本發(fā)明涉及測(cè)定。更具體地，本發(fā)明涉及用于預(yù)測(cè)化療劑毒性的測(cè)定。描述了用于實(shí)現(xiàn)該測(cè)定的試劑和試劑盒。

5-氟尿嘧啶(FU)通常被用作用于治療癌癥比如結(jié)腸直腸癌(CRC)、乳腺癌和其他實(shí)性腫瘤的化療劑。基于FU的給藥方案包括團(tuán)注和靜脈灌注給藥和口服卡培他濱，卡培他濱是在惡性組織中優(yōu)先轉(zhuǎn)化為FU的前體藥物。對(duì)具有CRC患者的常見(jiàn)治療為卡培他濱([1-(3,4-二羥基-5-甲基四氫呋喃-2-基)-5-氟-2-氧代-1H-嘧啶-4-基]氨基甲酸戊基酯)。

向FU添加奧沙利鉑或伊立替康可提高效力，以及聯(lián)合給藥方案FOLFOX(de Gramont A et al.,J Clin Oncol 18(16):2938-47(2000),通過(guò)引用并入本文)、XELOX(Cassidy J et al.,J Clin Oncol 22(11):2084-91(2004),通過(guò)引用并入本文)和FOLFIRI(Douillard JY et al.,Lancet 355(9209):1041-7(2000),通過(guò)引用并入本文)是治療癌癥的標(biāo)準(zhǔn)療法。

因此FU是化療的支柱。但是，F(xiàn)U毒性是常見(jiàn)的，有10-30％的患者經(jīng)受著多種重度毒性，該毒性可定義為使用NCI不良反應(yīng)常見(jiàn)毒性標(biāo)準(zhǔn)(CTCAE)3.0版本測(cè)量的3級(jí)或更高：

卡培他濱通過(guò)抑制胸腺嘧啶的生產(chǎn)和通過(guò)轉(zhuǎn)換為并入DNA和RNA的代謝物而引起細(xì)胞毒性(Noordhuis P et al.,Nucleosides Nucleotides&Nucleic Acids 23:1481-1484(2004),通過(guò)引用并入本文)。正如其他的基于5-FU的化療方案，大約三分之一的卡培他濱患者遭受了藥物誘導(dǎo)不良事件的劑量限制水平。

FU毒性通常包括癥狀比如腹瀉，惡心和嘔吐，粘膜炎/口腔炎，骨髓抑制，中性粒細(xì)胞減少，血小板減少和手足綜合征(HFS)。最常見(jiàn)的劑量限制的卡培他濱毒性是HFS和腹瀉。毒性的頻率和類(lèi)型存在著很大的變異，其取決于用藥方案，以及總的來(lái)說(shuō)存在著與FU使用相關(guān)聯(lián)的0.5-1.0％死亡率(使用CTCAE 3.0版本測(cè)量的5級(jí))(Grem JL.,Investigational new drugs 18(4):299-313(2000)；和Twelves C et al.,The New England journal of medicine 352(26):2696-704(2005),二者通過(guò)引用并入本文)。毒性的發(fā)作可以是快速的，這導(dǎo)致了在單一治療和灌注與團(tuán)注5-FU的聯(lián)合方案中患者死亡率為0.5％至2％，(Saltz LB et al.,J Clin Oncol.25(23):3456-3461(2007)，通過(guò)引用并入本文)，以及對(duì)于卡培他濱方案死亡率為上述數(shù)目的半數(shù)?；颊唛g毒性差別可通過(guò)臨床因素如患者年齡、性別、本地臨床實(shí)踐和飲食進(jìn)行說(shuō)明(Stein BN et al,.Cancer 75(1):11-17(1995)；Cassidy J et al,.Ann Oncol.13(4):566-575(2002)；Haller DG et al.,J Clin Oncol.26(13):2118-2123(2008),各自通過(guò)引用并入本文)。然而，毒性多變性依然是無(wú)法解釋的。

因此，很多注意力都集中在鑒定可預(yù)測(cè)FU毒性的生物標(biāo)記或測(cè)定(Boisdron-Celle M et al.,Cancer letters 249(2):271-82(2007)；和Saif MW et al.,Journal of the National Cancer Institute 101(22):1543-52(2009),二者均通過(guò)引用并入本文)。然而，F(xiàn)U代謝是復(fù)雜的，其具有多個(gè)酶促反應(yīng)和中間體，如圖1所示。

卡培他濱激活和隨后5-FU作用和降解的生物化學(xué)途徑完全建立了，并提供了25個(gè)候選基因，其中變異可能會(huì)影響5-FU毒性(圖1)(Longley DB et al.,Nat Rev Cancer 3(5):330-338(2003)；Thorn CF et al.,Pharmacogenet Genomics 21(4):237-242(2011)；West CM et al.,Nat Rev Cancer 4(6):457-469(2004)；Miwa M et al.,Eur J Cancer 34(8):1274-1281(1998),各自通過(guò)引入并入本文)。當(dāng)在消化道中吸收時(shí)，卡培他濱在肝臟中部分轉(zhuǎn)化為5-FU，然后在CRC位點(diǎn)優(yōu)先轉(zhuǎn)化為5-FU。在肝臟中許多5-FU在激活之前由二氫嘧啶脫氫酶(DPYD)降解。作為藥物合理設(shè)計(jì)激活的部分，5-FU在腫瘤中進(jìn)一步激活為細(xì)胞毒性化合物，所述細(xì)胞毒性化合物通過(guò)與核苷酸前體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合胸苷酸合成酶(TYMS)來(lái)抑制DNA合成。存在著毒性的各種來(lái)源，包括通過(guò)合并導(dǎo)致直接DNA/RNA破壞的腫瘤外替代的激活途徑，激活化合物的不期望運(yùn)輸，藥物靶點(diǎn)的可變表達(dá)和藥物降解水平減少。

在先前的研究中，嚴(yán)重的二氫嘧啶脫氫酶(DPYD)缺乏與致死的FU使用已經(jīng)聯(lián)系起來(lái)(Van Kuilenburg AB et al.,Eur J Cancer 33(13):2258-64(1997)，通過(guò)引用并入本文)。從此以后，多態(tài)性不斷擴(kuò)大的數(shù)目和參與FU代謝的基因中罕見(jiàn)變體已被建議作為影響不良事件的風(fēng)險(xiǎn)，包括MTHFR 677C>T(Afzal S et al.,Clin Cancer Res 17(11):3822-9(2011),通過(guò)引用并入本文)；和TYMS等位基因(Lecomte T et al.,Clin Cancer Res 10(17):5880-8(2004)),通過(guò)引用并入本文)。TYMS風(fēng)險(xiǎn)等位基因是北歐人群中是常見(jiàn)的。然而，盡管存在TYMS等位基因影響mRNA表達(dá)水平的一些證據(jù)(Mandola MV et al.,Cancer research 63(11):2898-904(2003)；和Zhang Q et al.,Chinese medical journal 124(2):262-7(2011),二者通過(guò)引用并入本文)，現(xiàn)有的數(shù)據(jù)受以下的限制：如報(bào)道和測(cè)試毒性的不一致；不同的FU方案患者的匯集；和功能不同多態(tài)性的聯(lián)合分析。

旨在鑒定FU毒性風(fēng)險(xiǎn)的商業(yè)可得的試劑盒不是最優(yōu)的，并且該試劑盒傾向于鑒定常見(jiàn)的多態(tài)性，從而將幾乎每一個(gè)測(cè)試受試者歸類(lèi)為處于風(fēng)險(xiǎn)中。甚至不包括該常見(jiàn)多態(tài)性的試劑盒通常也提供幾乎等于29％的敏感性。

因此，目前不存在預(yù)測(cè)不良事件的可靠方式，原因在于不清楚哪個(gè)(如果有的話)基因變體成為FU毒性的良好預(yù)測(cè)指標(biāo)。

因此，存在著確認(rèn)關(guān)于哪些基因變體真正預(yù)測(cè)FU不良事件的需求。存在著預(yù)測(cè)FU毒性的臨床生物標(biāo)記和測(cè)定的需求。

本發(fā)明專(zhuān)注于一個(gè)或多個(gè)上述需求。特別是，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了預(yù)測(cè)FU毒性的臨床生物標(biāo)記和相關(guān)測(cè)定的結(jié)合。

因此，本發(fā)明提供了篩選受試者中5-氟尿嘧啶(FU)毒性風(fēng)險(xiǎn)的方法，包括篩選存在選自以下a和/或b的至少一種多態(tài)性的受試者：

a.選自由5'VNTR 2R/3R rs45445694,3'UTR 6bp ins-del rs16430和rs2612091組成的組的TYMS多態(tài)性；和/或

b.選自由*2A rs3918290,2846T>A rs67376798,rs12132152,rs12022243,rs7548189,p.Ala551Thr組成的組的DPYD多態(tài)性，

也可篩選DPYD多態(tài)性的功能等同的變體。

陽(yáng)性結(jié)果(即存在一種或多種上述提及的多態(tài)性)表明了發(fā)生FU毒性的風(fēng)險(xiǎn)增加。陰性結(jié)果(即不存在篩選的多態(tài)性)可表明發(fā)生FU毒性的風(fēng)險(xiǎn)降低。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了篩選受試者中5-氟尿嘧啶(FU)毒性風(fēng)險(xiǎn)的方法，包括篩選存在選自以下的至少一種多態(tài)性的受試者：

a.選自由5'VNTR 2R/3R rs45445694,3'UTR 6bp ins-del rs16430和rs2612091組成的組的TYMS多態(tài)性；和/或

b.選自由*2A rs3918290,2846T>A rs67376798,rs12132152,rs12022243,rs7548189,p.Ala551Thr組成的組的DPYD多態(tài)性，和其功能等同的變體；

其中，與不具有所述至少一種多態(tài)性的受試者相比，所述至少一種多態(tài)性的存在表明了發(fā)展FU毒性的風(fēng)險(xiǎn)增加。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了篩選受試者中5-氟尿嘧啶(FU)毒性風(fēng)險(xiǎn)的方法，包括篩選存在選自以下的至少一種多態(tài)性的受試者：

a.選自由5'VNTR 2R/3R rs45445694,3'UTR 6bp ins-del rs16430和rs2612091組成的組的TYMS多態(tài)性；和/或

b.選自由*2A rs3918290,2846T>A rs67376798,rs12132152,rs12022243,rs7548189,p.Ala551Thr組成的組的DPYD多態(tài)性，和其功能等同的變體；

其中與具有所述至少一種多態(tài)性的受試者相比，陰性結(jié)果表明了發(fā)展FU毒性的風(fēng)險(xiǎn)降低。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了篩選受試者中5-氟尿嘧啶(FU)毒性風(fēng)險(xiǎn)的方法，包括篩選存在選自以下的至少一種多態(tài)性的受試者：

a.選自由5'VNTR 2R/3R rs45445694,3'UTR 6bp ins-del rs16430and rs2612091組成的組的TYMS多態(tài)性；和/或

b.選自由*2A rs3918290,2846T>A rs67376798,rs12132152,rs12022243,rs7548189,p.Ala551Thr和它們功能等同的變體組成的組的DPYD多態(tài)性；

其中，存在一種或多種所述多態(tài)性表明了發(fā)展FU毒性的風(fēng)險(xiǎn)增加以及陰性結(jié)果表明了發(fā)展FU毒性的風(fēng)險(xiǎn)降低。

TYMS 5'VNTR 2R/3R多態(tài)性可由rs45445694定義，和3'UTR 6bp ins-del多態(tài)性由rs16430定義。DPYD*2A多態(tài)性可由rs3918290定義，和2846T>A多態(tài)性由rs67376798定義。rs數(shù)目指的是dbSNP ID。

上述方法可高度預(yù)測(cè)FU毒性。該方法可包括篩選上述多態(tài)性的任何組合。因此，篩選可以是任何TYMS多態(tài)性5’2R/3R,3'UTR 6bp ins-del和rs2612091，和任何DPYD多態(tài)性*2A,2846T>A,rs12132152,rs7548189,p.Ala551Thr和其功能等同的變體。

本發(fā)明的方法可包括篩選存在TYMS多態(tài)性rs2612091；和存在DPYD多態(tài)性*2A,2846T>A,rs12132152,rs7548189,p.Ala551Thr。已經(jīng)出人意料的發(fā)現(xiàn)本方法提供了高達(dá)27％的敏感性(sensitivity)、91％的特異性、60％的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和71％的陰性預(yù)測(cè)值。

本發(fā)明的方法可包括篩選存在TYMS多態(tài)性5'VNTR 2R/3R和3'UTR 6bp ins-del；和存在DPYD多態(tài)性*2A和2846T>A。已經(jīng)出人意料的發(fā)現(xiàn)該方法提供了高達(dá)58％的敏感性、63％的特異性、47％的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(PPV)和72％的陰性預(yù)測(cè)值。

因此，本發(fā)明的方法與基于使用市售試劑盒的方法相比表現(xiàn)出了顯著的改進(jìn)。

受試者可以是癌癥患者。該患者可以具有實(shí)性腫瘤癌癥比如結(jié)腸直腸癌(CRC)或乳腺癌。該受試者可正在經(jīng)受(或已經(jīng)經(jīng)受)FU化療。可選地，該方法可在將要經(jīng)受FU化療的受試者中進(jìn)行。

FU化療可以是FU單一治療，比如卡培他濱單一治療。然而術(shù)語(yǔ)“FU化療”包含基于FU獨(dú)自或與一種或多種其他試劑如FOLFOX,XELOX或FOLFIRI聯(lián)合的任何治療。

篩選TYMS和/或DPYD多態(tài)性的存在可以在來(lái)自受試者的樣品中進(jìn)行。該樣品可以是流體樣品，例如唾液、血液、血清或血漿樣品。該樣品可以是固體樣品，比如來(lái)自活組織檢查的樣品。

篩選與2846A,*2A rs12132152,rs7548189或p.Ala551Thr具有等同功能效果的DPYD變體也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。此類(lèi)變體可使用已有的基因測(cè)序或本技術(shù)領(lǐng)域已知的直接功能測(cè)定來(lái)篩選。

本發(fā)明的方法允許密切監(jiān)測(cè)其中存在一種或多個(gè)上述多態(tài)性并因而處于增加的毒性風(fēng)險(xiǎn)中的受試者。本發(fā)明的方法可因此包括在陽(yáng)性結(jié)果的情況下，即其中檢測(cè)到一種或多種上述的多態(tài)性，監(jiān)測(cè)受試者FU毒性癥狀的步驟。

FU毒性風(fēng)險(xiǎn)可以是高等級(jí)FU毒性，即根據(jù)NCI不良事件常見(jiàn)毒性標(biāo)準(zhǔn)(CTCAE)3.0版本等級(jí)為3+。高等級(jí)FU毒性可以是總體毒性(global toxicity)。高等級(jí)FU毒性可包含腹瀉、惡心嘔吐、黏膜炎/口腔炎、骨髓抑制、中性粒細(xì)胞減少、血小板減少和手足綜合癥(HFS)。

可使用計(jì)分檢驗(yàn)來(lái)鑒定TYMS和DPYD多態(tài)性，其測(cè)試區(qū)域內(nèi)的變體的獨(dú)立效果。這個(gè)檢驗(yàn)可包括用毒性對(duì)于個(gè)體攜帶高風(fēng)險(xiǎn)等位基因的數(shù)目進(jìn)行邏輯回歸，并相應(yīng)地向受試者分配基因得分(如從0至4)。下面為示例，基因風(fēng)險(xiǎn)得分＝ΣβiNi，其中βi為邏輯回歸模型中與總體毒性顯著相關(guān)的第i個(gè)SNP的貝塔系數(shù)，以及Ni為該個(gè)體在該位置攜帶有害等位基因的數(shù)目。

還可使用組檢驗(yàn)來(lái)鑒定DPYD多態(tài)性。這個(gè)檢驗(yàn)可包括罕見(jiàn)變體的聯(lián)合組評(píng)價(jià)，其中基于酶功能，或DPYD 2846A或DPYD*2A的載體均被歸為“變體”類(lèi)，以及其他的被歸為“野生型”類(lèi)。

這個(gè)評(píng)價(jià)可包括與2846A,*2A,rs12132152,rs7548189和/或p.Ala551Thr具有等同功能效果的DPYD變體。

本發(fā)明還提供了用于本發(fā)明方法的能夠檢測(cè)例如在來(lái)自于患者的樣品中上述TYMS和/或DPYD多態(tài)性存在的一種或多種試劑。

上述試劑可存在于試劑盒中。因此，本發(fā)明提供了包括一種或多種上述能夠檢測(cè)上述TYMS和/或DPYD多態(tài)性存在的試劑的試劑盒。

篩選至少一種多態(tài)性的存在可包括本領(lǐng)域已知的測(cè)序方法如PCR。

表格列表

表1：挑選的DPYD和TYMS多態(tài)性與卡培他濱相關(guān)毒性(等位基因模型，毒性等級(jí)0-2對(duì)3+)之間的關(guān)聯(lián)

示出了對(duì)于給予卡培他濱患者的兩種TYMS和DPYD變體的固定效果薈萃分析和合并邏輯分析結(jié)果。每個(gè)所攜帶的毒性等位基因(范圍為每位患者0-2種等位基因)，首先提供了每一多態(tài)性的個(gè)體效果，其中比值比(OR)描述了經(jīng)歷毒性等級(jí)3+(總體、腹瀉或HFS)的患者的比例提高。對(duì)于兩種TYMS多態(tài)性，邏輯模型示出了這兩種多態(tài)性促進(jìn)了患者的風(fēng)險(xiǎn)。該風(fēng)險(xiǎn)是由TYMS“得分”檢驗(yàn)薈萃分析評(píng)估的，其中OR顯示了經(jīng)歷高毒性等級(jí)的患者比例提高，來(lái)自5’VNTR或3’UTR多態(tài)性的每一推定毒性等位基因(范圍為每一患者0-4個(gè)等位基因)。對(duì)于功能DPYD多態(tài)性，OR顯示了具有*2A或2846罕見(jiàn)等位基因的效果。N＝所研究的患者總數(shù)，TAF＝推定毒性相關(guān)等位基因的頻率，和S＝研究的數(shù)目。以斜體顯示測(cè)試等位基因。

表2：QUASAR2患者特征

顯示了對(duì)于總計(jì)1046個(gè)個(gè)體的來(lái)自QUASAR2研究人群的患者特征，所述患者隨機(jī)接受單獨(dú)卡培他濱(47％)或者卡培他濱和貝伐單抗(53％)，包含大量的等級(jí)3+毒性事件。

表3：QUASAR2中的毒性頻率

顯示了QUASAR2研究的毒性頻率，等級(jí)為0-4，包含未報(bào)道的等級(jí)。

表4：SCP研究中的毒性頻率

這組患者被選擇高毒性和低毒性(即少數(shù)等級(jí)2)以及僅僅收集腹瀉和HFS毒性數(shù)據(jù)。

表5：候選基因區(qū)域匯總

從其中鑒定變體的25個(gè)候選卡培他濱/5-FU途徑基因，其存在于一種或多種Hap300/370,Hap610或外顯子組陣列。

表6：挑選的QUASAR2中基因變體和卡培他濱毒性之間的關(guān)聯(lián)

顯示了二元或連續(xù)變量測(cè)量的總體和所挑選的個(gè)體毒性的關(guān)聯(lián)。TAF為毒性關(guān)聯(lián)等位基因的頻率。每一結(jié)果單元的第一行是OR，第二行是95％CIs和第三行是每一等位基因模型的p值。

表7：檢驗(yàn)TYMS rs2612091,5’VNTR和3’UTR單倍型對(duì)于一個(gè)多態(tài)性的獨(dú)立效果

在PLINK中執(zhí)行單倍型分析(Purcell S et al.,American Journal of Human Genetics 81(3):559-75(2007)通過(guò)引用并入本文)使用“--independent-effect”命令，其中輪流地對(duì)于每一多態(tài)性，分析等位基因與毒性的關(guān)聯(lián)，而保持其他多態(tài)性基因型不變。該檢驗(yàn)產(chǎn)生了每一該檢驗(yàn)的p值并隨后對(duì)于多態(tài)性的總p值，該總p值顯示了該多態(tài)性是否與毒性具有穩(wěn)定關(guān)聯(lián)，而不考慮單倍型基因型的背景。前3個(gè)面板顯示了分別變化5’VNTR等位基因,3’UTR等位基因和rs2612091的效果?？傮w上僅僅rs2612091顯示了顯著效果。后2個(gè)面板顯示了2種-多態(tài)性分析，其中變化rs2612091而使5’VNTR和3’UTR保持不變。注意的是沒(méi)有顯示一些罕見(jiàn)單倍型。

表8：SCP研究中挑選的變體和毒性之間的關(guān)聯(lián)

數(shù)據(jù)如表6所示。

表9：卡培他濱/5-FU途徑基因的集合檢驗(yàn)分析

集合檢驗(yàn)使用25種卡培他濱/5-FU途徑基因中每一種的25kb內(nèi)的SNPs和ENOSF1。在分析之前，已知的DPYD 2846和*2A變體和新鑒定的DPYD rs12132152,DPYD rs7548189和TYMS rs2612091，以及與這些SNPs連鎖不平衡r²>0.1的任何(包括TYMS 5’VNTR和3’UTR多態(tài)性)均被去除。通過(guò)在等位基因模型下使用邏輯回歸單獨(dú)檢驗(yàn)每一SNP的關(guān)聯(lián)來(lái)進(jìn)行檢驗(yàn)，調(diào)整年齡、治療分支和性別，交換結(jié)果數(shù)據(jù)并重新測(cè)試10000次，然后將觀察到的p值分布與每一集合隨機(jī)分配毒性數(shù)據(jù)的那些進(jìn)行比較(即所有SNPs的每一基因或交叉)。

表10：挑選的DPYD變體的具有毒性等級(jí)4的QUASAR2個(gè)體的基因型

對(duì)于毒性，D＝腹瀉，V＝嘔吐，H＝HFS，N＝中性粒細(xì)胞減少，P＝血小板減少，M＝黏膜炎，S＝口腔炎。所示的變體為(i)由本研究鑒定的那些(rs12132152,rs12022243,rs2612091,DPYD A551T)，(ii)在Rosmarin等人的薈萃分析中顯示與5-FU毒性關(guān)聯(lián)的DPYD等位基因(2846A>T和*2A)(Rosmarin et al.,Journal of clinical oncology:official journal of the American Society of Clinical Oncology(2014),出版中，通過(guò)引用并入本文)和(iii)來(lái)自于Caudle等人的潛在DPYD毒性等位基因(Caudle et al.,Clinical pharmacology and therapeutics 94(6):640-5(2013),incorporated herein by reference)。所示的基因型為主要等位基因純合子(0)，雜合子(1)和次要的或變異的等位基因純合子(2)?？瞻讍卧傅氖侨笔?shù)據(jù)。顯示了對(duì)嚴(yán)重毒性提供貌似合理說(shuō)明的等位基因。注意的是*4和*5DPYD等位基因與2A或2846T>A完全連鎖不平衡(D’＝1.0)。

表11：QUASAR2中DPYD編碼區(qū)域變體和卡培他濱毒性之間的關(guān)聯(lián)

顯示了存在于標(biāo)簽SNP或外顯子組陣列上的多態(tài)性和罕見(jiàn)變體，以及在QUASAR2的兩個(gè)分支的薈萃分析中與毒性關(guān)聯(lián)的概括統(tǒng)計(jì)。MAF＝次要等位基因頻率。

檢驗(yàn)基因由斜體表示

表1

表2

表3

表4

表5

表6

表6(接上頁(yè))

表7

表8

表9

表10

表11

示圖列表

圖1 FU代謝途徑

卡培他濱是口服的5-FU前體藥物，其被合理設(shè)計(jì)以便細(xì)胞毒性代謝物FdUMP,FdUTP and FUTP的濃度在惡性細(xì)胞中比在正常細(xì)胞中高。大多數(shù)藥物激活是通過(guò)共同的前體藥物激活途徑發(fā)生的(圖1a)。另外，在結(jié)腸腫瘤細(xì)胞和來(lái)自多個(gè)其他組織的細(xì)胞中，5-FU能通過(guò)交替的激活途徑轉(zhuǎn)化為活性化合物(圖1b)。通常當(dāng)5-FU退出靶向組織并隨后激活時(shí)，假如非靶向組織暴露在激活的卡培他濱/5-FU(如FdUMP和FUTP)則可發(fā)生毒性。由細(xì)胞釋放進(jìn)入血液循環(huán)中的5-FU可通過(guò)肝臟迅速代謝(圖1c)。主要途徑以實(shí)線示出；備選途徑以虛線示出。

圖2：FOLFOX患者中TYMS多態(tài)性薈萃分析的森林圖(等位基因模型，等級(jí)0-2對(duì)3+總體毒性)

示出了兩種TYMS多態(tài)性對(duì)來(lái)自FOLFOX治療的總體3+級(jí)FU相關(guān)毒性的個(gè)別效果，所述效果是不顯著的(TYMS 5’2R p＝0.26；TYMS 3’6bp-ins allele p＝0.8)。每一試驗(yàn)由方形表示，其中心表示比值比(OR)，示出了經(jīng)受高毒性患者的的比例增加，對(duì)于擁有的每一測(cè)試等位基因(范圍為0-2每一患者，每一多態(tài)性)，而水平線表示95％置信區(qū)間(CIs)。方形的尺寸與試驗(yàn)貢獻(xiàn)的信息量直接成比例。菱形表示納入研究的總OR，其中心表示OR以及邊緣表示95％CI。使用固定效果模型，p-het＝異質(zhì)性檢驗(yàn)的p值，meta＝薈萃分析。

圖3：在QUASAR2卡培他濱患者中，TYMS 5’VNTR 2R/3R,TYMS 3’UTR 6bp ins-del,DPYD 2846T>A和DPYD*2A多態(tài)性的FU毒性接受者操作特性(ROC)(receiver operating characteristics)分析

標(biāo)記了兩個(gè)敏感性/特異性截?cái)帱c(diǎn)：在圖的左下角那個(gè)對(duì)應(yīng)著正確分類(lèi)的患者的最大比例，敏感度為4％，特異性為100％以及陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為86％，主要是歸因于罕見(jiàn)的DPYD變體；其他的截?cái)帱c(diǎn)由于并入TYMS基因型而影響更多的患者，并對(duì)應(yīng)于敏感度為58％，特異性為63％以及陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為47％.

圖4 DPYD和TYMS與卡培他濱相關(guān)毒性相關(guān)的區(qū)域圖

示出了與總體等級(jí)012v34卡培他濱相關(guān)毒性和組分毒性表型的關(guān)聯(lián)，對(duì)于(a)DPYD和(b)TYMS/ENOSF1中區(qū)域側(cè)翼頂部標(biāo)簽SNPs。x軸顯示染色體坐標(biāo)，同時(shí)y軸顯示關(guān)聯(lián)顯著性的p值，在對(duì)數(shù)標(biāo)尺上。圓圈表示了包含在我們1,456-SNP測(cè)試板中的SNPs，而方塊表示精細(xì)地圖的SNPs。紫色圓圈代表最佳關(guān)聯(lián)的標(biāo)簽SNPs，以及如每個(gè)圖例所示顏色表示與該SNP的相關(guān)性。對(duì)于TYMS/ENOSF1,最顯著的HFS 01v2v34SNP(也是第三顯著總體012v34SNP)是rs2741171。通過(guò)LocusZoom進(jìn)行做圖。

圖5近(a)TYMS/ENOSF1和(b)DYPD(left＝D’；right＝R²)的所選變體之間的LD。

示出了對(duì)于TYMS的來(lái)自Haploview EM算法的單倍型頻率。

圖6 QUASAR2中，總體等級(jí)012v34卡培他濱相關(guān)毒性的的接受者操作特性(ROC)分析

來(lái)自QUASAR2試驗(yàn)的938位卡培他濱患者的接受者操作特性(ROC)分析，分析了總體卡培他濱/5-FU相關(guān)等級(jí)012v34毒性。包含在模型中的變體為先前鑒定的DPYD2846T>A(rs67376798)和DPYD*2A(rs3918290)和新鑒定的毒性變體DPYD A551T,DPYD rs12132152,DPYD rs7548189and TYMS rs2612091。曲線下面積(AUC)為0.66％(95％CI0.63-0.70)。線條標(biāo)記了截?cái)帱c(diǎn)，在該截?cái)帱c(diǎn)最大比例的患者被正確分類(lèi)(69％)，敏感度為27％(95％CI 23-33％)，特異性為91％(95％CI 88-93％),PPV為60％(95％CI 52％-68％),和NPV為71％(95％CI 68％-74％)。

實(shí)施例

將通過(guò)以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的闡明，其旨在僅僅作為本發(fā)明的示例而不是限制。

實(shí)施例1

作為概述，檢查候選多態(tài)性與來(lái)自下述試驗(yàn)(“QUASAR2”)的患者中的卡培他濱毒性之間的關(guān)聯(lián)。然后進(jìn)行薈萃分析，將這些數(shù)據(jù)與來(lái)自先前公布的研究的那些數(shù)據(jù)相結(jié)合，兩者都是卡培他濱和其他FU方案。最后，鑒定預(yù)測(cè)FU毒性的多態(tài)性，以及計(jì)算該檢驗(yàn)的敏感度、特異性和預(yù)測(cè)值。

a.在QUASAR2試驗(yàn)中檢驗(yàn)候選FU途徑毒性變體

i.患者和研究特性

QUASAR2研究(http://www.octo-oxford.org.uk/alltrials/infollowup/q2.html；http://www.controlled-trials.com/ISRCTN45133151/)為在CRC II/III期切除之后，輔助卡培他濱(希羅達(dá))(1250mg/m²每三周第1-14天每天兩次，總計(jì)8個(gè)周期)+/-貝伐單抗(7.5mg/kg每三周)的III期隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)?；颊咴?005年7月至2011年12月之間于123個(gè)UK位點(diǎn)和81個(gè)非UK位點(diǎn)進(jìn)入本研究。在自2010年7月起收集血液的1119個(gè)患者中，選擇1046個(gè)用于基于臨床數(shù)據(jù)和知情同意的可用性的研究。

ii.FU毒性評(píng)價(jià)

在每一治療周期之后使用NCI不良事件常見(jiàn)毒性標(biāo)準(zhǔn)(CTCAE)3.0版本對(duì)不良事件進(jìn)行分級(jí)。個(gè)別分析常見(jiàn)FU相關(guān)毒性——腹瀉、惡心嘔吐、黏膜炎/口腔炎、中性粒細(xì)胞減少、血小板減少和HFS，并且還結(jié)合分析作為“總體”毒性。不良事件可分為低級(jí)(CTCAE等級(jí)0/1/2)和高級(jí)(在任何治療周期CTCAE等級(jí)3/4/5)。高血壓和蛋白尿顯然與貝伐單抗相關(guān)(倍高的發(fā)生率)并不包含在分析中。兩個(gè)研究組之間的FU相關(guān)毒性發(fā)生率沒(méi)有重大差異，并將這些組合進(jìn)行分析。

iii.鑒定基因變體以檢驗(yàn)與卡培他濱毒性的關(guān)聯(lián)

為鑒定用于QUASAR2中檢驗(yàn)的合適的FU途徑多態(tài)性，對(duì)文獻(xiàn)進(jìn)行了系統(tǒng)回顧。在PubMed和谷歌學(xué)術(shù)搜索(Google Scholar)中進(jìn)行了139個(gè)檢索，首先使用檢索詞“毒性”與“5-氟尿嘧啶”、“5-FU”或“卡培他濱”的組合。然后重復(fù)該檢索，使用相同的檢索詞與初始檢索中鑒定的先前已檢驗(yàn)與FU毒性關(guān)聯(lián)的8個(gè)基因的符號(hào)組合(24個(gè)單獨(dú)檢索)。

從生成的出版物，回顧了參考和引用文章，與初始檢索詞結(jié)合檢索任何新的基因和所有的多態(tài)性。如果研究有如下則考慮將所述研究包含在內(nèi)：(i)已經(jīng)使用基于FU的方案；(ii)已經(jīng)分析與FU毒性相關(guān)的基因多態(tài)性和/或罕見(jiàn)變體；和(iii)以及報(bào)道一種或多種如上所列的6種常見(jiàn)FU毒性。總計(jì)有49個(gè)出版物符合這些標(biāo)準(zhǔn)，隨后將這些出版物進(jìn)一步限定在那些具有以下的出版物：(i)樣本大小≥30個(gè)患者；(ii)白種人參與者；和(iii)前瞻性設(shè)計(jì)用于收集毒性數(shù)據(jù)。

這保留了來(lái)自總計(jì)28個(gè)研究的7種基因中的59種多態(tài)性，如在以下公開(kāi)的：Boisdron-Celle M et al.,Cancer letters 249(2):271-82(2007)；Schwab M et al.,J Clin Oncol 26(13):2131-8(2008)；Afzal S et al.,Clin Cancer Res 17(11):3822-9(2011)；Lecomte T et al.,Clin Cancer Res 10(17):5880-8(2004)；Cohen V et al.,Clin Cancer Res 9(5):1611-5(2003)；Largillier R et al.,Clin Cancer Res 12(18):5496-502(2006)；Morel A et al.,Molecular cancer therapeutics 5(11):2895-904(2006)；Gross E et al.,PloS one 3(12):e4003(2008)；Salgado J et al.,Oncology reports 17(2):325-8(2007)；Capitain O et al.,Pharmacogenomics J 8(4):256-67(2008)；Martinez-Balibrea E et al.,Eur J Cancer 44(9):1229-37(2008)；Ribelles N et al.,Current drug metabolism 9(4):336-43(2008)；Ruzzo A et al.,Pharmacogenomics J 8(4):278-88(2008)；Sharma R et al.,Clin Cancer Res 14(3):817-25(2008)；Afzal S et al.,Annals of oncology:official journal of the European Society for Medical Oncology/ESMO 20(10):1660-6(2009)；Braun MS et al.,J Clin Oncol 27(33):5519-28(2009)；Chua W et al.,Br J Cancer 101(6):998-1004(2009)；Derwinger K et al.,Clinical colorectal cancer 8(1):43-8(2009)；Gusella M et al.,Br J Cancer 100(10):1549-57(2009)；Goekkurt E et al.,J Clin Oncol 27(17):2863-73(2009)；Boige V et al.,J Clin Oncol 28(15):2556-64(2010)；Etienne-Grimaldi MC et al.,British journal of clinical pharmacology 69(1):58-66(2010)；Martinez-Balibrea E et al.,Br J Cancer 103(4):581-9(2010)；McLeod HL et al.,J Clin Oncol 28(20):3227-33(2010)；Zarate R et al.,Br J Cancer 102(6):987-94(2010)；Caronia D et al.,Clin Cancer Res 17(7):2006-13(2011)；Martin M et al.,Clin Cancer Res 17(7):2006-13(2011)；Deenen MJ et al.,Clin Cancer Res 17(10):3455-68(2011)；Glimelius B et al.,Pharmacogenomics J 11(1):61-71(2011),所有這些均通過(guò)引用并入本文)。在這些59種變異體中，由于4種不能明確繪圖而將其舍棄，以及進(jìn)一步有19種在之前的FU毒性研究中是不變的，留下36種多態(tài)性用于研究。

iv.QUASAR2患者中FU毒性變體的基因分型

白種人種族的940個(gè)QUASAR2患者(439個(gè)單獨(dú)卡培他濱，501個(gè)卡培他濱+貝伐單抗)具有可用的毒性數(shù)據(jù)。得到36個(gè)候選多態(tài)性的患者基因型，以及包含至少400個(gè)患者的多態(tài)性基因型。

首先，先前已經(jīng)使用Illumina全基因組單核苷酸多態(tài)性(SNP)面板(panel)(Human Hap 370,Human Hap 610或Human Omni 2.5)對(duì)所有的患者進(jìn)行基因分型，以及從這些數(shù)據(jù)中提取一些多態(tài)性基因型。先前采用了對(duì)于大關(guān)聯(lián)研究的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量控制程序(Dunlop MG et al.,Nature genetics 44(7):770-6(2012),通過(guò)引用并入本文)。通過(guò)主成分分析(PCA)檢查群體分層，以及去除與已知非白人種族的HapMap樣本聚類(lèi)的6種病例。由于基因分型檢出率(genotying call rate)低(<95％)，進(jìn)一步排除了9種樣本。

第二，對(duì)于不存在于一些或所有SNP陣列的變體，推導(dǎo)得到估算基因型。將2009年8月數(shù)據(jù)1000個(gè)基因組的IMPUTE v2程序和CEU參與者用作參考面板?；跇?biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)則將多態(tài)性包含在內(nèi)(信息得分>0.90和缺失<0.10)。將具有全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)的個(gè)體面板用于檢查估算的精度。由于與其他含有的變體具有非常強(qiáng)的連鎖不平衡(LD；r²>0.9)，對(duì)2種變體進(jìn)行了刪減。

第三，使用競(jìng)爭(zhēng)等位基因特異性SNP基因分型的KASPar方法對(duì)DPYD*2A,DPYD2846T>A和CES2 823進(jìn)行分型(Cuppen E et al.,CSH protocols 2007pdb prot4841(2007),通過(guò)引用并入本文)。使用已知的基于PCR的方法對(duì)TYMS 5’VNTR 2R/3R(Horie N et al.,Cell structure and function 20(3):191-7(1995)，通過(guò)引用并入本文)和TYMS 3’UTR 6bp ins-del(Dotor E et al.,J Clin Oncol 24(10):1603-11(2006)，通過(guò)引用并入本文)進(jìn)行基因分型。

在所包含的21種變體中，有17種在超過(guò)800個(gè)QUASAR2患者中進(jìn)行基因分型，剩下的在超過(guò)400個(gè)患者中進(jìn)行分型。對(duì)于QUASAR2中單獨(dú)SNP分析，在分析中使用所有可用的基因型。對(duì)于多變量分析，僅僅分析調(diào)查中基因分型為所有變體的樣本的子集。

發(fā)現(xiàn)有34％的QUASAR2患者發(fā)展了等級(jí)3+總體毒性(表2)。

最頻繁的具體等級(jí)3+毒性為HFS(n＝247)，隨后是腹瀉(n＝109)和中性粒細(xì)胞減少(n＝22)。在21種基因型和/或估算的FU毒性多態(tài)性中，有3種表現(xiàn)了與總體G3+毒性顯著相關(guān)q<0.05：TYMS 5’VNTR 2R(OR＝1.48,95％CI 1.22-1.80,p＝0.000079)；TYMS 3’UTR 6bp ins(OR＝1.67,95％CI 1.23-2.22,p＝0.00084)；和DPYD 2846A(OR＝9.35,95％CI 2.01-43.4,p＝0.0043)(表1)。

值得注意的是，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)之前報(bào)道的18種FU變體對(duì)總體或具體毒性有正式顯著的效果。

5’VNTR和3’UTR TYMS具有中等連鎖不平衡(LD)(r2＝0.17,D’＝0.64)，以及當(dāng)通過(guò)邏輯回歸分析調(diào)整其他時(shí)二者均不與毒性保留顯著關(guān)聯(lián)(表1)。因此這些變體不是獨(dú)立的標(biāo)記物。

在缺失用于TYMS關(guān)聯(lián)信號(hào)的明確定義的遺傳基礎(chǔ)時(shí)，為了捕獲來(lái)自5’VNTR和3’UTR多態(tài)性的結(jié)合信號(hào)，檢驗(yàn)定量TYMS風(fēng)險(xiǎn)得分(根據(jù)每一患者的高風(fēng)險(xiǎn)等位基因的數(shù)目計(jì)數(shù)為0-4)。該計(jì)分檢驗(yàn)預(yù)測(cè)總體FU毒性(ORper count＝1.38,95％CI 1.16-1.64,p＝0.00031,邏輯回歸,表1；ORscore 3,4v score 0＝3.70,95％CI 1.35-10.1,p＝0.0011)?；谶壿嫽貧w的偽R2統(tǒng)計(jì)學(xué)(pseudo-R2statistics)，該計(jì)分檢驗(yàn)說(shuō)明了相比于兩者任一個(gè)體TYMS變體，更大的變異比例。

還分析了作為顯著相關(guān)基礎(chǔ)的個(gè)體毒性。TYMS多態(tài)性(計(jì)分檢驗(yàn))表現(xiàn)了對(duì)HFS(OR＝1.31,p＝0.0063)和腹瀉(OR＝1.24,p＝0.096)具有相似的效果，然而前者更為常見(jiàn)并且因此更多的促進(jìn)總體測(cè)量并在其分析中具有更大的統(tǒng)計(jì)功效(表1)。相反，相比于對(duì)于HFS(OR＝1.31,p＝0.69)，DPYD 2846A的效果表現(xiàn)出對(duì)腹瀉更加顯著(OR＝3.14,p＝0.093)(表1)。

b.統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)于每一多態(tài)性，進(jìn)行了等位基因與總體G3+毒性相關(guān)的檢驗(yàn)，偶聯(lián)有調(diào)整性別、年齡和分支(arm)的邏輯回歸分析，但是包含這些變量對(duì)于結(jié)果產(chǎn)生了最小的差異，因此不再包含這些數(shù)據(jù)。

對(duì)于具有毒性關(guān)聯(lián)連續(xù)證據(jù)的基因，進(jìn)行附加調(diào)查。通過(guò)二元模型來(lái)分析TYMS 5’VNTR重復(fù)單倍型，該二元模型是基于跨過(guò)兩個(gè)等位基因(0-2對(duì)3-4)的USF1/USF2結(jié)合位點(diǎn)的總數(shù)(Mandola MV et al.,Cancer research 63(11):2898-904(2003)，通過(guò)引用并入本文)，通過(guò)以研究為條件的邏輯回歸、單倍型分析和“計(jì)分檢驗(yàn)”來(lái)對(duì)中度連鎖不平衡的TYMS 5’VNTR和3’UTR多態(tài)性進(jìn)行聯(lián)合分析，其中用毒性對(duì)由3’UTR和5’VNTR多態(tài)性總計(jì)的TYMS風(fēng)險(xiǎn)等位基因的數(shù)目(0-4個(gè)等位基因)進(jìn)行邏輯回歸。

對(duì)于DPYD，對(duì)酶功能有效果的罕見(jiàn)變體(DPYD*2A and 2846T>A)的組合評(píng)估是做為一個(gè)組進(jìn)行的。

通過(guò)將患者進(jìn)行二分類(lèi)為G1/2或G3/4//5總體毒性來(lái)生成接受者操作特性(ROC)曲線，并基于ΣβiNi給予值，其中βi為邏輯回歸模型中與總體毒性顯著相關(guān)聯(lián)的第i個(gè)SNP的貝塔系數(shù)，以及Ni為在該位置攜帶有害等位基因的數(shù)目。由薈萃分析結(jié)果來(lái)確定列入的變體。計(jì)算曲線下面積(AUC)和基于對(duì)數(shù)似然比在適當(dāng)?shù)慕財(cái)帱c(diǎn)評(píng)估性能。在PLINK中進(jìn)行邏輯回歸。在Haploview中執(zhí)行單倍體構(gòu)建。

c.FU毒性變體對(duì)來(lái)自卡培他濱單一治療的毒性的效果

分析15種FU毒性變體與總體卡培他濱毒性關(guān)聯(lián)。附加QUASAR2的研究包含少數(shù)數(shù)據(jù)，全體可達(dá)382個(gè)患者.

發(fā)現(xiàn)了總體毒性和TYMS 5’VNTR 2R等位基因之間的關(guān)聯(lián)(包括QUASAR2:OR＝1.36,95％CI 1.15-1.60,p＝0.00028；不包括QUASAR2:OR＝1.09,95％CI 0.80-1.48,p＝0.27)，當(dāng)調(diào)整3’UTR 6bp ins-del時(shí)該變體不是單獨(dú)顯著的(表1)。

薈萃分析提供了對(duì)于TYMS 3’UTR 6bp ins-del關(guān)聯(lián)的微少支持(包括QUASAR2:OR＝1.35,95％CI 1.07-1.71,p＝0.012；不包括QUASAR2:OR＝0.94,95％CI 0.64-1.38,p＝0.74)，但是在數(shù)據(jù)中存在交叉研究異質(zhì)性的證據(jù)(Phet＝0.025,I2＝68.0％)，其來(lái)自于一個(gè)80位患者的相對(duì)小型研究。TYMS計(jì)分檢驗(yàn)薈萃分析，其使用來(lái)自兩個(gè)最大研究的數(shù)據(jù)，仍然表現(xiàn)了高度顯著相關(guān)(包含QUASAR2:OR＝1.33,95％CI 1.15-1.55,p＝0.00018；不包含QUASAR2:OR＝1.21,95％CI 0.89-1.63,p＝0.22)。

毒性與DPYD 2846T>A之間的關(guān)聯(lián)也是顯著的，但是這個(gè)變體僅僅在QUASAR2中檢驗(yàn)(參見(jiàn)如上)。

i.數(shù)據(jù)綜述

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有4個(gè)特定種系TYMS和DPYD變體來(lái)預(yù)測(cè)卡培他濱毒性：TYMS 5’VNTR2R/3R,TYMS 3’UTR 6bp ins-del,DPYD 2846T>A和DPYD*2A。該分析提示多態(tài)性還可用于預(yù)測(cè)其他FU單一治療方案中的毒性，但是這些方案不常使用。

還不清楚所分析的DPYD*2A和DPYD 2846T>A多態(tài)性是否也與聯(lián)合治療方案(FOLFOX,CAPOX,FOLFIRI,IFL,FLIRI)中的總體或任何具體毒性相關(guān)聯(lián)。圖2示出了來(lái)自于使用FOLFOX的研究中的2個(gè)主要TYMS多態(tài)性薈萃分析的結(jié)果，F(xiàn)OLFOX是最大的聯(lián)合治療數(shù)據(jù)集。

盡管一些之前的建議與引用文獻(xiàn)中相反，對(duì)于剩余多態(tài)性，任何毒性關(guān)聯(lián)的證據(jù)是不令人信服的。這些(DPYD 1627A>G,DPYD 85T>C,DPYD 496A>G,TYMS 5’VNTR G>C,MTHFR 677C>T,MTHFR 1298A>C,CDA-451C>T,CES2 823C>G和TYMP多態(tài)性)中的一些是常見(jiàn)的(MAF>8％)，并且可確信排除差不多適度的效果，其中樣本量相對(duì)較大。假設(shè)每一等位基因的比值比為1.5，檢測(cè)這些SNP關(guān)聯(lián)的效率(power)約為75-100％。對(duì)于其他的多態(tài)性(如DPYD 1601G>A,DPYD 1236G>A,DPYD 2194G>A,CDA 943insC,和大部分CES2多態(tài)性)，次等位基因頻率低或樣本量小，導(dǎo)致了檢測(cè)關(guān)聯(lián)性的次優(yōu)效率(約20-40％)。這些作為毒性標(biāo)記的病例仍未得到證實(shí)。

d.用對(duì)酶功能的效果證據(jù)組合分析罕見(jiàn)DPYD等位基因

對(duì)于在具有與毒性因果相關(guān)的等同功能效果的單基因內(nèi)的等位基因，將這些結(jié)合到用于預(yù)測(cè)檢驗(yàn)的一個(gè)功能組中是合理的。對(duì)于DPYD，已經(jīng)提出一些罕見(jiàn)變體導(dǎo)致DPYD缺陷綜合癥(OMIM#274270)(van Kuilenburg AB et al.,The Biochemical journal 364(Pt 1):157-63(2002)；Van Kuilenburg AB et al.,Human genetics 104(1):1-9(1999),二者均通過(guò)引用并入本文)。在這些中，已經(jīng)顯示有一些可在體外降低DPYD活性(Offer SM et al.,Cancer research(2013)，通過(guò)引用并入本文)，而其他的具有較少的來(lái)自體內(nèi)報(bào)道的功能證據(jù)(Seck K et al.,Clin Cancer Res 11(16):5886-92(2005)；van Kuilenburg AB et al.,Clin Cancer Res 6(12):4705-12(2000)，二者通過(guò)引用并入本文)。在患者群組中發(fā)現(xiàn)的變體中，發(fā)現(xiàn)對(duì)于DPYD 2846A and*2A具有功能性的良好公開(kāi)證據(jù)(van Kuilenburg AB et al.,The Biochemical journal 364(Pt 1):157-63(2002)；Van Kuilenburg AB et al.,Human genetics 104(1):1-9(1999)，二者通過(guò)引用并入本文)，而不是對(duì)于*9A(85T>C)或Ile370Val(1108A>G)，盡管之前已經(jīng)報(bào)道這些可引起DPYD缺陷。

因此，在“分組檢驗(yàn)”中將DPYD 2846T>A和*2A罕見(jiàn)等位基因作為分組(變體相對(duì)非變體)進(jìn)行分析。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與卡培他濱的總體毒性的正式顯著關(guān)聯(lián)(表明了聯(lián)合關(guān)聯(lián)風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)高)(OR＝5.51,95％CI 1.95-15.51,p＝0.0013；數(shù)據(jù)來(lái)自QUASAR2單獨(dú)，表1)，以及對(duì)于灌注(p＝0.042)和團(tuán)注(p＝0.0068)單一治療分析中的名義上顯著的關(guān)聯(lián)。所有這些關(guān)聯(lián)都強(qiáng)于當(dāng)兩個(gè)變體之一單獨(dú)考慮時(shí)。

e.用于預(yù)測(cè)FU毒性的多態(tài)性面板的性能

目前有三種用于預(yù)測(cè)FU毒性的商業(yè)可得的試劑盒。這些試劑盒包含總計(jì)17種多態(tài)性，這些多態(tài)性歸入3個(gè)類(lèi)別：(i)在本分析中毒性預(yù)測(cè)的證據(jù)(n＝4)；(ii)存在于本分析中，但不具有良好的預(yù)測(cè)能力證據(jù)(n＝5)；或(iii)不存在于本分析中(n＝8)。在類(lèi)別(iii)的變體中，有5種是具有對(duì)酶功能有有害效果的證據(jù)的罕見(jiàn)DPYD變體(1679(*13),1897(*3),295-298del(*7),703(*8)和2983(*10))(van Kuilenburg AB et al.,The Biochemical journal 364(Pt 1):157-63(2002)；Van Kuilenburg AB et al.,Human genetics 104(1):1-9(1999)二者通過(guò)引用并入本文)。

在QUASAR2卡培他濱患者中，每一試劑盒確定總體毒性預(yù)測(cè)的敏感性和特異性，盡量嚴(yán)格遵循說(shuō)明，并使用毒性的二元分類(lèi)(無(wú)/低風(fēng)險(xiǎn)與適中/中級(jí)/高風(fēng)險(xiǎn))。由于含有共同多態(tài)性，兩種試劑盒將幾乎所有的患者分為具有高風(fēng)險(xiǎn)毒性，假陽(yáng)性數(shù)目大大超過(guò)真陽(yáng)性數(shù)目。剩余的試劑盒提供了差不多29％的敏感性。

對(duì)于使用發(fā)展的DPYD組合的罕見(jiàn)功能等位基因檢驗(yàn)和TYMS得分檢驗(yàn)是否能提高該試劑盒的性能進(jìn)行了評(píng)估(如實(shí)施例1(b)所描述的)。使用獨(dú)立效果量估算(使用來(lái)自Caronia D et al.,Clin Cancer Res 17(7):2006-13(2011)的原始數(shù)據(jù))并將其應(yīng)用于邏輯回歸模型中的QUASAR2。AUC是0.62(95％CI 0.57-0.67)。

在0.698ln(p/1-p)截?cái)帱c(diǎn)——在這里最大比例(64％)的病例得到了正確分類(lèi)——敏感性為3.8％，特異性為99.6％，PPV 86％(95％CI 42-99％),和NPV 64％(95％CI 59-69％)，主要反映了僅僅罕見(jiàn)DPYD變體。在0.248ln(p/1-p)截?cái)帱c(diǎn)，敏感性為58％和特異性63％，61％的患者得到正確分類(lèi)(圖3)；PPV為47％(95％CI 40-55％)和NPV 72％(95％CI66％-77％)。

因此，篩選兩種TYMS變體和功能DPYD變體的存在可預(yù)測(cè)FU毒性。然而，依然存在鑒定并表征附加FU毒性變體的需求，以便提供對(duì)用于臨床實(shí)踐具有更大預(yù)測(cè)效率的改進(jìn)的檢驗(yàn)。這類(lèi)改進(jìn)的基因檢驗(yàn)將提供密切監(jiān)測(cè)處于毒性風(fēng)險(xiǎn)增加的患者或?qū)υ谔幱诘投拘燥L(fēng)險(xiǎn)的患者提高FU劑量的能力。

實(shí)施例2

對(duì)來(lái)自QUASAR2試驗(yàn)的患者的進(jìn)一步分析已經(jīng)導(dǎo)致了識(shí)別在25種卡培他濱/5-FU途徑基因中的罕見(jiàn)基因變體和隨后的DPYD和TYMS的外顯子測(cè)序。進(jìn)一步地，計(jì)算了該檢驗(yàn)的敏感度、特異性和預(yù)測(cè)值。

a.在QUASAR2試驗(yàn)中評(píng)估FU毒性

i.患者和研究特性

如實(shí)施例1(a)(i)所描述使用QUASAR2研究。在2010年7月收集血液的1119位患者中，基于臨床數(shù)據(jù)和知情同意的完整性來(lái)選擇1046位用于基因研究。表2示出了患者特性。

ii.FU毒性評(píng)估

根據(jù)NCI不良事件常見(jiàn)毒性標(biāo)準(zhǔn)(CTCAE)3.0版本收集毒性表型數(shù)據(jù)作為QUASAR2的部分。對(duì)于以下個(gè)體FU相關(guān)毒性的每一個(gè)得出了在任何治療周期的最大毒性(0-4)：腹瀉，惡心和嘔吐，黏膜炎/口腔炎，中性粒細(xì)胞減少，血小板減少和HFS。將總體毒性測(cè)量導(dǎo)出并定義為每一患者所測(cè)量的最高個(gè)體毒性得分。使用兩種方法來(lái)分析總體和個(gè)體毒性：(i)二元分類(lèi)為低毒性(等級(jí)0-2)與高(劑量限制)毒性(等級(jí)3-4)；和(ii)毒性定量測(cè)量。在后者中，假如<100位患者經(jīng)歷了特定的毒性等級(jí)，這些患者被組合到具有鄰近等級(jí)的單倉(cāng)。特別是，對(duì)于總體、腹瀉和HFS為等級(jí)01v2v34，和對(duì)于其他為等級(jí)0v1234，分析罕見(jiàn)毒性表型。表3示出了等級(jí)的毒性數(shù)據(jù)。

在34％患者中發(fā)現(xiàn)有等級(jí)3+的總體毒性，10％具有嚴(yán)重的腹瀉和24％具有HFS。對(duì)于其他的表型，嚴(yán)重的毒性較不常見(jiàn)，盡管有5位患者經(jīng)歷了等級(jí)4的中性粒細(xì)胞減少。

b.鑒定基因變體，以便檢驗(yàn)卡培他濱毒性的關(guān)聯(lián)

i.驗(yàn)證患者集

使用兩種附加數(shù)據(jù)集來(lái)驗(yàn)證毒性關(guān)聯(lián)。西班牙卡培他濱藥物遺傳學(xué)(SCP)研究由233位結(jié)腸直腸癌和乳腺癌患者組成，這些患者是由西班牙幾個(gè)腫瘤學(xué)單位前瞻性招募的并用兩種卡培他濱單一治療方案中的一種進(jìn)行治療(標(biāo)準(zhǔn)：每3周第1-14天每日兩次1250mg/m²；連續(xù)：每天每12小時(shí)口服800mg/m²)。根據(jù)CTCAT v3.0收集HFS和腹瀉數(shù)據(jù)表4。

先前已描述了EPICOLON研究(Abuli A,et al.Carcinogenesis(Epub ahead of print)(2013)，通過(guò)引用并入本文)。包含在本分析中的85個(gè)EPICOLON案例是那些接受卡培他濱單一治療的。由這些案例僅僅腹瀉毒性數(shù)據(jù)是可利用的。

ii.基因型數(shù)據(jù)

對(duì)于QUASAR2，來(lái)自患者身體組織的DNA樣本的基因型數(shù)據(jù)是由單核苷酸多態(tài)性(SNPs)和罕見(jiàn)編碼遺傳變體可得的，所述數(shù)據(jù)是使用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行分析的并經(jīng)受標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量控制程序以便消除不良性能樣本和多態(tài)性(Dunlop MG et al.,Nat Genet.44(7):770-776(2012)，通過(guò)引用并入本文)。僅僅那些與主要成分分析上的CEPH CEU面板(panel)聚類(lèi)的個(gè)體被包含在該研究。對(duì)于基于單倍型標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的SNP陣列，940個(gè)患者的數(shù)據(jù)是可得的(484位來(lái)自于Illumina Hap300或Hap370CNV，364位來(lái)自于Hap610以及92位來(lái)自于Omni2.5)。對(duì)于外顯子組陣列，其被設(shè)計(jì)為捕獲不常見(jiàn)的蛋白編碼變異，968位患者的數(shù)據(jù)是可得的，所述患者基因分型在Illumina HumanExome12v1_A or-12v1-1_A陣列。使用Illumina Genome Studio來(lái)執(zhí)行所有平臺(tái)的堿基讀出，而對(duì)于外顯子組陣列,另外通過(guò)Z-Caller(Goldstein JI et al.,Bioinformatics 28(19):2543-2545(2012)通過(guò)引用并入本文),基于對(duì)共同變體的讀出與Illumina Genome Studio的一致性(99.3％)，應(yīng)用7的z-得分。一些多態(tài)性存在于SNP陣列和外顯子組陣列兩者，并且這些變體的基因型一致性為99％。

在表5的25種候選卡培他濱/5-FU途徑基因中，存在于一個(gè)或多個(gè)Hap300/370,Hap610或外顯子組陣列上的且位于編碼區(qū)域25kb內(nèi)的變體均被鑒定。使用填補(bǔ)以得到由陣列內(nèi)容差別引起的缺失基因型：采用SHAPEITv2定相(phase)單倍型(Delaneau O et al.,Nat Methods 10(1):5-6(2013),通過(guò)引用并入本文)并采用IMPUTEv2進(jìn)行填補(bǔ)(Howie B et al.,Nat Genet.44(8):955-959(2012)，通過(guò)引用并入本文),使用250kb緩沖區(qū)和1000基因組2012發(fā)布(所有種族淵源)作為參考組(reference panel)。僅僅對(duì)在每一陣列上單獨(dú)具有至少0.95IMPUTEv2信息得分的SNPs通過(guò)SNPTESTv2進(jìn)行進(jìn)一步的分析(Marchini J et al.,Nat Genet 39(7):906-913(2007)，通過(guò)引用并入本文)。進(jìn)一步的排除標(biāo)準(zhǔn)是在來(lái)自于3個(gè)SNP陣列的合并得分上SNPTEST信息評(píng)分低于0.95的、次要等位基因頻率低于0.01的和哈代—魏因貝格(Hardy-Weinberg)平衡p值低于0.0001的?；蚍中秃吞钛a(bǔ)為分析提供了總計(jì)1456種基因變體。

對(duì)于SCP研究，通過(guò)Illumina Hap610平臺(tái)，并使用質(zhì)量控制措施和具有如上所述用于QUASAR2的SNPTESTv2的統(tǒng)計(jì)分析來(lái)執(zhí)行基因分型，。對(duì)于EPICOLON，使用基因組擴(kuò)增DNA上的KASPar來(lái)執(zhí)行基因分型。

對(duì)于TYMS 5’VNTR和3’UTR變體的進(jìn)一步基因分型是通過(guò)之前描述的方法來(lái)進(jìn)行的(Horie N et al.,Cell Struct Funct.20(3):191-197(1995)；Dotor E et al.,J Clin Oncol 24(10):1603-1611(2006)，二者通過(guò)引用并入本文)。DPYD 2846T>A和DPYD*2A的附加基因分型是通過(guò)KASPar(Cuppen E CSH Protoc 2007:pdb prot4841(2007)，通過(guò)引用并入本文)來(lái)進(jìn)行的，對(duì)于未基因分型的少數(shù)患者使用外顯子組陣列。

對(duì)于檢測(cè)到基因變體與毒性顯著關(guān)聯(lián)的位置，使用上述方法來(lái)進(jìn)行精細(xì)繪圖研究，以便填補(bǔ)1.5Mb側(cè)翼區(qū)域內(nèi)的所有SNPs，其目的為了精煉關(guān)聯(lián)信號(hào)。

ii.測(cè)序

根據(jù)特定的擴(kuò)增子測(cè)序方案通過(guò)Roche/454Titanium GS FLX技術(shù)來(lái)進(jìn)行DPYD和TYMS編碼區(qū)域的測(cè)序(參見(jiàn)http://454.com/downloads/my454/documentation/gs-junior/method-manuals/GSJunior_Amplicon LibraryPrep-RevJune2010.pdf)。

特別地，選擇具有最高水平5-FU相關(guān)毒性(“HiTox”)的100位患者，特別是在治療的首次4個(gè)周期內(nèi)腹瀉等級(jí)為3或4的和/或是在治療的首次4個(gè)周期內(nèi)其他毒性等級(jí)為3/4的患者。還選擇了在治療的整個(gè)期間沒(méi)有不良毒性事件(“LoTox”)的100位患者。使用來(lái)自外周血的DNA，設(shè)計(jì)PCR引物和反應(yīng)以便覆蓋所有的23種DPYD外顯子(27種擴(kuò)增子；4784bp)和7種TYMS外顯子(9種擴(kuò)增子；2276bp)。

使用PicoGreen對(duì)來(lái)自每一患者身體組織的DNA樣本(Constitutional DNA sample)進(jìn)行定量，稀釋到相等的實(shí)測(cè)濃度并形成每個(gè)20位患者的10個(gè)庫(kù)(pool)。然后對(duì)于36種擴(kuò)增子的每一種均PCR擴(kuò)增這些庫(kù)。通過(guò)安捷倫高敏感度DNA試劑盒(Agilent High Sensitivity DNA Kit)來(lái)鑒定缺失的或不期望的擴(kuò)增子。根據(jù)454方案通過(guò)PicoGreen對(duì)成功的擴(kuò)增子進(jìn)行定量，使成功的擴(kuò)增子濃度相等并形成到一個(gè)100位患者HiTox庫(kù)和一個(gè)100位患者LoTox庫(kù)內(nèi)用于測(cè)序。其目的是實(shí)現(xiàn)最小的讀取深度(read depth)3000每一庫(kù)的每一靶位置(即每一患者覆蓋面約為30x)。

在HiTox庫(kù)內(nèi)鑒定錯(cuò)義DPYD變體p.Ala551Thr(A551T)。將包括該庫(kù)的每一個(gè)體的DNA進(jìn)行桑格測(cè)序以便鑒定攜帶這個(gè)變體的那些DNA。只發(fā)現(xiàn)了一個(gè)雜合子個(gè)體。為分析完整樣本集，設(shè)計(jì)了KASPar(http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.prot4841.abstract)等位基因特異單核苷酸變體引物以便檢測(cè)A551T，以及在每次運(yùn)行中包括已知變體樣本的3重復(fù)以便促進(jìn)基因型聚類(lèi)。隨后通過(guò)雙向桑格測(cè)序來(lái)檢查不與A等位基因純合子聚類(lèi)的所有樣本。

iv.統(tǒng)計(jì)和計(jì)算分析

對(duì)于1456個(gè)SNP和外顯子組陣列變體中的每一種，初級(jí)分析檢驗(yàn)了總體(任何5-FU相關(guān))劑量限制(等級(jí)012與34)毒性與基因型之間的關(guān)聯(lián)。使用SNPTESTv2來(lái)實(shí)施在缺失數(shù)據(jù)線性或邏輯回歸模型下的頻率論檢驗(yàn)。以年齡和性別作為協(xié)變量通過(guò)QUASAR2處理對(duì)樣本進(jìn)行分層。使用GWAMA(http://www.well.ox.ac.uk/gwama/download.shtml)對(duì)QUASAR2的兩組(A分支中(卡培他濱)439位患者和B分支中(卡培他濱+貝伐單抗)501位患者)進(jìn)行薈萃分析，包含分支間異質(zhì)性檢驗(yàn)。使用Bonferroni校正的p值閾值3.43x10^-5(＝0.05/1456)來(lái)表示(二元)總體劑量限制毒性初級(jí)分析的顯著關(guān)聯(lián)。

對(duì)于具有達(dá)到或接近形式顯著性的關(guān)聯(lián)信號(hào)的所選的SNPs，將附加SNPs填補(bǔ)到1.5Mb側(cè)翼區(qū)域內(nèi)。使用總體等級(jí)012與34測(cè)量對(duì)總體和具體毒性進(jìn)行關(guān)聯(lián)檢驗(yàn)。由于基因分型和填補(bǔ)SNPs是非獨(dú)立的，與填補(bǔ)SNPs的關(guān)聯(lián)被聲明是顯著的，使用相同的閾值p＝3.43x10^-5。對(duì)于一種或多種SNPs在其內(nèi)實(shí)現(xiàn)與總體毒性顯著關(guān)聯(lián)的任何區(qū)域，在最強(qiáng)關(guān)聯(lián)SNPs處使用定量測(cè)量和QUASAR2中劑量延遲和減少臨床可行的截?cái)帱c(diǎn)來(lái)對(duì)基礎(chǔ)的個(gè)體毒性進(jìn)行調(diào)查(通常等級(jí)012對(duì)34，除腹瀉等級(jí)為01對(duì)234外)。

使用R內(nèi)邏輯回歸分析來(lái)檢驗(yàn)區(qū)域內(nèi)變體的獨(dú)立效果。最佳擬合模型確定成這樣，其最小化赤池信息量準(zhǔn)則(AIC)經(jīng)受顯示關(guān)聯(lián)p＝0.05的變體。在PLINK中使用“—單倍-邏輯”和“—獨(dú)立-效果”命令來(lái)進(jìn)行單倍型分析(Purcell S et al.,American Journal of Human Genetics 81(3):559-75(2007)通過(guò)引用并入本文)。在PLINK中執(zhí)行檢查多基因變體的檢驗(yàn)。在Stata中使用二元分類(lèi)，將患者分為等級(jí)0/1/2或等級(jí)3/4總體毒性，通過(guò)ΣβiNi使用每一個(gè)體的基因得分來(lái)進(jìn)行接受者操作特性(ROC)分析，其中其中βi為邏輯回歸模型中與總體毒性顯著相關(guān)聯(lián)的第i個(gè)SNP的貝塔系數(shù)，以及Ni為所述個(gè)體在該位置攜帶有害等位基因的數(shù)目。

通過(guò)ANNOVAR來(lái)執(zhí)行變體的功能注釋。由Genevar(Yang TP et al.,Bioinformatics 26(19):2474-2476(2010)，通過(guò)引用并入本文)和The Cancer Genome Atlas(TCGA)得到mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，其根據(jù)Qiyuan等人的方法進(jìn)行分析(Li QY et al.,Cell 152(3):633-641(2013)通過(guò)引用并入本文)。

對(duì)于測(cè)序數(shù)據(jù)，根據(jù)存在于HiTox和LoTox庫(kù)中的變體的估計(jì)數(shù)目和野生型讀數(shù)來(lái)確定與毒性的推定關(guān)聯(lián)(Pearson’s Chi Squared或Fisher’s exact test)。

c.在DPYD位置與毒性的新關(guān)聯(lián)

對(duì)于總體劑量限制毒性(等級(jí)012對(duì)34)的初級(jí)分析，使用Bonferroni校正p值閾值3.43x10^-5，進(jìn)行分析以搜索基因變體與卡培他濱毒性之間的關(guān)聯(lián)。這些分析鑒定了兩種新的DPYD毒性SNPs。

發(fā)現(xiàn)了SNP rs12132152A-等位基因(freq.＝0.03)與總體卡培他濱毒性關(guān)聯(lián)(OR_總體二元＝3.83,p＝4.31x10^-6；表6)。

rs12132152為DPYD下游的22kb的基因間SNP變體(chr1:97,523,004,b37)。當(dāng)側(cè)翼區(qū)域內(nèi)的變體填補(bǔ)到這個(gè)標(biāo)簽SNP時(shí)，鑒定出SNPs具有略多的顯著關(guān)聯(lián)，尤其是rs76387818(chr1:97,539,400；OR_總體二元＝4.05,p＝2.11x10^-6,r²_{標(biāo)簽}＝0.98；表6；圖4a)。當(dāng)使用總體毒性定量測(cè)量時(shí)可得到相似的結(jié)果(表6)。

調(diào)查了包含總體毒性測(cè)量的個(gè)體表型。在定量和二元這兩種模型下，rs12132152和rs76387818與HFS強(qiáng)烈關(guān)聯(lián)(對(duì)于rs76387818,OR_hfsquant＝1.78,p＝5.51x10^-8,OR_hfsbinary＝6.44,p＝1.75x10^-8)，但不與其他的個(gè)體毒性關(guān)聯(lián)。

進(jìn)一步研究了rs12132152/rs76387818關(guān)聯(lián)之下的計(jì)算機(jī)模擬(in silico)的可能功能機(jī)制。

檢查了包含rs12132152和7種強(qiáng)相關(guān)SNPs(圖4a:約為chr1:97,475,000-97,562,000,b37)的區(qū)域的ENCODE數(shù)據(jù)(http://genome.ucsc.edu/ENCODE/)。FAIRE和組蛋白K4甲基化數(shù)據(jù)表明了這是開(kāi)放染色質(zhì)區(qū)域并且一個(gè)尤其相關(guān)的SNP rs12123160位于甲基化的CpG。盡管沒(méi)有來(lái)自正常肝臟的合適數(shù)據(jù)是可用的，發(fā)現(xiàn)了rs12132152和相關(guān)SNPs基因型不與在脂肪組織、類(lèi)淋巴母細(xì)胞或皮膚中(Genevar數(shù)據(jù)庫(kù),p>0.13)(Nica AC et al.,Plos Genetics 7(2)(2011)，通過(guò)引用并入本文)或在結(jié)腸組織中(The Cancer Genome Atlas(TCGA),p＝0.72)的DPYD表達(dá)關(guān)聯(lián)。

在SNP填補(bǔ)在rs7548189，DPYD基因內(nèi)的tagSNP(chr1:97,867,713,b37)，周?chē)?.5Mb區(qū)域之后，鑒定了第二DPYD毒性關(guān)聯(lián)變體(表6)。rs7548189與二元測(cè)量總體毒性邊緣關(guān)聯(lián)(OR_globalbinary＝1.67,p＝3.79x10^-5)。進(jìn)一步研究表明了rs7548189與總體毒性的定量測(cè)量正式關(guān)聯(lián)，并在二元和定量模型下與腹瀉正式關(guān)聯(lián)(OR_globalquant＝1.23,p＝6.82x 10^-6；OR_{diarrhoeaquant}＝1.18,p＝1.54x 10^-5；OR_{diarrhoeabinary}＝1.76,p＝1.72x 10^-5)。由表6可以看出，HFS也貢獻(xiàn)了與總體毒性關(guān)聯(lián)。在區(qū)域填補(bǔ)之后，發(fā)現(xiàn)rs12022243(r²with rs7548189＝0.95)與二元模型下的總體毒性正式關(guān)聯(lián)(OR_globalbinary＝1.69,p＝2.55x 10^-5)。rs12022243顯示了優(yōu)秀的填補(bǔ)特性：在190個(gè)獨(dú)立評(píng)估的個(gè)體中，僅僅4個(gè)(2％)基因型缺失并且所有的剩余基因型正確填補(bǔ)。

盡管存在著很少的來(lái)自于ENCODE數(shù)據(jù)的證據(jù)，該證據(jù)證明rs7548189是功能性的，rs12022243落在可能具有增強(qiáng)子活性的開(kāi)放染色質(zhì)的區(qū)域內(nèi)。rs7548189不與淋巴母細(xì)胞、纖維母細(xì)胞、T細(xì)胞、脂肪組織或皮膚內(nèi)Genevar數(shù)據(jù)庫(kù)上的DPYD表達(dá)水平相關(guān)聯(lián)(p>0.07)(Nica AC et al.,Plos Genetics 7(2)(2011)；Stranger BE et al.,Plos Genetics 8(4):272-284(2012)；Dimas AS et al.,Science 325(5945):1246-1250(2009)，每一均通過(guò)引用并入本文)，或不與來(lái)自TCGA的結(jié)腸組織內(nèi)DPYD表達(dá)水平相關(guān)聯(lián)(p＝0.97)。rs12022243不存在于這些數(shù)據(jù)庫(kù)。

使用邏輯回歸分析，發(fā)現(xiàn)了rs12132152和rs7548189/rs12022243信號(hào)二者均彼此間相互獨(dú)立，并與已知的DPYD毒性變體*2A(rs3918290)和2846T>A(rs67373796)相互獨(dú)立(圖5b)?；贒PYD任一側(cè)面25kb窗口內(nèi)的81個(gè)標(biāo)簽SNPs的單倍型進(jìn)一步分析并未提供rs12132152和rs7548189/rs120222243關(guān)聯(lián)的進(jìn)一步改進(jìn)，并且沒(méi)有顯示附加的、獨(dú)立的關(guān)聯(lián)信號(hào)的證據(jù)。

d.改進(jìn)在TYMS和ENSOF1位置的毒性關(guān)聯(lián)

進(jìn)行了分析以便解決TYMS處已知毒性關(guān)聯(lián)的基礎(chǔ)(表6)。這個(gè)分析鑒定了預(yù)測(cè)FU毒性的新的TYMS/ENOSF1SNP。

發(fā)現(xiàn)了SNP rs2612091的G-等位基因(freq.＝0.45)與總體毒性提高相關(guān)聯(lián)(OR_globalbinary＝1.59,p＝5.28x10^-6；OR_globalquant＝1.19,p＝2.35x10^-6；表6)。rs2612091位于烯醇酶超家族成員的內(nèi)含子內(nèi)TYMS下游10kb處(ENOSF1,chr18:683,607)。精細(xì)繪圖顯示了對(duì)一SNP,rs2741171(chr18:700,687)在連鎖不平衡中(r²＝0.73)與rs2612091稍強(qiáng)的關(guān)聯(lián),特別是對(duì)于總體毒性的定量測(cè)量(OR_globalquant＝1.2,p＝9.24x10^-7)。rs2741171變體進(jìn)一步位于TYMS(27kb)的下游并再次是ENOSF1的內(nèi)含子，但是兩種SNPs落在位于整體TYMS和ENOSF1側(cè)面的重組熱點(diǎn)之間(圖4b)。rs2612091/rs2741171對(duì)毒性的效果本質(zhì)上由HFS驅(qū)使，具有使用定量測(cè)量觀察到的特別強(qiáng)關(guān)聯(lián)(rs2612091:OR_hfsquant＝1.21,p＝3.67x10^-7；rs2741171:OR_hfsquant＝1.23,p＝3.10x 10^-8)。

ENOSF1是似乎編碼蛋白和TYMS反義的RNAs的大部分未表征的基因。已經(jīng)被提出ENOSF1調(diào)節(jié)TYMS mRNA和/或蛋白表達(dá)(Dolnick BJ et al.,Cancer Biology&Therapy 2:364-369(2003)，通過(guò)引用并入本文)，因此使用Genevar和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)rs2612091基因型和TYMS和ENSOF1表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)進(jìn)行分析。使用來(lái)自(Nica AC et al.,Plos Genetics 7(2)(2011)，通過(guò)引用并入本文)的白種人匹配的雙數(shù)據(jù)，rs2612091G-等位基因顯著降低雙集合脂肪組織內(nèi)ENOSF1表達(dá)(p_set1＝7.0x10^-4,p_tset2＝9.7x10^-6)，并顯著降低一個(gè)集合淋巴樣干細(xì)胞內(nèi)ENOSF1表達(dá)(p_set1＝0.89,p_set2＝0.0012)。然而，rs2612091基因型不與TYMS表達(dá)關(guān)聯(lián)(對(duì)于每一相同的分析p>0.30)。類(lèi)似地，在來(lái)自(Stranger BE et al.,Plos Genetics 8(4):272-284(2012)，通過(guò)引用并入本文)類(lèi)淋巴母細(xì)胞表達(dá)數(shù)據(jù)中，rs2612091G-等位基因與ENOSF1表達(dá)降低相關(guān)聯(lián)(p＝1.9x10^-6)，但不與TYMS表達(dá)降低相關(guān)聯(lián)(p＝0.82)。在TCGA結(jié)腸數(shù)據(jù)中復(fù)制了這些結(jié)果，其中rs2612091G-等位基因再次與ENOSF1表達(dá)降低相關(guān)聯(lián)(OR＝0.76,p＝1.5x10^-7)，而不與TYMS表達(dá)降低相關(guān)聯(lián)(OR＝0.95,p＝0.45)。可以得出結(jié)論：ENOSF1最可能是rs2612091標(biāo)簽的功能變異的靶點(diǎn)，并且盡管ENOSF1和TYMS轉(zhuǎn)錄本是重疊的，這不通過(guò)TYMS的反義介導(dǎo)下調(diào)起作用。

檢驗(yàn)了新的TYMS/ENOSF1毒性SNP與兩種TYMS多態(tài)性(5’VNTR 2R/3R和3’UTR 6bp ins-del)的關(guān)系(Schwab M et al.,J Clin Oncol.26(13):2131-2138(2008)；Lecomte T et al.,Clin Cancer Res.10(17):5880-5888(2004)，二者均通過(guò)引用并入本文)，其中兩種TYMS多態(tài)性以前已被報(bào)道改變TYMS表達(dá)并從而影響5-FU相關(guān)毒性(表7)。注意到rs2612091與5’VNTR、3’UTR多態(tài)性之間的適度LD(r²＝0.40和0.32；圖5)，使用HFS定量測(cè)量(01v2v34)作為毒性表型檢驗(yàn)了rs2612091信號(hào)是否獨(dú)立于5’VNTR和3’UTR多態(tài)性，原因在于HFS構(gòu)成了所有的3種變體觀察到的總體毒性信號(hào)的基礎(chǔ)。

首先，將該3種變體并入?yún)f(xié)變量-調(diào)節(jié)的邏輯回歸模型中。當(dāng)調(diào)節(jié)其他變量時(shí)，僅僅rs2612091依然保持顯著關(guān)聯(lián)(對(duì)于rs2612091OR_hfsquant＝1.21,p＝0.00049,5’VNTR p＝0.19,3’UTR p＝0.48)。在模型中單獨(dú)使用rs2612091使AIC最小化。

第二，對(duì)變體間交互作用(異位顯性)的證據(jù)進(jìn)行了檢驗(yàn)，但是發(fā)現(xiàn)rs2612091與5’VNTR(p＝0.92)或3’UTR(p＝0.19)之間不顯著。這些分析表明了rs2612091和之前鑒定的變體不作為未鑒定變體的3-多態(tài)性標(biāo)簽而起作用，并且rs2612091更好的捕獲所有3種變體創(chuàng)造的關(guān)聯(lián)信號(hào)。

最后，對(duì)3-多態(tài)性單倍型中每一變體(表7)的獨(dú)立性進(jìn)行了檢驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)了rs2612091的G-等位基因始終增加毒性風(fēng)險(xiǎn)，而與5’VNTR或3’UTR基因型(p＝0.0021)無(wú)關(guān)。相反地，當(dāng)變化其他兩種SNPs的基因型時(shí)，5’VNTR(p＝0.17)或3’UTR(p＝0.61)風(fēng)險(xiǎn)-等位基因二者均不始終增加毒性風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)包含rs2612091和5’VNTR或者3’UTR的2-多態(tài)性單倍型進(jìn)行了重復(fù)分析。rs2612091基因型再次與HFS顯著關(guān)聯(lián)，而與5’VNTR(p＝0.00053)或3’UTR(p＝1.47x10^-6)基因型無(wú)關(guān)。使用總體毒性重復(fù)上述分析，結(jié)果是類(lèi)似的，但是適度降低了顯著性。

使用最高精細(xì)繪圖SNP rs2741171的等同邏輯回歸和單倍型分析顯示了更強(qiáng)的證據(jù)，新的rs2612091SNP信號(hào)單獨(dú)說(shuō)明了TYMS/ENOSF1處的關(guān)聯(lián)。在多變量邏輯回歸模型中進(jìn)一步檢驗(yàn)了rs2741171,rs2612091,5’VNTR和3’UTR多態(tài)性的各種組合，并發(fā)現(xiàn)使AIC最小化的模型單獨(dú)含有rs2741171。rs2741171緊挨著可能為p300結(jié)合位點(diǎn)的開(kāi)放染色質(zhì)的區(qū)域。

e.附加數(shù)據(jù)集的計(jì)算機(jī)模擬復(fù)制分析

在來(lái)自上述SCP研究的233位卡培他濱-治療患者中檢查了毒性與rs12132152,rs7548189和rs2612091之間的關(guān)聯(lián)。由于這些患者選自高毒性和低毒性分布的極端值(表4)，因而沒(méi)有進(jìn)行正式的薈萃分析。而且，毒性的總體測(cè)量是不可得的，并且檢驗(yàn)了與包括在QUASAR2患者中發(fā)現(xiàn)的總體關(guān)聯(lián)信號(hào)的具體個(gè)體毒性(腹瀉和/或HFS)的關(guān)聯(lián)(表6和表8)。

ENOSF1/TYMS SNP rs2612091與SCP患者中HFS關(guān)聯(lián)，其效果量與QUASAR2中的(OR_binary＝1.6,p＝0.012)類(lèi)似。DPYD區(qū)域SNP，rs7548189與SCP研究中HFS關(guān)聯(lián)(OR_binary＝1.7,p＝0.048)，但沒(méi)有證據(jù)顯示與腹瀉關(guān)聯(lián)(OR_binary＝0.78,p＝0.46)。進(jìn)一步地，在來(lái)自于上述EPICOLON研究的85位卡培他濱治療的患者中對(duì)rs7548189進(jìn)行了檢驗(yàn)(Abuli A,et al.Carcinogenesis(Epub ahead of print)(2013)，通過(guò)引用并入本文)，并發(fā)現(xiàn)了與嚴(yán)重腹瀉關(guān)聯(lián)的證據(jù)(OR_binary＝1.47,P＝0.020)。

在SCP集合中沒(méi)有復(fù)制HFS與相對(duì)罕見(jiàn)DPYD SNP rs12132152之間的關(guān)聯(lián)(表8)，其顯示了與QUASAR2中觀察到的效果的相反方向(OR_binary＝0.30,p＝0.025)。由于QUASAR2中rs12132152關(guān)聯(lián)非常強(qiáng)烈，在SCP研究中缺少關(guān)聯(lián)可能是由北歐和南歐人群之間的基因差異造成的。因此，確定了在1000個(gè)基因組GBR(UK)和TSI(Tuscan)數(shù)據(jù)集合中rs12132152周?chē)?Mb區(qū)域的連鎖不平衡結(jié)構(gòu)。

發(fā)現(xiàn)了14種非編碼罕見(jiàn)變體的集合，其彼此之間高度相關(guān)，并在GBR數(shù)據(jù)中與rs12132152，其最佳標(biāo)簽SNP，適度連鎖不平衡(r²～0.5)，然而在TSI數(shù)據(jù)中顯示了與rs12132152幾乎不關(guān)聯(lián)(r²<0.002)。所有的這14種變體已經(jīng)舍棄了QUASAR2的填補(bǔ)質(zhì)量控制檢查，但代表了由rs12132152標(biāo)簽的潛在功能毒性變體。特別注意的是，這些變體種的3種(rs72724388,rs72724390和rs142652198)位于DPYD內(nèi)含子內(nèi)并作為體內(nèi)未表征的反義mRNA(DPYD-AS1,chr1:97561479-97788511)的部分而被轉(zhuǎn)錄。

f.基于集合的檢驗(yàn)

為確定在QUASAR2中是否存在著附加毒性關(guān)聯(lián)的證據(jù)，其中該附加毒性關(guān)聯(lián)還未達(dá)到個(gè)體SNPs或罕見(jiàn)變體的正式統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，基于變體集合進(jìn)行了關(guān)聯(lián)檢驗(yàn)(表9)。之前報(bào)道的毒性變體和本發(fā)明的變體均被排除，即DPYD 2846,*2A變體,DPYD rs12132152,DPYD rs7548189和TYMS rs2612091，以及與這些SNPs連鎖不平衡r²>0.1的區(qū)域(包括TYMS 5’VNTR和3’UTR多態(tài)性)。

使用錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率q＝0.05，在任何基因處或在變體集合整體中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)令人信服的附加關(guān)聯(lián)的證據(jù)。然而，存在著TYMP位置處變體和HFS、腹瀉之間關(guān)聯(lián)的提示性證據(jù)(表9)。

g.鑒定DPYD和TYMS中新的、罕見(jiàn)易感變體

對(duì)DPYD和TYMS的編碼區(qū)域測(cè)序鑒定了HiTox庫(kù)內(nèi)僅僅單一錯(cuò)義變體(DPYD c.G1651A；p.Ala551Thr；chr1:97981371)，該變體不存在于SNP和外顯子組陣列上。在968位患者的全集合內(nèi)也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)該變體的其他存在。該變體的每人的測(cè)序讀出平均數(shù)目為70以及總變體讀出頻率為0.0035。通過(guò)SIFT,Polyphen,PhyloP和MutationTaster預(yù)測(cè)了這個(gè)變體(A551T)是強(qiáng)破壞性的。桑格測(cè)序鑒定了具有該罕見(jiàn)等位基因的單獨(dú)患者，該患者經(jīng)歷了等級(jí)4的中性粒細(xì)胞減少和血小板減少。

數(shù)據(jù)庫(kù)檢索確定了所述變體之前已被報(bào)道為DPYD缺陷綜合癥的原因(OMIM 612779)(Van Kuilenburg AB et al.,Biol Chem.386(4):319-324(2005)，通過(guò)引用并入本文)。已經(jīng)確認(rèn)了A551T不與任何其他的常見(jiàn)或罕見(jiàn)DPYD毒性變體連鎖不平衡。

在19位任何周期具有極端(等級(jí)4)毒性的患者中，確定了他們?cè)谶@3種毒性SNPs攜帶有哪種等位基因以及來(lái)自文獻(xiàn)的罕見(jiàn)DPYD等位基因的它們的補(bǔ)集(complement)，包括在我們之前的薈萃分析中顯示與5-FU毒性相關(guān)聯(lián)的2846A>T和*2A(Rosmarin et al.,Journal of clinical oncology:official journal of the American Society of Clinical Oncology(2014),出版中,通過(guò)引用并入本文)(表10)。沒(méi)有良好的證據(jù)顯示這3種新毒性SNPs的風(fēng)險(xiǎn)等位基因在這19位患者中作為群組被過(guò)表達(dá)(表10)。使用Caudle等人的評(píng)估(Caudle et al.,Clinical pharmacology and therapeutics 94(6):640-5(2013)，通過(guò)引用并入本文)作為指南，由來(lái)自本研究的數(shù)據(jù)進(jìn)行補(bǔ)充，評(píng)價(jià)了每一罕見(jiàn)DPYD變體對(duì)極端毒性的可能貢獻(xiàn)。存在著不充分的現(xiàn)有證據(jù)(Caudle et al.,Clinical pharmacology and therapeutics 94(6):640-5(2013)來(lái)把6種DPYD等位基因(*4,*5,*6,*9A,M166V and K259E)作為病原性的(表6)。檢查嚴(yán)重毒性病例中這些多態(tài)性的基因型(表10)和檢驗(yàn)二元總體毒性的關(guān)聯(lián)(表11)與本觀點(diǎn)并不矛盾。

幾種其他的罕見(jiàn)DPYD等位基因(*3,*7,*8,*9B,*10,*11,*12)不存在于樣本集合中。4種罕見(jiàn)DPYD等位基因被表示為嚴(yán)重功能毒性：*2A,2846T>A,*13and A551T。19位嚴(yán)重毒性患者中有5位(26％)攜帶這些DPYD等位基因的一種(表10)。在這5個(gè)病例中，有4個(gè)(80％)具有危及生命的骨髓毒性(G4中性粒細(xì)胞減少和血小板減少)，而其他的具有G4腹瀉。具有G4中性粒細(xì)胞減少但不具有血小板減少的另一個(gè)體，不攜帶任何該4種DPYD等位基因?？傊瑢?duì)于預(yù)測(cè)嚴(yán)重骨髓抑制，罕見(jiàn)DPYD變體具有83％敏感性，99％特異性，29％陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和99.9％陰性預(yù)測(cè)值。

如同已經(jīng)在雜合狀態(tài)下與5-FU相關(guān)毒性建立關(guān)聯(lián)的其他罕見(jiàn)DPYD變體(*2A和2846T>A)，已經(jīng)顯示了當(dāng)作為純合子或與另一突變等位基因的復(fù)合雜合子存在時(shí)，A551T引起隱性DPYD缺陷綜合癥(Schwab M et al.,J Clin Oncol.26(13):2131-2138(2008),通過(guò)引用并入本文)。對(duì)經(jīng)歷等級(jí)4中性粒細(xì)胞減少和血小板減少的患者中A551T的鑒定進(jìn)一步支持了以下觀點(diǎn)：引起DPYD缺陷綜合癥的罕見(jiàn)非同義DPYD變體，例如I560S和大約15種其他變體(Van Kuilenburg AB et al.,Biol Chem.386(4):319-324(2005)；Van Kuilenburg AB et al.,Hum Genet.104(1):1-9(1999)；Van Kuilenburg AB et al.,Biochem J 364:157-163(2002),每一均通過(guò)引用并入本文)，極大增加了雜合子內(nèi)5-FU毒性的風(fēng)險(xiǎn)。

進(jìn)一步地，在經(jīng)歷等級(jí)4骨髓毒性的3位其他QUASAR2患者中——其中有2位是QUASAR2中僅有的毒性誘導(dǎo)死亡的——1位攜帶DPYD*2A，1位攜帶2846A>C和1位攜帶*13。在不發(fā)展嚴(yán)重毒性的帶有罕見(jiàn)、功能毒性DPYD等位基因的12位攜帶者中，7位經(jīng)受了等級(jí)3毒性并可能因此免受了卡培他濱劑量減少的嚴(yán)重毒性。因此，極端卡培他濱/5-FU相關(guān)毒性為可遺傳的，這是看似合理的。

h.接受者操作特性(ROC)分析

為檢驗(yàn)基于先前報(bào)道的卡培他濱毒性變體和本發(fā)明新鑒定變體的模型對(duì)預(yù)測(cè)5-FU毒性的性能，將QUASAR2數(shù)據(jù)集合和DPYD 2846T>A,DPYD*2A,DPYD rs12132152,DPYD rs7548189,DPYD p.Ala551Thr和TYMS rs2612091變體合并到ROC分析中以便預(yù)測(cè)總體等級(jí)012v34卡培他濱相關(guān)毒性。該模型檢驗(yàn)了本發(fā)明的臨床實(shí)用性。

分析了938位患者，對(duì)每一患者使用如下得分：

(每一多態(tài)性有害等位基因的數(shù)目)x(每等位基因的貝塔系數(shù))

假設(shè)DPYD變體rs12132152,rs7548189and A551T是功能等同的，并從而為本分析的目的而將其結(jié)合到任何罕見(jiàn)功能等位基因?qū)Ψ呛币?jiàn)等位基因的檢驗(yàn)中(OR＝7.6,p＝4.5x10-⁴)。發(fā)現(xiàn)曲線下面積(AUC)為0.66(95％CI 0.63-0.70)。在最大比例(69％)的患者被正確分類(lèi)的截?cái)帱c(diǎn)處，敏感性為27％(95％CI 23-33％),特異性為91％(95％CI 88-93％),陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為60％(PPV:95％CI 52-68％),和陰性預(yù)測(cè)值為71％(NPV:95％CI 68-74％)(圖6)。