本發(fā)明涉及微流控芯片制備的領(lǐng)域，具體涉及一種與三維培養(yǎng)相結(jié)合的transwell微流控芯片及其制備方法。

背景技術(shù)：

Transwell實(shí)驗(yàn)技術(shù)，傳統(tǒng)方法是將商品化的Transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱(chēng)上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱(chēng)下室，上室內(nèi)盛裝上層培養(yǎng)液，下室內(nèi)盛裝下層培養(yǎng)液，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔。我們將細(xì)胞種在上室內(nèi)，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞，從而可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)等的影響。但Transwell實(shí)驗(yàn)因?yàn)橹虚g膜材料的性質(zhì)限制，無(wú)法直接觀察下層的現(xiàn)象，只能通過(guò)熒光進(jìn)行觀察，限制了它的應(yīng)用。

微流控芯片實(shí)驗(yàn)室又稱(chēng)芯片實(shí)驗(yàn)室或微流控芯片，指的是把生物和化學(xué)等領(lǐng)域中所涉及的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測(cè)、細(xì)胞培養(yǎng)、分選、裂解等基本操作單元集成或基本集成到一塊幾平方厘米(甚至更小)的芯片上，由微通道形成網(wǎng)絡(luò)，以可控流體貫穿整個(gè)系統(tǒng)，用以取代常規(guī)化學(xué)或生物實(shí)驗(yàn)室的各種功能的一種技術(shù)。微流控芯片技術(shù)作為一門(mén)迅速發(fā)展起來(lái)的科學(xué)技術(shù)，已經(jīng)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)了其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，更因其同細(xì)胞尺寸匹配、環(huán)境同生理環(huán)境相近、在時(shí)間和空間維度上能夠提供更為精確的操控，易于通過(guò)靈活設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)多種細(xì)胞功能研究等特點(diǎn)而成為新一代生物仿生和細(xì)胞研究的重要平臺(tái)。但微流控芯片又難以實(shí)現(xiàn)Transwell實(shí)驗(yàn)的功能，在藥物代謝、細(xì)胞侵襲等研究中受到了極大的限制。

三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)有著重要的應(yīng)用。普通的細(xì)胞培養(yǎng)由于細(xì)胞在體外改變 的環(huán)境下增生逐漸喪失了原有的性狀，細(xì)胞的基因表達(dá)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和形態(tài)學(xué)都可能與天然有異，往往和體內(nèi)情況不相符，而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)完全在體內(nèi)進(jìn)行,但由于體內(nèi)的多種因素制約以及體內(nèi)和外界環(huán)境相互影響而變得復(fù)雜化,難以研究單一過(guò)程，且難以研究中間過(guò)程。三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是介于單層細(xì)胞培養(yǎng)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)之間的一種技術(shù)，既能最大程度的模擬體內(nèi)環(huán)境，又能展現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)的直觀性及條件可控性的優(yōu)勢(shì)。三維細(xì)胞模型提供了獨(dú)特的視角來(lái)觀察干細(xì)胞的行為、組織器官和腫瘤的發(fā)展過(guò)程。這些研究模型有利于加速癌癥生物學(xué)和組織工程領(lǐng)域的轉(zhuǎn)化研究。

近來(lái)人來(lái)源的胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞在體外發(fā)育成各種3D微組織器官，雖然這些組織器官不夠成熟，但是一定程度上能夠模擬人各器官的發(fā)育和功能，填補(bǔ)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的一些不足。

總之，該發(fā)明首次將以上三種技術(shù)結(jié)合起來(lái)，可以用于體外各種生理病理模型的建立，在基礎(chǔ)生物學(xué)研究及醫(yī)藥研發(fā)中具有極大的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種與三維培養(yǎng)相結(jié)合的transwell微流控芯片的制備方法，制得的微流控芯片同時(shí)具有transwell小室和微流控芯片的功能優(yōu)勢(shì)，并且芯片坑狀結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)滿(mǎn)足體外細(xì)胞組織的三維培養(yǎng)，整個(gè)系統(tǒng)可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)體外三維細(xì)胞組織的生長(zhǎng)和發(fā)育，在發(fā)育生物學(xué)研究及醫(yī)藥研發(fā)中有廣闊的應(yīng)用前景。

本發(fā)明提供一種與三維培養(yǎng)相結(jié)合的transwell微流控芯片，其特征在于：該微流控芯片主要由頂層芯片、多孔濾膜、中間層芯片、底層芯片組成，

所述頂層芯片上設(shè)有頂層細(xì)胞培養(yǎng)室，

所述中間層芯片由細(xì)胞入口、細(xì)胞出口、中間層細(xì)胞培養(yǎng)室和中間層線型 通道組成。細(xì)胞入口、細(xì)胞出口和中間層細(xì)胞培養(yǎng)室之間通過(guò)中間層線型通道連接在一起。

所述底層芯片由底層線型通道和坑狀結(jié)構(gòu)組成。

多孔濾膜通過(guò)不可逆封接頂層芯片的下表面，所述中間層芯片和底層芯片進(jìn)行不可逆的氧等離子封接，中間層線型通道和底層線型通道位置相對(duì)應(yīng)；所述多孔濾膜通過(guò)PDMS粘合中間芯片的上表面。

封接后的芯片頂層細(xì)胞培養(yǎng)室和中間層細(xì)胞培養(yǎng)室位置相對(duì)應(yīng)，中間層芯片和底層芯片共用細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞入口和細(xì)胞出口。底層芯片的線型通道結(jié)構(gòu)延長(zhǎng)至多孔濾膜區(qū)域外，便于實(shí)時(shí)觀察。

底層芯片的坑狀結(jié)構(gòu)直徑在10-5000μm，深度在10-1000μm。

本發(fā)明提供一種與三維培養(yǎng)相結(jié)合的transwell微流控芯片的制備方法，按照以下步驟進(jìn)行：

將多孔濾膜通過(guò)不可逆封接頂層芯片的下表面；將中間層芯片和底層芯片進(jìn)行不可逆的氧等離子封接；然后將多孔濾膜通通過(guò)PDMS粘合到中間芯片的上表面。

所述芯片材料為可透光透氣的PDMS聚合物，PDMS單體與引發(fā)劑比例為10:1，多孔濾膜材料為聚碳酸酯膜，聚碳酸酯膜的孔徑為0.01um-10um。

不可逆封接方法為紫外活化1小時(shí)，硅烷化處理30分，氧等離子封接。

PDMS粘合方法為使用單體與引發(fā)劑比例為20:1的PDMS聚合物，在玻璃片上甩10um-50um厚的薄膜，中間芯片的上表面蘸取PDMS后，與已不可逆封接有上層芯片的多孔濾膜對(duì)齊封接。

本發(fā)明提供一種與三維培養(yǎng)相結(jié)合的transwell微流控芯片，不同層芯片可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求設(shè)計(jì)制成不同形狀、結(jié)構(gòu)的通道。

本發(fā)明提供一種與三維培養(yǎng)相結(jié)合的transwell微流控芯片的應(yīng)用，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求在多孔濾膜上下表面接種不同細(xì)胞。

本發(fā)明提供一種與三維培養(yǎng)相結(jié)合的transwell微流控芯片的應(yīng)用，底層芯片的3D培養(yǎng)類(lèi)型不僅適用于一種或多種細(xì)胞共培養(yǎng)形式，也適用于各種多功能干細(xì)胞來(lái)源的組織器官。

附圖說(shuō)明

圖1與三維培養(yǎng)相結(jié)合的transwell芯片的整體結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2與三維培養(yǎng)相結(jié)合的transwell芯片的實(shí)物圖。

圖3與三維培養(yǎng)相結(jié)合的transwell芯片的制備方法流程圖；

其中1頂層芯片，2多孔濾膜，3中間層芯片，4底層芯片，5頂層細(xì)胞培養(yǎng)室，6中間層細(xì)胞培養(yǎng)室、7細(xì)胞入口、8細(xì)胞出口、9中間層線型通道、10底層線型通道和11底層坑狀結(jié)構(gòu)；12頂層-多孔濾膜13中間-底層芯片，黑色虛線顯示各部分的位置對(duì)應(yīng)關(guān)系。

具體實(shí)施方式

下面的實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明予以進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不因此而限制本發(fā)明。

實(shí)施例1

一種與三維培養(yǎng)相結(jié)合的transwell微流控芯片，如圖1、圖2所示，該微流控芯片主要由頂層芯片1、多孔濾膜2、中間層芯片3、底層芯片4組成，該芯片按照以下步驟制備而成：

所述頂層芯片1上設(shè)有頂層細(xì)胞培養(yǎng)室5。

所述中間層芯片2由細(xì)胞入口7、細(xì)胞出口8、中間層細(xì)胞培養(yǎng)室6和中間層線型通道9組成，細(xì)胞入口7、細(xì)胞出口8和中間層細(xì)胞培養(yǎng)室之間通過(guò)中間 層線型通道9連接在一起。

所述底層芯片4由底層線型通道10和坑狀結(jié)構(gòu)11組成。

多孔濾膜3通過(guò)不可逆封接頂層芯片的下表面，所述中間層芯片3和底層芯片4進(jìn)行不可逆的氧等離子封接，中間層線型通道9和底層線型通道10相對(duì)應(yīng)連通；所述多孔濾膜通過(guò)PDMS粘合中間芯片的上表面。

封接后的芯片頂層細(xì)胞培養(yǎng)室5和中間層細(xì)胞培養(yǎng)室6位置相對(duì)應(yīng)，中間層芯片3和底層芯片4共用細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞入口7和細(xì)胞出口8；層芯片的線型通道10結(jié)構(gòu)延長(zhǎng)至多孔濾膜2區(qū)域外，便于實(shí)時(shí)觀察。

中間層芯片的線型通道結(jié)構(gòu)加大底層芯片細(xì)胞培養(yǎng)的空間，為底層細(xì)胞提供充足的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，便于細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)。

底層芯片的坑狀結(jié)構(gòu)直徑在10-5000μm，深度在10-1000μm。

與三維培養(yǎng)相結(jié)合的transwell芯片制作：

如圖3所示，首先將頂層芯片1和中間層芯片3打孔，并且確?？椎奈恢靡恢隆Ｆ浯螌⒅虚g層芯片3和帶有坑狀結(jié)構(gòu)11的底層芯片4進(jìn)行不可逆的氧等離子封接，并置于80度烘箱內(nèi)加熱20分鐘，得到中間-底層芯片13。再將多孔濾膜2置于玻璃片上進(jìn)行紫外活化1小時(shí)，然后，用硅烷化處理30分鐘，多孔濾膜2與頂層芯片1一同進(jìn)行不可逆的氧等離子封接后，置于80度烘箱中加熱30分鐘，得到頂層-多孔濾膜12。使用單體與引發(fā)劑比例為20:1的PDMS聚合物，在玻璃片上甩10um-50um厚的薄膜，將中間-底層芯片13的上表面進(jìn)行氧等離子的處理后，蘸取薄PDMS，與頂層-多孔濾膜12對(duì)齊粘合，置于80度烘箱中加熱，30分鐘固化完全。將封接好的芯片從烘箱中拿出后，切成需要的尺寸。