本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種多肽，一種多肽疫苗及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

糖尿病(diabetes mellitus)是由體內(nèi)胰島素相對或絕對不足，或靶細胞對胰島素敏感性降低，或胰島素本身存在結(jié)構(gòu)上的缺陷而引起的體內(nèi)碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂的一種慢性疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織最新公布數(shù)據(jù)顯示，糖尿病已成為繼心腦血管疾病、惡性腫瘤之后的第三大疾病。全球糖尿病患者目前已有3.66億人，預(yù)計至2030年，這個數(shù)字將達到5.52億，其中，二型糖尿病(T2DM)占患者總數(shù)的90％以上。我國已成為世界第一糖尿病大國，患病率為9.7％，患病人數(shù)達9200萬，高于世界平均水平的6.4％。2010年，我國用于糖尿病的治療費用高達250億美元，相當于全國醫(yī)療總支出的13％。據(jù)估計全世界每分鐘就有6人死于該病，T2DM已成為一個嚴峻的健康問題。

T2DM的特征是胰島素抵抗和胰島β細胞功能喪失甚至凋亡。肥胖伴隨著慢性低水平的炎癥狀態(tài)，是引起T2DM的主要風險因素。研究表明，肥胖者通過激活NLRP3炎癥小體，促進炎癥因子IL-1β等的釋放，阻斷代謝級聯(lián)反應(yīng)及胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而導(dǎo)致胰島素水平相對失衡和活性相對喪失，即胰島素抵抗。目前認為，高血糖，高水平游離脂肪酸，氧化應(yīng)激，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，以及淀粉樣蛋白沉積是誘發(fā)胰島素抵抗和β細胞功能喪失從而導(dǎo)致T2DM的主要機理，而這些機理都與組織炎癥密切相關(guān)。

炎癥是機體應(yīng)對損傷和微生物感染所產(chǎn)生的組織修復(fù)能力，是機體的一種自適應(yīng)反應(yīng)。IL-1β是調(diào)節(jié)機體炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵炎癥因子，在1、2型糖尿病、 類風濕性關(guān)節(jié)炎等許多自身免疫和代謝紊亂疾病的病理過程中都發(fā)揮著重要作用。IL-1β主要通過巨噬細胞產(chǎn)生，胰島β細胞也能夠產(chǎn)生和分泌IL-1β。在T2DM中，高血糖水平增強了胰島β細胞的代謝活性，誘導(dǎo)胰島β細胞產(chǎn)生大量的活性氧自由基(ROS)，導(dǎo)致NLRP3炎癥小體的異常激活，進而促進了IL-1β的大量合成和釋放，IL-1β的自我刺激功能進一步擴大了炎癥狀態(tài)，形成了一種惡性循環(huán)。過量的IL-1β抑制胰島素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致胰島素抵抗；β細胞功能喪失和凋亡進一步導(dǎo)致脂肪組織、肝臟、骨骼肌和循環(huán)系統(tǒng)的功能紊亂。因而，阻斷IL-1β將能夠減少胰島β細胞的炎癥和機體系統(tǒng)炎癥發(fā)生發(fā)展，增進胰島素的分泌，提高胰島素敏感性，降低高血糖，改善胰島功能，是治療T2DM的理想策略。

目前已經(jīng)有4種基于阻斷IL-1β治療T2DM的免疫制劑進入臨床研究，包括3種IL-1β單克隆抗體和一種以全長的IL-1β化學(xué)交聯(lián)至噬菌體Qβ病毒樣顆粒(Qβ-VLP)的表面制成的疫苗，它們是Xoma生產(chǎn)的Gevokizumab(XOMA 052)、Novartis生產(chǎn)的Canakinumab(ACZ885)、Lilly生產(chǎn)的LY2189102這3種IL-1β單抗和Cytos Biotech生產(chǎn)的IL-1β疫苗。這些制劑在臨床試驗階段都表現(xiàn)出了較好的治療作用，能夠明顯降低病人的血糖水平和增強胰島素敏感性，保護胰島功能，并且有效改善糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。其作用機制在于阻斷IL-1β并打斷了其自身的惡性循環(huán)，糾正了過度激活的免疫系統(tǒng)。T2DM是一種能夠?qū)е氯矶鄠€器官發(fā)生慢性炎癥的代謝疾病，這些基于阻斷IL-1β治療T2DM的免疫制劑不僅能夠有效改善胰島素抗性，同時能夠改善多器官間的代謝循環(huán)，降低機體系統(tǒng)炎癥，治療并發(fā)癥。但是，由于阻斷了IL-1β的自循環(huán)，免疫制劑的劑量優(yōu)化和療程設(shè)計是需要首要考慮的問題?；贗L-1β的表位多肽制備的T2DM疫苗在最大程度上避免或降低了全長的IL-1β蛋白可能導(dǎo)致的急性毒性， 副作用較小，在T2DM等炎癥相關(guān)的疾病治療方面將具有廣泛的應(yīng)用前景。然而，該類疫苗尚未見報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種多肽及其應(yīng)用，特別是基于IL-1β的表位多肽制備的治療T2DM的疫苗，其在最大程度上避免或降低了全長的IL-1β蛋白可能導(dǎo)致的急性毒性，副作用較小，在T2DM等炎癥相關(guān)的疾病治療方面將具有廣泛的應(yīng)用前景。

為達到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

第一方面，本發(fā)明提供了一種多肽，所述多肽的氨基酸序列為SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

氨基酸序列如下：

SEQ ID NO.1：VQGEESNDKESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEF。

本發(fā)明中，所述多肽由2部分合并組成，包括IL-1β前體蛋白的163-171位氨基酸構(gòu)成的肽段VQGEESNDK，和199-228位氨基酸構(gòu)成的肽段ESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEF。其中163-171位氨基酸組成的多肽模擬了全長IL-1β蛋白的免疫刺激活性，又不具有致炎性和毒性作用，199-228位氨基酸組成的多肽為主要抗原表位，不具有致熱原性。

所述氨基酸為含有39個氨基酸的表位多肽，既保持了全長的IL-1β蛋白的免疫原性，又在最大程度上避免或降低了全長的IL-1β蛋白可能導(dǎo)致的急性毒性，又因為所述氨基酸可以能夠明顯降低IL-1β表達水平，降低血糖，改善血糖控制，增強胰島素的分泌和胰島素敏感性，改善胰島功能，從而起到治療二型糖尿病的作用。

第二方面，本發(fā)明提供一種DNA片段，其包含編碼第一方面所述多肽的核苷酸序列。

第三方面，本發(fā)明提供一種重組載體，所述表達載體含有至少一個拷貝的如第二方面所述的DNA片段。

第四方面，本發(fā)明提供一種重組細胞，所述重組細胞含有第三方面所述的表達載體。

第五方面，本發(fā)明提供一種疫苗，所述疫苗包括第一方面所述的多肽和佐劑。

優(yōu)選地，所述佐劑為鋁佐劑和/或聚乳酸納微球佐劑。

優(yōu)選地，所述多肽與佐劑的體積比為(1-5)：1，例如可以是1：1、2：1、3：1、4：1或5：1，優(yōu)選為(2-4)：1，進一步優(yōu)選為3：1。

第六方面，本發(fā)明提供一種如第一方面所述的多肽，如第二方面所述的核苷酸序列，如第三方面所述的重組載體，如第四方面所述的重組細胞或如第五方面所述的疫苗在抑制IL-1β水平方面的應(yīng)用。

第七方面，本發(fā)明提供一種組合物，所述組合物包括如第一方面所述的多肽，如第二方面所述的核苷酸序列，如第三方面所述的重組載體，如第四方面所述的重組細胞或如第五方面所述的疫苗。

優(yōu)選地，所述組合物在制備檢測、診斷和/或治療二型糖尿病的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明中，所述組合物能夠控制血糖，增進胰島素分泌，增強胰島素敏感性，提高胰島β細胞數(shù)量，促進β細胞增殖，減少β細胞凋亡，改善胰島功能。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明多肽及疫苗能夠明顯降低IL-1β水平，降低血糖，改善血糖控制，增強胰島素的分泌和胰島素敏感性，改善胰島功能；

(2)本發(fā)明多肽及疫苗既保持了全長的IL-1β蛋白的免疫原性，又在最大程度上避免或降低了全長的IL-1β蛋白可能導(dǎo)致的急性毒性，副作用較小，在二型糖尿病等炎癥相關(guān)的疾病治療方面具有廣泛的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明IL-1β表位疫苗誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高的抗體滴度，其中，圖1(A)鋁佐劑疫苗，圖1(B)PLA微球佐劑疫苗；

圖2為本發(fā)IL-1β表位疫苗降低KK-A^y小鼠血糖水平，其中，圖2(A)鋁佐劑疫苗，圖2(B)PLA微球佐劑疫苗；

圖3為IL-1β表位疫苗改善KK-A^y小鼠的糖耐量，其中，圖3(A)鋁佐劑疫苗的糖耐量實驗的血糖值，圖3(B)鋁佐劑疫苗的糖耐量實驗的曲線下面積，圖3(C)PLA微球佐劑疫苗的糖耐量實驗血糖值，圖3(D)PLA微球佐劑疫苗的糖耐量實驗曲線下面積；

圖4為IL-1β表位疫苗增進KK-A^y小鼠的胰島素分泌，其中，圖4(A)鋁佐劑疫苗的胰島素水平，圖4(B)鋁佐劑疫苗的胰島素刺激指數(shù)；圖4(C)PLA微球佐劑疫苗的胰島素水平，圖4(D)PLA微球佐劑疫苗的胰島素刺激指數(shù)；

圖5為IL-1β表位疫苗增強KK-A^y小鼠對胰島素的敏感性，其中，圖5(A)鋁佐劑疫苗的胰島素抵抗指數(shù)，圖5(B)鋁佐劑疫苗的胰島素耐量實驗血糖水平，圖5(C)鋁佐劑疫苗的胰島素耐量實驗曲線下面積，圖5(D)PLA微球佐劑疫苗的胰島素抵抗指數(shù)，圖5(E)PLA微球佐劑疫苗的胰島素耐量實驗血糖水平，圖5(F)PLA微球佐劑疫苗的胰島素耐量實驗曲線下面積；

圖6為IL-1β表位疫苗提高KK-A^y小鼠胰島β細胞數(shù)量，其中，圖6(A)小鼠胰臟組織切片的胰島素染色，圖6(B)胰島β細胞比例的統(tǒng)計分析；

圖7為IL-1β表位疫苗促進KK-A^y小鼠胰島β細胞增殖，其中，圖7(A)小鼠胰臟組織切片的胰島素和Ki67染色，圖7(B)胰島β細胞增殖比例的統(tǒng)計分析；

圖8為IL-1β表位疫苗降低KK-A^y小鼠胰島β細胞凋亡，其中，圖8(A)小鼠胰臟組織切片的胰島素和TUNEL染色，圖8(B)胰島β細胞凋亡比例的統(tǒng)計分析；

圖9為IL-1β表位疫苗降低KK-A^y小鼠IL-1β的表達水平，其中，圖9(A)鋁佐劑疫苗IL-1β的表達水平；圖9(B)PLA微球佐劑疫苗IL-1β的表達水平。

具體實施方式

下面通過具體實施方式來進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明了，所述實施例僅僅是幫助理解本發(fā)明，不應(yīng)視為對本發(fā)明的具體限制。

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實施例中的表位多肽由上海吉爾生化有限公司合成和純化。

下述實施例中的小鼠由華阜康生物公司提供，所有小鼠為4周齡大的雄性KK-A^y小鼠，隨機分為疫苗組(A1佐劑)、疫苗組(PLA微球佐劑)、佐劑對照組，每組8只，同時以8只年齡相同的雄性C57BL/6J小鼠作為對照組。

實施例1本發(fā)明表位多肽及其疫苗的制備

通過對IL-1β蛋白進行表位序列分析得到了本發(fā)明表位多肽，所述多肽的氨基酸序列為：SEQ ID NO.1： VQGEESNDKESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEF，通過全合成并純化所述多肽。

疫苗(Al佐劑)組：表位多肽用PBS溶解后，與注射用鋁佐劑以3:1的體積比吹打混勻。疫苗(PLA微球佐劑)組：用5mg/mL PLA與表位多肽混合，4℃混懸過夜。佐劑對照組：PBS溶液與佐劑以3:1的體積比吹打混勻。得到所述疫苗。

實驗例2 IL-1β表位疫苗對小鼠抗體滴度的影響

以兩周一次的間隔分別在第0、14、28天對小鼠進行皮下注射。疫苗組每只小鼠注射含50μg表位多肽的疫苗。佐劑對照組和C57對照組注射等體積的不含表位多肽的佐劑溶液。

抗體滴度測定：分別在首次免疫后的第10、24和38天尾靜脈取血，將取出的血液于37℃靜置2小時后，4000r/min離心5min，取上層血清，分裝待用。

將100μL表位多肽包被96孔酶聯(lián)免疫微孔板0.5μg/孔，BSA為陰性對照，置37℃2小時，以5％BSA 37℃封閉2小時，340μL/孔。以PBS洗板3次，加入以5％BSA梯度稀釋的小鼠血清100μL，室溫孵育1小時后用含有0.1％Tween-20的PBS洗滌6次。每孔加入HRP標記的山羊抗小鼠IgG 1:3000，室溫孵育1小時后，用含有0.1％Tween-20的PBS洗滌6次。每孔加入底物溶液TMB100μL，放置37℃20min，然后每孔加入100μL 1mM硫酸終止反應(yīng)，于酶標儀上測定OD₄₅₀值。在相同的條件下重復(fù)三次，結(jié)果見圖1。

實驗結(jié)果如圖1所示，佐劑對照組在首次免疫后的第10、24和38天的抗體滴度都為0；疫苗組(Al)在首次免疫后的第10、24和38天的抗體滴度分別是0、1960、9500；疫苗組(PLA)在首次免疫后的第10、24和38天的抗體滴度分別是0、1913、7167；表明IL-1β表位疫苗能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高的抗體滴度。

實驗例3 IL-1β表位疫苗對KK-A^y小鼠血糖水平的影響

血糖測量：以兩周一次的間隔分別在首次免疫后第0、14、28、42天采小鼠尾尖血用羅氏血糖儀/活力型測量小鼠的空腹血糖值。

各組小鼠血糖值如圖2(A)和2(B)所示，C57對照組在第0、14、28、42天的平均空腹血糖分別為4.0、4.4、4.6、4.7；佐劑對照組在第0、14、28、42天的平均空腹血糖分別為4.3、11.0、12.3、13.0；疫苗組(Al)在第0、14、28、42天的平均空腹血糖分別為4.3、9.7、8.7、8.5；疫苗組(PLA)在第0、14、28、42天的平均空腹血糖分別為4.3、8.1、8.8、9.1；實驗結(jié)果表明，KK-A^y小鼠的血糖水平隨著年齡的增長迅速升高，給予IL-1β表位疫苗能夠明顯降低KK-A^y小鼠的血糖水平。

實驗例4 IL-1β表位疫苗對KK-A^y小鼠糖耐量的影響

糖耐量實驗：首次免疫后的第42天，小鼠過夜禁食12小時后，腹腔注射40％濃度的葡萄糖溶液，劑量為2g/kg體重。分別在0、30、60、90、120和150分鐘采尾尖血測量血糖值，并計算曲線下面積(AUC)。

實驗結(jié)果如圖3(A)和3(C)所示，在給予葡萄糖后，佐劑對照組小鼠的血糖水平迅速升高，而Al佐劑疫苗組和PLA微球佐劑疫苗組小鼠的血糖水平明顯低于佐劑對照組小鼠，圖3(B)和3(D)顯示疫苗組的糖耐量曲線下面積也顯著降低，表示IL-1β表位疫苗能夠顯著改善KK-A^y小鼠的血糖控制。

實驗例5 IL-1β表位疫苗對KK-A^y小鼠胰島素分泌的影響

在糖耐量實驗的0和30分鐘取血，分離血清，使用小鼠超敏感胰島素ELISA試劑盒測定血清中胰島素含量，計算胰島素刺激指數(shù)。

胰島素刺激指數(shù)＝30分鐘血清胰島素水平(ng/mL)/0min血清胰島素水平 (ng/mL)。實驗結(jié)果如圖4(A)和4(C)所示，30分鐘時Al佐劑疫苗組和PLA微球佐劑疫苗組小鼠的胰島素水平明顯升高，而佐劑對照組小鼠的胰島素水平?jīng)]有明顯變化。圖4(B)和4(D)顯示佐劑對照組的胰島素刺激指數(shù)為1.2；疫苗組(Al)的胰島素刺激指數(shù)為3.3；疫苗組(PLA)的胰島素刺激指數(shù)為3.0；表明疫苗組小鼠的胰島素刺激指數(shù)明顯高于佐劑對照組。說明IL-1β表位疫苗能夠增進KK-A^y小鼠的胰島素分泌。

實驗例6 IL-1β表位疫苗對KK-A^y小鼠胰島素敏感性的影響

(1)胰島素耐量試驗：首次免疫后的第49天，小鼠禁食5小時后，腹腔注射人工合成胰島素，劑量0.75U/kg體重，分別在0、30、60、90、120分鐘采尾尖血測量血糖值，并計算曲線下面積(AUC)。

(2)根據(jù)小鼠空腹血糖值和胰島素含量，計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)：

HOMA-IR＝空腹胰島素水平(ng/mL)×空腹血糖水平(mmol/L)

實驗結(jié)果如圖5(A)和5(D)所示，Al佐劑疫苗組和PLA微球佐劑疫苗組的HOMA-IR都明顯低于佐劑對照組。在胰島素耐量實驗中，圖5(B)和5(E)顯示Al佐劑疫苗組和PLA微球佐劑疫苗組的血糖值也顯著低于佐劑對照組，并且圖5(C)和5(F)顯示疫苗組的胰島素耐量曲線下面積也顯著降低，以上結(jié)果說明IL-1β表位疫苗能夠增強KK-A^y小鼠對胰島素的敏感性。

實驗例7 IL-1β表位疫苗對KK-A^y小鼠胰島β細胞的影響

(1)腹腔注射三溴乙醇300mg/kg麻醉小鼠，立即打開小鼠胸腔，以50mL預(yù)冷的PBS(PH7.4，含肝素10U/mL)進行心臟灌流，取胰臟組織，4℃多聚甲醛固定24h，石蠟包埋。石蠟切片厚度5μm，每10個切片取一個進行染色觀察。

(2)將上述石蠟切片脫蠟，并于10mM pH 6.0枸櫞酸鈉緩沖液中沸水浴15 分鐘后自然冷卻至室溫，然后應(yīng)用10％的羊血清對切片進行封閉。

β細胞量檢測：1:200稀釋的胰島素一抗37℃作用1小時，Alexa Fluor 488偶聯(lián)的山羊抗豚鼠二抗室溫避光作用1小時。

β細胞增殖檢測：加入1:100稀釋的Ki-67一抗和Alexa Fluor 594偶聯(lián)的山羊抗兔二抗，按前述方法對胰島素復(fù)染，最后加入DAPI染色，室溫作用5min。

β細胞凋亡檢測：應(yīng)用試劑盒In Situ Cell Death Detection Kit,TMR red檢測β細胞凋亡，按前述方法對胰島素復(fù)染，最后加入DAPI染色，室溫作用5min。

(3)應(yīng)用熒光顯微鏡采集圖像，應(yīng)用軟件ImageJ進行圖像統(tǒng)計分析。

實驗結(jié)果如圖6(A)-(B)、圖7(A)-(B)和圖8(A)-(B)所示：

圖6(A)-(B)可以看出，佐劑對照組KK-A^y小鼠胰臟中β細胞比例為0.78％；疫苗(Al佐劑)組KK-A^y小鼠胰臟中β細胞比例為1.81％；疫苗(PLA微球佐劑)組KK-A^y小鼠胰臟中β細胞比例為1.13％；

圖7(A)-(B)可以看出，佐劑對照組KK-A^y小鼠胰臟中β細胞增殖比例為0.22％；疫苗(Al佐劑)組KK-A^y小鼠胰臟中β細胞增殖比例為0.42％；疫苗(PLA微球佐劑)組KK-A^y小鼠胰臟中β細胞增殖比例為0.38％；

圖8(A)-(B)可以看出，佐劑對照組KK-A^y小鼠胰臟中β細胞凋亡比例為1.44％；疫苗(Al佐劑)組KK-A^y小鼠胰臟中β細胞凋亡比例為0.38％；疫苗(PLA微球佐劑)組KK-A^y小鼠胰臟中β細胞凋亡比例為0.60％。

以上結(jié)果表明，IL-1β表位疫苗能夠明顯提高KK-A^y小鼠的β細胞數(shù)量，促進β細胞增殖，并降低β細胞凋亡。

實驗例8 IL-1β表位疫苗對KK-A^y小鼠IL-1β的表達水平的影響

取小鼠胰臟約50mg，應(yīng)用RNeasy脂質(zhì)組織試劑盒提取胰臟總RNA。應(yīng)用 PrimeScrip RT-PCR試劑盒將所提總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR Select Master Mix熒光探針試劑以及7500快速實時定量PCR儀檢測IL-1β基因表達。GAPDH作為內(nèi)參。

引物序列為：

IL-1β：5’-CAACCAACAAGTGATATTCTCCATG-3’和5’-GATCCACACTCTCCAGCTGCA-3’；

GAPDH：5’-TCCATGACAACTTTGGCATTG-3’和5’-CAGTCTTCTGGGTGGCAGTGA-3’。

結(jié)果如圖9(A)-(B)所示，Al佐劑IL-1β表位疫苗和PLA微球佐劑IL-1β表位疫苗能夠明顯抑制KK-A^y小鼠胰臟組織中的IL-1β的表達。

綜上所述，本發(fā)明的表位多肽能夠明顯抑制小鼠體內(nèi)的IL-1β表達水平，降低血糖，改善血糖控制，增強胰島素的分泌和胰島素敏感性，改善胰島功能，在二型糖尿病等炎癥相關(guān)的疾病治療方面有廣闊的應(yīng)用前景。

申請人聲明，本發(fā)明通過上述實施例來說明本發(fā)明的工藝方法，但本發(fā)明并不局限于上述工藝步驟，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述工藝步驟才能實施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明的任何改進，對本發(fā)明所選用原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護范圍和公開范圍之內(nèi)。