本專利發(fā)明了一種庫(kù)爾勒香梨果實(shí)果肉細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，用番紅-固綠染色法，對(duì)常規(guī)石蠟切片法處理好的庫(kù)爾勒香梨果實(shí)切片進(jìn)行染色，然后在顯微鏡下觀察單位面積內(nèi)的細(xì)胞數(shù)目，通過(guò)基于果實(shí)切面面積基礎(chǔ)上的換算方法，計(jì)算出庫(kù)爾勒香梨果實(shí)果肉細(xì)胞數(shù)目，本專利方法能更準(zhǔn)確地計(jì)算出庫(kù)爾勒香梨果實(shí)果肉細(xì)胞數(shù)目，能為研究庫(kù)爾勒香梨果實(shí)果肉細(xì)胞體積、果肉細(xì)胞數(shù)目與果實(shí)大小之間的關(guān)系提供更科學(xué)的計(jì)算方法。
背景技術(shù)：
梨（Pyrus spp）屬于薔薇科（Rosaceae）梨亞科（Pomoideae）梨屬（Pyrus.L）植物，共有30多個(gè)種，是繼葡萄和蘋果后，世界上第三大溫帶水果品種，有3 000多年的栽培歷史。Baile根據(jù)梨屬植物的原生分布，將其劃分為兩類，一類為西方梨，或稱歐洲梨（European pear），也稱西洋梨，起源于地中海和高加索地區(qū)，主要分布于歐洲、北美洲、南美洲、非洲及大洋洲；另一類為東方梨，也稱亞洲梨（Asian pear），起源于我國(guó)，主要分布在中國(guó)、日本、韓國(guó)等亞洲國(guó)家。我國(guó)為世界第一產(chǎn)梨大國(guó)，依據(jù)美國(guó)農(nóng)業(yè)部對(duì)外農(nóng)業(yè)服務(wù)局公布統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)顯示：2012-2013年度，中國(guó)梨的產(chǎn)量為165 000萬(wàn)噸，占世界梨總產(chǎn)量的75%，其中出口4 400萬(wàn)噸，占世界梨出口總量的25%左右。庫(kù)爾勒香梨是新疆有名的特色水果，原產(chǎn)于新疆庫(kù)爾勒地區(qū)，為鴨梨和瀚海梨的天然雜交種，有1 400多年的栽培歷史。庫(kù)爾勒香梨具有皮薄肉脆，細(xì)嫩多汁，清甜爽口，含糖量高等特點(diǎn)，維生素C含量豐富且耐貯藏，尤以氣味芳香最為獨(dú)特。曾在國(guó)內(nèi)多次獲獎(jiǎng)，在國(guó)際市場(chǎng)上享有‘果中之王’、‘梨中珍品’、‘中華蜜梨’、‘梨后’、‘梨中王子’等美譽(yù)，通過(guò)多年的發(fā)展，庫(kù)爾勒香梨產(chǎn)業(yè)已經(jīng)成為當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的支柱產(chǎn)業(yè)，也是農(nóng)民擺脫貧困，增加收入的主要渠道，更是出口創(chuàng)匯的重要農(nóng)產(chǎn)品，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)所占份額越來(lái)越大，產(chǎn)品遠(yuǎn)銷日本、新加坡、泰國(guó)、加拿大等十多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，深受國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者的喜愛。
但庫(kù)爾勒香梨具有果實(shí)偏小，果肉部分相對(duì)較小，果心部分所占比例較大的缺點(diǎn)。本特色果樹研究中心在前期研究中發(fā)現(xiàn)，植物器官間大小的個(gè)體差異是由控制該器官特異基因表達(dá)水平變化而引起的。庫(kù)爾勒香梨果實(shí)大小主要是由細(xì)胞體積與細(xì)胞數(shù)目共同決定的。繼成功授粉后，果實(shí)膨大主要取決于細(xì)胞分裂和細(xì)胞膨大，這兩個(gè)過(guò)程共同決定了庫(kù)爾勒香梨果實(shí)的最終體積。而國(guó)內(nèi)科研工作者在研究庫(kù)爾勒香梨果肉組織細(xì)胞體積、數(shù)目時(shí)，所采用的方法是縱橫經(jīng)測(cè)量法，誤差較大，不能滿足科研需要，本實(shí)驗(yàn)發(fā)明了一種基于果實(shí)切面面積基礎(chǔ)上的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，可用于不同時(shí)期庫(kù)爾勒香梨梨果肉組織細(xì)胞體積、數(shù)目測(cè)定，為研究庫(kù)爾勒香梨果肉細(xì)胞體積、細(xì)胞數(shù)目與梨果實(shí)大小之間的關(guān)系提供更科學(xué)的計(jì)算方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)庫(kù)爾勒香梨果實(shí)相對(duì)較小，可食用果肉部分較少，果心部分過(guò)大特點(diǎn)，本發(fā)明創(chuàng)造發(fā)明了一種庫(kù)爾勒香梨果實(shí)果肉細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，可用于分析影響庫(kù)爾勒香梨果實(shí)大小的主要原因的研究中。本專利方法具有以下優(yōu)點(diǎn):1.本發(fā)明方法是在庫(kù)爾勒香梨果實(shí)切面面積基礎(chǔ)上進(jìn)行的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，比傳統(tǒng)的細(xì)胞縱橫徑測(cè)量方法更科學(xué)。2.本發(fā)明方法避免了流式細(xì)胞法的取樣不均勻、不易分離細(xì)胞的繁瑣操作步驟，具有操作簡(jiǎn)便，對(duì)染色時(shí)間要求不嚴(yán)格的特點(diǎn)。3.本發(fā)明方法能更準(zhǔn)確地定位果肉層細(xì)胞，更大程度上避免表皮細(xì)胞和維管束細(xì)胞的干擾，又能將石細(xì)胞的影響減到最小。4.本發(fā)明方法能將果肉細(xì)胞染成藍(lán)色，石細(xì)胞和疏導(dǎo)組織細(xì)胞染成黑色，具有立體染色效果。5.本發(fā)明方法節(jié)約時(shí)間和材料，不需要載玻片即可直接觀察，也可制作成永久切片，用于教學(xué)、科學(xué)研究中。
具體實(shí)施方法
1 切割樣品 將庫(kù)爾勒香梨果實(shí)沿中心部分橫向切開，并用游標(biāo)卡尺從中心向外依次測(cè)出庫(kù)爾勒香梨梨核部分半徑為r，庫(kù)爾勒香梨果實(shí)半徑為R。2 樣品固定：將庫(kù)爾勒香梨果肉部分切成0.5cm*0.5cm*1cm的小塊，固定在FAA固定液中，第2天更換一次固定液，第4天更換一次固定液，第7天更換一次固定液，第15天更換一次固定液，然后將樣品保存在4±0.5℃冰箱內(nèi)（FAA固定液配制方法是70%無(wú)水酒精:冰乙酸:40%甲醛溶液=90:5:5）。3 試劑：番紅溶液，將1.2g番紅溶入100ml 50%乙醇溶液中，過(guò)濾后備用；固綠溶液，將0.4g固綠溶入100ml 95%乙醇溶液中，過(guò)濾后備用。4 操作步驟：（1）石蠟切片制作 用50%乙醇溶液浸洗固定好的庫(kù)爾勒香梨果肉組織30min→依次用65%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇浸泡1.5h→分別在乙醇和二甲苯體積比例依次為2∶1，1∶1，1∶2的混合溶液中各浸泡1h→純二甲苯中浸泡2h→在40℃烘箱中，用二甲苯和石蠟質(zhì)量比為1∶1的混合溶液中浸泡12 h→在60℃烘箱中浸蠟，每天更換兩次干凈的蠟液，一共更換6次→用常規(guī)石蠟切片法將庫(kù)爾勒香梨果肉切成10μm厚→貼片→脫蠟→染色（番紅固綠復(fù)染）→中性樹膠封片。（2）果肉細(xì)胞數(shù)目計(jì)算 在顯微鏡下選取庫(kù)爾勒香梨果肉部分，計(jì)數(shù)一定面積S（0.03cm2<S<0.05cm2）內(nèi)的果肉細(xì)胞數(shù)目N（單位面積邊界處的細(xì)胞運(yùn)用四舍五入計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，大部分在單位面積內(nèi)的記作1，小部分在單位面積內(nèi)的記作0)。則單個(gè)細(xì)胞的平均面積S（均）=S/N，已知庫(kù)爾勒香梨果實(shí)半徑為R，梨核部分半徑為r，則所測(cè)庫(kù)爾勒果實(shí)果肉細(xì)胞數(shù)目為：