本發(fā)明涉及一種利用嗜胺甲基桿菌(Methylobacteriumaminovorans)，以甲醇為唯一碳源和能源產(chǎn)聚羥基丁酸酯(polyhydroxybutyrate，簡稱PHB)的方法及該菌的培養(yǎng)過程。

背景技術：

聚羥基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates，縮寫為PHAs)是微生物合成的一類聚酯(PHB是PHA的一種)，由于其具有優(yōu)良性質，如生物可降解性、生物相容性和光學性能等，有很廣泛的用途。生物可降解性和熱加工性使得其可制作塑料袋，農用地膜及農用除草劑、殺蟲劑、肥料的載體，提高它們的利用效率而不會產(chǎn)生環(huán)境污染。生物相容性使得其可用作醫(yī)用植入材料，藥物載體，可調節(jié)藥物的釋放速率。手性藥物：其手性單體(R型)可以作為手性藥物或者手性藥物合成的中間體。良好的氣體相隔性使得其可用作食品等的包裝材料。此外PHA還可用于生產(chǎn)生物能源，具有可燃性，經(jīng)甲酯化處理以后，可直接作為生物燃料，只比柴油的燃燒熱低15％左右。由于其具有這些優(yōu)良特性，所以現(xiàn)已吸引了科技界和工業(yè)界的廣泛興趣。

目前主要利用微生物合成PHB，主要碳源為葡萄糖，成本較高，用其制造塑料無法與化石塑料競爭，采用便宜的原料是一種減少成本的很好策略。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是要利用一株菌，以甲醇為原料產(chǎn)聚羥基丁酸酯(PHB)。在該菌的揺瓶階段，利用連續(xù)補加甲醇的方式消耗掉培養(yǎng)液里面的鎂離子，磷元素，氮元素，近似的創(chuàng)造出合成PHB的條件，而不再是通過換培養(yǎng)液的方法。由于在發(fā)酵罐中很難換培養(yǎng)液，這樣更有利于摸索出適合發(fā)酵的條件。

本發(fā)明提供的生產(chǎn)聚羥基丁酸酯的方法以甲醇為原料，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)聚羥基丁酸酯。具體過程為：

(1)土壤樣品用水稀釋，取上清加入液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)。將培養(yǎng)液用滅菌水5-20倍進行梯度稀釋，再取稀釋液涂布于固態(tài)富集培養(yǎng)基平板上，25-40℃培養(yǎng)；所用液體培養(yǎng)基組分為：蛋白胨5-20g/L，牛肉浸膏2-5g/L，NaCl3-10g/L；所用固體培養(yǎng)基組分為：蛋白胨5-20g/L，牛肉浸膏2-5g/L，NaCl3-10g/L，15-25g/L瓊脂；培養(yǎng)基pH值6.6-7.5。滅菌后加入體積分數(shù)0.3-0.7％的甲醇。；

(2)用接種環(huán)挑不同顏色、形態(tài)的單菌落到新的固體培養(yǎng)基上面劃線、培養(yǎng)；重復本步驟上述操作3-5次；

(3)將分離得到的菌株分別接種至選性擇培養(yǎng)液中，于120-240rpm的搖床中培養(yǎng)，將能夠生長的菌接到新的選擇性培養(yǎng)液里面，每天測菌液在600nm下的吸光度值并加入培養(yǎng)液體積0.5％-1％的體積分數(shù)為40-80％的甲醇水溶液，以補充甲醇；所用選擇性培養(yǎng)液的組分為：MgSO₄·7H₂O0.1-0.3g/L，(NH₄)₂HPO₄1.5-4.5g/L，NaCl0.8-2.0g/L，K₂HPO₄1.0-3.0g/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O5.0-20.0mg/L，MnSO₄·H₂O2.0-5.0mg/L，CaCl₂·2H₂O2.0-5.0mg/L，ZnSO₄·7H₂O80.0-200.0ug/L，Na₂MoO₄·2H₂O20.0-60.0ug/L，CuSO₄·5H₂O20.0-60.0ug/L，CoCl₂·6H₂O20.0-60.0ug/L，H₃BO₃20.0-60.0ug/L，硫胺素5.0-20.0ug/L，核黃素10.0-30.0ug/L，鹽酸吡哆醇10.0-30.0ug/L，生物素0.5-2.0ug/L，對氨基苯甲酸5.0-20.0ug/L，煙酸10.0-30.0ug/L，調pH值為6.0-8.0，滅菌后加入體積分數(shù)0.3-1.0％的甲醇作為碳源。

(4)當菌液的吸光度值達到最大值后再培養(yǎng)48小時，離心菌液，取沉淀真空冷凍干燥18-30小時得到干菌體。

檢測方法為：取干菌體到玻璃反應管中，每個菌取3個做平行，加入以干菌體計0.1mL/mg的氯仿，加入以干菌體計0.1mL/mg的含體積分數(shù)1-20％的硫酸的甲醇溶液，在100℃下反應1-4小時，冷卻0加入去離子水，搖勻，靜置使其分層，取層重相注入氣相色譜柱，檢測PHB。

所述甲醇為唯一碳源和能源。

所述的微生物為嗜胺甲基桿菌。

所述取上清加入液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度是28—32℃，培養(yǎng)液pH值為6.8—7.2。

本發(fā)明以甲醇為原料產(chǎn)聚羥基丁酸酯細菌通過選擇性培養(yǎng)液篩選得到，其篩選方法包括步驟如下：

1、土壤樣品用水稀釋，搖勻后靜置分層。

2、取1mL上清加入盛有50mL液體富集培養(yǎng)液的250mL錐形瓶中，30℃振蕩培養(yǎng)3天。

3、將培養(yǎng)液用滅菌水10倍進行梯度稀釋,即稀釋10、100、1000、10000、100000倍再取200ul稀釋液涂布于5個固態(tài)富集培養(yǎng)基平板上，用封口膜將口封上，并用牙簽在邊緣上扎幾個小孔，放到28℃培養(yǎng)箱里面培養(yǎng)24～36h。

4、等菌長起來以后，用接種環(huán)挑不同顏色、形態(tài)的單菌落到新的平板上面劃線。劃線結束后用封口膜將口封上，并用牙簽在邊緣上扎幾個小孔，放到28℃培養(yǎng)箱里面培養(yǎng)24～36h。

5、重復劃線、培養(yǎng)5次。

6、將分離得到的菌株分別接種至盛有50mL選擇培養(yǎng)液的250mL錐形瓶中,如果菌能夠生長起來，表明該菌可以利用甲醇為唯一碳源和 能源。

7、將能夠生長的菌接到新的選擇性培養(yǎng)液里面，每天測菌液在600nm下的吸光度值并加入800ul50％的甲醇水溶液，以補充甲醇。

8、當菌液的吸光度值達到最大值后再培養(yǎng)48小時，離心菌液，真空冷凍干燥24小時。

9、取10mg干菌體到玻璃反應管中，每個菌取3個做平行(同時也取10㎎PHB標準品)，加入1mL氯仿，1mL含3％硫酸的甲醇溶液，在100℃下反應1小時，冷卻，加入1mL去離子水，搖勻，靜置使其分層，取下層重相注入氣相色譜柱，檢測PHB。

上述步驟中液體培養(yǎng)液培養(yǎng)條件都是30℃，搖床轉速為170rpm。

本發(fā)明具有的優(yōu)點：該菌能以便宜的甲醇為原料合成聚羥基丁酸酯，可降低成本。

附圖說明

圖1為基于16s基因序列以Neighbor-Joining法構建的系統(tǒng)發(fā)育樹。

圖2為氣相測定的PHB標準品氣相色譜圖，經(jīng)試驗確定保留時間為6.74min左右時為目標峰。

圖3為嗜胺甲基桿菌所產(chǎn)生樣品的PHB測定的氣相色譜圖，在6.74min左右的保留時間處有明顯的峰圖，故可以確定為目標產(chǎn)物。

SEQ ID NO.1。

TGCAGTCGAGCGGGCACCTTCGGGTGTCAGCGGCAGACGGGTGAGTAACACGTGGGAACGTGCCCTTCGGTTCGGAATAACTCAGGGAAACTTGAGCTAATACCGGATACGCCCTTTTGGGGAAAGGTTTACTGCCGAAGGATCGGCCCGCGTCTGATTAGCTTGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCTCTTTTGTCCGGGACGATAATGACGGTACCGGAAGAATAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGCTCGGAATCACTGGGCGTAAAGGGCGCGTAGGCGGCCGATTAAGTCGGGGGTGAAAGCCTGTGGCTCAACCACAGAATTGCCTTCGATACTGGTTGGCTTGAGACCGGAAGAGGACAGCGGAACTGCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGCAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCCGGTTCTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCCAGCCGTTGGTCTGCTTGCAGGTCAGTGGCGCCGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCATCCCTTGACATGGCATGTTACCTCGAGAGATCGGGGATCCTCTTCGGAGGCGTGCACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCACGTCCTTAGTTGCCATCATTCAGTTGGGCACTCTAGGGAGACTGCCGGTG ATAAGCCGCGAGGAAGGTGTGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGATGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGGTGACAGTGGGACGCGAAACCGCGAGGTTGAGCAAATCCCCAAAAGCCGTCTCAGTTCGGATTGCACTCTGCAACTCGGGTGCATGAAGGCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGCACGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGTCTTACCCGACGGCGCTGCGCCAACCGCAA

具體實施方式

下面結合實施例對本發(fā)明做進一步的闡述，但不是對本發(fā)明內容的限定。

以下實施例中富集培養(yǎng)基配方均為為：蛋白胨10g/L，牛肉浸膏3g/L，NaCl5g/L，(固體培養(yǎng)基還加入20g/L瓊脂)，用玻璃杯攪拌均勻，調pH值＝7.0。滅菌后加入0.5％的甲醇。

選擇培養(yǎng)液配方均為：MgSO₄·7H₂O0.2g/L，(NH₄)₂HPO₄3.0g/L，NaCl1.0g/L，K₂HPO₄2.0g/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O10mg/L，MnSO₄·H₂O3.5mg/L，CaCl₂·2H₂O3.3mg/L，ZnSO₄·7H₂O130ug/L，Na₂MoO₄·2H₂O40ug/L，CuSO₄·5H₂O40ug/L，CoCl₂·6H₂O40ug/L，H₃BO₃30ug/L，硫胺素10ug/L，核黃素20ug/L，鹽酸吡哆醇20ug/L，生物素1ug/L，對氨基苯甲酸10ug/L，煙酸20ug/L，調pH值為7.0，滅菌后加入體積分數(shù)為0.5％的甲醇作為碳源。

實施例1：甲醇利用菌的篩選

本發(fā)明以甲醇為原料進行合成聚羥基丁酸酯細菌的篩選，包括如下步驟：

(1)采集土壤樣品：

采樣區(qū)域：①北方(大連)、②南方(四川)

土壤類型：大連廣鹿島海邊沙灘上選取4個不同的位置取樣；在沼氣池和廢水溝選取4個位置點取樣。

(2)樣品預處理：

分別取不同的土壤樣品各5g分別裝入已滅菌并盛有40mL無菌水的離心管中，密封后劇烈震蕩5分鐘，靜置分層。

(3)擴大培養(yǎng)

待分層后分別取上清1mL分別接入100mL液體富集培養(yǎng)液中，，培養(yǎng)條件是30℃，搖床轉速為170rpm，培養(yǎng)72小時。

(4)分別將培養(yǎng)液按照10倍的梯度用滅菌水進行稀釋,即稀釋10、100、1000、10000、100000倍，再分別取200uL稀釋液涂布于5個固態(tài)富集培養(yǎng)基平板上，用封口膜將口封上，并用牙簽在邊緣上扎幾個小孔，放到28℃培養(yǎng)箱里面培養(yǎng)24h。

(5)、等菌長起來以后，用接種環(huán)挑不同顏色、形態(tài)的單菌落分別到新的固態(tài)富集培養(yǎng)基平板上上面劃線。劃線結束后用封口膜將口 封上，并用牙簽在邊緣上扎幾個小孔，放到28℃培養(yǎng)箱里面培養(yǎng)24h。

(6)、菌長起來以后再挑單菌落劃線，重復5次，以獲得純的菌并確定菌可以穩(wěn)定地遺傳。

(7)、挑分離得到的菌株分別接種至盛有50mL選擇培養(yǎng)液的250mL錐形瓶中,如果菌能夠生長起來，表明該菌可以利用甲醇為唯一碳源和能源。

(8)、將能夠生長的菌按照1％的接種量接到新的選擇性培養(yǎng)液里面，測菌液在600nm下的吸光度值，并每隔24小時加入800ul50％的甲醇水溶液，以補充甲醇。

(9)、當菌液的吸光度值達到最大值(吸光度值不再增長)后48小時，離心菌液，真空冷凍干燥24小時，保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例2：菌體中PHB的檢測

(1)、取實施例1制備的干菌體10mg到玻璃反應管中，另外取10㎎PHB標準品到另一支玻璃反應管作為參照，每管加入1mL氯仿和1mL含3％硫酸的甲醇溶液，在100℃下反應1小時，冷卻，分別加入1mL去離子水，搖勻，靜置使其分層，取下層重相注入氣相色譜柱，檢測PHB。

(2)、根據(jù)標準品的峰圖可以看出PHB的保留時間在6.76min，樣品的氣相圖和標準圖進行對比即可確定存在PHB。

實施例3：菌種的鑒定

(1)、將實施例2檢測PHB產(chǎn)物的一株菌在固態(tài)富集培養(yǎng)基平板上劃線，長出單菌落以后挑單菌落接到液體富集培養(yǎng)液里面。

(2)、待菌密度的OD₆₀₀值達到0.7的時候，收集2ml菌液提基因組，提取過程參照Thermor公司的GeneJET Genomic DNA Purification Kit#0721for 50preps的試劑盒的說明。

(3)、以提出的基因組為模板，利用16s序列的通用引物R27(引物序列為：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R(引物序列為：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’所用反應體系為：10倍PCR緩沖液10uL，dNTPs8uL，F(xiàn)27引物0.5uL，1492R引物0.5uL，DNA模板1uL，rTaq酶1uL，滅菌ddH₂O79uL。所用PCR程序為：94℃5min；94℃30S；55℃30S；72℃2min；共30個循環(huán)，最后72℃5min。擴增出16s序列，送華大基因測序。

(4)、測出的序列提交到到http://www.ezbiocloud.net/eztaxon進行對比，下載模式菌株，利用MEGA6軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果見圖1，可以看出篩選出的菌與Methylobacteriumaminovorans最接近，基本可以確定篩選出的菌就是該菌。

(5)該菌的16S rRNA基因部分序列(1340bp)見SEQ ID NO.1。

實施例4：將實施例1中的培養(yǎng)溫度變?yōu)?5℃，其它條件不變時，測得的PHB含量為0.479g/L，為菌體干重的16.87％。

實施例5：將實施例1中搖床的轉速變?yōu)?50rpm，其它條件不變時，測得的PHB含量為0.577g/L，為菌體干重的18.81％。