本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種穩(wěn)定的結(jié)腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

結(jié)腸上皮細(xì)胞是結(jié)腸黏膜屏障的主要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，不僅能阻止細(xì)菌、內(nèi)毒素進(jìn)入體循環(huán)，還能分泌多種細(xì)胞因子，促進(jìn)結(jié)腸黏膜損傷后的修復(fù)及促進(jìn)免疫耐受。結(jié)腸上皮細(xì)胞受損及功能的缺失會(huì)導(dǎo)致多種疾病的產(chǎn)生。目前，對(duì)腸上皮細(xì)胞的離體實(shí)驗(yàn)研究多采用細(xì)胞株進(jìn)行，如：colorectal cancer cell line(Caco2)、human colon adenocarcinoma(HT-29)、intestinal epithelial cells(IEC-6)等，這些細(xì)胞株或來(lái)源于腫瘤細(xì)胞，或經(jīng)過(guò)永生化處理，在形態(tài)及功能方面和正常結(jié)腸上皮細(xì)胞存在差異，不利于機(jī)體生理病理反應(yīng)及藥物作用的分析。原代細(xì)胞具有直接來(lái)源于機(jī)體組織，生物性狀尚未發(fā)生變化的優(yōu)勢(shì)，然而分離培養(yǎng)技術(shù)是一個(gè)難題，限制了其應(yīng)用。因此，建立可靠穩(wěn)定的結(jié)腸上皮細(xì)胞分離、純化及原代培養(yǎng)方法，對(duì)研究結(jié)腸上皮的生理病理機(jī)制及相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制和治療具有重要的意義。

國(guó)外文獻(xiàn)[Baten A,akamoto K,Shamsuddin A M.Long-term culture of normal human colonic epithelial cells in vitro[J].FASEB J,1992,6(9):2726-2734]報(bào)道大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞體外分離純化所采用的消化酶主要是胰酶+EDTA的組合，但胰酶消化法對(duì)細(xì)胞損傷大，所獲得的細(xì)胞很難存活并分裂增殖，對(duì)纖維結(jié)締組織也無(wú)能為力，因此，酶消化法逐漸被淘汰。此外，Bartsch I等人[Bartsch I,Zschaler I,Haseloff M,et al Establishment of a long-term culture system f or rat colon epithelial cells[J].In Vitro Cell Dev Biol Anim,2004,40(8-9):278-284]報(bào)道采用EDTA分離獲得了比較純的腸上皮細(xì)胞，但翟榮林等人[翟榮林,王國(guó)斌,蔡開(kāi)琳,田元,許飛.正常SD新生大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞體外分離的培養(yǎng)與鑒定研究[J].中華腫瘤防治雜志,2008,15(18):1365-1367]認(rèn)為單純應(yīng)用EDTA并不能獲得良好的分離效果，所獲得的細(xì)胞貼壁能力和活性均不理想，并且不能克服結(jié)腸上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的難題。多篇文獻(xiàn)[Evans GS,Flint N,Somers AS,Eyden B,Potten CS.The development of a method for the preparation of rat intestinal epithelial cell primary cultures[J].Cell Sci,1992,101:219-231.W,Weber S,Birkner S.Primary cell cultures of bovine colon epithelium:isolation and cell culture of colonocytes[J].Toxicol In Vitro,2000,14:435-445]表明膠原酶作用溫和，且能抑制成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，因此在腸上皮細(xì)胞的分離中常和不同的酶聯(lián)合運(yùn)用，可分離獲取較多的腸上皮細(xì)胞。上述文獻(xiàn)中分離腸上皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)多采用新生大鼠，雖分離效果較好但不利于疾病模型的建立， 無(wú)法為探討發(fā)病機(jī)制提供途徑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種穩(wěn)定的結(jié)腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中的問(wèn)題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明提供一種穩(wěn)定的結(jié)腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法，包括如下步驟：

1)將結(jié)腸組織剪碎，并加入消化液中進(jìn)行消化，所述消化液中包含IV型膠原酶和透明質(zhì)酸酶；

優(yōu)選的，所述結(jié)腸上皮細(xì)胞為哺乳動(dòng)物結(jié)腸上皮細(xì)胞，所述步驟1中的結(jié)腸組織為對(duì)應(yīng)的哺乳動(dòng)物結(jié)腸組織。

更優(yōu)選的，所述哺乳動(dòng)物為大鼠(拉丁名：Rattus norvegicus)。

進(jìn)一步優(yōu)選的，所述哺乳動(dòng)物為SD大鼠(拉丁名：Sprague-Dawley)。

從哺乳動(dòng)物內(nèi)獲取結(jié)腸組織的方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是公知的現(xiàn)有技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的方法獲取哺乳動(dòng)物的結(jié)腸組織。

進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟1中，結(jié)腸組織通過(guò)如下步驟獲得：首先，麻醉成年大鼠，消毒后放入超凈臺(tái)內(nèi)，無(wú)菌條件下打開(kāi)大鼠腹腔，找到自肛門(mén)向近端5～10cm的大鼠結(jié)腸，將腸系膜組織剝離干凈，完全游離出結(jié)腸，剪下后浸泡在含抗生素的處理液中，將結(jié)腸剪開(kāi)，用含抗生素的處理液中漂洗以去除結(jié)腸內(nèi)容物。在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述含抗生素的處理液為含抗生素的無(wú)菌PBS。

優(yōu)選的，所述步驟1中，所述消化液為中IV型膠原酶和透明質(zhì)酸酶的水溶液，消化液中IV型膠原酶和透明質(zhì)酸酶的重量比為4.5～5.5:1，消化時(shí)間為1.5～2.5h，更優(yōu)選的，所述消化液為中IV型膠原酶和透明質(zhì)酸酶的水溶液，消化液中IV型膠原酶和透明質(zhì)酸酶的重量比為4.9～5.1:1，消化時(shí)間為1.8～2.2h。

優(yōu)選的，所述步驟1中，消化液中IV型膠原酶和透明質(zhì)酸酶的總濃度為0.36～0.44wt％，更優(yōu)選為0.38～0.42wt％。

在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述IV型膠原酶為Sigma C5138-100MG IV型膠原酶，所述透明質(zhì)酸酶為Sigma H4272-30MG透明質(zhì)酸酶。

所述步驟1中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)細(xì)胞種類(lèi)，在確定了消化液以后，選取合適的消化條件，在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟1中的消化的具體條件為：37℃、5％CO₂，每1mm³ 結(jié)腸組織使用6～9ml消化液，消化過(guò)程中對(duì)消化體系震蕩搖勻，優(yōu)選為每隔15～20min震蕩一次。

2)將上清轉(zhuǎn)移至離心管離心，離心后棄去上清，并使用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并將細(xì)胞接種培養(yǎng)。

所述步驟2、3中，完全培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和血清，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的完全培養(yǎng)基，在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述完全培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM，血清為胎牛血清，其中血清的質(zhì)量百分比含量為10％。

3)培養(yǎng)至瓶底細(xì)胞覆蓋率≥70％時(shí)消化、離心，并重懸于完全培養(yǎng)基中，傳代培養(yǎng)后，即得結(jié)腸上皮細(xì)胞。

優(yōu)選的，所述步驟3中，培養(yǎng)至瓶底細(xì)胞覆蓋率≥70％的過(guò)程中，需換液、洗去殘留未消化的組織塊。

優(yōu)選的，所述步驟3中，消化為胰酶消化。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)細(xì)胞種類(lèi)選取合適培養(yǎng)條件，在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟3中的培養(yǎng)的具體條件為：37℃、5％CO₂，培養(yǎng)體系的體積為6～8ml。

優(yōu)選的，所述步驟3中，培養(yǎng)18～32h后換液，洗去殘留未消化的組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)3～5天后換液，換液后繼續(xù)培養(yǎng)，至瓶底細(xì)胞覆蓋率≥70％時(shí)胰酶消化。

優(yōu)選的，所述步驟3中，培養(yǎng)至瓶底細(xì)胞覆蓋率≥90％時(shí)消化、離心。

優(yōu)選的，所述步驟3中，傳代培養(yǎng)時(shí)選取上皮細(xì)胞純度較高的孔進(jìn)行傳代。

更優(yōu)選的，所述步驟3中，傳代培養(yǎng)具體包括如下步驟：

A)計(jì)數(shù)后將細(xì)胞鋪板，培養(yǎng)7～10天；

本領(lǐng)域技術(shù)人員可選擇合適的孔板和對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例中，所述步驟A中采用48孔板，每孔接種5000個(gè)細(xì)胞。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)細(xì)胞種類(lèi)選取合適培養(yǎng)條件，在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟A中的培養(yǎng)的具體條件為：37℃、5％CO₂，培養(yǎng)體系的體積為6～8ml。

B)觀察各孔細(xì)胞，選取上皮細(xì)胞純度較高的孔中的細(xì)胞消化、離心，并重懸于完全培養(yǎng)基中；

優(yōu)選的，所述步驟B中，消化為胰酶消化。

重復(fù)步驟A和B，至上皮細(xì)胞純度達(dá)到目標(biāo)純度。

更優(yōu)選的，所述步驟3中，重復(fù)步驟A和B，至培養(yǎng)孔中上皮細(xì)胞純度≥90％。

進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟3中，重復(fù)步驟A和B三次，即可獲得上皮細(xì)胞純度≥90％的 培養(yǎng)孔。在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟3中，重復(fù)步驟A和B三次，即可獲得沒(méi)有成纖維細(xì)胞、且上皮細(xì)胞純度≥90％的培養(yǎng)孔。

本發(fā)明的成年大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞制備與培養(yǎng)方法，經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)摸索，采用Ⅳ型膠原酶和透明質(zhì)酸酶聯(lián)合消化，并探索了最佳的消化時(shí)間；傳代培養(yǎng)時(shí)用胰酶進(jìn)行消化傳代，并不斷選取較純的孔進(jìn)行傳代，最終得到較純的大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞。此外，本發(fā)明所提供的培養(yǎng)方法亦可應(yīng)用于疾病大鼠細(xì)胞，是一種可靠穩(wěn)定的結(jié)腸上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)方法，可為探討相關(guān)疾病的病機(jī)提供研究途徑。

附圖說(shuō)明

圖1顯示為正常大鼠細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果示意圖。

圖2顯示為模型大鼠細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果示意圖。

圖3顯示為正常大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞爬片SP免疫組化鑒定示意圖。

圖4顯示為模型大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞爬片SP免疫組化鑒定示意圖。

圖5顯示為陰性對(duì)照SP免疫組化鑒定示意圖。

圖6顯示為正常大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞核染色示意圖。

圖7顯示為正常大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞質(zhì)CK-19染色示意圖。

圖8顯示為正常大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞染色示意圖。

圖9顯示為模型大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞核染色示意圖。

圖10顯示為模型大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞質(zhì)CK-19染色示意圖。

圖11顯示為模型大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞染色示意圖。

圖12顯示為大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線示意圖。

具體實(shí)施方式

以下通過(guò)特定的具體實(shí)例說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說(shuō)明書(shū)所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過(guò)另外不同的具體實(shí)施方式加以實(shí)施或應(yīng)用，本說(shuō)明書(shū)中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒(méi)有背離本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。

在進(jìn)一步描述本發(fā)明具體實(shí)施方式之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語(yǔ)是為了描述特定的具體實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍；在本發(fā)明說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中，除非文中另外明確指出，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一”和“這個(gè)”包括復(fù)數(shù)形式。

當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說(shuō)明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端點(diǎn)以及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。

除非另外說(shuō)明，本發(fā)明中所公開(kāi)的實(shí)驗(yàn)方法、檢測(cè)方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說(shuō)明，具體可參見(jiàn)Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989 and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987 and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

本發(fā)明實(shí)施例中，發(fā)明人以克羅恩病為模型組，分別制備了正常組和模型組的結(jié)腸上皮細(xì)胞并進(jìn)行原代培養(yǎng)。模型組的造模方法如下：①采用成年SD大鼠，造模前24h禁食不禁水；②大鼠稱(chēng)質(zhì)量后，使用2wt％戊巴比妥鈉30mg/kg腹腔注射麻醉；③TNBS灌腸溶液制備：將無(wú)水乙醇加雙蒸水，配制成50％(體積比)的乙醇，再將5wt％TNBS(三硝基苯磺酸)與50％(體積比)乙醇以2:1比例混合體積比配制成TNBS灌腸液；④灌腸：模型組大鼠以TNBS溶液3ml/kg灌腸；正常組大鼠用生理鹽水3ml/kg灌腸。灌腸器插入肛門(mén)約6～8cm注入灌腸液。大鼠體位為頭朝下，拔出灌腸器后再持續(xù)倒立1min左右，以防灌腸液溢出。每隔7d重復(fù)灌腸1次，共灌腸4次分別建立正常組和克羅恩病大鼠模型組。

實(shí)施例1

成年大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞的分離、純化及原代培養(yǎng)：

1)首先，腹腔注射10％水合氯醛(5ml/kg)麻醉成年SD大鼠(分別包括正常大鼠和模型大鼠)，75％的酒精浸泡消毒15min后放入超凈臺(tái)內(nèi)，無(wú)菌條件下打開(kāi)大鼠腹腔，找到自肛門(mén)向近端5～10cm的大鼠結(jié)腸，將腸系膜組織剝離干凈，完全游離出結(jié)腸，剪下后浸泡在 含青、鏈霉素(青霉素的工作濃度為100U/ml，鏈霉素的工作濃度為0.1mg/ml)的無(wú)菌PBS中。

2)將結(jié)腸剪開(kāi)，用含抗生素的無(wú)菌PBS漂洗5～10遍以去除結(jié)腸內(nèi)容物。

3)用無(wú)菌眼科剪將組織剪碎至體積為1mm³左右，加入7ml 0.4％Ⅳ型膠原酶：透明質(zhì)酸酶＝5:1的消化液中，置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱消化2h左右，邊消化邊震蕩搖勻以便消化更充分，一般間隔15～20min震蕩一次。

4)消化完畢，小心轉(zhuǎn)移上清至離心管中，1000rpm，離心10min，棄上清，沉淀主要成分為腸上皮細(xì)胞團(tuán)塊和未消化的組織小塊，用含10％胎牛血清(GIBCO胎牛血清)的DMEM重懸細(xì)胞，接種于培養(yǎng)皿中，37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后換液，洗去殘留未消化的組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)。

5)倒置顯微鏡鏡下觀察，細(xì)胞不多，有纖維細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)3～5天后，鏡下可見(jiàn)較多成纖維細(xì)胞，結(jié)腸上皮細(xì)胞較少。換液后繼續(xù)培養(yǎng)。

6)大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞的純化：細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)5～7天后，倒置顯微鏡下觀察上皮細(xì)胞生長(zhǎng)情況，其長(zhǎng)至瓶底的90％時(shí)(總培養(yǎng)天數(shù)一般為9～13天)，胰酶消化，選用培養(yǎng)板進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

實(shí)施例2

成年大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：

經(jīng)過(guò)上述步驟進(jìn)行原代培養(yǎng)的大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞(分別包括正常大鼠和模型大鼠)，從5％CO₂培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)皿，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿的90％便可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。按照如下步驟進(jìn)行傳代培養(yǎng)，進(jìn)一步純化結(jié)腸上皮細(xì)胞，具體步驟如下：將細(xì)胞用0.25％胰酶消化，離心，完全培養(yǎng)基(DMEM+10％胎牛血清)重懸，計(jì)數(shù)。取1×10³/ml細(xì)胞，鋪48孔板，繼續(xù)培養(yǎng)7天左右。鏡下觀察，有3～5孔細(xì)胞幾乎沒(méi)有成纖維細(xì)胞，大部分是上皮細(xì)胞，將這3～5孔細(xì)胞消化傳代，一般7天左右擴(kuò)到12孔板，繼續(xù)培養(yǎng)7天左右，鏡下觀察，2孔細(xì)胞較純，幾乎都是上皮細(xì)胞，將2孔細(xì)胞消化下來(lái)，計(jì)數(shù)，再鋪一個(gè)48孔板，繼續(xù)培養(yǎng)7～10天左右。鏡下觀察，有3孔細(xì)胞都是上皮細(xì)胞。將3孔細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，使之增殖到一定數(shù)量，取一部分細(xì)胞，分別進(jìn)行SP免疫組化和免疫熒光鑒定。在倒置顯微鏡下觀察傳代細(xì)胞形態(tài)基本一致，貼壁鋪展開(kāi)后表現(xiàn)為多角形、短梭形或鵝卵石樣，是典型的上皮細(xì)胞源性特征(正常大鼠和模型大鼠的培養(yǎng)結(jié)果分別見(jiàn)圖1-2)。

實(shí)施例3

成年大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞的鑒定：

采用單克隆抗體cytokeratin-19(CK-19)分別進(jìn)行SP免疫組化染色和免疫熒光鑒定大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞。

(1)SP免疫組化鑒定，具體步驟如下：

1)取實(shí)施例2制備獲得的正常大鼠細(xì)胞和模型大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞分別制作細(xì)胞爬片，24h后進(jìn)行免疫細(xì)胞組織化學(xué)染色鑒定。

2)PBS沖洗標(biāo)本3次，各1min。

3)4％多聚甲醛固定15min。

4)PBS沖洗標(biāo)本3次，各2min。

5)滴加3％BSA封閉液，室溫孵育30min，甩去多余液體。

6)加3％H₂O₂，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，濕盒孵育10min。

7)PBS沖洗2～3次，每次5min。

8)滴加1:200一抗鼠源性單抗CK-19(Santa Cruz,sc-53003)，室溫孵育2h(陰性對(duì)照不加一抗)。

9)PBS沖洗2～3次，每次5min。

10)滴加1:500辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗(羊抗鼠IgG多克隆抗體，為長(zhǎng)島公司廣譜二抗)，室溫孵育1h。

11)PBS沖洗2～3次，每次5min。

12)顯色：DAB顯色5～10min，在顯微鏡下掌握染色程度。

13)自來(lái)水沖洗10min終止反應(yīng)。

14)復(fù)染：蘇木精復(fù)染2min，鹽酸酒精分化。

15)自來(lái)水沖洗10～15min。

16)脫水：75％酒精、85％酒精、95％酒精、100％酒精梯度脫水，各3min。

17)透明：二甲苯透明3min×2次。

18)中性樹(shù)膠封片鏡檢。

每張爬片中隨機(jī)選取3個(gè)區(qū)域，在高倍鏡下計(jì)數(shù)每個(gè)視野下的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，匯總計(jì)算出百分率。CK-19陽(yáng)性反應(yīng)為細(xì)胞胞質(zhì)染成黃褐色。正常大鼠細(xì)胞和模型大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞爬片中，均只有<5％的細(xì)胞染色陰性，主要是成纖維樣細(xì)胞；>95％的細(xì)胞染色陽(yáng)性，表明為上皮細(xì)胞源性(見(jiàn)圖3-5)。

(2)免疫熒光鑒定，結(jié)腸上皮細(xì)胞質(zhì)CK-19染色具體步驟如下：

1)在孔板中加入對(duì)應(yīng)大小的細(xì)胞爬片。將正常大鼠細(xì)胞和模型大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞消化成單個(gè)細(xì)胞，分別接種到對(duì)應(yīng)的孔板中，37℃，5％CO₂培養(yǎng)過(guò)夜。

2)取出培養(yǎng)皿，用PBS(pH7.4)洗2次，每次2ml。

3)加入4％多聚甲醛室溫固定15min；PBS/0.05％Tween20，洗滌2次，每次5min。

4)封閉：5％BSA，室溫封閉2h；吸去皿中的洗滌液，用鑷子取出蓋玻片(細(xì)胞爬片)，有細(xì)胞的一面朝上，放在吸水紙上；加一抗稀釋液(1:200稀釋的CK19一抗，種類(lèi)同實(shí)施例3第一部分)；置濕盒內(nèi)，4℃，過(guò)夜或室溫孵育1h。

5)洗滌，PBS/0.05％Tween20，洗滌2次，每次5min；加二抗稀釋液(1:500稀釋的羊抗鼠FITC標(biāo)記二抗，碧云天公司A0568)，37℃，1h；洗滌，PBS/0.05％Tween20，洗滌2次，每次5min。

6)取干凈的載玻片一塊，作上標(biāo)記，滴一滴mounting solution(含DAPI)，約15～20μl；用鑷子取出蓋玻片，邊緣搭在紙巾上吸去多余液體，細(xì)胞面朝下，貼在載玻片上，不要有氣泡。

7)蓋玻片的邊緣四周刷上無(wú)色指甲油，待干；擦去蓋玻片上表面析出的PBS鹽份；避光保存在干燥的容器內(nèi)。

8)熒光顯微鏡觀察，在熒光顯微鏡下可以觀察到，絕大多數(shù)細(xì)胞胞漿呈現(xiàn)出亮綠色熒光，為CK-19表達(dá)陽(yáng)性的結(jié)腸上皮細(xì)胞，胞核呈現(xiàn)藍(lán)色熒光(圖6-11)(綠色熒光FITC波長(zhǎng)488nm，藍(lán)色熒光DAPI波長(zhǎng)340nm)。其中，圖8和圖11分別為正常大鼠和模型大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞核染色和CK-19染色疊加示意圖。

實(shí)施例4

成年大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞的活性(生長(zhǎng)曲線)檢測(cè)：

經(jīng)過(guò)上述傳代培養(yǎng)的正常大鼠與模型大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞通過(guò)CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，具體步驟如下：

1)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的正常組和模型組的細(xì)胞株(實(shí)施例2制備獲得的正常大鼠細(xì)胞和模型大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞)，胰蛋白酶消化，稀釋細(xì)胞使其濃度為1～5×10⁴個(gè)細(xì)胞/ml培養(yǎng)液，分別取100μl至96孔培養(yǎng)板，每種細(xì)胞每塊板接種3個(gè)同樣的孔作為復(fù)孔，1～5×10³個(gè)細(xì)胞/孔，以100μl培養(yǎng)液做空白對(duì)照，37℃培養(yǎng)過(guò)夜；

2)按1:10體積比混合Cell Counting Kit-8(CCK-8)和無(wú)血清必需基本培養(yǎng)基DMEM， 混合液按每孔100μl加入待測(cè)孔中，37℃，5％CO₂孵育1h；

3)用微板分光光度計(jì)測(cè)定450nm波長(zhǎng)吸光度，記錄每塊板的數(shù)值。

正常大鼠與模型大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖12。

實(shí)施例5

成年大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞的分離、純化及原代培養(yǎng)：

1)首先，腹腔注射10％水合氯醛(5ml/kg)麻醉成年SD大鼠(分別包括正常大鼠和模型大鼠)，75％的酒精浸泡消毒15min后放入超凈臺(tái)內(nèi)，無(wú)菌條件下打開(kāi)大鼠腹腔，找到自肛門(mén)向近端5～10cm的大鼠結(jié)腸，將腸系膜組織剝離干凈，完全游離出結(jié)腸，剪下后浸泡在含青、鏈霉素(青霉素的工作濃度為100U/ml，鏈霉素的工作濃度為0.1mg/ml)的無(wú)菌PBS中。

2)將結(jié)腸剪開(kāi)，用含抗生素的無(wú)菌PBS漂洗5～10遍以去除結(jié)腸內(nèi)容物。

3)用無(wú)菌眼科剪將組織剪碎至體積為1mm³左右，加入9ml 0.36％Ⅳ型膠原酶：透明質(zhì)酸酶＝4.5:1的消化液中，置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱消化2.5h左右，邊消化邊震蕩搖勻以便消化更充分，一般間隔15～20min震蕩一次。

4)消化完畢，小心轉(zhuǎn)移上清至離心管中，1000rpm，離心10min，棄上清，沉淀主要成分為腸上皮細(xì)胞團(tuán)塊和未消化的組織小塊，用含10％胎牛血清(GIBCO胎牛血清)的DMEM重懸細(xì)胞，接種于培養(yǎng)皿中，37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。16h后換液，洗去殘留未消化的組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)。

5)倒置顯微鏡鏡下觀察，細(xì)胞不多，有纖維細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)3～5天后，鏡下可見(jiàn)較多成纖維細(xì)胞，結(jié)腸上皮細(xì)胞較少。換液后繼續(xù)培養(yǎng)。

6)大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞的純化：細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)5～7天后，倒置顯微鏡下觀察上皮細(xì)胞生長(zhǎng)情況，其長(zhǎng)至瓶底的90％時(shí)，胰酶消化，選用培養(yǎng)板進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

成年大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：

經(jīng)過(guò)上述步驟進(jìn)行原代培養(yǎng)的大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞(分別包括正常大鼠和模型大鼠)，從5％CO₂培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)皿，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿的90％便可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。按照如下步驟進(jìn)行傳代培養(yǎng)，進(jìn)一步純化結(jié)腸上皮細(xì)胞，具體步驟如下：將細(xì)胞用0.25％胰酶消化，離心，完全培養(yǎng)基(DMEM+10％胎牛血清)重懸，計(jì)數(shù)。取1×10³/ml細(xì)胞，鋪48孔板，繼續(xù)培養(yǎng)7天左右。鏡下觀察，有3～5孔細(xì)胞幾乎沒(méi)有成纖維細(xì)胞，大部分是上皮細(xì)胞，將這3～5孔細(xì)胞消化傳代，一般7天左右擴(kuò)到12孔板，繼續(xù)培養(yǎng)7天左右，鏡下 觀察，2孔細(xì)胞較純，幾乎都是上皮細(xì)胞，將2孔細(xì)胞消化下來(lái)，計(jì)數(shù)，再鋪一個(gè)48孔板，繼續(xù)培養(yǎng)7～10天左右。鏡下觀察，有4孔細(xì)胞都是上皮細(xì)胞。將4孔細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，使之增殖到一定數(shù)量，取一部分細(xì)胞，分別進(jìn)行SP免疫組化和免疫熒光鑒定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與實(shí)施例1所得細(xì)胞相近，在倒置顯微鏡下觀察傳代細(xì)胞形態(tài)與實(shí)施例1培養(yǎng)所得細(xì)胞基本一致。

實(shí)施例6

成年大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞的分離、純化及原代培養(yǎng)：

1)首先，腹腔注射10％水合氯醛(5ml/kg)麻醉成年SD大鼠(分別包括正常大鼠和模型大鼠)，75％的酒精浸泡消毒15min后放入超凈臺(tái)內(nèi)，無(wú)菌條件下打開(kāi)大鼠腹腔，找到自肛門(mén)向近端5～10cm的大鼠結(jié)腸，將腸系膜組織剝離干凈，完全游離出結(jié)腸，剪下后浸泡在含青、鏈霉素(青霉素的工作濃度為100U/ml，鏈霉素的工作濃度為0.1mg/ml)的無(wú)菌PBS中。

2)將結(jié)腸剪開(kāi)，用含抗生素的無(wú)菌PBS漂洗5～10遍以去除結(jié)腸內(nèi)容物。

3)用無(wú)菌眼科剪將組織剪碎至體積為1mm³左右，加入6ml 0.44％Ⅳ型膠原酶：透明質(zhì)酸酶＝5.5:1的消化液中，置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱消化1.5h左右，邊消化邊震蕩搖勻以便消化更充分，一般間隔15～20min震蕩一次。

4)消化完畢，小心轉(zhuǎn)移上清至離心管中，1000rpm，離心10min，棄上清，沉淀主要成分為腸上皮細(xì)胞團(tuán)塊和未消化的組織小塊，用含10％胎牛血清(GIBCO胎牛血清)的DMEM重懸細(xì)胞，接種于培養(yǎng)皿中，37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。32h后換液，洗去殘留未消化的組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)。

5)倒置顯微鏡鏡下觀察，細(xì)胞不多，有纖維細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)3～5天后，鏡下可見(jiàn)較多成纖維細(xì)胞，結(jié)腸上皮細(xì)胞較少。換液后繼續(xù)培養(yǎng)。

6)大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞的純化：細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)5～7天后，倒置顯微鏡下觀察上皮細(xì)胞生長(zhǎng)情況，其長(zhǎng)至瓶底的90％時(shí)，胰酶消化，選用培養(yǎng)板進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

成年大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：

經(jīng)過(guò)上述步驟進(jìn)行原代培養(yǎng)的大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞(分別包括正常大鼠和模型大鼠)，從5％CO₂培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)皿，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿的90％便可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。按照如下步驟進(jìn)行傳代培養(yǎng)，進(jìn)一步純化結(jié)腸上皮細(xì)胞，具體步驟如下：將細(xì)胞用0.25％胰酶消化，離心，完全培養(yǎng)基(DMEM+10％胎牛血清)重懸，計(jì)數(shù)。取1×10³/ml細(xì)胞，鋪48孔板，繼續(xù)培養(yǎng)7天左右。鏡下觀察，有3～5孔細(xì)胞幾乎沒(méi)有成纖維細(xì)胞，大部分是上 皮細(xì)胞，將這3～5孔細(xì)胞消化傳代，一般7天左右擴(kuò)到12孔板，繼續(xù)培養(yǎng)7天左右，鏡下觀察，2孔細(xì)胞較純，幾乎都是上皮細(xì)胞，將2孔細(xì)胞消化下來(lái)，計(jì)數(shù)，再鋪一個(gè)48孔板，繼續(xù)培養(yǎng)7～10天左右。鏡下觀察，有3孔細(xì)胞都是上皮細(xì)胞。將3孔細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，使之增殖到一定數(shù)量，取一部分細(xì)胞，分別進(jìn)行SP免疫組化和免疫熒光鑒定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與實(shí)施例1所得細(xì)胞相近，在倒置顯微鏡下觀察傳代細(xì)胞形態(tài)與實(shí)施例1培養(yǎng)所得細(xì)胞基本一致。

綜上所述，本發(fā)明有效克服了現(xiàn)有技術(shù)中的種種缺點(diǎn)而具高度產(chǎn)業(yè)利用價(jià)值。

上述實(shí)施例僅例示性說(shuō)明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識(shí)者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。