具有6個或更少碳的有機化合物如小型二羧酸是有商業(yè)意義的用途多樣的化學品。例如，小型二酸類包括1,4-二酸類，如琥珀酸、蘋果酸和酒石酸，和5-碳分子衣康酸。其他二酸類包括二碳草酸、三碳丙二酸、五碳戊二酸和六碳己二酸并且也存在這類二酸的許多衍生物。作為一類，這些小型二酸具有某種化學相似性并且它們在聚合物生產(chǎn)中的用途可以為樹脂提供?；匦?。這種多用性使其輕易契合下游化工基礎(chǔ)設(shè)施市場。例如，1,4-二酸類分子滿足大規(guī)?；瘜W品馬來酐的許多用途，在于它們被轉(zhuǎn)化成多種工業(yè)化學品(四氫呋喃，丁內(nèi)酯，1,4-丁二醇，2-吡咯烷酮)和琥珀酸鹽衍生物琥珀酰胺、琥珀腈、二氨基丁烷和琥珀酸酯。酒石酸在食品、皮革、金屬和印刷行業(yè)具有眾多用途。衣康酸形成生產(chǎn)3-甲基吡咯烷酮、甲基-BDO、甲基-THF和其他的原料。尤其，琥珀酸或琥珀酸酯-這些術(shù)語在本文中互換使用-已經(jīng)吸引巨大興趣，因為已經(jīng)在食品、化工和制藥業(yè)中使用它作為許多工業(yè)上重要的化學品的前體。實際上，一份來自美國能源部的報告報道，琥珀酸是從生物質(zhì)生產(chǎn)的前12大化學結(jié)構(gòu)單元之一。因此，在細菌中制得二酸類的能力將具有明顯的商業(yè)重要性。WO-A-2009/024294公開了產(chǎn)生琥珀酸的細菌菌株(其屬于巴斯德菌科(Pasteurellaceae)成員，最初從瘤胃分離并能夠利用甘油作為碳源)，以及來自其中的保留所述能力的變體和突變株，尤其，如保藏于DSMZ(德意志微生物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH),因霍夫街.7B,D-38124布勞恩斯切魏格，德國)的命名為DD1的細菌菌株，所述細菌菌株具有保藏編號DSM18541(ID06-614)并且具有產(chǎn)生琥珀酸的能力。DD1-菌株屬于物種Basfiasucciniciproducens及巴斯德菌科，如依據(jù)Kuhnert等人,2010分類。WO-A-2010/092155中公開了對這些菌株的突變，其中已經(jīng)破壞ldhA-基因和/或pflD-或pflA-基因，這些突變株的特征為：與WO-A-2009/024294中公開的DD1-野生型相比，在厭氧條件下顯著增加從碳源如甘油或甘油和糖(如麥芽糖)的混合物產(chǎn)生琥珀酸。然而，基于生物的琥珀酸仍然面臨以下挑戰(zhàn)：在成本上針對基于石油化學的替代品變得有競爭力。為了發(fā)展基于生物的工業(yè)生產(chǎn)琥珀酸，在低成本培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞將重要，并且工作菌株應(yīng)當最佳地能夠代謝類型廣泛的低成本糖原料以按照良好產(chǎn)率產(chǎn)生琥珀酸，從而可以使用最便宜的可用原料。蔗糖(俗稱為糖)是由葡萄糖和果糖組成的二糖，并且它是是自然界中非常豐富并從具有光合作用能力的全部植物產(chǎn)生的碳源。尤其，甘蔗和糖用甜菜含有大量蔗糖，并且世界上超過60％的蔗糖目前產(chǎn)自甘蔗。特別地，蔗糖以十分低的成本生產(chǎn)，因為它可以通過蒸發(fā)/濃縮通過機械壓榨甘蔗獲得的提取物的簡單工藝而工業(yè)產(chǎn)生。蔗糖作為通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生化學化合物的原料因此是價廉的，并且它還發(fā)揮以下作用：保護細胞膜免受含有大量所需代謝物的外部環(huán)境影響，因此產(chǎn)生高濃度的所需代謝物，如Kilimann等人,(BiochimicaetBiophysicaActa,1764,2006)所示。即使蔗糖是具有上述優(yōu)點(包括低價格和保護微生物免受外部環(huán)境影響的功能)的優(yōu)異原料，這種碳源的缺點可以見于以下事實：眾多微生物沒有運輸蔗糖至細胞中、降解運輸?shù)恼崽遣⒔到猱a(chǎn)物與糖酵解聯(lián)系的完整機制，并且因此不能利用蔗糖作為碳源。甚至在微生物具有能夠利用蔗糖的機制情況下，它們也不能高效產(chǎn)生所需的代謝物，因為攝入和降解蔗糖作為碳源的速率十分低下。因此，本發(fā)明的一個目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點。特別地，本發(fā)明的目的是提供可以用于發(fā)酵產(chǎn)生有機化合物如琥珀酸并且可以在不犧牲生長速率或產(chǎn)率的情況下高效利用蔗糖作為優(yōu)勢碳源的微生物。優(yōu)選地，所述微生物將能夠利用眾多低成本碳源并產(chǎn)生優(yōu)異產(chǎn)量的有機化合物如琥珀酸。與用于發(fā)酵產(chǎn)生琥珀酸的現(xiàn)有技術(shù)的重組微生物相比，本發(fā)明的微生物應(yīng)當以細胞基于蔗糖作為優(yōu)勢碳源而生長期間琥珀酸產(chǎn)率增加和碳產(chǎn)率增加為特征。實現(xiàn)上述目標的貢獻由一種修飾的微生物提供，所述修飾的微生物與其野生型相比具有fruA-基因編碼的酶的減少活性，其中修飾微生物所來自的野生型屬于巴斯德菌科(Pasteurellaceae)。實現(xiàn)上述目標的貢獻尤其由一種其中已經(jīng)缺失fruA-基因或其部分的修飾的微生物提供，其中修飾微生物所來自的野生型屬于巴斯德菌科(Pasteurellaceae)。令人驚訝地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，(例如通過缺失fruA-基因)減少由fruA-基因編碼的酶(這種酶假定地是果糖特異性磷酸轉(zhuǎn)移酶)的活性產(chǎn)生修飾的巴斯德菌科菌株，所述菌株與其中這種酶的活性尚未減少的相應(yīng)微生物相比，以增加的有機化合物(如琥珀酸)產(chǎn)量為特征，特別地如果這些修飾的微生物基于蔗糖作為可同化碳源培養(yǎng)時。如根據(jù)Lee等人,(AppliedandEnvironmentalMicrobiology(2010),Vol.76(5),第1699-1703頁))中的教導，這的確令人驚訝的，至少在產(chǎn)琥珀酸曼氏桿菌(Mannheimiasucciniciproducens)中，fruA-基因編碼負責將果糖攝入細胞的果糖PTS-系統(tǒng)。當產(chǎn)琥珀酸曼氏桿菌基于蔗糖培養(yǎng)時，該二糖在細胞內(nèi)部水解以獲得葡萄糖-6-磷酸和果糖。然而，果糖，在水解后分泌并且由細胞使用果糖PTS-系統(tǒng)再次攝取。本領(lǐng)域技術(shù)人員將因此假定，當細胞基于蔗糖作為優(yōu)勢碳源培養(yǎng)時，fruA-基因的失活將導致琥珀酸的形成減少，因為至少一部分的二糖(即果糖)不能輸入細胞中。在表述“與其野生型相比具有由x-基因編碼的酶的減少活性的修飾微生物”(其中x-基因是fruA-基因和任選地，如稍后所述是ldhA-基因、pflA-基因和/或pflD-基因)的上下文中，術(shù)語“野生型”指一種微生物，其中由x-基因編碼的酶的活性尚未減少，即，指其基因組以如引入x-基因(尤其引入fruA-基因和任選地ldhA-基因、pflA-基因和/或pflD-基因)的基因修飾之前的狀態(tài)存在的微生物。優(yōu)選地，表述“野生型”指其基因組、特別其x-基因以因進化而天然生成的狀態(tài)存在的微生物。該術(shù)語可以用于完整的微生物，但是優(yōu)選地用于各個基因，例如fruA--基因、ldhA-基因、pflA-基因和/或pflD-基因。術(shù)語“修飾的微生物”因此包括這樣的微生物，所述微生物已經(jīng)被遺傳改變、修飾或工程化(例如，基因工程化)，從而如與它所來自的天然存在的野生型微生物相比，顯示出改變、修飾或不同的基因型和/或表型(例如，當基因修飾影響微生物的編碼核酸序列時)。根據(jù)本發(fā)明的修飾微生物的具體的優(yōu)選實施方案，修飾的微生物是重組微生物，其意指已經(jīng)使用重組DNA獲得該微生物。如本文所用的表述“重組DNA”指因利用實驗室方法(分子克隆)以令來自多個來源的遺傳物質(zhì)在一起，產(chǎn)生否則在生物學生物中將不存的序列而得到的DNA序列。這種重組DNA的例子是已經(jīng)向其中插入異源性DNA序列的質(zhì)粒。本發(fā)明微生物所來源的野生型屬于巴斯德菌科。巴斯德菌科包含大的革蘭氏陰性變形菌門(Proteobacteria)家族，其成員范圍從細菌如流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)至動物與人粘膜的共生物。大部分成員作為共生物生活在鳥和哺乳動物的粘膜表面上，特別地生活在上呼吸道中。巴斯德菌科細菌通常為桿狀，并且是令人矚目的一組兼性需氧厭氧菌。它們可以與相關(guān)的腸桿菌科(Enterobacteriaceae)細菌相區(qū)別在于存在氧化酶，并且與大部分的其他相似細菌相區(qū)別在于無鞭毛。巴斯德菌科中的細菌已經(jīng)基于代謝特性和16SRNA和23SRNA序列劃分成多個屬。許多巴斯德菌科細菌含有丙酮酸-甲酸-裂解酶基因并且能夠?qū)⑻荚磪捬醢l(fā)酵成有機酸。根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)修飾的微生物的具體的優(yōu)選實施方案，已經(jīng)從中衍生經(jīng)修飾的微生物的野生型屬于Basfia屬并且特別優(yōu)選已經(jīng)從中衍生經(jīng)修飾的微生物的野生型屬于Basfiasucciniciproducens物種。最優(yōu)選地，本發(fā)明修飾微生物所來源的野生型是根據(jù)布達佩斯條約保藏于DSMZ(德意志微生物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH),德國)的Basfiasucciniciproducens菌株DD1，其具有保藏編號DSM18541。該菌株已經(jīng)最初從德國起源的牛的瘤胃分離。巴氏桿菌屬(Pasteurella)細菌可以從動物和優(yōu)選地哺乳動物的胃腸道分離。細菌菌株DD1尤其可以從牛瘤胃分離并且能夠利用甘油(包括粗制甘油)作為碳源。可以用于制備本發(fā)明修飾微生物的Basfia屬其他菌株是是已經(jīng)按保藏編號DSM22022保藏的Basfia菌株或已經(jīng)在瑞典哥德堡大學培養(yǎng)物保藏中心保藏的具有保藏編號CCUG57335、CCUG57762、CCUG57763、CCUG57764、CCUG57765或CCUG57766的Basfia菌株。該菌株已經(jīng)最初從德國或瑞士起源的牛的瘤胃分離。在這種情況下，特別優(yōu)選本發(fā)明修飾微生物所來源的野生型具有SEQIDNO:1的16SrDNA或顯示與SEQIDNO:1的至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.9％序列同源性的序列。還優(yōu)選本發(fā)明修飾微生物所來源的野生型具有SEQIDNO:2的23SrDNA或顯示與SEQIDNO:2的至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.9％序列同源性的序列。連同待用于本發(fā)明的經(jīng)修飾的微生物的多種多肽或多核苷酸所提到的以百分數(shù)值計的同一性優(yōu)選地計算為所比對的序列的整個全長上的殘基同一性，例如，采用以下默認參數(shù)，借助來自生物信息學軟件包EMBOSS(第5.0.0版，http://emboss.source-forge.net/what/)的程序needle計算的同一性(對于相當相似的序列)：空位開口(空位開口罰分)：10.0；空位延伸(空位延伸罰分)：0.5和數(shù)據(jù)文件(軟件包中包含的評分矩陣)：EDNAFUL。應(yīng)當指出，本發(fā)明的修飾微生物不能僅來自上文提到的野生型微生物，特別來自Basfiasucciniciproducens菌株DD1，還來自這些菌株的變體。在這種情況下，表述“菌株的變體”包括具有與野生型菌株相同或基本上相同的特征的每個菌株。在這種情況下，特別優(yōu)選該變體的16SrDNA與該變體所來自的野生型具有至少90％、優(yōu)選地至少95％、更優(yōu)選地至少99％、更優(yōu)選地至少99.5％、更優(yōu)選地至少99.6％、更優(yōu)選地至少99.7％、更優(yōu)選地至少99.8％和最優(yōu)選地至少99.9％的同一性。還特別優(yōu)選該變體的23SrDNA與該變體所來自的野生型具有至少90％、優(yōu)選地至少95％、更優(yōu)選地至少99％、更優(yōu)選地至少99.5％、更優(yōu)選地至少99.6％、更優(yōu)選地至少99.7％、更優(yōu)選地至少99.8％和最優(yōu)選地至少99.9％的同一性。在這種定義的含義下，可以例如通過用誘變化學劑、X射線或UV光處理野生型菌株獲得菌株的變體。本發(fā)明修飾微生物的特征在于，相比其野生型，由fruA-基因編碼的酶活性減少。酶活性減少(Δ活性)定義如下：其中，當測定Δ活性時，野生型中的活性和修飾的微生物中的活性在完全相同的條件下測定?？梢岳缭谝陨蠀⒖嫉腖ee等人的出版物中找到用于檢測和測定由fruA-基因編碼的酶的活性的方法。本文公開的酶的活性減少、尤其由fruA-基因編碼的酶、乳酸脫氫酶和/或丙酮酸甲酸裂合酶的活性減少可以是與所述酶在野生型微生物中的活性相比，酶活性減少至少50％、或酶活性減少至少90％或更優(yōu)選地酶活性減少至少95％、或更優(yōu)選地酶活性減少至少98％、或甚至更優(yōu)選地酶活性減少至少99％或甚至更優(yōu)選地酶活性減少至少99.9％。術(shù)語“由fruA-基因編碼的酶的減少的活性”或–如下文描述–“減少的乳酸脫氫酶活性”或“減少的丙酮酸甲酸裂合酶活性”，還涵蓋具有這些酶的不可檢出活性的修飾微生物。術(shù)語“酶的減少的活性”例如包括由所述基因操作的(例如，基因工程化的)微生物以比所述微生物野生型表達的水平更低的水平表達酶。減少酶表達的基因操作可以包括，但不限于缺失編碼酶的基因或其部分、改變或修飾與表達編碼酶的基因相關(guān)聯(lián)的調(diào)節(jié)序列或位點(例如，通過移除強啟動子或阻遏型啟動子)、修飾參與轉(zhuǎn)錄編碼酶的基因和/或基因產(chǎn)物翻譯的蛋白質(zhì)(例如，調(diào)節(jié)蛋白、阻抑子、增強子、轉(zhuǎn)錄激活子等)或本領(lǐng)域常規(guī)的減少特定基因表達的任何其他常規(guī)手段(包括但不限于，使用敲除或阻斷靶蛋白表達的反義核酸分子或其他方法)。另外，可以將去穩(wěn)定化元件引入mRNA中或引入導致RNA的核糖體結(jié)合位點(RBS)劣化的基因修飾。還可能以降低翻譯效率和速度的方式改變基因的密碼子使用。也可以通過引入導致酶活性減少的一個或多個基因突變，獲得減少的酶活性。另外，減少酶活性還可以包括失活下述活化酶的(或減少其表達)，所述活化酶是激活待減少其活性的酶必需的。通過后一種方案，優(yōu)選地保持待減少其活性的酶處于失活狀態(tài)。由fruA-基因編碼的酶活性減少的微生物可以天然地存在，即因自發(fā)性突變產(chǎn)生?？梢酝ㄟ^多種技術(shù)(如化學處理或輻射)修飾某微生物以缺少或具有由fruA-基因編碼的酶的顯著減少活性。為此目的，微生物將例如受誘變化學劑、X射線或UV光處理。在后續(xù)步驟中，將選出這些微生物，所述微生物具有由fruA-基因編碼的酶的減少活性。修飾的微生物還通過同源重組技術(shù)可獲得，所述同源重組技術(shù)旨在突變、破壞或切除該微生物基因組中的fruA-基因或旨在將該基因置換為編碼下述酶的相應(yīng)基因，與野生型基因編碼的酶相比，所述酶具有減少的活性。根據(jù)本發(fā)明修飾微生物的一個優(yōu)選實施方案，通過修飾fruA-基因?qū)崿F(xiàn)由fruA-基因編碼的酶的活性減少，其中優(yōu)選地通過缺失fruA-基因或至少其部分、缺失fruA-基因的調(diào)節(jié)元件或其部分如啟動子序列、或通過向fruA-基因引入至少一個突變，實現(xiàn)這種基因修飾。在下文中，描述用于重組、尤其用于引入突變或用于缺失序列的合適技術(shù)。這項技術(shù)在本文中有時也稱作“Campbell重組”(Leenhouts等人,ApplEnvMicrobiol.(1989),第55卷,第394-400頁)。如本文所用，“Campbellin”指原始宿主細胞的轉(zhuǎn)化體，在所述轉(zhuǎn)化體中，完整環(huán)狀雙鏈DNA分子(例如質(zhì)粒)已經(jīng)通過單個同源重組事件(crossin事件)整合入染色體，并且所述轉(zhuǎn)化體有效地導致線性化形式的所述環(huán)狀DNA分子插入染色體的第一DNA序列，所述第一DNA序列與所述環(huán)狀DNA分子的第一DNA序列同源?！癈ampbelledin”指已經(jīng)整合至“Campbellin”轉(zhuǎn)化體的染色體中的線性化DNA序列?！癈ampbellin”含有第一同源性DNA序列的重復，其每個拷貝包括并且包圍同源重組交叉點的副本。如本文中所用，“Campbellout”指起源于“Campbellin”轉(zhuǎn)化體的細胞，其中第二同源重組事件(crossout事件)已經(jīng)在“Campbelledin”DNA的線性化的插入的DNA上所含有的第二DNA序列和與所述線性化插入物的第二DNA序列同源的染色體源的第二DNA序列之間發(fā)生，第二重組事件導致整合的DNA序列的一部分缺失(丟棄)，但是，重要的，還導致整合的CampbelledinDNA的一部分(這可以小至單個堿基)留在染色體中，從而與原始宿主細胞相比，“Campbellout”細胞在染色體中含有一個或多個刻意變化(例如，單堿基置換、多堿基置換、插入異源基因或DNA序列，插入同源基因或修飾的同源基因的一個額外拷貝或多個拷貝，或插入包含多于一個上文所列的前述這些例子的DNA序列)。優(yōu)選地通過對基因反向選擇獲得“Campbellout”細胞，所述基因含有于“Campbelledin”DNA序列的一部分(需要拋棄的部分)，例如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)sacB基因，其在約5％至10％蔗糖存在下生長的細胞中表達時致死。借助或不借助反向選擇，可以通過使用任何可篩選表型如，但不限于菌落形態(tài)、菌落顏色、抗生素耐藥性的存在或不存在、借助聚合酶鏈反應(yīng)判斷給定DNA序列的存在或不存在、某種營養(yǎng)缺陷型的存在或不存在、某種酶的存在或不存在、菌落核酸雜交、抗體篩選法等篩選所需細胞，獲得或鑒定所需的“Campbellout”細胞。術(shù)語“Campbellin”和“Campbellout”也可以用作多種時態(tài)的動詞以指稱上文所述的方法或過程?？梢岳斫?，導致“Campbellin”或“Campbellout”的同源重組事件可以在同源性DNA序列內(nèi)部的DNA堿基的范圍內(nèi)發(fā)生，并且由于同源序列將對于這個范圍的至少部分是彼此相同的，所以通常不可能確切指定交叉事件在何處發(fā)生。換句話說，不可能確切指出哪個序列最初來自插入的DNA并且哪個序列最初來自染色體DNA。另外，第一同源性DNA序列和第二同源性DNA序列通常由一個部分非同源區(qū)域隔開，并且正是這個非同源區(qū)域仍放置在“Campbellout”細胞的染色體中。優(yōu)選地，第一和第二同源性DNA序列長至少約200堿基對，并且可以長達幾千堿基對。然而，可以用更短或更長的序列實施該過程。例如，第一和第二同源序列的長度可以是從約500個至2000個堿基的范圍，并且通過設(shè)置第一和第二同源序列具有大致相同的長度、優(yōu)選地具有少于200堿基對的差異并且最優(yōu)選地二者中較短者堿基對長度是較長者堿基對長度的至少70％，協(xié)助從“Campbellin”獲得“Campbellout”。其活性在本發(fā)明的修飾微生物中減少的fruA-基因優(yōu)選地包含選自以下的核酸：a)具有SEQIDNO:3的核苷酸序列的核酸；b)編碼SEQIDNO:4的氨基酸序列的核酸；c)與a)或b)的核酸至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％、最優(yōu)選地100％同一的核酸，同一性是在a)或b)的核酸總長度范圍內(nèi)的同一性；d)編碼氨基酸序列的核酸，所述氨基酸序列與a)或b)的核酸編碼的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％、最優(yōu)選地100％同一，同一性是在a)或b)的核酸編碼的氨基酸序列的總長度范圍內(nèi)的同一性；e)能夠在嚴格條件下與根據(jù)a)或b)的任一核酸的互補序列雜交的核酸；和f)與a)或b)的任一核酸編碼相同的蛋白質(zhì)，但因遺傳密碼簡并性而與上文a)或b)的核酸不同的核酸。如本文中所用，術(shù)語“雜交”包括“核酸分子的鏈通過堿基配對作用與互補鏈結(jié)合的任意過程”(J.Coombs(1994)DictionaryofBiotechnology,StocktonPress,NewYork)。雜交和雜交的強度(即，核酸分子之間結(jié)合的強度)受此類因素影響，如核酸分子之間的互補性程度、所涉及條件的嚴格性、所形成雜合體的Tm和核酸分子內(nèi)部的G:C比。如本文中所用，術(shù)語“Tm”用來指“解鏈溫度”。解鏈溫度是雙鏈核酸分子群體一半解離成單鏈的溫度。用于計算核酸分子的Tm的等式是本領(lǐng)域熟知的。如標準參考文獻所示，當核酸分子處于1MNaCl的水溶液中時，可以通過等式：Tm＝81.5+0.41(％G+C)計算來進行Tm值的簡單估計(見例如，Anderson和Young,QuantitativeFilterHybridization,inNucleicAcidHybridization(1985))。其他參考文獻包括更復雜計算法，這些算法考慮了結(jié)構(gòu)特征及序列特征以計算Tm。嚴格條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且可以在CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中找到。特別地，術(shù)語“嚴格性條件”指這些條件，其中作為互補核酸分子(DNA、RNA、ssDNA或ssRNA)的片段或與互補核酸分子(DNA、RNA、ssDNA或ssRNA)相同的100個或更多個連續(xù)核苷酸、150個或更多個連續(xù)核苷酸、200個或更多個連續(xù)核苷酸或250個或更多個連續(xù)核苷酸在等同于在50℃在7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中雜交同時在50℃或65℃、優(yōu)選地在65℃于2×SSC、0.1％SDS中洗滌的條件下與特定核酸分子(DNA、RNA、ssDNA或ssRNA)雜交。優(yōu)選地，該雜交條件等同于在50℃在7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中雜交，同時在50℃或65℃、優(yōu)選地65℃于1×SSC、0.1％SDS中洗滌，更優(yōu)選地，該雜交條件等同于在50℃在7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中雜交，同時在50℃或65℃、優(yōu)選地在65℃于0.1×SSC、0.1％SDS中洗滌。優(yōu)選地，互補核苷酸與fruA核酸的片段或完整fruA核酸雜交。備選地，優(yōu)選的雜交條件涵蓋在65℃在1×SSC中或在42℃在1×SSC和50％甲酰胺中雜交，隨后在65℃在0.3×SSC中洗滌或在50℃在4×SSC中或在40℃在6×SSC和50％甲酰胺中雜交，隨后在50℃在2×SSC中洗滌。其他優(yōu)選的雜交條件是0.1％SDS、0.1xSSD和65℃。可以通過上文提到的“Campbell重組”缺失或其中通過上文提到的“Campbell重組”引入至少一個突變的fruA-基因或其部分優(yōu)選地包含如上文定義的核酸。具有SEQIDNO:3的核苷酸序列的核酸對應(yīng)于Basfiasucciniciproducens-菌株DD1的fruA-基因。根據(jù)本發(fā)明的修飾微生物的優(yōu)選實施方案，修飾的微生物不以蔗糖介導的甘油分解代謝阻遏為特征。顯示蔗糖介導的甘油分解代謝阻遏的微生物例如在WO-A-2012/030130中公開。另外，優(yōu)選是在本發(fā)明的修飾微生物中，不缺失選自pta-基因和ackA-基因的至少一個基因。優(yōu)選地，既不缺失ptA-基因，又不缺失ackA-基因。在這種情況下，特別優(yōu)選在本發(fā)明的修飾微生物中，由pta-基因編碼的酶(其是磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶)的活性、由ackA-基因編碼的酶(其是乙酸鹽激酶)的活性或由pta-基因編碼的酶的活性和由ackA-基因編碼的酶的活性與野生型中這種酶/這些酶的相應(yīng)活性相比，不減少。根據(jù)本發(fā)明修飾微生物的又一個優(yōu)選的實施方案，這種微生物不僅特征為fruA-基因編碼的酶的活性減少，與野生型相比，還特征如下：i)減少的丙酮酸甲酸裂合酶活性，ii)減少的乳酸脫氫酶活性，iii)減少的丙酮酸甲酸裂合酶活性和減少的乳酸脫氫酶活性。存在乳酸脫氫酶缺陷和/或存在丙酮酸甲酸裂合酶活性缺陷的修飾微生物在WO-A-2010/092155、US2010/0159543和WO-A-2005/052135中公開，其中就減少微生物中、優(yōu)選地巴氏桿菌屬細菌細胞中、特別優(yōu)選地Basfiasucciniciproducens菌株DD1中乳酸脫氫酶和/或丙酮酸甲酸裂合酶活性的不同方法而言，通過引用方式并入所述文獻的公開內(nèi)容。用于確定丙酮酸甲酸裂合酶活性的方法例如由AsanumN.和HinoT.在“EffectsofpHandEnergySupplyonActivityandAmountofPyruvate-Formate-LyaseinStreptococcusbovis”,Appl.Environ.Microbiol.(2000),第66卷,第3773-3777頁中公開，并且用于確定乳酸脫氫酶活性的方法是例如由Bergmeyer,H.U.,BergmeyerJ.和Grassl,M.(1983-1986)在“MethodsofEnzymaticAnalysis”,第3版,第III卷,第126-133頁,VerlagChemie,Weinheim中公開。在這種情況下，優(yōu)選通過失活ldhA-基因(其編碼乳酸脫氫酶；LdhA；EC1.1.1.27或EC1.1.1.28)實現(xiàn)乳酸脫氫酶活性的減少并且通過失活pflA-基因(其編碼丙酮酸甲酸裂合酶的激活蛋白；PflA；EC1.97.1.4)或pflD-基因(其編碼丙酮酸甲酸裂合酶；PflD；EC2.3.1.54)實現(xiàn)丙酮酸甲酸裂合酶活性的減少，其中優(yōu)選地通過以下方式實現(xiàn)這些基因(即ldhA、pflA和pflD)的失活：缺失這些基因或其部分，缺失這些基因的調(diào)節(jié)元件或至少其部分或向這些基因引入至少一個突變，其中這些修飾優(yōu)選地借助如上文所述的“Campbell重組”進行。其活性在本發(fā)明的修飾微生物中減少的ldhA-基因優(yōu)選地包含選自以下的核酸：α1)具有SEQIDNO:9的核苷酸序列的核酸；α2)編碼SEQIDNO:10的氨基酸序列的核酸；α3)與α1)或α2)的核酸至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％、最優(yōu)選地100％相同的核酸，同一性是在α1)或α2)的核酸總長度范圍內(nèi)的同一性；α4)編碼氨基酸序列的核酸，所述氨基酸序列與α1)或α2)的核酸編碼的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％、最優(yōu)選地100％相同，同一性是在α1)或α2)的核酸編碼的氨基酸序列的總長度范圍內(nèi)的同一性；α5)能夠在嚴格條件下與根據(jù)α1)或α2)的任何核酸的互補序列雜交的核酸；和α6)編碼與α1)或α2)的任何核酸相同的蛋白質(zhì)，但因遺傳密碼簡并性而與上文α1)或α2)的核酸不同的核酸。其活性在本發(fā)明的修飾微生物中減少的pflA-基因優(yōu)選地包含選自以下的核酸：β1)具有SEQIDNO:11的核苷酸序列的核酸；β2)編碼SEQIDNO:12的氨基酸序列的核酸；β3)與β1)或β2)的核酸至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％、最優(yōu)選地100％相同的核酸，同一性是在β1)或β2)的核酸總長度范圍內(nèi)的同一性；β4)編碼氨基酸序列的核酸，所述氨基酸序列與β1)或β2)的核酸編碼的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％、最優(yōu)選地100％相同，同一性是在β1)或β2)的核酸編碼的氨基酸序列的總長度范圍內(nèi)的同一性；β5)能夠在嚴格條件下與根據(jù)β1)或β2)的任何核酸的互補序列雜交的核酸；和β6)編碼與β1)或β2)的任何核酸相同的蛋白質(zhì)，但因遺傳密碼簡并性而與上文β1)或β2)的核酸不同的核酸。其活性在本發(fā)明的修飾微生物中減少的pflD-基因優(yōu)選地包含選自以下的核酸：γ1)具有SEQIDNO:13的核苷酸序列的核酸；γ2)編碼SEQIDNO:14的氨基酸序列的核酸；γ3)與γ1)或γ2)的核酸至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％、最優(yōu)選地100％相同的核酸，同一性是在γ1)或γ2)的核酸總長度范圍內(nèi)的同一性；γ4)編碼氨基酸序列的核酸，所述氨基酸序列與γ1)或γ2)的核酸編碼的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％、最優(yōu)選地100％相同，同一性是在γ1)或γ2)的核酸編碼的氨基酸序列的總長度范圍內(nèi)的同一性；γ5)能夠在嚴格條件下與根據(jù)γ1)或γ2)的任何核酸的互補序列雜交的核酸；和γ6)編碼與γ1)或γ2)的任何核酸相同的蛋白質(zhì)，但因遺傳密碼簡并性而與上文γ1)或γ2)的核酸不同的核酸。在這種情況下，優(yōu)選本發(fā)明的修飾微生物還包含：A)ldhA-基因或至少其部分的缺失、ldhA-基因調(diào)節(jié)元件或至少其部分的缺失或向ldhA-基因引入至少一個突變；B)pflD-基因或至少其部分的缺失、pflD-基因調(diào)節(jié)元件或至少其部分的缺失或向pflD-基因引入至少一個突變；C)pflA-基因或至少其部分的缺失、pflA-基因調(diào)節(jié)元件或至少其部分的缺失或向pflA-基因引入至少一個突變；D)ldhA-基因或至少其部分的缺失、ldhA-基因調(diào)節(jié)元件或至少其部分的缺失或向ldhA-基因引入至少一個突變和pflD-基因或至少其部分的缺失、pflD-基因調(diào)節(jié)元件或至少其部分的缺失或向pflD-基因引入至少一個突變；或E)ldhA-基因或至少其部分的缺失、ldhA-基因調(diào)節(jié)元件或至少其部分的缺失或向ldhA-基因引入至少一個突變和pflA-基因或至少其部分的缺失、pflA-基因調(diào)節(jié)元件或至少其部分的缺失或向pflA-基因引入至少一個突變。本發(fā)明的修飾微生物的具體的優(yōu)選實施方案是：-Basfia屬的修飾的細菌細胞和特別優(yōu)選物種Basfiasucciniciproducens的修飾的細菌細胞，其中已經(jīng)缺失fruA-基因或至少其部分或其中已經(jīng)在fruA-基因中引入至少一個突變，其中進一步優(yōu)選修飾的細菌細胞不以蔗糖介導的甘油分解代謝阻遏為特征；-Basfia屬的修飾的細菌細胞和特別優(yōu)選物種Basfiasucciniciproducens的修飾的細菌細胞，其中已經(jīng)缺失fruA-基因或至少其部分或其中已經(jīng)在fruA-基因中引入至少一個突變，并且其中與野生型相比，減少乳酸脫氫酶的活性，優(yōu)選地通過修飾ldhA-基因、尤其通過修飾下述ldhA-基因，所述ldhA-基因具有根據(jù)SEQIDNO:9的核酸序列并且編碼具有根據(jù)SEQIDNO:10的氨基酸序列的LdhA，其中進一步優(yōu)選修飾的微生物不以蔗糖介導的甘油分解代謝阻遏為特征；-Basfia屬的修飾的細菌細胞和特別優(yōu)選物種Basfiasucciniciproducens的修飾的細菌細胞，其中已經(jīng)缺失fruA-基因或至少其部分或其中已經(jīng)在fruA-基因中引入至少一個突變，并且其中與野生型相比，減少丙酮酸甲酸裂合酶的活性，優(yōu)選地通過修飾pflA-基因或pflD-基因、尤其通過修飾下述pflA-基因或通過修飾下述pflD-基因，所述pflA-基因具有根據(jù)SEQIDNO:11的核酸序列并且編碼具有根據(jù)SEQIDNO:12的氨基酸序列的PflA，所述pflD-基因具有根據(jù)SEQIDNO:13的核酸序列并且編碼具有根據(jù)SEQIDNO:14的氨基酸序列的PflD，其中進一步優(yōu)選修飾的細菌細胞不以蔗糖介導的甘油分解代謝阻遏為特征；-Basfia屬的修飾的細菌細胞和特別優(yōu)選物種Basfiasucciniciproducens的修飾的細菌細胞，其中已經(jīng)缺失fruA-基因或至少其部分或其中已經(jīng)在fruA-基因中引入至少一個突變，并且其中與野生型相比，減少乳酸脫氫酶和丙酮酸甲酸裂合酶的活性，優(yōu)選地通過修飾ldhA-基因和pflA-基因、尤其通過修飾下述ldhA-基因或通過修飾下述pflA-基因減少乳酸脫氫酶和丙酮酸甲酸裂合酶的活性，所述ldhA-基因具有根據(jù)SEQIDNO:9的核酸序列并且編碼具有根據(jù)SEQIDNO:10的氨基酸序列的LdhA，所述pflA-基因具有根據(jù)SEQIDNO:11的核酸序列并且編碼具有根據(jù)SEQIDNO:12的氨基酸序列的PflA，或通過修飾ldhA-基因和pflD-基因、尤其通過修飾下述ldhA-基因或通過修飾下述pflD-基因減少乳酸脫氫酶和丙酮酸甲酸裂合酶的活性，所述ldhA-基因具有根據(jù)SEQIDNO:9的核酸序列并且編碼具有根據(jù)SEQIDNO:10的氨基酸序列的LdhA，所述pflD-基因具有根據(jù)SEQIDNO:13的核酸序列并且編碼具有根據(jù)SEQIDNO:14的氨基酸序列的PflD，其中進一步優(yōu)選修飾的細菌細胞不以蔗糖介導的甘油分解代謝阻遏為特征。進一步通過產(chǎn)生有機化合物的方法提供解決一開始所提到問題的促進手段，所述方法包括：I)在包含蔗糖作為可同化碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明的修飾微生物以允許修飾的微生物產(chǎn)生有機化合物，因而獲得包含有機化合物的發(fā)酵液；II)從過程步驟I)中獲得的發(fā)酵液回收有機化合物。在過程步驟I)中，將根據(jù)本發(fā)明的修飾微生物在包含蔗糖作為可同化碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)以允許修飾的微生物產(chǎn)生有機化合物，因而獲得包含有機化合物的發(fā)酵液?？梢酝ㄟ^本發(fā)明方法產(chǎn)生的優(yōu)選有機化合物包括羧酸如甲酸、乳酸、丙酸、2-羥基丙酸、3-羥基丙酸、3-羥基丁酸、丙烯酸、丙酮酸或這些羧酸的鹽、二羧酸如丙二酸、琥珀酸、蘋果酸、酒石酸、戊二酸、衣康酸、己二酸或其鹽，三羧酸如檸檬酸或其鹽，醇如甲醇或乙醇、氨基酸如L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-精氨酸、L-異亮氨酸、L-甘氨酸、L-谷氨酰胺，L-谷氨酸、L-半胱氨酸、L-絲氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、L-蘇氨酸、L-纈氨酸、L-組氨酸、L-脯氨酸、L-甲硫氨酸、L-賴氨酸、L-亮氨酸等。根據(jù)本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案，有機化合物是琥珀酸。如本發(fā)明上下文中所用，術(shù)語“琥珀酸”應(yīng)當以其最廣意義理解并且還涵蓋其鹽(即，琥珀酸鹽)，例如堿金屬鹽，如Na+鹽和K+鹽，或堿土金屬鹽，如Mg2+鹽和Ca2+鹽，或琥珀酸的銨鹽或酐。優(yōu)選地在培養(yǎng)基中在約10℃至60℃或20℃至50℃或30℃至45℃范圍內(nèi)的溫度在5.0至9.0或5.5至8.0或6.0至7.0的pH溫育本發(fā)明的修飾微生物。優(yōu)選地，有機化合物，尤其琥珀酸，在無氧條件下產(chǎn)生?？梢越柚Ｒ?guī)技術(shù)建立無氧條件，例如通過使反應(yīng)介質(zhì)組分排氣并且通過以例如0.1至1或0.2至0.5vvm流速引入二氧化碳或氮氣或其混合物和任選地氫，維持厭氧條件?？梢越柚Ｒ?guī)技術(shù)建立需氧條件，例如通過以例如0.1至1或0.2至0.5vvm流速引入空氣或氧氣。如果需要，可以在過程中應(yīng)用0.1至1.5巴的略微較高壓力?？赏荚磧?yōu)選地是蔗糖。根據(jù)本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案，可同化碳源不是甘油和蔗糖的混合物。在這種情況下，優(yōu)選基于可同化碳源(二氧化碳除外)的總重量，至少50wt.％、優(yōu)選地至少75wt.％、更優(yōu)選地至少90wt.％、甚至更優(yōu)選地至少95wt.％和最優(yōu)選地至少99wt.％的可同化碳源是蔗糖。另外優(yōu)選基于可同化碳源的總重量，小于50wt.％、優(yōu)選地小于25wt.％，更優(yōu)選地小于10wt.％，甚至更優(yōu)選地小于5wt.％和最優(yōu)選地小于1wt.％的可同化碳源是甘油。將可同化碳源的初始濃度調(diào)節(jié)至、優(yōu)選地將蔗糖的初始濃度調(diào)節(jié)至5至100g/l、優(yōu)選地5至75g/l和更優(yōu)選地5至50g/l范圍內(nèi)的值，并且可以在培養(yǎng)期間維持所述初始濃度處于所述范圍內(nèi)。反應(yīng)介質(zhì)的pH可以通過添加合適的堿控制，所述堿例如是氨氣、NH4HCO3、(NH4)2CO3、NaOH、Na2CO3、NaHCO3、KOH、K2CO3、KHCO3、Mg(OH)2、MgCO3、Mg(HCO3)2、Ca(OH)2、CaCO3、Ca(HCO3)2、CaO、CH6N2O2、C2H7N和/或其混合物。如果發(fā)酵過程期間形成的有機化合物是羧酸或二羧酸，則尤其需要這些堿性中和劑。在作為有機化合物的琥珀酸情況下，Mg(OH)2是特定優(yōu)選的堿。本發(fā)明的發(fā)酵步驟I)可以例如在攪拌式發(fā)酵罐、鼓泡塔和環(huán)流反應(yīng)器中進行?？梢栽贑hmiel:“Bioprozesstechnik:EinführungindieBioverfahrenstechnik”,第1卷"中找到可能方法類型的綜合概覽，包括攪拌器類型和幾何設(shè)計。在本發(fā)明的方法中，可用的常見變例是本領(lǐng)域技術(shù)人員(例如在Chmiel,HammesandBailey:“BiochemicalEngineering”中)已知或解釋的以下變體，如分批發(fā)酵、補料分批、重復補料分批或另外伴隨或不伴隨生物質(zhì)再循環(huán)的連續(xù)發(fā)酵。取決于生產(chǎn)菌株，可以用空氣、氧、二氧化碳、氫氣、氮氣或適宜氣體混合物實現(xiàn)鼓泡以實現(xiàn)良好產(chǎn)量(YP/S)。在過程步驟I)中產(chǎn)生有機酸、尤其琥珀酸的特別優(yōu)選條件是：可同化碳源：蔗糖溫度：30℃至45℃pH：5.5至7.0供應(yīng)的氣體：CO2在過程步驟I)中進一步優(yōu)選，可同化碳源、優(yōu)選地蔗糖，轉(zhuǎn)化成有機化合物，優(yōu)選地轉(zhuǎn)化成琥珀酸，其中碳產(chǎn)率YP/S是至少0.5g/g直至約1.18g/g；例如碳產(chǎn)率YP/S為至少0.6g/g、至少0.7g/g、至少0.75g/g、至少0.8g/g、至少0.85g/g、至少0.9g/g、至少0.95g/g、至少1.0g/g、至少1.05g/g或至少1.1g/g(有機化合物/碳，優(yōu)選地琥珀酸/碳)。在過程步驟I)中還優(yōu)選，可同化碳源、優(yōu)選地蔗糖，轉(zhuǎn)化成有機化合物，優(yōu)選地轉(zhuǎn)化成琥珀酸，其中比生產(chǎn)率產(chǎn)量(specificproductivityyield)是至少0.6ggDCW-1h-1有機化合物，優(yōu)選地琥珀酸，或是至少0.65ggDCW-1h-1、至少0.7ggDCW-1h-1、至少0.75ggDCW-1h-1或至少0.77ggDCW-1h-1有機化合物，優(yōu)選地琥珀酸。在過程步驟I)中還優(yōu)選，蔗糖轉(zhuǎn)化成有機化合物，優(yōu)選地轉(zhuǎn)化成琥珀酸，有機化合物、優(yōu)選地琥珀酸的空間時間產(chǎn)率是至少2.2g/(L×h)或至少2.5g/(L×h)、至少2.75g/(L×h)、至少3g/(L×h)、至少3.25g/(L×h)、至少3.5g/(L×h)、至少3.7g/(L×h)、至少4.0g/(L×h)至少4.5g/(L×h)或至少5.0g/(L×h)有機化合物，優(yōu)選地琥珀酸。根據(jù)本發(fā)明方法的另一個優(yōu)選實施方案，在工藝步驟I)中修飾的微生物將至少20g/L，更優(yōu)選地至少25g/l和甚至更優(yōu)選地至少30g/l蔗糖轉(zhuǎn)化成至少20g/l、更優(yōu)選地至少25g/l和甚至更優(yōu)選地至少30g/l有機化合物、優(yōu)選地琥珀酸。如本文所述的不同產(chǎn)量參數(shù)(“碳產(chǎn)率”或“YP/S”；“比生產(chǎn)率產(chǎn)量”；或“空間-時間-產(chǎn)率(STY)”)是本領(lǐng)域熟知的并且例如由Song和Lee,2006所述那樣測定?！疤籍a(chǎn)率”和“YP/S”(各自以產(chǎn)生的有機化合物的質(zhì)量/消耗的可同化碳源的質(zhì)量表述)在本文中作為同義詞使用。比生產(chǎn)率產(chǎn)量描述每小時和每升發(fā)酵液每g生物質(zhì)產(chǎn)生的產(chǎn)物(如琥珀酸)的量。稱作“DCW”的干細胞重量的量描述了生物化學反應(yīng)中有生物活性的微生物的量。該值作為g產(chǎn)物/gDCW/小時(即ggDCW-1h-1)給出?？臻g-時間-產(chǎn)率(STY)定義為在整個培養(yǎng)時間范圍內(nèi)考慮時在發(fā)酵過程中形成的有機化合物的總量對培養(yǎng)物體積的比率?？臻g-時間-產(chǎn)率也稱作“體積生產(chǎn)率”。在過程步驟II)中，從過程步驟I)中獲得的發(fā)酵液回收有機化合物、優(yōu)選地琥珀酸。通常，回收方法包括步驟：將重組微生物從發(fā)酵液作為所謂“生物質(zhì)”分離。用于取出生物質(zhì)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且包括過濾、沉積和浮選或其組合。因此，生物質(zhì)可以用例如離心機、分離器、傾析器、濾器或在浮選裝置中取出。為了最大限度回收有價值的產(chǎn)物，經(jīng)常建議洗滌生物質(zhì)，例如以滲濾形式洗滌。方法的選擇取決于發(fā)酵液中的生物質(zhì)含量和生物質(zhì)的特性，并且還取決于生物質(zhì)與有機化合物(即有價值產(chǎn)物)的相互作用。在一個實施方案中，可以將發(fā)酵液消毒或巴氏消毒。在又一個實施方案中，濃縮發(fā)酵液。取決于要求，該濃縮可以分批或連續(xù)地進行。應(yīng)當如此選擇壓力和溫度范圍，從而首先不出現(xiàn)產(chǎn)物受損，并且其次必須最少使用裝置和能量。熟練選擇用于多步蒸發(fā)的壓力和溫度水平尤其能夠節(jié)省能量?；厥者^程還可以包括其中進一步純化有機化合物、優(yōu)選地琥珀酸的額外純化步驟。然而，如果有機化合物通過如下文描述的化學反應(yīng)轉(zhuǎn)化成次級有機產(chǎn)物，則取決于反應(yīng)類別和反應(yīng)條件，不必然要求進一步純化有機化合物。為了純化過程步驟II)中獲得的化合物，優(yōu)選地純化琥珀酸，可以例如使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，如結(jié)晶、過濾、電滲析和色譜。在琥珀酸作為有機化合物的情況下，例如，可以通過以下方式分離琥珀酸：通過使用氫氧化鈣、氧化鈣、碳酸鈣或碳酸氫鈣中和并過濾沉淀物，將琥珀酸通過作為琥珀酸鈣產(chǎn)物沉淀來分離。通過用硫酸酸化作用，隨后過濾以移除沉淀的硫酸鈣(石膏)，從沉淀的琥珀酸鈣回收琥珀酸。所產(chǎn)生的溶液可以通過離子交換色譜進一步純化以除去不想要的殘余離子。備選地，如果氫氧化鎂，碳酸鎂或其混合物已經(jīng)用來中和發(fā)酵液，則可以酸化過程步驟I)中獲得的發(fā)酵液以轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中所含的琥珀酸鎂成為酸形式(即琥珀酸)，后者隨后可以通過冷卻酸化的培養(yǎng)基而結(jié)晶。其他合適的純化過程的例子在EP-A-1005562，WO-A-2008/010373，WO-A-2011/082378，WO-A-2011/043443，WO-A-2005/030973，WO-A-2011/123268和WO-A-2011/064151和EP-A-2360137中公開。根據(jù)本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案，該過程還包含過程步驟：III)通過至少一個化學反應(yīng)，將過程步驟I)中獲得的發(fā)酵液內(nèi)所含的有機化合物轉(zhuǎn)化成或?qū)⑦^程步驟II)中獲得的已回收有機化合物轉(zhuǎn)化成與該有機化合物不同的次級有機產(chǎn)物。在琥珀酸作為有機化合物的情況下，優(yōu)選的次級有機產(chǎn)物選自琥珀酸酯及其聚合物、四氫呋喃(THF)、1,4-丁二醇(BDO)、γ-丁內(nèi)酯(GBL)和吡咯烷酮。根據(jù)一個用于產(chǎn)生THF、BDO和/或GBL的優(yōu)選實施方案，這種方法包括：b1)將過程步驟I)或II)中獲得的琥珀酸直接催化氫化成THF和/或BDO和/或GBL或b2)將過程步驟I)或II)中獲得的琥珀酸和/或琥珀酸鹽化學酯化成其相應(yīng)雙低級烷基酯并將所述酯后續(xù)催化氫化成THF和/或BDO和/或GBL。根據(jù)一個用于產(chǎn)生吡咯烷酮的優(yōu)選實施方案，這種方法包括：b)將過程步驟I)或II)中獲得的琥珀酸銨鹽按本身已知的方式化學轉(zhuǎn)化成吡咯烷酮。關(guān)于制備這些化合物的詳情，參考US-A-2010/0159543和WO-A-2010/092155。進一步通過本發(fā)明的修飾微生物用于發(fā)酵產(chǎn)生有機化合物的用途提供了解決一開始所提到問題的促進手段。優(yōu)選的有機化合物是已經(jīng)與本發(fā)明方法相聯(lián)系時提到的那些化合物，琥珀酸是最優(yōu)選的有機化合物。另外，發(fā)酵產(chǎn)生有機化合物、優(yōu)選地琥珀酸的優(yōu)選條件是已經(jīng)與本發(fā)明方法的過程步驟I)相聯(lián)系時描述的那些條件?，F(xiàn)在借助附圖和非限制性例子更詳細地解釋本發(fā)明。圖1顯示質(zhì)粒pSacB(SEQIDNO:5)的示意性圖譜。圖2顯示質(zhì)粒pSacBΔldhA(SEQIDNO:6)的示意性圖譜。圖3顯示質(zhì)粒pSacBΔpflA(SEQIDNO:7)的示意性圖譜。圖4顯示質(zhì)粒pSacBΔfruA(SEQIDNO:8)的示意性圖譜。實施例實施例1：用于轉(zhuǎn)化Basfiasucciniciproducens的一般方法菌株野生型DD1(保藏DSM18541)DD1ΔldhADD1ΔldhAΔfruADD1ΔldhAΔpflADD1ΔldhAΔpflAΔfruADD1ΔfruA表1：實施例中提到的DD1-野生型和突變體的命名使用以下方案，通過電穿孔法，用DNA轉(zhuǎn)化BasfiasucciniciproducensDD1(野生型)：為了制備預培養(yǎng)物，將DD1從冷凍貯存物接種至100ml搖瓶中的40mlBHI(心腦浸液；Becton,DickinsonandCompany)。孵育在37℃；200轉(zhuǎn)/分鐘過夜進行。為了制備主培養(yǎng)物，將100mlBHI置于250ml搖瓶中并用預培養(yǎng)物接種至最終OD(600nm)0.2。孵育在37℃，200轉(zhuǎn)/分鐘進行。在大約0.5、0.6和0.7的OD時收獲細胞，將沉淀物用10％冷甘油在4℃洗滌1次并重懸于2ml10％甘油(4℃)中。將100μl感受態(tài)細胞與2-8μg質(zhì)粒-DNA混合并且在冰上在寬度0.2cm的電穿孔杯中保持2分鐘。電穿孔按以下條件進行：400Ω；25μF；2.5kV(GenePulser,Bio-Rad)。在電穿孔后立即添加1ml冰冷的BHI，并且孵育在37℃進行大約2小時。將細胞鋪種在含5mg/L氯霉素的BHI上并且在37℃孵育2-5天直至轉(zhuǎn)化體的菌落可見。將克隆分離并在含5mg/L氯霉素的BHI上再劃線直至獲得克隆純化。實施例2：缺失構(gòu)建體的產(chǎn)生基于載體pSacB(SEQIDNO:5)構(gòu)建突變/缺失質(zhì)粒。圖1顯示質(zhì)粒pSacB的示意圖。從Basfiasucciniciproducens的染色體DNA通過PCR擴增應(yīng)當缺失的染色體片段的5’-和3’-側(cè)翼區(qū)(各自大約1500bp)，并且使用標準技術(shù)，將它們引入所述載體中。正常情況下，將至少80％的ORF靶向以缺失。以如此方式，構(gòu)建了乳酸脫氫酶ldhA的缺失質(zhì)粒pSacB_δ_ldhA(SEQIDNO:6)、丙酮酸甲酸裂合酶活化酶pflA的缺失質(zhì)粒pSacB_δ_pflA(SEQID.NO.7)和推定性果糖特異性磷酸轉(zhuǎn)移酶fruA的缺失質(zhì)粒pSacB_δ_fruA(SEQIDNo:8)。圖2、圖3和圖4分別顯示質(zhì)粒pSacB_δ_ldhA、pSacB_δ_pflA和pSacB_δ_fruA的示意性圖譜。在pSacB的質(zhì)粒序列(SEQIDNO:5)中，sacB基因含于堿基2380-3801。sacB-啟動子含于堿基3802-4264。氯霉素基因含于堿基526-984。大腸桿菌復制起點(oriEC)含于堿基1477-233(參見圖1)。在pSacB_δ_ldhA的質(zhì)粒序列(SEQIDNO:6)中，與Basfiasucciniciproducens的基因組同源的ldhA基因5’側(cè)翼區(qū)含于堿基1519-2850，而與Basfiasucciniciproducens的基因組同源的ldhA基因3’側(cè)翼區(qū)含于堿基62-1518。sacB基因含于堿基5169-6590。sacB-啟動子含于堿基6591-7053。氯霉素基因含于堿基3315-3773。大腸桿菌復制起點(oriEC)含于堿基4266-5126(參見圖2)。在pSacB_δ_pflA的質(zhì)粒序列(SEQIDNO:7)中，與Basfiasucciniciproducens的基因組同源的pflA基因5’側(cè)翼區(qū)含于堿基1506-3005，而與Basfiasucciniciproducens的基因組同源的pflA基因3’側(cè)翼區(qū)含于堿基6-1505。sacB基因含于堿基5278-6699。sacB-啟動子含于堿基6700-7162。氯霉素基因含于堿基3424-3882。大腸桿菌復制起點(oriEC)含于堿基4375-5235(參見圖3)。在pSacB_δ_fruA的質(zhì)粒序列(SEQIDNO:8)中，與Basfiasucciniciproducens的基因組同源的fruA-基因3’側(cè)翼區(qū)含于堿基1506-3005之間，而與Basfiasucciniciproducens的基因組同源的fruA-基因5’側(cè)翼區(qū)含于堿基6-1505之間。sacB-基因含于堿基5278-6699之間。sacB-啟動子含于堿基6700-7162之間。氯霉素基因含于堿基3424-3882之間。大腸桿菌復制起點(oriEC)含于堿基952-1812之間(參見圖4)。實施例3：產(chǎn)生改進的琥珀酸酯產(chǎn)生菌株a)將BasfiasucciniciproducensDD1用pSacB_delta_ldhA如上文所述轉(zhuǎn)化并“Campbelledin”以產(chǎn)生“Campbellin”菌株。通過產(chǎn)生質(zhì)粒進入Basfiasucciniciproducens基因組的整合事件的條帶的PCR證實轉(zhuǎn)化和整合入Basfiasucciniciproducens基因組中。隨后使用含有蔗糖的瓊脂平板作為反向選擇培養(yǎng)基，對“Campbellin”菌株“Campbelledout”，從而選擇出sacB基因(功能)喪失。因此，將“Campbellin”菌株在25-35ml非選擇性培養(yǎng)基(不含抗生素的BHI)中在37℃，220轉(zhuǎn)/分鐘孵育過夜。隨后將過夜培養(yǎng)物在新鮮制備的含有BHI的蔗糖平板上(10％，無抗生素)劃線并且在37℃孵育過夜(“第一次蔗糖轉(zhuǎn)移”)。從第一次轉(zhuǎn)移獲得的單菌落再次在新鮮制備的含有BHI的蔗糖平板上(10％)劃線并且在37℃孵育過夜(“第二次蔗糖轉(zhuǎn)移”)。重復這個程序直至在蔗糖中最少完成5次轉(zhuǎn)移(“第三、第四、第五次糖轉(zhuǎn)移”)。術(shù)語“第一至第五次蔗糖轉(zhuǎn)移”指在含有sacB-果聚糖-蔗糖酶基因的載體的染色體整合后菌株轉(zhuǎn)移到含有蔗糖和生長培養(yǎng)基的瓊脂平板上，目的在于選出sacB基因和包圍質(zhì)粒序列丟失的菌株。將來自第五次轉(zhuǎn)移平板的單菌落接種到25-35ml非選擇性培養(yǎng)基(不含抗生素的BHI)上并且在37℃，220轉(zhuǎn)/分鐘孵育過夜。將過夜培養(yǎng)物連續(xù)稀釋并鋪種在BHI平板上以獲得孤立的單菌落。通過氯霉素敏感性證實含有野生型狀態(tài)的ldhA基因座或ldhA基因突變/缺失的“Campbelledout”菌株。通過PCR分析鑒定并且證實這些菌株當中的突變/缺失突變體。這導致ldhA-缺失突變體BasfiasucciniciproducensDD1ΔldhA。b)將BasfiasucciniciproducensDD1ΔldhA用pSacB_delta_pflA如上文所述轉(zhuǎn)化并“Campbelledin”以產(chǎn)生“Campbellin”菌株。通過PCR證實轉(zhuǎn)化和整合。隨后如先前所描述將“Campbellin”菌株“Campbelledout”。通過PCR分析鑒定并且證實這些菌株當中的缺失突變體。這導致ldhApflA-雙缺失突變體BasfiasucciniciproducensDD1ΔldhAΔpflA。c)BasfiasucciniciproducensDD1ΔldhAΔpflA用pSacB_δ_fruA如上文所述轉(zhuǎn)化并“Campbelledin”以產(chǎn)生“Campbellin”菌株。通過PCR證實轉(zhuǎn)化和整合。隨后如先前所描述將“Campbellin”菌株“Campbelledout”。通過PCR分析鑒定并且證實這些菌株當中的缺失突變體。這導致ldhApflDfruA-三重缺失突變體BasfiasucciniciproducensDD1ΔldhAΔpflAΔfruA。d)將BasfiasucciniciproducensDD1用pSacB_δ_fruA如上文所述轉(zhuǎn)化并“Campbelledin”以產(chǎn)生“Campbellin”菌株。通過PCR證實轉(zhuǎn)化和整合。隨后如先前所描述將“Campbellin”菌株“Campbelledout”。通過PCR分析鑒定并且證實這些菌株當中的缺失突變體。這導致fruA-缺失突變體BasfiasucciniciproducensDD1ΔfruA。實施例4：基于蔗糖培養(yǎng)DD1和DD1ΔfruADD1-菌株的生產(chǎn)率與突變株DD1ΔfruA的生產(chǎn)率在蔗糖作為碳源存在下比較。利用下文描述的培養(yǎng)基和溫育條件，分析生產(chǎn)率。1.培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基的組成和制備如下表2(培養(yǎng)基CGM)、表3(微量元素溶液1)、表4(維生素溶液1)和表5(培養(yǎng)基LSM_1)中所述。化合物濃度[g/L]酵母提取物(BioSpringer)10.0CaCl2×2H2O0.2MgCl2×6H2O0.2(NH4)2SO42.0NaCl1.0K2HPO43.0MgCO350.0NaHCO38.4葡萄糖52表2：基于葡萄糖培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成(培養(yǎng)基CGM)表3：痕量元素溶液1的組成。表4：維生素溶液1的組成表5：基于蔗糖培養(yǎng)的LSM_1培養(yǎng)基的組成。2.培養(yǎng)和分析為了培養(yǎng)預培養(yǎng)物，來自新鮮培養(yǎng)的BHI-瓊脂平板(在37℃在無氧條件下溫育過夜)的細菌用來接種100ml含有表2中所述的50mlCGM液體培養(yǎng)基連同CO2-氣氛的帶氣密性丁基橡膠瓶塞的血清瓶至OD600＝0.75。將各瓶在37℃和170轉(zhuǎn)/分鐘(振搖直徑：2.5cm)溫育。為了培養(yǎng)主培養(yǎng)物，2.5ml在CGM培養(yǎng)基中的細菌培養(yǎng)物(在11小時溫育后)用來接種100ml含有表5中所述的50mlLSM_1液體培養(yǎng)基連同CO2-氣氛的帶氣密性丁基橡膠瓶塞的血清瓶。在24小時后，通過HPLC(表13和表14中描述HPLC方法)對蔗糖的消耗量和羧酸的產(chǎn)生定量。通過使用分光光度計(Ultrospec3000,AmershamBiosciences，烏普薩拉，瑞典)測量600nm處吸光度(OD600)，測量細胞生長。3.結(jié)果表6中顯示采用DD1和DD1ΔfruA的培養(yǎng)實驗的結(jié)果。基于蔗糖時，fruA的缺失導致顯著增強的琥珀酸濃度和琥珀酸的增強碳產(chǎn)量。表6：基于蔗糖時DD1-菌株和DD1ΔfruA菌株的培養(yǎng)a培養(yǎng)時間b底物(蔗糖)的消耗量c琥珀酸，乳酸，甲酸，乙酸，丙酮酸和乙醇的形成gSA產(chǎn)率(SA/消耗底物的比率)h發(fā)現(xiàn)乙酸，乳酸，蘋果酸，和甲酸的檢測限在給定的HPLC方法中低于0.01g/l實施例5：基于蔗糖培養(yǎng)DD1ΔldhA和DD1ΔldhAΔfruADD1ΔldhA-菌株的生產(chǎn)率與突變株DD1ΔldhAΔfruA的生產(chǎn)率在蔗糖作為碳源存在下比較。利用下文描述的培養(yǎng)基和溫育條件，分析生產(chǎn)率。1.培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基(培養(yǎng)基P)的組成和制備如下表7中所述。表7：基于蔗糖培養(yǎng)的培養(yǎng)基P的組成。2.培養(yǎng)和分析為了培養(yǎng)主培養(yǎng)物，來自新鮮培養(yǎng)的BHI-瓊脂平板(在37℃在無氧條件下溫育過夜)的細菌用來接種100ml含有表7中所述的50ml液體培養(yǎng)基(培養(yǎng)基P)連同CO2-氣氛的帶氣密性丁基橡膠瓶塞的血清瓶至OD600＝0.75。將各瓶在37℃和170轉(zhuǎn)/分鐘(振搖直徑：2.5cm)溫育。在24小時后，通過HPLC(表13和表14中描述HPLC方法)對蔗糖的消耗量和羧酸的產(chǎn)生定量。通過使用分光光度計(Ultrospec3000,AmershamBiosciences，烏普薩拉，瑞典)測量600nm處吸光度(OD600)，測量細胞生長。3.結(jié)果表8中顯示采用DD1ΔldhA和DD1ΔldhAΔfruA的培養(yǎng)實驗的結(jié)果。基于蔗糖時，fruA的缺失導致顯著增強的琥珀酸濃度和琥珀酸的增強碳產(chǎn)量。表8：基于蔗糖時DD1ΔldhAΔpflA-菌株和DD1ΔldhAΔpflAΔfruA-菌株的培養(yǎng)a培養(yǎng)時間b底物(蔗糖)的消耗量c琥珀酸，乳酸，甲酸，乙酸，丙酮酸和乙醇的形成gSA產(chǎn)率(SA/消耗底物的比率)h發(fā)現(xiàn)乙酸，乳酸，蘋果酸，和甲酸的檢測限在給定的HPLC方法中低于0.01g/l實施例6：基于蔗糖培養(yǎng)DD1ΔldhAΔpflA和DD1ΔldhAΔpflAΔfruADD1ΔldhAΔpflA-菌株的生產(chǎn)率與突變株DD1ΔldhAΔpflAΔfruA的生產(chǎn)率在蔗糖作為碳源存在下比較。利用下文描述的培養(yǎng)基和溫育條件，分析生產(chǎn)率。1.培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基(LSM_2)的組成和制備如下表9、表10和表11中所述。表9：痕量元素溶液2的組成。表10：維生素溶液2的組成。表11：基于蔗糖培養(yǎng)的LSM_2培養(yǎng)基的組成。2.培養(yǎng)和分析為了培養(yǎng)主培養(yǎng)物，來自新鮮培養(yǎng)的BHI-瓊脂平板(在37℃在無氧條件下溫育過夜)的細菌用來接種100ml含有表11中所述的50ml液體培養(yǎng)基LSM_2連同CO2-氣氛的帶氣密性丁基橡膠瓶塞的血清瓶至OD600＝0.75。將各瓶在37℃和160轉(zhuǎn)/分鐘(振搖直徑：2.5cm)溫育。在24小時后，通過HPLC(表13和表14中描述HPLC方法)對蔗糖的消耗量和羧酸的產(chǎn)生定量。通過使用分光光度計(Ultrospec3000,AmershamBiosciences，烏普薩拉，瑞典)測量600nm處吸光度(OD600)，測量細胞生長。3.結(jié)果表12中顯示采用DD1ΔldhAΔpflA和DD1ΔldhAΔpflAΔfruA的培養(yǎng)實驗的結(jié)果?；谡崽菚r，fruA的缺失導致顯著增強的琥珀酸濃度和琥珀酸的增強碳產(chǎn)量。表12：基于蔗糖時DD1ΔldhAΔpflA-菌株和DD1ΔldhAΔpflAΔfruA-菌株的培養(yǎng)a培養(yǎng)時間b底物(蔗糖)的消耗量c琥珀酸，乳酸，甲酸，乙酸，丙酮酸和乙醇的形成gSA產(chǎn)率(SA/消耗底物的比率)h發(fā)現(xiàn)乙酸，乳酸，蘋果酸，和甲酸的檢測限在給定的HPLC方法中低于0.01g/l表13：分析琥珀酸、甲酸、乳酸、乙酸、丙酮酸和乙醇的HPLC方法(ZX-THF50)表14：分析蔗糖的HPLC方法(Fast-CH)序列SEQIDNO：1(菌株DD1的16SrDNA的核苷酸序列)tttgatcctggctcagattgaacgctggcggcaggcttaacacatgcaagtcgaacggtagcgggaggaaagcttgctttctttgccgacgagtggcggacgggtgagtaatgcttggggatctggcttatggagggggataacgacgggaaactgtcgctaataccgcgtaatatcttcggattaaagggtgggactttcgggccacccgccataagatgagcccaagtgggattaggtagttggtggggtaaaggcctaccaagccgacgatctctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatggggggaaccctgatgcagccatgccgcgtgaatgaagaaggccttcgggttgtaaagttctttcggtgacgaggaaggtgtttgttttaataggacaagcaattgacgttaatcacagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcgagcgttaatcggaataactgggcgtaaagggcatgcaggcggacttttaagtgagatgtgaaagccccgggcttaacctgggaattgcatttcagactgggagtctagagtactttagggaggggtagaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaataccgaaggcgaaggcagccccttgggaagatactgacgctcatatgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgcggtaaacgctgtcgatttggggattgggctttaggcctggtgctcgtagctaacgtgataaatcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctactcttgacatccagagaatcctgtagagatacgggagtgccttcgggagctctgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcatgtaaagatgggaactcaaaggagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgagtagggctacacacgtgctacaatggtgcatacagagggcggcgataccgcgaggtagagcgaatctcagaaagtgcatcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgcaaatcagaatgttgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgtaccagaagtagatagcttaaccttcggggggggcgtttaccacggtatgattcatgactggggtgaagtcgtaacaaggtaaccgtaggggaacctgcggSEQIDNO：2(菌株DD1的23SrDNA的核苷酸序列)agtaataacgaacgacacaggtataagaatacttgaggttgtatggttaagtgactaagcgtacaaggtggatgccttggcaatcagaggcgaagaaggacgtgctaatctgcgaaaagcttgggtgagttgataagaagcgtctaacccaagatatccgaatggggcaacccagtagatgaagaatctactatcaataaccgaatccataggttattgaggcaaaccgggagaactgaaacatctaagtaccccgaggaaaagaaatcaaccgagattacgtcagtagcggcgagcgaaagcgtaagagccggcaagtgatagcatgaggattagaggaatcggctgggaagccgggcggcacagggtgatagccccgtacttgaaaatcattgtgtggtactgagcttgcgagaagtagggcgggacacgagaaatcctgtttgaagaaggggggaccatcctccaaggctaaatactcctgattgaccgatagtgaaccagtactgtgaaggaaaggcgaaaagaaccccggtgaggggagtgaaatagaacctgaaaccttgtacgtacaagcagtgggagcccgcgagggtgactgcgtaccttttgtataatgggtcagcgacttatattatgtagcgaggttaaccgaataggggagccgaagggaaaccgagtcttaactgggcgtcgagttgcatgatatagacccgaaacccggtgatctagccatgggcaggttgaaggttgggtaacactaactggaggaccgaaccgactaatgttgaaaaattagcggatgacctgtggctgggggtgaaaggccaatcaaaccgggagatagctggttc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