本發(fā)明涉及光敏藥物與光動力療法領(lǐng)域，具體的說涉及一類四苯基亞甲基二氫卟吩化合物及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
光動力療法(PDT)是一種治療腫瘤、視網(wǎng)膜黃斑變性、光化性角化病、鮮紅斑痣、尖銳濕疣等疾病的新方法。自20世紀(jì)70年代進入臨床研究以來，PDT在臨床治療中已取得了令人矚目的成就，因其具有選擇性好、毒副作用小、可重復(fù)性好、安全、微創(chuàng)性、可協(xié)同性和相對低成本等優(yōu)點脫穎而出，顯示出巨大的潛力和強大的生命力。
光動力療法的原理是光敏劑進入機體后，隨血液循環(huán)選擇性地聚集于靶組織中，然后利用一定波長的激光直接照射到腫瘤組織上，光敏劑吸收光子能量后由基態(tài)變成不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)，處于激發(fā)態(tài)的光敏劑與周圍分子發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生高氧化活性的自由基(如單線態(tài)氧)，作用于靶細(xì)胞，引起細(xì)胞代謝紊亂，殺傷靶細(xì)胞。
在光動力治療中，光敏藥物(也稱光敏劑或光動力藥物)作為能量的載體、反應(yīng)的橋梁而起著決定性的作用。第一代光敏劑是以1993年在荷蘭上市的第一個光敏劑photofrin II為代表，它是組成復(fù)雜的血卟啉衍生物的混合物，在紅光區(qū)的相對吸收較弱；第二代光敏劑以卟啉類衍生物為主，該類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)明確、組成成分單一、紅光區(qū)的吸收較強、體內(nèi)停留時間短，第二代光敏劑中二氫卟吩類衍生物的抗腫瘤效果更為顯著。它是卟啉結(jié)構(gòu)中吡咯環(huán)上的一個雙鍵被還原后的產(chǎn)物，具有很好的光物理性質(zhì)，在可見區(qū)的吸收波長長并且吸收強度大。從理論上講，這類化合物表現(xiàn)出了理想的PDT藥物的特性，具有開發(fā)成PDT藥物的巨大潛力。目前PDT藥物被廣泛的應(yīng)用于各種腫瘤疾病的治療中，例如已經(jīng)上市的光動力藥物替莫泊芬(Temoporfin)在抗腫瘤治療中取得了顯著的社會效益與經(jīng)濟效益，應(yīng)用前景十分可觀。但這些四苯基二氫卟吩類藥物尚存在某些缺點，如Temoporfin易被氧化、穩(wěn)定性差、合成困難、價格昂貴等。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為了克服Temoporfin等四苯基二氫卟吩類光敏劑的缺陷，本發(fā)明創(chuàng)新性的設(shè)計了一類結(jié)構(gòu)新穎的四苯基亞甲基二氫卟吩化合物，并且利用丙二酸二甲酯和四苯基卟吩化合物發(fā)生麥克加成反應(yīng)，非常簡便的合成了一類結(jié)構(gòu)新穎的四苯基亞甲基二氫卟吩化合物。
本發(fā)明涉及一類四苯基亞甲基二氫卟吩化合物及其制備方法與應(yīng)用。
本發(fā)明概述如下：
一類四苯基亞甲基二氫卟吩化合物具有下述結(jié)構(gòu)(I)：
其中R1、R2處于苯環(huán)的鄰位(o-)或間位(m-)或?qū)ξ?p-)。
R1＝-H，-OH，-Me，-OMe，-NMe2，-COOH，-F，-Cl或-Br。
R2＝-H，-OH，-Me，-OMe，-NMe2，-COOH，-F，-Cl或-Br。
R3＝-OH，-OCH2CH2OH，-NHCH3，-NHCH2CH3，-NHCH2CH2CH3，-NHCH(CH3)2，
-NHCH2CH2CH2CH3，-NHCH(CH3)CH2CH3，-NHCH2CH(CH3)2，-N(CH3)2，-N(CH2CH3)2，
-N(CH2CH2CH3)2，-N(CH2CH2CH2CH3)2，-NHCH2CH2OH，-N(CH2CH2OH)2，-NHCH2COOH，
-NHCH2CH2COOH，-NHCH2CH2CH2COOH，-NHCH(CH3)CH2COOH，
-NHCH2CH(CH3)COOH，-N(CH2COOH)2，-N(CH2CH2COOH)2，-N(CH2CH2CH2COOH)2，
-N(CH2CH(CH3)COOH)2，-NHC6H5，-NHCH2C6H5，-NHCH2CH2C6H5，-N(CH2CH2C6H5)2等。
四苯基亞甲基二氫卟吩化合物的制備方法，包括如下步驟：
將硝基卟啉化合物(II)(其合成方法參照文獻Eur.J.Inorg.Chem.2005，3857-3874)和丙二酸二甲酯溶于有機溶劑，在堿性條件下加熱反應(yīng)，將反應(yīng)液冷后卻倒入水中，二氯甲烷萃取。有機相用無水硫酸鈉干燥，柱層析分離得到二氫卟吩類衍生物(III)。
上述制得的二氫卟吩類衍生物(III)溶于有機溶劑中，加入氨基化合物或者堿，加熱至回流，反應(yīng)液用二氯甲烷萃取。有機相先用水洗滌后用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，柱層析分離即得四苯基亞甲基二氫卟吩化合物(I)：
其中R1、R2處于苯環(huán)的鄰位(o-)或間位(m-)或?qū)ξ?p-)。
R1＝-H，-OH，-Me，-OMe，-NMe2，-COOH，-F，-Cl或-Br。
R2＝-H，-OH，-Me，-OMe，-NMe2，-COOH，-F，-Cl或-Br。
R3＝-OH，-OCH2CH2OH，-NHCH3，-NHCH2CH3，-NHCH2CH2CH3，-NHCH(CH3)2，
-NHCH2CH2CH2CH3，-NHCH(CH3)CH2CH3，-NHCH2CH(CH3)2，-N(CH3)2，-N(CH2CH3)2，
-N(CH2CH2CH3)2，-N(CH2CH2CH2CH3)2，-NHCH2CH2OH，-N(CH2CH2OH)2，-NHCH2COOH，
-NHCH2CH2COOH，-NHCH2CH2CH2COOH，-NHCH(CH3)CH2COOH，
-NHCH2CH(CH3)COOH，-N(CH2COOH)2，-N(CH2CH2COOH)2，-N(CH2CH2CH2COOH)2，
-N(CH2CH(CH3)COOH)2，-NHC6H5，-NHCH2C6H5，-NHCH2CH2C6H5，-N(CH2CH2C6H5)2等。
所述步驟中，式(II)制備式(III)時所用的有機溶劑是N，N-二甲基甲酰胺、1，4-二氧六環(huán)、二甲基亞砜、乙腈、丙酮、四氫呋喃、乙醚、甲基叔丁基醚、乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚、乙二醇二正丁醚等中的任意一種或任意多種的混合物。
所述步驟中，式(II)制備式(III)時所用的堿是二異丙基乙基胺、三乙胺、吡啶、鈉氫、碳酸鉀、碳酸鈉、碳酸氫鉀、碳酸氫鈉、磷酸氫鉀、磷酸氫鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈉、氫氧化鋰、甲酸鈉、乙酸鈉、甲醇鈉、甲醇鉀、乙醇鈉、乙醇鉀、正丙醇鈉、正丙醇鉀、異丙醇鈉、異丙醇鉀、叔丁醇鉀、叔丁醇鈉等中的任意一種或任意多種的混合物；反應(yīng)溫度為60～100℃；反應(yīng)時間為4～8h。
所述步驟中，式(II)制備式(III)時柱層析分離所用的填充劑為硅膠，洗脫液為二氯甲烷∶石油醚的混合溶液(1∶10～10∶1)。
所述步驟中，式(III)制備式(I)時所用的有機溶劑是甲醇、乙醇、乙二醇、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、乙腈、四氫呋喃、乙醚、乙二醇二甲醚、甲基叔丁基醚、乙二醇二乙醚、乙二醇二正丁醚等中的任意一種或任意多種的混合物。
所述步驟中，式(III)制備式(I)時氨基化合物是NH2CH3，NH2CH2CH3，NH2CH2CH2CH3，NH2CH(CH3)2，NH2CH2CH2CH2CH3，NH2CH(CH3)CH2CH3，NH2CH2CH(CH3)2，NH(CH3)2， NH(CH2CH3)2，NH(CH2CH2CH3)2，NH(CH2CH2CH2CH3)2，NH2CH2CH2OH，NH(CH2CH2OH)2，NH2CH2COOH，NH(CH2CH2COOH)2，NH2CH2CH2COOH，NH(CH2CH2COOH)2，NH2CH2CH2CH2COOH，NH(CH2CH2CH2COOH)2，NH2CH(CH3)CH2COOH，NH2CH2CH(CH3)COOH，NH(CH2CH(CH3)COOH)2，NH2C6H5，NH2CH2C6H5，NH2CH2CH2C6H5，NH(CH2CH2C6H5)2等。
所述步驟中，式(III)制備式(I)時所用的堿是二異丙基乙基胺、三乙胺、吡啶、鈉氫、碳酸鉀、碳酸鈉、碳酸氫鉀、碳酸氫鈉、磷酸氫鉀、磷酸氫鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈉、氫氧化鋰、磷酸鉀、磷酸鈉、甲酸鈉、乙酸鈉、甲醇鈉、甲醇鉀、乙醇鈉、乙醇鉀、正丙醇鈉、正丙醇鉀、異丙醇鈉、異丙醇鉀、叔丁醇鉀、叔丁醇鈉等中的任意一種或任意多種的混合物。
所述步驟中，式(III)制備式(I)時柱層析分離所用的填充劑為硅膠，洗脫液為二氯甲烷∶甲醇的混合溶液(100∶1～5∶1)。
本發(fā)明所述的四苯基亞甲基二氫卟吩化合物作為光動力藥物在腫瘤、視網(wǎng)膜黃斑變性、光化性角化病、鮮紅斑痣、尖銳濕疣等疾病的光動力治療中的用途。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[實施例1]
1、5，10，15，20-四苯基-[2：3]-[(甲氧羰基，羧基)-亞甲基]二氫卟吩的制備方法
在100mL的三口燒瓶中，加入碳酸鉀(620mg，4.5mmol)、丙二酸二甲酯(0.64mL，6.8mmol)和20mL二甲基亞砜，氮氣氣氛下升溫至60℃攪拌反應(yīng)約1h；然后加入2-硝基-5，10，15，20-四苯基卟啉(400mg，0.606mmol)加熱至100℃反應(yīng)約8h，薄層層析監(jiān)測至反應(yīng)完全。待反應(yīng)液冷卻至室溫，加入100mL水，用二氯甲烷(100mL×3)萃取水相，合并有機相。有機相用飽和食鹽水(100mL×3)洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾。將濾液減壓濃縮，對所得殘留物進行柱層析(洗脫液為二氯甲烷∶石油醚＝1∶10)得到紫紅色固體粉末5，10，15，20-四苯基-[2：3]-[二(甲氧羰基)-亞甲基]二氫卟吩280mg，產(chǎn)率約為62％。
在50mL的三口燒瓶中，加入5，10，15，20-四苯基-[2：3]-[二(甲氧羰基)-亞甲基]二氫卟吩(144mg，0.2mmol)，然后加入8mL四氫呋喃和3N NaOH溶液8mL，加熱至回流，薄層層析監(jiān)測至反應(yīng)完全。待反應(yīng)液冷卻至室溫，加入150mL二氯甲烷萃取。有機相用水(100mL×3)洗滌，飽和食鹽水(100mL×3)洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾。將濾液減壓濃縮，對所得殘留物進行柱層析(洗脫液為甲醇∶二氯甲烷＝1∶10)得到紫紅色固體粉末5，10，15，20- 四苯基-[2：3]-[(甲氧羰基，羧基)-亞甲基]二氫卟吩96mg，產(chǎn)率約為68.1％。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.67(d，J＝4.6Hz，2H)，8.49(d，J＝7.3Hz，2H)，8.41(d，J＝4.9Hz，2H)，8.37(s，2H)，8.09(dd，J＝16.8Hz，5.8Hz，4H)，7.88(d，J＝5.6Hz，2H)，7.75(m，12H)，4.55(s，2H)，2.31(s，3H)，-2.22(s，2H).MS(ESI)m/z：731.3[M+H]+。UV/Visλmax(CH2Cl2)nm：418(soret)，519，549，595，649。
2、對人食管癌細(xì)胞(Eca-109)的光動力抗增殖實驗
受試細(xì)胞：人食管癌細(xì)胞(Eca-109)
受試藥物：5，10，15，20-四苯基-[2：3]-[(甲氧羰基，羧基)-亞甲基]二氫卟吩(以下簡稱光敏劑1)，在無菌條件下將該藥物溶于最小量吐溫-8中，用生理鹽水稀釋至0.2mg/mL溶液備用；替莫泊芬(上海先輝醫(yī)藥科技有限公司)，配制方法同光敏劑1。
光源：XD-650AB型激光器。
激光功率儀：SD2490型激光功率測量儀。
光動力抗腫瘤細(xì)胞增殖作用實驗：
將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用胰酶消化后，完全培養(yǎng)基重懸成細(xì)胞懸液，隨之將其接種于96孔板，每孔100μl，置于37℃5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24h后加入濃度不同的光敏劑；12h換成新鮮培養(yǎng)基，然后進行光照(功率25mW/cm2、波長650nm、光劑量18J/cm2)；24h后進行MTT檢測。培養(yǎng)終止前4h加入10μl 5mg/ml的MTT，吸棄培養(yǎng)液后加100μl DMSO終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀570nm檢測OD值。實驗重復(fù)三次。實驗結(jié)果見表1，結(jié)果表明光敏劑1對人食管癌細(xì)胞(Eca-109)有顯著的光動力抗增殖作用。
表1光敏劑1對人食管癌細(xì)胞(Eca-109)增殖抑制作用
3、對裸鼠體內(nèi)人食管癌細(xì)胞(Eca-109)移植瘤的光動力治療實驗
受試動物：BABL/c裸小鼠，平均體重15～20g(上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司)
受試藥物：5，10，15，20-四苯基-[2：3]-[(甲氧羰基，羧基)-亞甲基]二氫卟吩(以下簡稱光敏劑1)，在無菌條件下將該藥物溶于最小量吐溫-80中，用生理鹽水稀釋至0.2mg/mL溶液備用；替莫泊芬(上海先輝醫(yī)藥科技有限公司)，配制方法同光敏劑1。
光源：XD-650AB型激光器。
激光功率儀：SD2490型激光功率測量儀。
人食管癌細(xì)胞(Eca-109)移植瘤光動力損傷實驗：
無菌條件下于小鼠前胸部皮下接種Eca-109細(xì)胞，待腫瘤長至直徑5～7mm時，選取生長良好、無潰瘍、具半球狀單一腫瘤的裸鼠，按同窩同性別隨機分組，每組8只，尾靜脈注射給藥，并以藥物溶劑作為空白對照，將替莫泊芬配成相同濃度溶液作為陽性對照，給藥后3h用功率密度為180mW/cm2的激光(波長650mm、光劑量100J/cm2)輻射腫瘤；光照后5天，處死小鼠，剝離腫瘤，稱瘤重，計算抑制率。
腫瘤抑制率％＝(C-T)/C×100％
式中，T：給藥組平均瘤重；C：對照組平均瘤重。
實驗結(jié)果見表2，光敏劑1對腫瘤具有顯著的光動力抑制作用。
表2光敏劑1對腫瘤的抑制效果
*P＜0.05與空白對照
[實施例2]
1、5，10，15，20-四苯基-[2：3]-{[甲氧羰基，(2-羥乙基)氨甲?；鵠-亞甲基}二氫卟吩的制備方法
5，10，15，20-四苯基-[2：3]-[二(甲氧羰基)-亞甲基]二氫卟吩的合成參照實施例1。
在100mL的三口燒瓶中，加入5，10，15，20-四苯基-[2：3]-[二(甲氧羰基)-亞甲基]二氫卟吩(372mg，0.5mmol)，然后加入20mL四氫呋喃，10mL乙醇胺，加熱至回流，薄層層析監(jiān)測至反應(yīng)完全。待反應(yīng)液冷卻至室溫，加入二氯甲烷150mL萃取。有機相用水(100mL×3)洗滌，飽和食鹽水(100mL×3)洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾。將濾液減壓濃縮，對所得殘留物進行柱層析分離(洗脫液為二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)得到紫紅色固體粉末5，10，15，20- 四苯基-[2：3]-{[甲氧羰基，(2-羥乙基)氨甲?；鵠-亞甲基}二氫卟吩263mg，產(chǎn)率約為68％。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.68(d，J＝4.9Hz，2H)，8.51(s，2H)，8.48-8.42(m，4H)，8.13(dd，J＝12.9Hz，6.9Hz，4H)，7.83(d，J＝3.1Hz，2H)，7.77-7.64(m，12H)，7.19(t，J＝5.5Hz，1H)，4.82(s，2H)，3.81-3.77(m，2H)，3.53(dd，J＝10.2Hz，5.6Hz，2H)，2.12(s，3H)，-2.02(s，2H).MS(ESI)m/z：774.7[M+H]+。UV/Visλmax(CH2Cl2)nm：419(soret)，519，549，596，650。
2、對人食管癌細(xì)胞(Eca-109)的光動力抗增殖實驗
受試細(xì)胞：人食管癌細(xì)胞(Eca-109)
受試藥物：5，10，15，20-四苯基-[2：3]-{[甲氧羰基，(2-羥乙基)氨甲酰基]-亞甲基}二氫卟吩(以下簡稱光敏劑2)，在無菌條件下將該藥物溶于最小量吐溫-80中，用生理鹽水稀釋至0.2mg/mL溶液備用；替莫泊芬(上海先輝醫(yī)藥科技有限公司)，配制方法同光敏劑2。
光源：XD-650AB型激光器。
激光功率儀：SD2490型激光功率測量儀。
光動力抗腫瘤細(xì)胞增殖作用實驗：
將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用胰酶消化后，完全培養(yǎng)基重懸成細(xì)胞懸液，隨之將其接種于96孔板，每孔100μl，置于37℃5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24h后加入濃度不同的光敏劑；12h換成新鮮培養(yǎng)基，然后進行光照(功率25mW/cm2、波長650nm、光劑量18J/cm2)；24h后進行MTT檢測。培養(yǎng)終止前4h加入10μl 5mg/ml的MTT，吸棄培養(yǎng)液后加100μl DMSO終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀570nm檢測OD值。實驗重復(fù)三次。實驗結(jié)果見表3，結(jié)果發(fā)現(xiàn)光敏劑2對人食管癌細(xì)胞(Eca-109)有顯著的光動力抗增殖作用。
表3光敏劑2對人食管癌細(xì)胞(Eca-109)增殖抑制作用
3、對裸鼠體內(nèi)人食管癌細(xì)胞(Eca-109)移植瘤的光動力治療實驗
受試動物：BABL/c裸小鼠，平均體重15～20g(上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司)
受試藥物：5，10，15，20-四苯基-[2：3]-{[甲氧羰基，(2-羥乙基)氨甲酰基]-亞甲基}二氫卟吩(以下簡稱光敏劑2)，在無菌條件下將該藥物溶于最小量吐溫-80中，用生理鹽水稀釋至0.2mg/mL溶液備用；替莫泊芬(上海先輝醫(yī)藥科技有限公司)，配制方法同光敏劑2。
光源：XD-650AB型激光器。
激光功率儀：SD2490型激光功率測量儀。
人食管癌細(xì)胞(Eca-109)移植瘤光動力損傷實驗：
無菌條件下于小鼠前胸部皮下接種Eca-109細(xì)胞，待腫瘤長至直徑5～7mm時，選取生長良好、無潰瘍、具半球狀單一腫瘤的裸鼠，按同窩同性別隨機分組，每組8只，尾靜脈注射給藥，并以藥物溶劑作為空白對照，將替莫泊芬配成相同濃度溶液作為陽性對照，給藥后3h用功率密度為180mW/cm2的激光(波長650mm、光劑量100J/cm2)輻射腫瘤；光照后5天，處死小鼠，剝離腫瘤，稱瘤重，計算抑制率。
腫瘤抑制率％＝(C-T)/C×100％
式中，T：給藥組平均瘤重；C：對照組平均瘤重。
實驗結(jié)果見表4，光敏劑2對腫瘤具有顯著的光動力抑制作用。
表4光敏劑2對腫瘤的抑制效果
*P＜0.05與空白對照。