1.一種穩(wěn)定的哺乳動物結(jié)腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法,包括如下步驟:
1)將結(jié)腸組織剪碎,并加入消化液中進(jìn)行消化,所述消化液中包含IV型膠原酶和透明質(zhì)酸酶;
2)將上清轉(zhuǎn)移至離心管離心,離心后棄去上清,并使用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,并將細(xì)胞接種培養(yǎng);
3)培養(yǎng)至瓶底細(xì)胞覆蓋率≥70%時消化、離心,并重懸于完全培養(yǎng)基中,傳代培養(yǎng)后,即得結(jié)腸上皮細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的結(jié)腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法,其特征在于,所述哺乳動物為大鼠。
3.如權(quán)利要求2所述的結(jié)腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法,其特征在于,所述步驟1中,結(jié)腸組織通過如下步驟獲得:首先,麻醉成年大鼠,消毒后放入超凈臺內(nèi),無菌條件下打開大鼠腹腔,找到自肛門向近端5~10cm的大鼠結(jié)腸,將腸系膜組織剝離干凈,完全游離出結(jié)腸,剪下后浸泡在含抗生素的處理液中,將結(jié)腸剪開,用含抗生素的處理液漂洗以去除結(jié)腸內(nèi)容物。
4.如權(quán)利要求1所述的結(jié)腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法,其特征在于,所述步驟1中,所述消化液為中IV型膠原酶和透明質(zhì)酸酶的水溶液,消化液中IV型膠原酶和透明質(zhì)酸酶的重量比為4.5~5.5:1,消化時間為1.5~2.5h,消化液中IV型膠原酶和透明質(zhì)酸酶的總濃度為0.36~0.44wt%。
5.如權(quán)利要求1所述的結(jié)腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法,其特征在于,所述步驟1中的消化的具體條件為:每1mm3結(jié)腸組織使用6~9ml消化液,消化過程中對消化體系震蕩搖勻。
6.如權(quán)利要求1所述的結(jié)腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法,其特征在于,所述步驟2、3中,完全培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和血清,所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM,所述血清為胎牛血清。
7.如權(quán)利要求1所述的結(jié)腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法,其特征在于,所述步驟3中,培養(yǎng)至瓶底細(xì)胞覆蓋率≥70%的過程中,需換液、洗去殘留未消化的組織塊;
和/或,所述消化為胰酶消化;
和/或,培養(yǎng)至瓶底細(xì)胞覆蓋率≥90%時消化、離心。
8.如權(quán)利要求7所述的結(jié)腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法,其特征在于,所述培養(yǎng)的具體條件為:37℃、5%CO2,培養(yǎng)體系的體積為6~8ml;
和/或,培養(yǎng)18~32h后換液,洗去殘留未消化的組織塊,繼續(xù)培養(yǎng)3~5天后換液,換液后繼續(xù)培養(yǎng),至瓶底細(xì)胞覆蓋率≥70%時胰酶消化。
9.如權(quán)利要求1所述的結(jié)腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法,其特征在于,所述步驟3中,傳代培養(yǎng)具體 包括如下步驟:
A)計數(shù)后將細(xì)胞鋪板,培養(yǎng)7~10天;
B)觀察各孔細(xì)胞,選取上皮細(xì)胞純度較高的孔中的細(xì)胞消化、離心,并重懸于完全培養(yǎng)基中;
重復(fù)步驟A和B,至上皮細(xì)胞純度達(dá)到目標(biāo)純度。
10.如權(quán)利要求9所述的結(jié)腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法,其特征在于,所述步驟A中的培養(yǎng)的具體條件為:37℃、5%CO2,培養(yǎng)體系的體積為6~8ml;
和/或,所述步驟B中,消化為胰酶消化;
和/或,重復(fù)步驟A和B,至培養(yǎng)孔中上皮細(xì)胞純度≥90%。