本發(fā)明屬于核酸擴(kuò)增
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種檢測革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因的基因芯片試劑盒。
背景技術(shù)：
：細(xì)菌耐藥基因檢測具有重要臨床意義。臨床診斷中存在抗生素的用量大、起點(diǎn)高、種類較為隨意的缺陷，從而導(dǎo)致耐藥菌種的產(chǎn)生和流行。目前用于耐藥基因檢測仍較為傳統(tǒng)，大致有生理生化試驗(yàn)、血清學(xué)試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)等后加以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增相應(yīng)基因的方法，而上述檢測方法需要時(shí)間長，方法操作煩瑣、報(bào)告結(jié)果慢、通量低，且往往先鑒定出菌種，才能相應(yīng)的進(jìn)行藥敏等后續(xù)試驗(yàn)，因而難以適應(yīng)臨床治療的需要。因此開發(fā)快速高通量的分子診斷技術(shù)檢測，可以協(xié)助快速診斷，指導(dǎo)及時(shí)準(zhǔn)確用藥。生物芯片技術(shù)是近年來在生命科學(xué)領(lǐng)域中迅速發(fā)展并成熟的一項(xiàng)高新技術(shù)，主要是通過微加工技術(shù)和微電子技術(shù)在固相芯片表面構(gòu)建的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞、蛋白質(zhì)、核酸以及其他多種生物成份的準(zhǔn)確、快速、大量信息的檢測。生物芯片的主要特點(diǎn)是高通量、微型化和自動化。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一個目的是提供一種用于檢測革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因的引物對組。本發(fā)明所提供的用于檢測革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因的引物對組，由如下10個引物對組成：1)如下(a1)或(a2)所示的引物對，記為引物對1：(a1)由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對；(a2)由將序列表中序列1和序列2經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的兩條單鏈DNA分子組成的，且與(a1)中所述引物對功能相同的引物對；2)如下(b1)或(b2)所示的引物對，記為引物對2：(b1)由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對；(b2)由將序列表中序列3和序列4經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的兩條單鏈DNA分子組成的，且與(b1)中所述引物對功能相同的引物對；3)如下(c1)或(c2)所示的引物對，記為引物對3：(c1)由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對；(c2)由將序列表中序列5和序列6經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的兩條單鏈DNA分子組成的，且與(c1)中所述引物對功能相同的引物對；4)如下(d1)或(d2)所示的引物對，記為引物對4：(d1)由序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對；(d2)由將序列表中序列7和序列8經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的兩條單鏈DNA分子組成的，且與(d1)中所述引物對功能相同的引物對；5)如下(e1)或(e2)所示的引物對，記為引物對5：(e1)由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對；(e2)由將序列表中序列9和序列10經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的兩條單鏈DNA分子組成的，且與(e1)中所述引物對功能相同的引物對；6)如下(f1)或(f2)所示的引物對，記為引物對6：(f1)由序列表中序列11和序列12所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對；(f2)由將序列表中序列11和序列12經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的兩條單鏈DNA分子組成的，且與(f1)中所述引物對功能相同的引物對；7)如下(g1)或(g2)所示的引物對，記為引物對7：(g1)由序列表中序列13和序列14所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對；(g2)由將序列表中序列13和序列14經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的兩條單鏈DNA分子組成的，且與(g1)中所述引物對功能相同的引物對；8)如下(h1)或(h2)所示的引物對，記為引物對8：(h1)由序列表中序列15和序列16所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對；(h2)由將序列表中序列15和序列16經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的兩條單鏈DNA分子組成的，且與(h1)中所述引物對功能相同的引物對；9)如下(i1)或(i2)所示的引物對，記為引物對9：(i1)由序列表中序列17和序列18所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對；(i2)由將序列表中序列17和序列18經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的兩條單鏈DNA分子組成的，且與(i1)中所述引物對功能相同的引物對；10)如下(j1)或(j2)所示的引物對，記為引物對10：(j1)由序列表中序列19和序列20所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對；(j2)由將序列表中序列19和序列20經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的兩條單鏈DNA分子組成的，且與(j1)中所述引物對功能相同的引物對。其中，所述引物對1用于擴(kuò)增blaDHA-1基因；所述引物對2用于擴(kuò)增blaOXA-23基因；所述引物對3用于擴(kuò)增blaOXA-24基因；所述引物對4用于擴(kuò)增blaOXA-58基因；所述引物對5用于擴(kuò)增blaKPC-1基因；所述引物對6用于擴(kuò)增blaIMP-4基因；所述引物對7用于擴(kuò)增blaVIM-8基因；所述引物對8用于擴(kuò)增blaNDM-1基因；所述引物對9用于擴(kuò)增blaCTX-M-1基因；所述引物對10用于擴(kuò)增blaCTX-M-9基因。本發(fā)明的第二個目的是提供一種用于檢測革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因的成套單鏈DNA。本發(fā)明所提供的用于檢測革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因的成套單鏈DNA，具體由探針組和所述引物對組組成；所述探針組由如下10個單鏈DNA探針組成：序列表中序列21所示的單鏈DNA探針1；序列表中序列22所示的單鏈DNA探針2；序列表中序列23所示的單鏈DNA探針3；序列表中序列24所示的單鏈DNA探針4；序列表中序列25所示的單鏈DNA探針5；序列表中序列26所示的單鏈DNA探針6；序列表中序列27所示的單鏈DNA探針7；序列表中序列28所示的單鏈DNA探針8；序列表中序列29所示的單鏈DNA探針9；序列表中序列30所示的單鏈DNA探針10。其中，所述單鏈DNA探針1用于檢測所述引物對1的擴(kuò)增結(jié)果；所述單鏈DNA探針2用于檢測所述引物對2的擴(kuò)增結(jié)果；所述單鏈DNA探針3用于檢測所述引物對3的擴(kuò)增結(jié)果；所述單鏈DNA探針4用于檢測所述引物對4的擴(kuò)增結(jié)果；所述單鏈DNA探針5用于檢測所述引物對5的擴(kuò)增結(jié)果；所述單鏈DNA探針6用于檢測所述引物對6的擴(kuò)增結(jié)果；所述單鏈DNA探針7用于檢測所述引物對7的擴(kuò)增結(jié)果；所述單鏈DNA探針8用于檢測所述引物對8的擴(kuò)增結(jié)果；所述單鏈DNA探針9用于檢測所述引物對9的擴(kuò)增結(jié)果；所述單鏈DNA探針10用于檢測所述引物對10的擴(kuò)增結(jié)果。本發(fā)明的第三個目的是提供一種用于檢測革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因的試劑盒。本發(fā)明所提供的用于檢測革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因的試劑盒，含有所述引物對組，以及雜交芯片；所述雜交芯片是按照包括如下步驟的方法制備獲得的：將通式為“NH2-(T)n-雜交探針序列”的3種單鏈檢測探針分別通過氨基與醛基的反應(yīng)固定到醛基修飾化的固相載體(如玻片)上，獲得所述雜交芯片；所述通式中的(T)n表示n個連續(xù)的T，n為大于等于5，且小于等于30的整數(shù)；所述通式中對應(yīng)于所述10種單鏈 檢測探針的10種雜交探針序列分別如序列表中序列21-30所示。根據(jù)需要，所述試劑盒中還可含有經(jīng)熒光標(biāo)記的隨機(jī)引物；所述隨機(jī)引物的序列為5’-NX-3’，N表示A、G、C和T中的任一種，6≤X≤15，且X為整數(shù)(如X＝9)，NX表示X個連續(xù)的脫氧核糖核苷酸。以上所述經(jīng)熒光標(biāo)記的隨機(jī)引物是用于對所述引物對組中的引物對的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熒光標(biāo)記的。根據(jù)需要，也可以不采用所述經(jīng)熒光標(biāo)記的隨機(jī)引物對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熒光標(biāo)記，而是采用其他方法。如將所述引物對組中每個引物對的一條引物的5’末端進(jìn)行熒光標(biāo)記(如TAMRA)，被熒光標(biāo)記的引物是存在于擴(kuò)增產(chǎn)物中可被相應(yīng)探針雜交的單鏈DNA上的引物。所述試劑盒中還可含有雜交液；所述雜交液中含有經(jīng)熒光標(biāo)記的無關(guān)單鏈DNA分子；所述無關(guān)單鏈DNA分子為非源自于所述革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因的單鏈DNA分子。所述雜交芯片的制備方法還包括將表面化學(xué)質(zhì)控探針QC、和/或雜交質(zhì)控探針PC、和/或陰性對照探針BC通過氨基與醛基的反應(yīng)固定到所述醛基修飾化的固相載體(如玻片)上的步驟；所述表面化學(xué)質(zhì)控探針QC、所述雜交質(zhì)控探針PC和所述陰性對照探針均為單鏈探針；所述表面化學(xué)質(zhì)控探針QC的一端經(jīng)氨基修飾，另一端具有熒光標(biāo)記(如Hex)；所述雜交質(zhì)控探針PC的一端經(jīng)氨基修飾，且能與所述雜交液中的所述無關(guān)單鏈DNA分子雜交；所述陰性對照探針BC的一端經(jīng)氨基修飾，且與源自于所述細(xì)菌耐藥基因的任何單鏈DNA分子均不能雜交。進(jìn)一步，在本發(fā)明中，所述表面化學(xué)質(zhì)控探針QC自5’端到3’端的結(jié)構(gòu)組成為“NH2-TCACTTGCTTCCGTTGAGG-Hex”；所述雜交質(zhì)控探針PC自5’端到3’端的結(jié)構(gòu)組成為“NH2-TTTTTTTTTTTTCCTCAACGGAAGCAAGTGAT”；所述陰性對照探針BC自5’端到3’端的結(jié)構(gòu)組成為“NH2-TTTTTTTTTTTTGTTGCTTCTGGAATGAGTTTGCT”。所述引物對組或所述成套單鏈DNA或所述試劑盒在如下(a)或(b)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：(a)檢測或輔助檢測革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因(非診斷目的)，或制備用于檢測或輔助檢測革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因的產(chǎn)品；(b)檢測或輔助檢測含有革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因的細(xì)(非診斷目的)菌，或制備用于檢測或輔助檢測含有革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因的細(xì)菌的產(chǎn)品。在本發(fā)明中，所述革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因具體可為如下中的至少一種：blaDHA-1基因、blaOXA-23基因、blaOXA-24基因、blaOXA-58基因、blaKPC-1基因、blaIMP-4基因、blaVIM-8 基因、blaNDM-1基因、blaCTX-M-1基因和blaCTX-M-9基因。所述blaDHA-1基因的GenBank登錄號為EF406115.1(update：2007-8-17)；所述blaOXA-23基因的GenBank登錄號為JN665073.1(update：2011-11-7)；所述blaOXA-24基因的GenBank登錄號為JN207494.1(update：2011-11-27)；所述blaOXA-58基因的GenBank登錄號為EU107372.1(update：2007-9-11)；所述blaKPC-1基因的GenBank登錄號為AF297554.1(update：2001-3-26)；所述blaIMP-4基因的GenBank登錄號為AF244145.1(update：2001-2-27)；所述blaVIM-8基因的GenBank登錄號為AY524987.1(update：2004-11-5)；所述blaNDM-1基因的GenBank登錄號為JF503991.1(update：2012-12-11)；所述blaCTX-M-1基因的GenBank登錄號為AJ416342.1(update：2008-10-23)；所述blaCTX-M-9基因的GenBank登錄號為AJ416345.1(update：2005-4-15)。相應(yīng)的，含有所述blaDHA-1基因的細(xì)菌具體可為肺炎克雷伯菌；含有所述blaOXA-23基因的細(xì)菌具體可為鮑曼不動桿菌；含有所述blaOXA-24基因的細(xì)菌具體可為鮑曼不動桿菌；含有所述blaOXA-58基因的細(xì)菌具體可為鮑曼不動桿菌；含有所述blaKPC-1基因的細(xì)菌具體可為肺炎克雷伯菌或銅綠假單胞菌；含有所述blaIMP-4基因的細(xì)菌具體可為鮑曼不動桿菌；含有所述blaVIM-8基因的細(xì)菌具體可為肺炎克雷伯菌或鮑曼不動桿菌；含有所述blaNDM-1基因的細(xì)菌具體可為大腸埃希氏菌；含有所述blaCTX-M-1基因的細(xì)菌具體可為奇異變形桿菌；含有所述blaCTX-M-9基因的細(xì)菌具體可為大腸埃希氏菌。所述引物對組或所述成套單鏈DNA在制備所述試劑盒中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明對極大樣本量的革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因進(jìn)行研究。本發(fā)明提供的試劑盒支持高通量，快速、準(zhǔn)確地檢測多個革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因，對中國人群進(jìn)行篩查，能有效地起到準(zhǔn)確診斷、耐藥溯源、耐藥控制等作用，從而抗生素使用量，減少耐藥產(chǎn)生。附圖說明圖1為雜交芯片的點(diǎn)陣排布示意圖(即芯片探針布局示意圖)。-表示未固定任何探針。圖2為用于檢測革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因的試劑盒的特異性分析結(jié)果。該圖對應(yīng)的芯片探針布局示意圖如圖1所示。其中，A所示芯片檢測結(jié)果對應(yīng)的參考品DNA質(zhì)粒為ZL-CTX-M-1(對應(yīng)blaCTX-M-1基因)；B所示芯片檢測結(jié)果對應(yīng)的參考品DNA質(zhì)粒為ZL-CTX-M-9(對應(yīng)blaCTX-M-9基因)；C所示芯片檢測結(jié)果對應(yīng)的參考品DNA質(zhì)粒為ZL-DHA-1(對應(yīng)blaDHA-1基因)；D所示芯片檢測結(jié)果對應(yīng)的參考品DNA質(zhì)粒為ZL-IMP-4(對應(yīng)blaIMP-4基因)；E所示芯片檢測結(jié)果對應(yīng)的參考品DNA質(zhì)粒為ZL-KPC-1(對應(yīng)blaKPC-1基因)；F所示芯片檢測結(jié)果對應(yīng)的參考品DNA質(zhì)粒為 ZL-NDM-1(對應(yīng)blaNDM-1基因)；G所示芯片檢測結(jié)果對應(yīng)的參考品DNA質(zhì)粒為ZL-OXA-23(對應(yīng)blaOXA-23基因)；H所示芯片檢測結(jié)果對應(yīng)的參考品DNA質(zhì)粒為ZL-OXA-24(對應(yīng)blaOXA-24基因)；I所示芯片檢測結(jié)果對應(yīng)的參考品DNA質(zhì)粒為ZL-OXA-58(對應(yīng)blaOXA-58基因)；J所示芯片檢測結(jié)果對應(yīng)的參考品DNA質(zhì)粒為ZL-VIM-8(對應(yīng)blaVIM-8基因)。圖3為三份臨床樣品的芯片檢測結(jié)果圖。該圖對應(yīng)的芯片探針布局示意圖如圖1所示。其中，A為1號臨床樣本；B為2號臨床樣本；C為3號臨床樣本。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、用于檢測革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因的試劑盒的制備及其使用一、用于檢測革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因的試劑盒的組裝與制備1、針對10個革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因設(shè)計(jì)的引物和雜交探針針對10個革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因設(shè)計(jì)的引物和單鏈雜交探針具體序列如表1和表2所示。表1針對10個革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因設(shè)計(jì)的引物表2針對10個革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因設(shè)計(jì)的單鏈雜交探針編號檢測基因GenBank探針名稱序列(5’-3’)1blaDHA-1EF406115.1DHA-574TTGCTGACTGCACGGATCCT(序列21)2blaOXA-23JN665073.1OXA23-139CCCGAGTCAGATTGTTCAAG(序列22)3blaOXA-24JN207494.1OXA24-673GTTACTCCACAGGTAGGTTG(序列23)4blaOXA-58EU107372.1OXA58-120CGATCAGAATGTTCAAGCGC(序列24)5blaKPC-1AF297554.1KPC-335TGACAACAGGCATGACGGTG(序列25)6blaIMP-4AF244145.1IMP_573AGAAGCTTGGCCAAAGTCCG(序列26)7blaVIM-8AY524987.1VIM_368TTGATGTCCTTCGGGCGGCT(序列27)8blaNDM-1JF503991.1NDM1-214GCAGTCGCTTCCAACGGTTT(序列28)9blaCTX-M-1AJ416342.1CTXM1-648CAATACCACCGGTGCAGCGA(序列29)10blaCTX-M-9AJ416345.1CTXM9-433AGCCTGCCGATCTGGTTAAC(序列30)2、將雜交探針固定于雜交芯片雜交芯片為分別固定有10種單鏈檢測探針的基片。每種檢測探針都是一段氨基修飾的寡核苷酸探針，10種單鏈檢測探針的通式為“NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-雜交探針序列”，其中“雜交探針序列”即為表2中序列20-30所示的10種單鏈雜交探針”。各檢測探針分別用基因點(diǎn)樣液(博奧生物集團(tuán)有限公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號為CP.440010)溶解，終濃度為10μM，重復(fù)三次點(diǎn)制到醛基化修飾的玻片(博奧生物集團(tuán)有限公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號為CP.420022)上，從而通過氨基與醛基的反應(yīng)將10種探針固定到雜交芯片上。另外，同樣通過氨基與醛基的反應(yīng)將表面化學(xué)質(zhì)控探針QC、雜交質(zhì)控探針PC和陰性對照探針BC也固定到雜交芯片上。QC是一端帶有Hex標(biāo)記，另一端具有氨基修飾的單鏈寡核苷酸探針，用于觀察芯片點(diǎn)樣和固定的效率，其自5’端到3’端的結(jié)構(gòu)組成為NH2-TCACTTGCTTCCGTTGAGG-Hex。PC是一段氨基修飾的單鏈寡核苷酸探針，可以與雜交液中添加的經(jīng)熒光標(biāo)記的無關(guān)單鏈DNA分子(C-PC)雜交，用于雜交過程的質(zhì)控，其自5’端到3’端的結(jié)構(gòu)組成為NH2-TTTTTTTTTTTTCCTCAACGGAAGCAAGTGAT。BC是一段氨基修飾的寡核苷酸探針，與雜交體系中的所有待檢測序列均不會雜交，用于觀察有無非特異雜交，其自5’端到3’端的結(jié)構(gòu)組成為NH2-TTTTTTTTTTTTGTTGCTTCTGGAATGAGTTTGCT。圖1為雜交芯片的點(diǎn)陣排布示意圖。3、用于檢測革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因的試劑盒的組成本發(fā)明所提供的用于檢測革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因(即表1和表2中涉及的10種革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因)的試劑盒含有：(1)步驟1中表1所示的10個引物對；(2)步驟2中固定有10種檢測探針以及表面化學(xué)質(zhì)控探針QC、雜交質(zhì)控探針PC和陰性對照探針BC的雜交芯片；(3)經(jīng)熒光標(biāo)記的隨機(jī)引物；所述隨機(jī)引物的序列為5’-N9-3’，N表示A、G、C和T中的任一種，N9表示9個連續(xù)的脫氧核糖核苷酸。(4)雜交液；所述雜交液中含有經(jīng)熒光標(biāo)記的無關(guān)單鏈DNA分子(C-PC)，其核苷酸序列為5’-ATCACTTGCTTCCGTTGAGG-3’。二、用于檢測革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因的試劑盒的使用方法1、樣品聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增取1μL待測的DNA樣品溶液，以其為模板，分別采用表1所示的10個引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增。20μLPCR擴(kuò)增體系如下：10×PCRbuffer(含Mg2+)2μL；2.5mMdNTP1.6μL；10μM上游引物0.5μL；10μM下游引物0.5μL；模板1μL；5U/μLrTaq0.2μL；補(bǔ)水至20μL。PCR擴(kuò)增程序如下：94℃5min；(94℃30s；55℃30s；72℃1min)30循環(huán)；72℃10min。PCR反應(yīng)結(jié)束后共得到10份PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。2、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光標(biāo)記每種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物取5μL，加入到不同樣品管中，每個樣品管中加入3μL濃度為100μM的經(jīng)TAMRA熒光標(biāo)記的9N隨機(jī)引物(核苷酸序列為5’-N9-3’，N表示A、G、C和T中的任一種，N9表示9個連續(xù)的脫氧核糖核苷酸，具體為生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品)，補(bǔ)水至19μL，震蕩混勻，瞬時(shí)離心；95℃變性后置于冰上，加入6μL熒光標(biāo)記反應(yīng)體系mix(組成：10×KlenowBuffer2.5μL；5U/μLKlenow酶1μL；2.5mMdNTP2.5μL)。按程序進(jìn)行熒光標(biāo)記，程序如下：37℃90min；70℃10min。共得到10份TAMRA熒光標(biāo)記產(chǎn)物。3、TAMRA熒光標(biāo)記產(chǎn)物的純化使用Macherey-Nagel公司生產(chǎn)的NucleoSpinGelandPCRClean-up試劑盒(產(chǎn)品貨號：REF740609*250)，對步驟2獲得的TAMRA熒光標(biāo)記產(chǎn)物進(jìn)行純化，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。4、雜交將含有經(jīng)TAMRA熒光標(biāo)記的無關(guān)單鏈DNA分子(5’-ATCACTTGCTTCCGTTGAGG-3’)的雜交buffer(博奧生物集團(tuán)有限公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號為CP.440030)在50℃融化，配制10份雜交混合液(其中步驟3純化后的TAMRA熒光標(biāo)記產(chǎn)物溶液15μL，雜交buffer5μL)，將配制好的10份雜交混合液加入到步驟一2中的雜交芯片上，每份雜交混合液對應(yīng)一個完整雜交芯片，95℃變性3min，立即放置冰上，并50℃水浴雜交2h。5、清洗用兩種不同洗液(洗液I：2×SSC，0.2％SDS，預(yù)熱至50℃；洗液II：0.2×SSC，預(yù)熱至50℃)按照先洗液I后洗液II的順序分別清洗4min后，把芯片放在SlideWasher_8芯片清洗儀中，選擇離心程序，離心(或離心機(jī)1000rpm離心2min)，甩干。6、掃描及結(jié)果判定使用博奧晶芯LuxScan10K微陣列芯片掃描儀完成掃描(選擇綠色通道，設(shè)定“Power”的參數(shù)范圍為50-90和“PMT”的參數(shù)范圍為500-900)，并根據(jù)掃描結(jié)果按照如下方法確定待測DNA樣品中是否含有表1中涉及的10種革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因，以及具體含有10種革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因中的哪一種或哪幾種：用于檢測某革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因的探針在芯片上的固定位置處如果檢測到熒光信號，則判定對應(yīng)的待測DNA樣品中含有對應(yīng)的革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因；否則則不含有對應(yīng)的革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因。另外，掃描過程中軟件會根據(jù)檢測到的熒光信號強(qiáng)度賦予不同顏色，顏色由藍(lán)色至白色，信號逐漸增強(qiáng)，進(jìn)而可初步判斷待測DNA樣品中目標(biāo)革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因含量的高低。實(shí)施例2、用于檢測革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因的試劑盒的特異性和靈敏度測定一、參考品DNA質(zhì)粒的制備1、含有blaDHA-1基因靶標(biāo)片段的質(zhì)粒的構(gòu)建將blaDHA-1基因(GenBank：EF406115.1，update：2007-8-17)的第1-1113位所示DNA片段連接至pGEM-TEasyVector載體(promega公司產(chǎn)品)上，得到重組質(zhì)粒ZL-DHA-1。并經(jīng)測序驗(yàn)證正確。2、含有blaOXA-23基因靶標(biāo)片段的質(zhì)粒的構(gòu)建將blaOXA-23基因(GenBank：JN665073.1，update：2011-11-7)的第97-899位所示DNA片段連接至pGEM-TEasyVector載體上，得到重組質(zhì)粒ZL-OXA-23。并經(jīng)測序驗(yàn)證正確。3、含有blaOXA-24基因靶標(biāo)片段的質(zhì)粒的構(gòu)建將blaOXA-24基因(GenBank：JN207494.1，update：2011-11-27)的第4168-4882位所示DNA片段連接至pGEM-TEasyVector載體上，得到重組質(zhì)粒ZL-OXA-24。并經(jīng)測序驗(yàn)證正確。4、含有blaOXA-58基因靶標(biāo)片段的質(zhì)粒的構(gòu)建將blaOXA-58基因(GenBank：EU107372.1，update：2007-9-11)的第42-835位所示DNA片段連接至pGEM-TEasyVector載體上，得到重組質(zhì)粒ZL-OXA-58。并經(jīng)測 序驗(yàn)證正確。5、含有blaKPC-1基因靶標(biāo)片段的質(zhì)粒的構(gòu)建將blaKPC-1基因(GenBank：AF297554.1，update：2001-3-26)的第154-1003位所示DNA片段連接至pGEM-TEasyVector載體上，得到重組質(zhì)粒ZL-KPC-1。并經(jīng)測序驗(yàn)證正確。6、含有blaIMP-4基因靶標(biāo)片段的質(zhì)粒的構(gòu)建將blaIMP-4基因(GenBank：AF244145.1，update：2001-2-27)的第1-470位所示DNA片段連接至pGEM-TEasyVector載體上，得到重組質(zhì)粒ZL-IMP-4。并經(jīng)測序驗(yàn)證正確。7、含有blaVIM-8基因靶標(biāo)片段的質(zhì)粒的構(gòu)建將blaVIM-8基因(GenBank：AY524987.1，update：2004-11-5)的第89-798位所示DNA片段連接至pGEM-TEasyVector載體上，得到重組質(zhì)粒ZL-VIM-8。并經(jīng)測序驗(yàn)證正確。8、含有blaNDM-1基因靶標(biāo)片段的質(zhì)粒的構(gòu)建將blaNDM-1基因(GenBank：JF503991.1，update：2012-12-11)的第118437-119168位所示DNA片段連接至pGEM-TEasyVector載體上，得到重組質(zhì)粒ZL-NDM-1。并經(jīng)測序驗(yàn)證正確。9、含有blaCTX-M-1基因靶標(biāo)片段的質(zhì)粒的構(gòu)建將blaCTX-M-1基因(GenBank：AJ416342.1，update：2008-10-23)的第567-1373位所示DNA片段連接至pGEM-TEasyVector載體上，得到重組質(zhì)粒ZL-CTX-M-1。并經(jīng)測序驗(yàn)證正確。10、含有blaCTX-M-9基因靶標(biāo)片段的質(zhì)粒的構(gòu)建將blaCTX-M-9基因(GenBank：AJ416345.1，update：2005-4-15)的第218-958位所示DNA片段連接至pGEM-TEasyVector載體上，得到重組質(zhì)粒ZL-CTX-M-9。并經(jīng)測序驗(yàn)證正確。二、用于檢測革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因的試劑盒的特異性分析將步驟一構(gòu)建的10種參考品DNA質(zhì)粒均稀釋至濃度為104拷貝/μL，分別以稀釋后的10種參考品DNA質(zhì)粒為待測DNA樣品，然后按照實(shí)施例1步驟二進(jìn)行操作，檢測待測DNA樣品中是否含有目的革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因，具體判定方法參見實(shí)施例1步驟二6。結(jié)果如圖2所示，由圖可見對于每一種參考品DNA質(zhì)粒而言，均僅為固定了相應(yīng)檢測探針的點(diǎn)能夠檢測到明顯熒光信號，其他點(diǎn)均沒有檢測到熒光信號。該結(jié)果表明本發(fā)明所提供的用于檢測革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因的試劑盒具有較強(qiáng)的特異性。三、用于檢測革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因的試劑盒的靈敏度分析將上述步驟一構(gòu)建的10種參考品DNA質(zhì)粒分別進(jìn)行梯度稀釋，得到濃度依次為104拷貝/μL、103拷貝/μL、102拷貝/μL、101拷貝/μL的稀釋液。分別以不同稀釋度的10種參考品DNA質(zhì)粒為待測DNA樣品，然后按照實(shí)施例1步驟二進(jìn)行操作，檢測待測DNA樣品中是否含有目的革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因，具體判定方法參見實(shí)施例1步驟二6。結(jié)果顯示：對于每一種參考品DNA質(zhì)粒而言，濃度為104拷貝/μL、103拷貝/μL、102拷貝/μL時(shí)相應(yīng)檢測探針的點(diǎn)都能夠檢測到明顯熒光信號；僅濃度為101拷貝/μL的參考品DNA質(zhì)粒沒有檢測到熒光信號。該結(jié)果表明本發(fā)明所提供的用于檢測革蘭氏陽性細(xì)菌耐藥基因的試劑盒具有較高的靈敏度。實(shí)施例3、實(shí)際臨床樣品的檢測一、臨床樣本類型本實(shí)施例所采用臨床樣本來自于北京大學(xué)人民醫(yī)院采集的人傷口處粘稠膿液(本著本采集者自愿的原則)，共三份。二、臨床樣本中DNA樣品的提取1、取步驟一的臨床樣本1-3mL；2、加入4倍體積4％(4g/100mL)的NaOH，搖勻，室溫放置30min液化；3、取0.5mL液化后膿液與0.5ml4％(4g/100mL)的NaOH，室溫，10min；4、12000rpm離心15min；5、棄上清，加無菌生理鹽水1mL，混勻，12000rpm離心5min；6、棄上清，沉淀用于DNA提??；7、加入50μL核酸提取液(博奧生物集團(tuán)有限公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號為CP.360090)，充分震蕩混勻，使沉淀完全懸浮；8、將懸浮液轉(zhuǎn)移至核酸提取管中，旋緊管蓋，放入核酸提取儀或渦旋震蕩儀上最大轉(zhuǎn)速震蕩5min；9、95℃金屬浴加熱5min；10、5000rpm離心1min，將上清液轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，-20℃保存?zhèn)溆?。三、?shí)際臨床樣品的檢測將步驟二獲得的三份臨床樣本DNA為待測DNA樣品，然后按照實(shí)施例1步驟二進(jìn)行操作，檢測待測DNA樣品中是否含有目的革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥基因，具體判定方法參見實(shí)施例1步驟二6。結(jié)果如圖3所示，由圖可見三份樣本雜交信號均清晰且單一。經(jīng)與探針位置比對， 1號臨床樣本中檢測得到信號為耐藥基因blaCTX-M-9和blaKPC-1；2號臨床樣本中檢測得到信號為耐藥基因blaOXA-23、blaOXA-58和blaVIM-8；3號臨床樣本中檢測得到信號為耐藥基因blaCTX-M-1和blaDHA-1。為了進(jìn)一步確定以上本發(fā)明檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，本發(fā)明的發(fā)明人將三份臨床樣本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了瓊脂糖凝膠電泳及測序驗(yàn)證，結(jié)果證實(shí)：1號臨床樣本僅采用引物對CTX-M9-F/CTX-M9-R和KPC-F/KPC-R的擴(kuò)增產(chǎn)物具有明顯的電泳條帶，而其他引物對的擴(kuò)增產(chǎn)物均沒有檢測到明顯的電泳條帶，進(jìn)一步對引物對CTX-M9-F/CTX-M9-R和KPC-F/KPC-R的擴(kuò)增產(chǎn)物測序發(fā)現(xiàn)其序列正依次分別為blaCTX-M-9基因(GenBank：AJ416345.1，update：2005-4-15)的第218-958位和blaKPC-1基因(GenBank：AF297554.1，update：2001-3-26)的第154-1003位；2號臨床樣本僅采用引物對OXA23-F/OXA23-R、OXA58-F/OXA58-R和VIM-F/VIM-R的擴(kuò)增產(chǎn)物具有明顯的電泳條帶，而其他引物對的擴(kuò)增產(chǎn)物均沒有檢測到明顯的電泳條帶，進(jìn)一步對引物對OXA23-F/OXA23-R、OXA58-F/OXA58-R和VIM-F/VIM-R的擴(kuò)增產(chǎn)物測序發(fā)現(xiàn)其序列正依次分別為blaOXA-23基因(GenBank：JN665073.1，update：2011-11-7)的第97-899位、blaOXA-58基因(GenBank：EU107372.1，update：2007-9-11)的第42-835位和blaVIM-8基因(GenBank：AY524987.1，update：2004-11-5)的第89-798位；3號臨床樣本僅采用引物對CTX-M1-F/CTX-M1-R和DHA-F/DHA-R的擴(kuò)增產(chǎn)物具有明顯的電泳條帶，而其他引物對的擴(kuò)增產(chǎn)物均沒有檢測到明顯的電泳條帶，進(jìn)一步對引物對CTX-M1-F/CTX-M1-R和DHA-F/DHA-R的擴(kuò)增產(chǎn)物測序發(fā)現(xiàn)其序列正依次分別為blaCTX-M-1基因(GenBank：AJ416342.1，update：2008-10-23)的第567-1373位和blaDHA-1基因(GenBank：EF406115.1，update：2007-8-17)的第1-1113位。該結(jié)果證明利用本發(fā)明試劑盒的檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。當(dāng)前第1頁1 2 3