本發(fā)明涉及口腔醫(yī)學(xué)和病毒學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種從牙周炎患者口腔中分離獲得的小細(xì)環(huán)病毒及其獲得方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

牙周病是一組復(fù)雜的感染性疾病，通常認(rèn)為其由細(xì)菌刺激引起、由人體免疫等多因素參與。牙周病以牙槽骨吸收、牙齒松動(dòng)及脫落為主要臨床癥狀，已經(jīng)成為成年人失牙的主要原因。重度牙周炎不僅會(huì)影響口腔健康，還與糖尿病、心血管疾病、低體重新生兒及早產(chǎn)等系統(tǒng)性疾病相關(guān)，對(duì)全身健康產(chǎn)生嚴(yán)重的負(fù)面影響。傳統(tǒng)的牙周病病因?qū)W研究通常認(rèn)為牙周病的發(fā)病與特定種類(lèi)的細(xì)菌感染相關(guān)，然而細(xì)菌致病理論卻并不能完整地解釋牙周病的各種臨床特征。例如，Umeda等研究發(fā)現(xiàn)，牙周致病菌廣泛存在于唾液之中，接觸所有牙齒，但是牙周病卻常常不是全口發(fā)病，而僅影響有限數(shù)目的牙齒，具有位點(diǎn)特異性；盡管牙周環(huán)境中總有不同種類(lèi)和數(shù)目的牙周致病菌持續(xù)感染和定植，但是牙周病卻通常是短期發(fā)病，有自限性；病毒作為另一種潛在的牙周病致病因素逐漸受到關(guān)注，牙周病發(fā)病過(guò)程中，與病毒相關(guān)的牙周致病菌的粘附定植、病毒導(dǎo)致的宿主抗牙周致病菌的免疫功能抑制、與牙周病相關(guān)的病毒激活等機(jī)制可相對(duì)合理地解釋菌斑量與牙周炎嚴(yán)重程度、進(jìn)展速度的關(guān)系。病毒宏基因組學(xué)作為一項(xiàng)新興技術(shù)能充分挖掘特定環(huán)境中的病毒群落和未知病毒。

TTV是一種無(wú)囊膜的單鏈環(huán)狀DNA病毒，于1997年首次被發(fā)現(xiàn),屬于指環(huán)病毒科(Anelloviridae)。分為三屬:torqueteno virus(TTV)s；torque teno mini virus(TTMV)；torque teno midi virus(TTMDV)。目前TTV的研究較多，但是，指環(huán)病毒是否致病仍是一個(gè)懸而未決的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種小細(xì)環(huán)病毒(TTMV)，該病毒是從牙周炎患者牙周袋內(nèi)壁牙齦上皮中分離獲得的新病毒，經(jīng)病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)與牙周病發(fā)病有關(guān)，為牙周病的治療與預(yù)防提供新的解決方案。

此外，還需要提供一種上述小細(xì)環(huán)病毒的獲得方法和應(yīng)用。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):

在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種小細(xì)環(huán)病毒，該病毒包含：編碼SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。

優(yōu)選的，所述病毒具有SEQ ID NO.2所示的全長(zhǎng)核苷酸序列。

在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種重組載體，包含上述小細(xì)環(huán)病毒的全部或部分核苷酸序列。

所述重組載體包括重組克隆載體或重組表達(dá)載體。

在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種抗小細(xì)環(huán)病毒的抗體，該抗體與SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或其部分片段特異性結(jié)合。

在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種檢測(cè)小細(xì)環(huán)病毒的試劑盒，包含特異性針對(duì)SEQ ID NO.2所示全部或部分核苷酸序列設(shè)計(jì)的引物對(duì)。利用該試劑盒，通過(guò)簡(jiǎn)單的PCR反應(yīng)就可以檢測(cè)出本發(fā)明的小細(xì)環(huán)病毒。

在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種檢測(cè)小細(xì)環(huán)病毒的試劑盒，包含上述的抗體。利用該試劑盒，通過(guò)ELISA等方法就可檢測(cè)出本發(fā)明的小細(xì)環(huán)病毒。

在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種小細(xì)環(huán)病毒的獲得方法，包括以下步驟：

取牙周炎患者牙齦組織樣品，提取該樣品中的病毒基因組；

將所述病毒基因組反轉(zhuǎn)錄成病毒cDNA，再用隨機(jī)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物通過(guò)高通量測(cè)序，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)；

將高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理后，把長(zhǎng)度大于100bp的短序列拼接為重疊群；

將拼接的序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，找出序列之間的相似性；

分析比對(duì)結(jié)果，依據(jù)已知序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，通過(guò)巢式PCR擴(kuò)增，獲得未知病毒的全長(zhǎng)基因序列，該基因序列編碼SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，對(duì)未知病毒進(jìn)行物種分類(lèi)，將該未知病毒歸類(lèi)為小細(xì)環(huán)病毒。

在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述小細(xì)環(huán)病毒的應(yīng)用，用于篩選預(yù)防或治療牙周病的藥物。

在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種抗上述小細(xì)環(huán)病毒的藥物。

在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述藥物的應(yīng)用，用于制備預(yù)防或治療牙周病的藥物。

本發(fā)明的小細(xì)環(huán)病毒，是采用病毒宏基因組學(xué)方法從牙周炎患者牙周袋內(nèi)壁牙齦上皮中分離獲得的一株新病毒，經(jīng)病例對(duì)照流行病學(xué)研究，該病毒在牙周病組檢出率明顯高于牙周健康人群(P<0.001)，推測(cè)其與牙周病發(fā)病相關(guān)，為牙周病的病因、治療及預(yù)防策略提供新的依據(jù)。

附圖說(shuō)明

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。

圖1是本發(fā)明實(shí)施例1小細(xì)環(huán)病毒TTMV-222的基因結(jié)構(gòu)圖；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例1的TTMV-222系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析圖。

具體實(shí)施方式

下列實(shí)施例中，未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按常規(guī)條件，如《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(F.M.奧斯伯,R.E.金斯頓,J.G.塞德曼等主編，馬學(xué)軍,舒躍龍的譯.北京：科學(xué)出版社，2004)中所述的方法進(jìn)行。

傳統(tǒng)的牙周病病因?qū)W研究焦點(diǎn)多為牙周致病細(xì)菌，而細(xì)菌致病理論卻不足以完整解釋牙周病相關(guān)的臨床癥狀，本發(fā)明將關(guān)注轉(zhuǎn)移到牙周病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的病毒因素，力圖揭示牙周環(huán)境中的病毒群落，篩選出牙周病的可疑致病病毒，為后續(xù)治療與預(yù)防牙周病提供基礎(chǔ)。由于病毒特殊的生物學(xué)特性，傳統(tǒng)的病毒鑒定方法已經(jīng)無(wú)法滿足要求，本發(fā)明首次采用病毒宏基因組學(xué)方法分析牙周環(huán)境中的病毒群落以及鑒定牙周環(huán)境中的未知病毒。通過(guò)釣取疑似新病毒的序列，克隆出新病毒的全基因組序列，分析該新病毒的全基因組，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，并將其命名為小細(xì)環(huán)病毒TTMV-222。

實(shí)施例1采用病毒宏基因組學(xué)方法從牙周炎患者口腔中分離獲得小細(xì)環(huán)病毒的全長(zhǎng)基因序列

取牙齦組織約2g，放入2ml離心管中，加入1mlPBS及3粒直徑0.3cm鋼珠后封口膜封口，后進(jìn)行勻漿(反復(fù)凍融三次并勻漿5min)。4℃條件下,13000g離心10分鐘，抽取上清樣品，再次4℃條件下，12000g離心5分鐘，抽取上清樣品，兩次離心去除細(xì)胞碎片和其它微生物；通過(guò)0.45m濾器處理上清樣品，7500rpm離心1min過(guò)濾，再次去除懸液中的非病毒殼粒；37℃下水浴90min，應(yīng)用Turbo DNase、RNase、Baseline Zero Dnase和Benzonase去除病毒顆粒包裹外的遺傳物質(zhì)。目前已處理病例組66份樣品，對(duì)照組32份樣品。并且提取其遺傳物質(zhì)(包括DNA、RNA、dsDNA、ssDNA、dsRNA和ssRNA等)。用QIAamp Viral RNA extraction Kit提取樣品中的病毒基因組，通過(guò)DNA酶去除DNA病毒的遺傳物質(zhì)及反轉(zhuǎn)錄和Klenow Fragment酶，提取完病毒基因組后立刻使用SuperScriptⅢReverse Transcriptase試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作，反轉(zhuǎn)錄的引物為Fixed-Primer-8N，該引物的設(shè)計(jì)是在網(wǎng)站(http://www.changbioscience.com/primo/primor.html)上完成，在網(wǎng)站中產(chǎn)生隨機(jī)引物，隨后通過(guò)與NCBI的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，挑選其中不能夠匹配到人或者細(xì)菌的引物作為Fixed-Primer；向提取的病毒基因組12μl中加入1μl 100pmol的Fixed-Primer-8N，上下顛倒5-6次混合均勻；70℃水浴5min；冰上靜置2min；后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于94℃下5min變性，冰上冷卻2min；后向上述產(chǎn)物中加入1μl的Klenow酶進(jìn)行第二鏈的合成反應(yīng)，合成病毒雙鏈 cDNA，同時(shí)將引物標(biāo)簽分別加在不同樣品的病毒雙鏈cDNA上；通過(guò)單引物PCR擴(kuò)增病毒遺傳物質(zhì)，PCR擴(kuò)增的引物為Fixed-Primer-8N對(duì)應(yīng)的Fixed-Primer引物，模板即為上一步中得到的雙鏈cDNA模板；PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1％的瓊脂糖凝膠電泳，切取滿足高通量測(cè)序的DNA；設(shè)置48個(gè)復(fù)孔，并設(shè)定電壓為100伏特。經(jīng)90分鐘電泳后得到smear條帶，分別切取48個(gè)復(fù)孔對(duì)應(yīng)長(zhǎng)度范圍在500-1000bp的凝膠，置于2ml離心管，稱(chēng)重。產(chǎn)物經(jīng)PCR Purification Kit純化，電泳后切膠回收；根據(jù)Miseq高通量測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建試劑盒的操作說(shuō)明，構(gòu)建Miseq測(cè)序文庫(kù)，送至測(cè)序公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果由斯坦福大學(xué)基因組工程中心進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和序列分析，依據(jù)引物標(biāo)簽將各條序列信息分類(lèi)至各個(gè)樣品，隨后去除引物及標(biāo)簽。將長(zhǎng)度大于100bp的短序列經(jīng)NEWBLER2.5軟件拼接為重疊群(contigs)。下載NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的生物遺傳信息，建立本地BLAST文庫(kù)，并將拼接和翻譯的核苷酸和氨基酸序列在本地文庫(kù)和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行多重BLAST比對(duì)。設(shè)定E-value≤0.00001為臨界參數(shù)，將比對(duì)結(jié)果依據(jù)E-Value值的大小分為真核生物、細(xì)菌、病毒和未知序列。比對(duì)結(jié)果上傳至可視化網(wǎng)站，分析病毒序列信息，發(fā)現(xiàn)疑似全新TTV序列。

分析比對(duì)結(jié)果，依據(jù)已有序列設(shè)計(jì)疑似TTV擴(kuò)增引物，進(jìn)行反向巢式PCR擴(kuò)增后測(cè)序，第一輪引物為A*C*TCGTGTGTCTCCTCCTCG(SEQ ID NO.9)和C*G*GAGACGGCATCACATCAG(SEQ ID NO.10)，第二輪引物為A*C*TCGTGTGTCTCCTCCTCG(SEQ ID NO.11)和TGATACCCGGCTGATCTTGG(SEQ ID NO.12)，引物中“*”標(biāo)記的堿基指硫代修飾的堿基。PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳、用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygene,Silicon Valley,USA)切膠回收、克隆后測(cè)序。測(cè)序后的序列經(jīng)過(guò)載體的剪切和拼接，找出插入堿基和突變位點(diǎn)，并進(jìn)行糾錯(cuò)?？寺〕龅幕蛐蛄型ㄟ^(guò)NCBI的ORF finder工具尋找其開(kāi)放閱讀框，結(jié)果如圖1所示，新病毒的全長(zhǎng)基因序列為2803bp(SEQ ID NO.2)，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，包含3個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF1、ORF2、ORF3)。三個(gè)開(kāi)放閱讀框中，ORF1長(zhǎng)1941bp，位于316–2256(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；ORF2長(zhǎng)267bp，位于170–436(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；ORF3長(zhǎng)273bp，位于1979-2251(核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

通過(guò)MEGA5.1軟件分析新病毒與其它代表株的同源性，并畫(huà)出其系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(結(jié)果見(jiàn)圖2)，予以命名并歸類(lèi)其種屬信息。該新病毒命名為T(mén)TMV-222，經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析和同源性分析，新病毒與指環(huán)病毒科(Anelloviridae)、乙型細(xì)環(huán)病毒屬(Betatorquevirus)中的TTMV1-CBD279,TTMV2-NLC023及TTMV3-NLC026全核酸同源性最高，分別為62.6％，55.8％和56.8％。

實(shí)施例2采用流行病學(xué)病例對(duì)照研究方法驗(yàn)證本發(fā)明小細(xì)環(huán)病毒與牙周炎的關(guān)系

采用流行病學(xué)病例對(duì)照研究方法，驗(yàn)證牙周炎與新病毒TTMV-222的關(guān)系。設(shè)定假陽(yáng)性率(ɑ)定為5％，把握度定為0.9。依據(jù)牙齦炎癥、牙周袋深度、附著喪失情況，選取慢性牙周炎患者150名作為病例組，根據(jù)病例組樣本人群的年齡、性別、文化程度和全身健康情況，采用成組配比的方法選取牙周健康者150名作為對(duì)照組。按照上述方法留取患者的牙齦上皮，巢式PCR方法檢測(cè)兩組人群牙菌斑中小細(xì)環(huán)病毒TTMV-222的陽(yáng)性率，第一輪引物為T(mén)*G*AGTGAAACCACCGAAGTC(SEQ ID NO.13)和C*G*TTACTTGTTGTCCACCAG(SEQ ID NO.14)，第二輪引物為ACCACGGATTATTCTGCGGC(SEQ ID NO.15)和C*G*TTACTTGTTGTCCACCAG(SEQ ID NO.16)，引物中“*”標(biāo)記的堿基指硫代修飾的堿基。用卡方檢驗(yàn)檢測(cè)兩組人群牙菌斑中TTMV-222病毒的陽(yáng)性率的差異，結(jié)果如表1所示，該病毒在牙周病組檢出率明顯高于牙周健康人群(P<0.001)，推測(cè)其與牙周病發(fā)病相關(guān)。

表1牙周病與TTMV-204的病例對(duì)照

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專(zhuān)利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專(zhuān)利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。