml，調(diào)節(jié)pH值到6.0，封口滅菌。

使用前溶解培養(yǎng)基，加入250μl 50mg/ml的潮霉素和400ppm頭孢霉素，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。

7)預(yù)分化培養(yǎng)基

加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，封口滅菌。

使用前溶解培養(yǎng)基，加入250μl 50mg/ml的潮霉素和400ppm頭孢霉素，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。

8)分化培養(yǎng)基

加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到6.0。

煮沸并定容至1000ml，分裝到100ml三角瓶(50ml/瓶)，封口滅菌。

9)生根培養(yǎng)基

加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.8。

煮沸并定容至1000ml，分裝到生根管中(25ml/管)，封口滅菌。

10)LA培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基不含瓊脂粉)

蒸餾水溶解定容至250ml，裝于500ml三角瓶，滅菌后室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

本發(fā)明所涉及到的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化的步驟如下：

(1)愈傷誘導(dǎo)

1)將成熟的水稻種子去殼，然后依次用70％的乙醇處理1min，0.15％氯化汞(HgCl₂)15min

2)滅菌水洗種子4-5次；

3)將種子放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；

4)置于黑暗處培養(yǎng)5周，溫度26±1℃。

(2)愈傷繼代

挑選亮黃色、緊實(shí)且相對干燥的胚性愈傷，放于繼代培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度26±1℃。

(3)預(yù)培養(yǎng)

挑選緊實(shí)且相對干燥的胚性愈傷，放于預(yù)培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)4d，溫度26±1℃。

(4)農(nóng)桿菌培養(yǎng)

1)在帶有卡那霉素的LA培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)含構(gòu)建好載體的農(nóng)桿菌EHA1052d，溫度28℃；

2)將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至懸浮培養(yǎng)基里，28℃搖床上培養(yǎng)2-3h。

(5)農(nóng)桿菌侵染

1)將預(yù)培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至滅菌好的瓶子內(nèi)；

2)調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌的懸浮液至OD₆₀₀0.8-1.0；

3)將愈傷在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡30min；

4)轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；然后放置在共培養(yǎng)基上培養(yǎng)2d，溫度19-20℃。

(6)愈傷洗滌和選擇培養(yǎng)

1)滅菌水洗滌愈傷至看不見農(nóng)桿菌；

2)浸泡在含400ppm頭孢霉素的滅菌水中30min；

3)轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；

4)轉(zhuǎn)移愈傷至選擇培養(yǎng)基上選擇2-3次，每次2周。(第一次頭孢霉素篩選濃度為400ppm，第二次以后為250ppm)

(7)分化

1)將抗性愈傷轉(zhuǎn)移至預(yù)分化培養(yǎng)基上黑暗處培養(yǎng)5-7d；

2)轉(zhuǎn)移預(yù)分化培養(yǎng)的愈傷至分化培養(yǎng)基上，光照下培養(yǎng)，溫度26℃，5－7周。

(8)生根

1)拔出分化好的苗子，剪掉分化時產(chǎn)生的根；

2)然后將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中光照下培養(yǎng)2-3周，溫度26℃。

(9)移栽

洗掉根上的殘留培養(yǎng)基，將具有良好根系的幼苗轉(zhuǎn)入溫室，同時在最初的幾天保持水分濕潤。在溫室煉苗約2周左右后，再移載至大田。

實(shí)施例5：轉(zhuǎn)基因水稻的鑒定與表型觀察

設(shè)計以下引物用于檢測轉(zhuǎn)基因植株的基因型，序列如下：

SNBOEJCF(正向引物):5'-GCGATGGGAGTCGCACATCT-3'；

SNBOEJCR(反向引物):5'-CACAAACTCCTCCTTGGTCCA-3'；

因?yàn)镾NBOEJCF是設(shè)計在SNB基因的第一個外顯子上的，而SNBOEJCR是設(shè)計在SNB基因的第五個外顯子上的，而遺傳轉(zhuǎn)化用的是沒有內(nèi)含子的突變了microRNA172結(jié)合位點(diǎn)的rSNB基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)進(jìn)行的，因此使用該對引物擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因植株，可以得到一條來自基因組DNA的612bp的片段，同時如果是轉(zhuǎn)基因陽性植株的話，還可以得到一條來自rSNB基因蛋白質(zhì)編碼區(qū)的191bp的片段。根據(jù)這兩條帶型就可以判斷PCR是否成功以及所檢測的單株是否是轉(zhuǎn)基因陽性的。

抽提T0代35S:rSNBOE轉(zhuǎn)化植株(來自實(shí)施例4)葉片的總DNA，DNA抽提方法為CTAB法(Zhang et al.,Genetic diversity and differentiation of indica an japonica rice detected by RFLP analysis.Theor Appl Genet,1992,83:495-499)。以葉片總DNA為模板，用引物SNBOEJCF和SNBOEJCR進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)總體積為20μl，包含DNA模板100ng，10xPCR buffer 2μl，10mM dNTP 2μl，10mM引物SNBOEJCF和SNBOEJCR各0.3μl，rTaq酶0.2μl,加去離子水至20μl(所用到的PCR buffer、dNTP、rTaq酶等均購自寶生物工程大連有限公司)。PCR反應(yīng)條件如下：①94℃4min，②94℃40s，③58℃40s，④72℃1min，⑤從②－④循環(huán)38次，⑥72℃7min，⑦4℃保存。PCR產(chǎn)物在1％(質(zhì)量/體積)的TBE瓊脂糖凝膠上電泳檢測。

PCR檢測結(jié)果表明，對表達(dá)載體35S:rSNBOE轉(zhuǎn)基因而來陽性植株相對于陰性植株而言，全部表現(xiàn)為株高變矮，每穗一次枝梗數(shù)不變，但是每穗二次枝梗數(shù)和每穗粒數(shù)都明顯增加，其表型如圖6所示。

為了進(jìn)行表型分析，申請人將35S:rSNBOE的3個獨(dú)立轉(zhuǎn)化而來的T0植株的種子(來自實(shí)施例4)經(jīng)過浸種、催芽后播種于秧田，20d以后移栽至大田獲得T1代轉(zhuǎn)基因植株。種植密度為15cm×24cm，種植地點(diǎn)為中國湖北省武漢市洪山區(qū)華中農(nóng)業(yè)大學(xué)的試驗(yàn)田，在一個有安全防護(hù)設(shè)施條件下按常規(guī)的水稻種植方法進(jìn)行田間管理。利用引物SNBOEJCF和SNBOEJCR進(jìn)行PCR擴(kuò)增以檢測分離單株的陰陽性，并且進(jìn)行轉(zhuǎn)基因事件和表型變化的共分離檢測，以及統(tǒng)計表型數(shù)據(jù)。

分析結(jié)果表明在T1代，表達(dá)載體35S:rSNBOE轉(zhuǎn)基因后代分離出來的所有陽性單株相對于陰性單株而言，都表現(xiàn)為株高變矮，每穗一次枝梗數(shù)不變，但是每穗二次枝梗數(shù)和每穗粒數(shù)都明顯增加，表明35S:rSNBOE的轉(zhuǎn)基因事件同這些表型的變化是共分離的(見圖5和圖6所示的結(jié)果)。

考察和記錄T1代相關(guān)植株的表型數(shù)據(jù)，包括株高、每穗一次枝梗數(shù)、每穗二次枝梗數(shù)和每穗粒數(shù)，并以每個家系分離出來的的陰性單株為對照，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

表1超量表達(dá)35S:rSNBOE(rSNBOE)的T1代陽性和陰性單株的表型統(tǒng)計值

表1的說明：(+)和(-)分別表示轉(zhuǎn)基因陽性和陰性單株。利用t測驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，^a,b,c分別表示P<0.05,0.01和0.001的顯著水平。

實(shí)施例6：SNB的轉(zhuǎn)錄活性檢測

為了檢測SNB的轉(zhuǎn)錄活性，申請人按照公開發(fā)表過的檢測植物轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄活性的方法進(jìn)行(Weng et al.,Grain number,plant height,and heading date7is a central regulator of growth,development,and stress response.Plant Physiol,2014,164:735-747)。具體的講，將SNB蛋白質(zhì)融合到GAL4蛋白質(zhì)(登陸號NM_001184062.1)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域后面，并且將該重組蛋白質(zhì)置于35S啟動子控制下，構(gòu)成檢測轉(zhuǎn)錄活性的效應(yīng)子(如圖7中的A和B圖所示)。GAL4蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域識別的DNA元件稱為UAS序列，申請人將4×UAS和mini35S的啟動子序列克隆到報告基因螢火蟲的熒光素酶前面構(gòu)成效應(yīng)子(如圖7中的C圖所示)。同時申請人還構(gòu)建了一個35S啟動子驅(qū)動的GUS基因(縮寫為35S:GUS)作為不同轉(zhuǎn)化之間的平衡化參照(如圖7中D圖所示)。申請人將報告子、效應(yīng)子和參照35S:GUS的質(zhì)粒按照5:4:1的比例，通過聚乙二醇介導(dǎo)的方法共轉(zhuǎn)化進(jìn)入擬南芥的原生質(zhì)體，經(jīng)過24h的室溫培養(yǎng)，提取蛋白質(zhì)測量熒光素酶的活性。聚乙二醇介導(dǎo)的擬南芥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化按照Yoo等報道的方法進(jìn)行(Yoo et al.,Arabidopsis mesophyll protoplasts:a versatile cell system for transient gene expression analysis.Nat Protoc,2007,2:1565-1572)；熒光素酶酶活測定的底物熒光素購買自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司，即美國Promega公司，具體的操作參照該公司的相關(guān)產(chǎn)品說明書進(jìn)行；熒光素酶酶活測定所使用的儀器是TECAN infinite M200型多功能酶標(biāo)儀，具體操作按照儀器的使用說明書進(jìn)行。熒光素酶酶活檢測結(jié)果見圖8，相對于單獨(dú)的GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域而言，融合有SNB蛋白質(zhì)的GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域會導(dǎo)致報告基因熒光素酶的活性下降，因此SNB蛋白質(zhì)在擬南芥原生質(zhì)體中具有轉(zhuǎn)錄抑制子活性。