抗生素抗性是藥物抗性形式，由此盡管暴露于抗生素藥物，微生物亞群例如細(xì)菌物種菌株仍可以存活且繁殖。它是關(guān)于個體患者的嚴(yán)重健康關(guān)注以及重大公共衛(wèi)生問題。細(xì)菌感染的及時治療需要得自患者的臨床分離物有關(guān)抗生素抗性的分析，以便選擇有效治療。

抗菌藥物抗性（ADR）代表重大的健康負(fù)擔(dān)。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的抗生素抗性全球監(jiān)測報告，ADR在歐洲每年導(dǎo)致25,000例死亡，并且在美國每年導(dǎo)致23,000例死亡。在歐洲，250萬額外住院日導(dǎo)致15億歐元的社會成本。在美國，2百萬疾病的直接成本導(dǎo)致200億美元直接成本?？偝杀竟烙嫺叩枚啵箛鴥?nèi)生產(chǎn)總值（GDP）減少最高達(dá)1.6%。

目前，抗性/敏感性測試通過下述進(jìn)行：獲得可疑細(xì)菌的培養(yǎng)物，對其實(shí)施不同抗生素藥物方案，且測定在哪種情況下細(xì)菌在某一物質(zhì)的存在下不生長。在這種情況下，細(xì)菌是非抗性的（即對抗生素藥物敏感），并且療法可施用于分別的患者。文件US7335485描述了測定微生物的抗生素敏感性的方法，其中生物在待測試的抗生素藥物的存在下進(jìn)行培養(yǎng)。最近以來，靈敏技術(shù)如質(zhì)譜法應(yīng)用于測定抗性，但這仍需要在待測試的抗生素藥物的存在下培養(yǎng)待測試的微生物。另外，在所有技術(shù)中，待測試的每種微生物必須針對個別抗生素藥物或藥物組合進(jìn)行測試，需要大量、耗時和繁瑣的測試。

已知藥物抗性可以與遺傳多態(tài)性相關(guān)。這適用于病毒，其中抗性測試是成熟的臨床實(shí)踐（例如HIV基因分型）。最近以來，已顯示抗性還在細(xì)菌和甚至更高等的生物例如人中具有遺傳原因，其中針對某些細(xì)胞生長抑制劑的腫瘤抗性可以與基因組突變關(guān)聯(lián)。

Wozniak等人（BMC Genomics 2012，13（Suppl 7）:S23）公開了基于基因型和表型數(shù)據(jù)，在金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）中的藥物抗性的遺傳決定因子。Stoesser等人公開了使用全基因組序列數(shù)據(jù)，關(guān)于大腸桿菌（Escherichia coli）和肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）分離物的抗微生物敏感性的預(yù)測（J Antimicrob Chemother 2013；68: 2234-2244）。

大腸桿菌（大腸桿菌（E. coli））是一般例如在哺乳動物的下胃腸道中發(fā)現(xiàn)的革蘭氏陰性、兼性厭氧、桿狀細(xì)菌。雖然埃希氏桿菌屬的許多物種是無害的，但一些物種的一些菌株在人中是致病性的，引起泌尿道感染、胃腸疾病、以及廣泛范圍的其他致病性狀況。大腸桿菌導(dǎo)致了這些致病性狀況中的大多數(shù)。

存在快速有效的抗生素抗性測試的需要。

這種需要通過本發(fā)明獲得了解決。

發(fā)明概述

本發(fā)明人進(jìn)行了關(guān)于對抗生素藥物抗性的大腸桿菌細(xì)菌的基因組的廣泛研究，并且發(fā)現(xiàn)與野生型大腸桿菌的顯著差異?；谠撔畔?，目前能夠提供基于個別基因或核苷酸水平上的突變，關(guān)于大腸桿菌菌株的抗性模式的詳細(xì)分析。這種分析涉及針對單一抗生素藥物的抗性以及其中的簇的鑒定。這不僅允許測定對單一抗生素藥物的抗性，還允許測定對抗生素類別例如內(nèi)酰胺或喹諾酮類抗生素，或甚至對所有相關(guān)抗生素藥物的抗性。

因此，本發(fā)明將相當(dāng)大地促進(jìn)選擇適當(dāng)?shù)目股厮幬镉糜谥委熁颊咧械拇竽c桿菌感染，并且因此將在很大程度上改善診斷和治療的質(zhì)量。

根據(jù)第一個方面，本發(fā)明涉及測定屬于大腸桿菌種的細(xì)菌微生物抗生素抗性概況的方法，其包括下述步驟：

a）提供含有或疑似含有細(xì)菌微生物的樣品；

b）測定在細(xì)菌微生物的至少一種基因中突變的存在，所述至少一種基因選自表4中列出的基因；

其中所述突變的存在指示對抗生素藥物的抗性。

表4在下文描述：

參考菌株大腸桿菌K12亞株DH10B，測試這些基因中突變的存在與否（關(guān)于更詳細(xì)的信息還參見下文和實(shí)施例1）。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，步驟b）包括測定在選自表4的至少兩種或更多種基因中突變的存在，并且其中所述在至少兩種基因中突變的存在指示對抗生素藥物的抗性。

相比僅測試單一基因或突變體，幾個變體位置的組合可以改善預(yù)測準(zhǔn)確度，且進(jìn)一步減少受其他因素影響的假陽性發(fā)現(xiàn)。因此，特別優(yōu)選的是測定在選自表4的2、3、4、5、6、7、8或9種（或更多種）基因中突變的存在。

在另外的優(yōu)選實(shí)施方案中，本文方法包括在步驟b）中測定在選自表5中列出的基因的至少一種基因中突變的存在，并且其中所述至少一種基因中突變的存在指示對抗生素藥物的抗性。

根據(jù)表5的基因之前從未在大腸桿菌細(xì)菌的抗生素抗性的背景下得到描述。它們可以單獨(dú)或與本文公開的其他基因組合用于測定大腸桿菌的抗生素藥物抗性。

對于大腸桿菌，識別出了86個超高度顯著的遺傳位置和藥物抗性對（表2）。86個組合對應(yīng)于35個遺傳位置，因?yàn)槲稽c(diǎn)通常對于不止一種單一藥物是顯著的。最重要的是，位點(diǎn)分別位于9種基因上：hofB、allA、mukB、ymdC、potB、ycgK、ycgB、valS、yjjJ。這些基因因此看起來對于抗生素抗性/敏感性是關(guān)鍵的。識別出的突變均導(dǎo)致氨基酸改變，導(dǎo)致在相應(yīng)位置上的氨基酸交換或新終止密碼子的產(chǎn)生。關(guān)于更詳細(xì)的信息，參考下文實(shí)施例1。

更一般地，本發(fā)明在另外的方面涉及測定屬于大腸桿菌種的細(xì)菌微生物對抗生素藥物的抗性或敏感性的方法，其包括：

- 提供含有或疑似含有屬于大腸桿菌種的細(xì)菌微生物的樣品；

- 由所述樣品測定在選自hofB、allA、mukB、ymdC、potB、ycgK、ycgB、valS和yjjJ的至少一種基因的核酸序列信息；以及

- 基于所述遺傳信息的測定，測定對抗生素藥物的抗性或敏感性。

在本發(fā)明的另外的實(shí)施方案中，測定在選自hofB、allA、mukB、ymdC、potB、ycgK、ycgB、valS和yjjJ的至少一種基因中突變的存在。因此，可以分析在這些基因的至少一種或2、3、4、5、6、7、8或9種中突變的存在。

在另外的實(shí)施方案中，測定在選自下表6的至少一種基因中突變的存在。更優(yōu)選地，測定表6中指示的確切氨基酸交換。

令人驚訝的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌的功能上相似蛋白質(zhì)中存在突變重疊。有趣的是，當(dāng)考慮與至少一種藥物顯著相關(guān)的蛋白質(zhì)時，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌以及肺炎克雷伯氏菌中受影響的1,746種蛋白質(zhì)的重疊（相同正式名稱和在成對比較中在BLAST中超過80%陽性）。將分析延伸至這些蛋白質(zhì)中的確切AA交換，本發(fā)明人仍檢測到在兩種生物體中相等的55個突變位置的重疊。因此，上述基因可能構(gòu)成用于測定大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌微生物兩者中的抗生素抗性模式的有價值的基礎(chǔ)。

根據(jù)本發(fā)明的一個任選方面，核酸序列信息可以是對在至少一種基因中的單一位置處的單一核苷酸存在的測定。

因此，本發(fā)明包括其中檢測在單一核苷酸位置處的單核苷酸多態(tài)性或突變的存在的方法。

例如，這可以在選自hofB、allA、mukB、ymdC、potB、ycgK、ycgB、valS和yjjJ的至少一種基因中完成。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個任選方面，突變是選自表2中列出的突變的突變（參見下文實(shí)施例1）。本發(fā)明因此還包括測定關(guān)于屬于大腸桿菌種的細(xì)菌微生物的抗生素抗性概況的方法，其包括下述步驟：

a）提供含有或疑似含有細(xì)菌微生物的樣品；

b）測定在如表2中識別出的至少一個位置中突變的存在；

其中所述突變的存在指示對抗生素藥物的抗性。

測定可以基于表2中識別出的1、2、3、4、5、6、7個和最高達(dá)35個遺傳位置進(jìn)行。

一般地，根據(jù)本發(fā)明的方法涉及測定大腸桿菌對一種或多種抗生素藥物的抗性。這些藥物包括但不限于選自下述的抗生素藥物：氨芐青霉素舒巴坦（A.S.）、氨芐青霉素（AM）、阿莫西林克拉維酸鹽（AUG）、氨曲南（AZT）、頭孢曲松（CAX）、頭孢他啶（CAZ）、頭孢噻肟（CFT）、頭孢吡肟（CPM）、環(huán)丙沙星（CP）、厄他培南（ETP）、左氧氟沙星（LVX）、頭孢呋辛（CRM）、哌拉西林他唑巴坦（P/T）、甲氧芐啶磺胺甲噁唑（T/S）、妥布霉素（TO）、慶大霉素（GM）、頭孢唑啉（CFZ）、頭孢噻吩（CF）、亞胺培南（IMP）、美羅培南（MER）和四環(huán)素（TE）。還參見表1。

本發(fā)明人已驚訝地發(fā)現(xiàn)某些基因中的突變不僅指示對一種單一抗生素藥物的抗性，還指示對含有若干種藥物的組的抗性。

例如，事實(shí)證明在內(nèi)酰胺類抗生素組的情況下，應(yīng)測定在下述基因中突變的存在：chbG、eutQ、flgL、gudD、gyrA、ldrA、menE、murB、murP、nepI、parC、pphB、ptrB、rhaD、ydiU、yegE、yegI、yfbL、yfiK、ygcR、ygiF、ygjM、yohG和/或yrfB，并且指示針對該組抗生素的抗性的存在。

內(nèi)酰胺類抗生素組優(yōu)選包括A.S.、AM、AUG、AZT、CFZ、CPE、CFT、CAZ、CAX、CRM、CF、CP、IMP、MER、ETP和/或P/T。這些識別出的基因的p值閾值為≤ 10^-45。

在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是上述測定是基于該組的單一基因或2、3、4等種基因完成的，然而，優(yōu)選地是參考菌株K12亞株DH10B，測定所有這些基因中的突變（關(guān)于進(jìn)一步信息還參見下文）。

在另外的實(shí)施方案中，抗生素藥物選自喹諾酮或氨基糖苷類抗生素，并且測定在下述基因中突變的存在：agaD、chbG、eutE、eutQ、gcvP、gspO、gyrA、livG、menE、nepI、parC、speC、tiaE、torZ、uidB、yegE、yegI、yejA、ygcU、ygfZ、ygiF、ygjM、yjjU、yjj 、ymdC、ypdB、yqjA和/或ytfG。

喹諾酮和氨基糖苷類抗生素優(yōu)選自CP、LVX、GM和TO。

令人驚訝的是，有關(guān)基因關(guān)于對喹諾酮和氨基糖苷類抗生素的抗性是完全重疊的；這些基因的p值閾值為< 10^-53。另外，在此處，在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是測定是僅基于該組中的單一基因或者2、3、4種或更多種基因完成的，然而，優(yōu)選地是參考菌株K12亞株DH10B，測定所有這些基因中的突變。

在另外的實(shí)施方案中，抗生素藥物選自四環(huán)素，并且測定在下述基因中的至少一種或多種中突變的存在：astE、chbG、eutQ、flgL、gudD、gyrA、hemF、hypF、kdpE、ldrA、menE、murB、murP、nepI、ompC、parC、pphB、ptrB和/或rhaD。p值閾值為< 10^-47。

在仍另外的實(shí)施方案中，抗生素藥物選自甲氧芐啶磺胺甲噁唑，并且測定在下述基因中的至少一種或多種中突變的存在：astE、chbG、eutQ、flgL、gudD、gyrA、ldrA、menE、murB、nepI、parC、ycjX、ydiU、yegE、yfiK、ygcR、ygiF和/或yrfB。p值閾值為< 10^-48。

在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括測定突變，其中所述突變選自表7中列出的突變。表7在下文中描述：

本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)除指示針對抗生素的抗性的上述基因之外，單核苷酸多態(tài)性（= SNP's）也可以對于針對確定的抗生素藥物的抗性的存在具有高度意義。在核苷酸水平上的這些多態(tài)性分析可以進(jìn)一步改善且加速大腸桿菌中對抗生素的藥物抗性的測定。

例如，針對抗生素藥物AM的大腸桿菌抗性可以通過在以下核苷酸位置的至少一個，例如1、2、3、4、5或6個中的單核苷酸多態(tài)性的存在進(jìn)行測定：2428183、4525576、1684413、4636902、1181357、206427。

在一個實(shí)施方案中，抗生素藥物是A/S，并且檢測在以下核苷酸位置的至少一個，例如1、2或3個中的SNP：2428183、4054212、1974644。

在另外的實(shí)施方案中，抗生素藥物是AUG，并且檢測在以下核苷酸位置中的突變：2463877。

關(guān)于針對抗生素藥物AZT的抗性，檢測在下述核苷酸位置的至少一個中的突變：2428183、1615473。

在仍另外的實(shí)施方案中，抗生素藥物是CAX，并且檢測在以下核苷酸位置的至少一個中的突變：2428183、1615473。

針對抗生素藥物CFT、CP、CPE、CRM、GM、LVX、TO、T/S或CAZ的抗性可以通過核苷酸位置2428183中的突變進(jìn)行檢測。

當(dāng)抗生素藥物是ETP時，檢測在以下核苷酸位置的至少一個，例如1、2、3或4個中的突變：2052365、2233638、4553471、2565236。

在另外的實(shí)施方案中，抗生素藥物是P/T，并且檢測在下述核苷酸位置的至少一個，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14個中的突變：2233638、2216164、2725302、1567286、2755319、319290、3240296、1517573、2178525、2924554、1516808、37032、1368519、4575887。

優(yōu)選地，根據(jù)圖5-20的決策圖測試針對相應(yīng)的抗生素藥物的抗性。

決策圖或“決策樹”是用于預(yù)測任務(wù)（例如分類）的樹狀圖?？紤]到由具有特征值（任何測量，此處SNP）的樣品數(shù)目以及類別標(biāo)記（此處針對某一藥物的抗性/非抗性）組成的數(shù)據(jù)集，決策樹對由其特征值推斷樣品類別標(biāo)記的決策過程進(jìn)行建模。

為了構(gòu)建模型，使用給定數(shù)據(jù)（如上所述）：在所有特征（SNP）及其陽性值（DNA堿基A、C、T和G）中，選擇實(shí)現(xiàn)就給定樣品標(biāo)記而言的最佳樣品分離的特征值。理想地，它將是其關(guān)于非抗性樣品的值不同于抗性樣品的SNP。所選擇的特征值作為樹的根（第一樹節(jié)點(diǎn)，通常在頂部處描繪），并且樣品根據(jù)該特征拆分，即具有該特征值的樣品和具有另一值的樣品。所得到的樣品亞集形成新節(jié)點(diǎn)，并且對于其中每一種分開重復(fù)特征選擇和拆分過程。如果滿足特定標(biāo)準(zhǔn)，則該程序停止（例如未實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步改善或最大限度樹尺寸）。

使用的圖形表示如下定義：

樹根始終在頂部處描繪。每個節(jié)點(diǎn)含有下述信息：

? 它的特征及其值在節(jié)點(diǎn)下描繪，例如SNP 2428183 = G。

? 類別標(biāo)記：0 = 非抗性，1 = 抗性。

? 類別分布：該節(jié)點(diǎn)中包含的屬于類別0或1的樣品比例。

? 在該節(jié)點(diǎn)中包含的樣品比例（w.r.t.至用于構(gòu)建樹的樣品數(shù)目）。

? 顏色：綠色 = 0，藍(lán)色 = 1，顏色越強(qiáng)，所選擇的類別標(biāo)記的確定性越高。

一般地，模型在所謂的訓(xùn)練集上進(jìn)行構(gòu)建，并且它的預(yù)測力在所謂的測試集上進(jìn)行測試（以評價關(guān)于不可見數(shù)據(jù)的模型性能）。兩個數(shù)據(jù)集均應(yīng)是獨(dú)立的，并且沒有交點(diǎn)。然而，如果可用數(shù)據(jù)集不夠大以形成足夠大的訓(xùn)練和測試數(shù)據(jù)集，則我們應(yīng)用稱為k倍交叉驗(yàn)證（CV）的程序：我們將我們的數(shù)據(jù)集分成相等大小的k個亞集，隨后k個亞集各自作為測試數(shù)據(jù)使用一次，并且剩余部分用作訓(xùn)練數(shù)據(jù)。最終樹在整個數(shù)據(jù)集上進(jìn)行構(gòu)建，因此CV僅用于估計最終模型的性能。

新樣品的分類如下工作：

? 從樹根處開始：檢查樣品中根屬性的值。如果值等于根值，則去往下一個節(jié)點(diǎn)左側(cè)。否則，去往右側(cè)。

? 檢查樣品中的目前節(jié)點(diǎn)屬性的值，并且再次決定它是去往左側(cè)還是右側(cè)。等等。

? 如果處在葉節(jié)點(diǎn)（末端節(jié)點(diǎn)，沒有外出邊緣的節(jié)點(diǎn)），則該過程停止。樣品獲得與該葉節(jié)點(diǎn)相同的標(biāo)記。

根據(jù)本發(fā)明的一個任選方面，檢測到的突變是導(dǎo)致衍生自相應(yīng)基因的多肽中改變的氨基酸序列的突變，檢測到的突變位于所述相應(yīng)基因中。根據(jù)該方面，檢測到的突變因此導(dǎo)致截短形式的多肽（其中新的終止密碼子通過突變產(chǎn)生），或具有在相應(yīng)位置處的氨基酸交換的突變形式的多肽。

根據(jù)本發(fā)明的一個任選方面，測定氨基酸序列信息或突變的存在包括測定至少一種基因的部分序列或整個序列。

根據(jù)本發(fā)明的一個任選方面，測定核酸序列信息或突變的存在包括測定所述細(xì)菌微生物的基因組的部分或整個序列，其中所述基因組的部分或整個序列包含所述至少一種基因的至少部分序列。

根據(jù)本發(fā)明的一個任選方面，樣品是患者樣品（臨床分離物）。

根據(jù)本發(fā)明的一個任選方面，測定核酸序列信息或突變的存在包括使用下一代測序或高通量測序方法。根據(jù)本發(fā)明的這一方面的一個優(yōu)選的另外的方面，通過使用下一代測序或高通量測序方法測定細(xì)菌生物的部分或整個基因組序列。

根據(jù)本發(fā)明的一個任選方面，本發(fā)明的方法還包括測定針對2、3、4、5或6種抗生素藥物的抗性。

在另外的方面，本發(fā)明涉及測定患者中的抗生素抗性大腸桿菌感染的診斷方法，其包括下述步驟：

a）獲得或提供來自患者的含有或疑似含有大腸桿菌的樣品；

b）測定如上所述的至少一種基因中至少一個突變的存在，其中所述至少一個突變的存在指示所述患者中的抗生素抗性大腸桿菌感染。

在仍另外的方面，本發(fā)明涉及治療患有抗生素抗性大腸桿菌感染的患者的方法：

a）獲得或提供來自患者的含有或疑似含有大腸桿菌的樣品；

b）測定如上所述的至少一種基因中至少一個突變的存在，其中所述至少一個突變的存在指示對一種或多種抗生素藥物的抗性；

c）識別所述至少一種或多種抗生素藥物；

d）選擇不同于步驟c）中識別出的那些且適合于治療大腸桿菌感染的一種或多種抗生素藥物；以及

e）用所述一種或多種抗生素藥物治療患者。

根據(jù)一個優(yōu)選實(shí)施方案，患者是脊椎動物，更優(yōu)選哺乳動物且最優(yōu)選人類患者。

關(guān)于抗生素藥物的劑量，參考人和獸醫(yī)學(xué)中確定的藥理學(xué)原則。例如，F(xiàn)orth，Henschler，Rummel "Allgemeine und spezielle Pharmakologie und Toxikologie"，第9版，2005可以用作指南。關(guān)于即用型藥劑的配制，參考"Remington，The Science and Practice of Pharmacy"，第22版，2013。

定義

除非另有定義，否則本文使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。

術(shù)語“核酸分子”指具有確定序列的多核苷酸分子。它包含DNA分子、RNA分子、核苷酸類似物分子及其組合和衍生物，例如具有摻入的核苷酸類似物或cDNA的DNA分子或RNA分子。

術(shù)語“核酸序列信息”指可以來源于核酸分子的序列的信息，例如序列自身或與參考序列相比較在序列中的變異。

術(shù)語“突變”指與參考序列相比較在序列中的變異。此類參考序列可以是在占優(yōu)勢的野生型生物或參考生物，例如確定和已知的細(xì)菌菌株或亞株中測定的序列。突變例如是一個或多個核苷酸的缺失、一個或多個核苷酸的插入、或者一個或多個核苷酸的置換、一個核苷酸或多個核苷酸序列的復(fù)制、一個核苷酸或多個核苷酸的序列的易位、且特別是單核苷酸多態(tài)性（SNP）。

在本發(fā)明的上下文中，“樣品”是包含來自細(xì)菌微生物的核酸分子的樣品。樣品的例子是：細(xì)胞、組織、體液、活組織檢查標(biāo)本、血液、尿液、唾液、痰、血漿、血清、細(xì)胞培養(yǎng)上清液、拭子樣品及其他。

被稱為下一代測序的新的和高度有效的測序核酸的方法已拓展了大規(guī)?；蚪M分析的可能性。術(shù)語“下一代測序”或“高通量測序”指高通量測序技術(shù)，其使測序過程并行化，一次產(chǎn)生數(shù)千或數(shù)百萬個序列。例子包括大規(guī)模平行簽名測序（MPSS）、聚合酶克隆測序、454焦磷酸測序、Illumina（Solexa）測序、SOLiD測序、離子半導(dǎo)體測序、DNA納米球測序、Helioscope（TM）單分子測序、單分子SMRT（TM）測序、單分子實(shí)時（RNAP）測序、納米孔DNA測序。

在舉例詳細(xì)描述本發(fā)明之前，應(yīng)理解本發(fā)明并不限于本文所述方法的過程步驟的特定組分部分，因?yàn)榇祟惙椒梢愿淖?。還應(yīng)理解本文使用的術(shù)語僅用于描述特定實(shí)施方案的目的，并且不預(yù)期是限制性的。必須指出如說明書和所附權(quán)利要求中使用的，單數(shù)形式“一個”、“一種”和“該/所述”包括單數(shù)和/或復(fù)數(shù)所指物，除非上下文另有明確說明。例如，如本文使用的，術(shù)語“一個/種”可以理解為一個單一實(shí)體或“一個或多個/一種或多種”實(shí)體的含義。還應(yīng)理解復(fù)數(shù)形式包括單數(shù)和/或復(fù)數(shù)所指物，除非上下文另有明確說明。此外，應(yīng)理解在給出由數(shù)值界定的參數(shù)范圍的情況下，范圍視為包括這些極限值。

圖例

圖1-4涉及下文實(shí)施例2。

圖1：用于計算Fisher精確檢驗(yàn)，并且測量準(zhǔn)確度、靈敏度、特異性、陽性預(yù)測值（PPV）和陰性預(yù)測值（NPV）的示例性列聯(lián)表。針對氨基酸交換S83L（GyrA）和環(huán)丙沙星給出數(shù)字。

圖2：關(guān)于在GyrA（S83，D87）和ParC（S80）中不具有突變、在GyrA而非ParC中具有一個突變、在GyrA而非ParC中具有兩個突變或具有全部三個突變的樣品的環(huán)丙沙星的平均MIC值概述。

圖3：小圖A：具有最高數(shù)目的顯著位點(diǎn)的基因的條形圖。小圖B. 詳述具有與至少3種藥物關(guān)聯(lián)的最高位點(diǎn)數(shù)目的基因的條形圖。小圖C. 顯示根據(jù)基因中的顯著位點(diǎn)總數(shù)目，關(guān)于每種基因與至少3種藥物關(guān)聯(lián)的顯著位點(diǎn)數(shù)目的散點(diǎn)圖。著色基因代表具有最高絕對數(shù)目的那些（yfaL、yehL、YjgL）），具有與至少3種藥物關(guān)聯(lián)的更高抗性頻率的那些（yjgN）和在至少3種藥物中具有較低顯著位點(diǎn)的基因（fhuA、yeeJ）。小圖D. 連同關(guān)于yigN的基因圖。沿遺傳序列的顯著位點(diǎn)作為點(diǎn)呈現(xiàn)，y軸顯示對于相應(yīng)位點(diǎn)顯著的藥物類別數(shù)目。下面顯示了所謂的跨膜蛋白質(zhì)的蛇形圖，指出了受影響的氨基酸。

圖4：小圖A：顯示作為矩形的藥物和具有更高或更低覆蓋率的基因的網(wǎng)絡(luò)圖解，其中針對相應(yīng)藥物的抗性以圓圈顯示。mmuP、mmuM、yiel、insN-1對應(yīng)于在抗性分離物的情況下的更高讀出計數(shù)，而綠色基因?qū)?yīng)于更低覆蓋率。小圖B和C：兩個示例性沿染色體圖。每個樣品由線表示，黑線對應(yīng)于非抗性分離物，并且灰線對應(yīng)于抗性分離物。

圖5：關(guān)于氨芐青霉素的決策圖。

圖6：關(guān)于氨芐青霉素舒巴坦的決策圖。

圖7：關(guān)于阿莫西林克拉維酸鹽的決策圖。

圖8：關(guān)于氨曲南的決策圖。

圖9：關(guān)于頭孢曲松的決策圖。

圖10：關(guān)于頭孢他啶的決策圖。

圖11：關(guān)于頭孢噻肟的決策圖。

圖12：關(guān)于環(huán)丙沙星的決策圖。

圖13：關(guān)于頭孢吡肟的決策圖。

圖14：關(guān)于頭孢呋辛的決策圖。

圖15：關(guān)于厄他培南的決策圖。

圖16：關(guān)于慶大霉素的決策圖。

圖17：關(guān)于左氧氟沙星的決策圖。

圖18：關(guān)于哌拉西林他唑巴坦的決策圖。

圖19：關(guān)于妥布霉素的決策圖。

圖20：關(guān)于甲氧芐啶磺胺甲噁唑的決策圖。

實(shí)施例

實(shí)施例1

此處，識別出了獨(dú)特的基因集合，其允許測定細(xì)菌微生物對常用抗生素藥物的抗性。

得自150個臨床分離物的細(xì)菌樣品的獨(dú)特隊列使用高通量測序進(jìn)行測序，以便理解遺傳抗性機(jī)制。平行地，應(yīng)用了使用21種藥物或藥物組合的常規(guī)抗性測試（表1）。

表1：抗生素藥物

將待測試的大腸桿菌菌株接種到瓊脂板上，并且在生長條件下溫育24小時。隨后，挑選菌落并且在生長培養(yǎng)基中在給定抗生素藥物的存在下在稀釋序列中在生長條件下溫育16-20小時。細(xì)菌生長通過觀察濁度進(jìn)行測定。

接下來尋找與表型抗性測試的結(jié)果高度關(guān)聯(lián)的突變。

對于測序，使用Nextera文庫制備來制備樣品，然后使用Illuminat HiSeq 2500系統(tǒng)的多路測序，成對末端測序。數(shù)據(jù)用BWA進(jìn)行作圖（Li H.和Durbin R.（2010）Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler Transform. Bioinfor-matics，Epub . [PMID: 20080505] ），并且使用samtools調(diào)用SNP（Li H.*，Handsaker B.*，Wysoker A.，F(xiàn)ennell T.，Ruan J.，Homer N.，Marth G.，Abecasis G.，Durbin R. and 1000 Ge-nome Project Data Processing Subgroup（2009）The Sequence alignment/map（SAM）format and SAMtools. Bioinformatics ，25，2078-9. [PMID: 19505943] ）。

參考序列得自大腸桿菌菌株K-12亞株DH10B：

LOCUS CP000948 4686137 bp DNA circu-lar BCT 05-JUN-2008

DEFINITION Escherichia coli str. K12 substr. DH10B，complete genome .

ACCESSION CP000948

VERSION CP000948.1 GI:169887498

DBLINK BioProject: PRJNA20079

KEYWORDS

SOURCE Escherichia coli str. K-12 substr. DH10B

ORGANISM Escherichia coli str. K-12 substr. DH10B

Bacteria；Proteobacteria；Gammaproteobacteria；Enterobacteriales ；Enterobacteriaceae ；Escherichia.

REFERENCE 1（bases 1 to 4686137）

AUTHORS Durfee,T.，Nelson，R.，Baldwin，S.，Plunkett,G. Ill，Burland,V.，Mau，B . ，Petrosino，J. F. ，Qin,X.，Muzny，D . M . ，Ayele,M.，Gibbs,R.A.，Csorgo,B.，Posfai,G.，The inventorsin-stock，G.M. and Blattner，F(xiàn) . R .

TITLE The complete genome sequence of Escherichia coli

DH10B: insights into the biology of a laboratory workhorse JOURNAL J. Bacteriol. 190（7），2597-2606（2008）

PUBMED 18245285

REFERENCE 2（bases 1 to 4686137）

AUTHORS Plunkett,G. III.

TITLE Direct Submission

JOURNAL Submitted（20-FEB-2008）Department of Genetics and Biotechnology,

University of Wisconsin，425G Henry Mall，Madison，WI 53706，USA

COMMENT DH10B and DH10B-T1R are available from Invitrogen

Corporation

（http://www.invitrogen.com）。

將突變與基因匹配，并且計算氨基酸變化。使用不同算法（SVM，同源性建模），計算導(dǎo)致具有可能的致病性/抗性的氨基酸變化的突變。排除來自swissprot數(shù)據(jù)庫的已知變體，并且選擇相應(yīng)基因中的所有變體。

如上所述，對于大腸桿菌，識別出了86個超高度顯著的遺傳位置和藥物抗性對（表2）。86個組合對應(yīng)于35個遺傳位置，因?yàn)槲稽c(diǎn)通常對于不止一種單一藥物是顯著的。最重要的是，位點(diǎn)分別位于9種基因上：hofB、allA、mukB、ymdC、potB、ycgK、ycgB、valS、yjjJ。這些基因因此看起來對于抗生素抗性/敏感性是關(guān)鍵的。識別出的突變均導(dǎo)致氨基酸改變，在相應(yīng)位置上的氨基酸交換或新終止密碼子的產(chǎn)生。由此，檢測到針對以下6種抗生素藥物的抗性相關(guān)變體：CP、LVX、TE、CFZ、CRM、GM。

表2：識別出的突變

在表2中，列如下指定：

基因組位置：大腸桿菌參考基因組中的SNP/變體的基因組位置（參見下文）；

療法：突變與之顯著關(guān)聯(lián)的療法，多重療法在單獨(dú)的行中（如果SNP與例如4種療法關(guān)聯(lián)，則這導(dǎo)致4個單行）；

p值：使用Fisher精確檢驗(yàn)計算的顯著性值；

基因位置：基因中突變的位置；

Ref：參考堿基，A、C、T、G；

Alt：與抗性相關(guān)的替代堿基；

AA：原始氨基酸；

Alt A：改變的氨基酸；

基因：受影響的基因；

交換：以標(biāo)準(zhǔn)命名法表示的氨基酸交換；

p值使用Fisher精確檢驗(yàn)基于具有4個域的列聯(lián)表進(jìn)行計算：#抗性/野生型樣品；#抗性/突變型樣品；#非抗性/野生型樣品；#非抗性/突變型樣品。

在表3中，列出了所識別的基因和基因產(chǎn)物，并且通過基因的基因ID和相應(yīng)蛋白質(zhì)所對應(yīng)的（NCBI）登錄號進(jìn)行識別

表3：基因名稱和標(biāo)識符

測試基于在4個域中的樣品分布。平均分布指示無顯著性，而聚簇成兩個域指示顯著性。

使用這種方法，識別出了在9種基因（hofB、allA、mukB、ymdC、potB、ycgK、ycgB、valS、yjjJ）中的35個高度顯著的新型遺傳位置或突變，其可以用于且允許測定對常用抗生素藥物的抗性。本文描述且在表2中列出的所有高度顯著的突變均是非保守突變，其導(dǎo)致氨基酸交換或新的終止密碼子（由表2中的符號指定），并且因此導(dǎo)致改變的蛋白質(zhì)。因此所識別的9種基因可能在抗生素抗性中起顯著作用，并且是用于開發(fā)新的藥物候選物的假定靶。

實(shí)施例2

在本實(shí)施例中，本發(fā)明人評估了大腸桿菌對來自五個藥物類別的21種不同藥物的遺傳敏感性（參見下文）。

方法：進(jìn)行對21種FDA批準(zhǔn)藥物具有可變抗性譜的1,162個臨床大腸桿菌分離物的抗微生物敏感性測試（AST），并且測序所有分離物的基因組。遺傳變體與AST數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)。

結(jié)果：本發(fā)明人報告了在大腸桿菌基因組中與藥物抗性顯著關(guān)聯(lián)的25,744個位點(diǎn)。就GyrA（喹諾酮的靶）中的氨基酸（AA）交換S83L而言，最高顯著性對于藥物環(huán)丙沙星和左氧氟沙星達(dá)到（P_{環(huán)丙沙星}=10^-235，準(zhǔn)確度、特異性和靈敏度：98%、99%和94%；P_{左氧氟沙星}=10^-209，97%、98%和93%）。對于ParC（喹諾酮的第二靶）觀察到第二最顯著的相關(guān)（AA交換S80I，P_{環(huán)丙沙星}=10^-196和P_{左氧氟沙星}=10^-194）。特別地，在YigN中發(fā)現(xiàn)了與對多重藥物的抗性顯著相關(guān)的許多AA交換。通過分析在基因組水平上的序列覆蓋率，本發(fā)明人確定了幾種基因的基因劑量依賴性，所述幾種基因包括mmuP和mmuM，其編碼假定的S-甲基甲硫氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和同型半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶。兩個基因座均與針對α-內(nèi)酰胺和喹諾酮的抗性相關(guān)。

結(jié)論：本發(fā)明人提供了高通量篩選和分析流水線，以研究大腸桿菌菌株中的抗生素抗性。結(jié)果證實(shí)了基于遺傳學(xué)的測試以預(yù)測針對抗微生物藥物的敏感性的潛力。另外，報告了基因劑量與抗性的新型關(guān)聯(lián)。

本發(fā)明人使用大腸桿菌進(jìn)行系統(tǒng)評估。具體地，本發(fā)明人經(jīng)過22年（1991-2013）跨越60個不同研究所收集了1,162份大腸桿菌樣品。對于這些分離物，本發(fā)明人進(jìn)行了針對21種FDA批準(zhǔn)藥物的標(biāo)準(zhǔn)AST，并且針對相同的1,162種分離物進(jìn)行了全基因組測序（WGS），以構(gòu)建揭示用于由基因數(shù)據(jù)預(yù)測AST的基因位點(diǎn)的數(shù)據(jù)庫。

方法

細(xì)菌菌株

本發(fā)明人選擇了來自Siemens Healthcare Diagnostics（West Sacramento，CA）的微生物學(xué)菌株集合的1,162個大腸桿菌菌株用于敏感性測試和全基因組測序。

抗微生物敏感性測試實(shí)驗(yàn)對象組

遵循臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（Clinical Laboratory Standards Institute）（CLSI）建議¹⁶制備了冷凍的參考AST實(shí)驗(yàn)對象組。下述抗微生物試劑（具有在括號中所示的μg/ml濃度）包括在實(shí)驗(yàn)對象組中：阿莫西林/克拉維酸鉀（0.5/0.25-64/32）、氨芐青霉素（0.25-128）、氨芐青霉素/舒巴坦（0.5/0.25-64/32）、氨曲南（0.25-64）、頭孢唑啉（0.5-32）、頭孢吡肟（0.25-64）、頭孢噻肟（0.25128）、頭孢他啶（0.25-64）、頭孢曲松（0.25-128）、頭孢呋辛（1-64）、頭孢噻吩（1-64）、環(huán)丙沙星（0.015-8）、厄他培南（0.12-32）、慶大霉素（0.12-32）、亞胺培南（0.25-32）、左氧氟沙星（0.25-16）、美羅培南（0.12-32）、哌拉西林/他唑巴坦（0.25/4-256/4）、四環(huán)素（0.5-64）、妥布霉素（0.12-32）、以及甲氧芐啶/磺胺甲噁唑（0.25/4.7-32/608）。在與臨床分離物一起使用之前，AST實(shí)驗(yàn)對象組用QC菌株進(jìn)行測試。當(dāng)QC結(jié)果符合由CLSI16描述的QC范圍時，AST實(shí)驗(yàn)對象組對于用臨床分離物的測試被視為可接受的。

接種物制備

分離物在含有5%綿羊血的胰胨大豆瓊脂（BBL，Cockeysville，Md.）上進(jìn)行培養(yǎng)，并且在環(huán)境空氣中在35±1℃下溫育18-24小時。將分離的菌落（4-5個大菌落或5-10個小菌落）轉(zhuǎn)移至3 ml無菌接種水（Siemens），并且乳化至0.5 McFarland標(biāo)準(zhǔn)的最終濁度。將2 ml這種懸浮液加入到含有Pluronic-F的25 ml接種水（Siemens）中。使用冷凍AST實(shí)驗(yàn)對象組專用的接種器（Siemens），將5μl細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至AST實(shí)驗(yàn)對象組的每個孔中。接種的AST實(shí)驗(yàn)對象組在環(huán)境空氣中在35±1℃下溫育16-20小時。對實(shí)驗(yàn)對象組結(jié)果進(jìn)行目測，并且測定最小抑制濃度（MIC）。

DNA提取

每個革蘭氏陰性細(xì)菌分離物的四個劃線培養(yǎng)物在含有5%綿羊血的胰胨大豆瓊脂上進(jìn)行培養(yǎng)，并且細(xì)胞懸浮液在含有50 μl無核酸酶水（AM9930，Life Technologies）的無菌1.5 ml收集管中進(jìn)行制備。細(xì)菌分離物樣品貯存于-20℃下直至核酸提取時。組織制備系統(tǒng)（TPS）（096D0382-02_01_B，Siemens）和VERSANT?組織制備試劑（TPR）試劑盒（10632404B，Siemens）用于從這些細(xì)菌分離物中提取DNA。在提取前，細(xì)菌分離物在室溫下解凍，并且在2000 G下5秒形成團(tuán)塊。DNA提取方案DNAext用于在4小時內(nèi)從各50 μl 的48個分離物樣品和洗脫物中提取完全總核酸?？偤怂嵯疵撐镫S后轉(zhuǎn)移到96孔qPCR檢測板（401341，Agilent Technologies）內(nèi)，用于RNA酶A消化、DNA定量和板DNA濃度標(biāo)準(zhǔn)化過程。遵循制造商的說明書，將在無核酸酶水中稀釋的RNA酶A（AM2271，Life Technologies）加入到50μl總核酸洗脫物中，得到20 μg/ml的最終工作濃度。使用Siemens VERSANT?擴(kuò)增和檢測儀器將消化酶和洗脫物混合物在37℃下溫育30分鐘。遵循測定試劑盒說明書，來自RNA酶消化的洗脫物的DNA使用Quant-iT? PicoGreen dsDNA Assay（P11496，Life Technologies）進(jìn)行定量，并且熒光在Siemens VERSANT?擴(kuò)增和檢測儀器上進(jìn)行測定。數(shù)據(jù)分析使用Microsoft? Excel 2007進(jìn)行。25μl定量的DNA洗脫物轉(zhuǎn)移到新的96孔PCR板內(nèi)，用于在文庫制備之前的板DNA濃度標(biāo)準(zhǔn)化。來自TPR試劑盒的洗脫緩沖液用于調(diào)整DNA濃度。標(biāo)準(zhǔn)化的DNA洗脫物板隨后貯存于-80℃下直至文庫制備時。

下一代測序

在文庫制備之前，使用Qubit 2.0熒光計（Qubit dsDNA BR Assay Kit，Life Technologies）和Agilent 2200 TapeStation（Genomic DNA ScreenTape，Agilent Technologies），進(jìn)行所分離的細(xì)菌DNA的質(zhì)量控制。根據(jù)制造商的方案，使用NexteraXT DNA樣品制備試劑盒和NexteraXT Index Kit for 96 Indexes（Illumina），以96孔形式制備NGS文庫。使用在ViiA 7實(shí)時PCR系統(tǒng)（Life Technologies）上的KAPA SYBR FAST qPCR MasterMix Kit（Peqlab），在基于qPCR的方法中定量所得到的測序文庫。使用TruSeq PE Cluster v3和TruSeq SBS v3測序化學(xué)（Illumina），合并96個樣品/泳道用于在Illumina Hiseq2000或Hiseq2500測序儀上的成對末端測序（2x 100bp）。使用用于高通量序列數(shù)據(jù)的FastQC質(zhì)量控制工具（Babraham Bioinformat-ics Institute）測定基礎(chǔ)測序質(zhì)量參數(shù)。

數(shù)據(jù)分析

使用BWA 0.6.1.20，對1,162個大腸桿菌樣品的原始成對末端測序數(shù)據(jù)針對大腸桿菌DH10B參考（NC_010473）（還參見上文實(shí)施例1）進(jìn)行作圖。將所得到的SAM文件分選，轉(zhuǎn)換為BAM文件，并且使用Picard工具包1.104（http://picard.sourceforge.net/）標(biāo)記PCR復(fù)制物。Genome Analysis Toolkit 3.1.1（GATK）21用于調(diào)用關(guān)于200個大腸桿菌樣品塊的SNP和插入缺失（參數(shù)：-ploidy 1 -glm BOTH -stand_call_conf 30 -stand_emit_conf 10）。將VCF文件合并成單個文件，并且針對SNP（QD < 2.0 | | FS > 60.0 | | MQ < 40.0）和插入缺失（QD < 2.0 | | FS > 200.0）進(jìn)行質(zhì)量過濾。檢測到的變體用SnpEff22注釋，以預(yù)測編碼效應(yīng)。對于每個注釋位置，考慮所有大腸桿菌樣品的基因型。將大腸桿菌樣品相對于某一MIC濃度（斷點(diǎn)）分成兩組，低抗性組（對于所考慮的藥物具有更低的MIC濃度）和高抗性組（具有更高的MIC濃度）。為了發(fā)現(xiàn)最佳斷點(diǎn)，評估所有閾值且用Fisher精確檢驗(yàn)計算p值，依賴于2x2列聯(lián)表（具有參考或變體基因型的大腸桿菌樣品數(shù)目相對于屬于低和高抗性組的樣品數(shù)目）。最佳計算的斷點(diǎn)是針對某一基因組位置和藥物得到最低p值的閾值。關(guān)于進(jìn)一步分析，考慮具有非同義改變和p值< 10^-9的位置。基于列聯(lián)表，計算準(zhǔn)確度（ACC）、靈敏度（SENS）、特異性（SPEC）以及陽性/陰性預(yù)測值（PPV/NPV）（圖1）。

因?yàn)樗幬锟剐缘囊粋€潛在原因是基因復(fù)制，所以評估了基因劑量依賴性。對于每個樣品，使用BED工具測定關(guān)于每個位置的基因組覆蓋率。從參考組件NC_010473. gff中提取23個基因范圍，并且計算標(biāo)準(zhǔn)化的中值覆蓋率/基因。為了比較低抗性和高抗性分離物，計算最佳曲線下面積（AUC）值?？紤]了這樣的組，該組中所有樣品的20%針對該基因具有大于零的中值覆蓋率且該組含有超過15個樣品，以便排除假象，并且進(jìn)一步評估具有AUC > 0.75的情況。

結(jié)果

我們研究的目的在于證實(shí)遺傳抗微生物敏感性測試（GAST）的可行性，以針對已知抗性機(jī)制驗(yàn)證我們的方法，并且發(fā)現(xiàn)新型機(jī)制。本發(fā)明人針對1,162個大腸桿菌分離物和21種抗微生物藥物進(jìn)行了基于簇的AST，所述21種抗微生物藥物屬于5個不同藥物類別：α-內(nèi)酰胺、氟喹諾酮、氨基糖苷、四環(huán)素和葉酸合成抑制劑。藥物的完全列表示于表1中。對于相同的1,162個大腸桿菌分離物，使用Illumina的HiSeq2500儀器進(jìn)行了全基因組測序。

大腸桿菌基因組中的最顯著位點(diǎn)

為了計算全基因組顯著性得分，本發(fā)明人將所有1,162個大腸桿菌基因組相對參考菌株DH10B進(jìn)行標(biāo)定。對于每個基因組位置，本發(fā)明人測定每個樣品的堿基，并且發(fā)現(xiàn)了通過質(zhì)量過濾并且其中至少一個樣品具有非參考堿基的973,226個位點(diǎn)。使用Fisher精確檢驗(yàn)，將相應(yīng)的位點(diǎn)與關(guān)于21種藥物的AST數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)。我們的分析揭示25,744個位點(diǎn)，其中遺傳突變與至少一種藥物顯著關(guān)聯(lián)（p值<10^-9），并且導(dǎo)致AA序列中的變化，包括點(diǎn)突變以及小的插入和缺失。針對GyrA中的AA交換S83L和藥物環(huán)丙沙星得到了最高顯著性（p = 10^-235）。值得注意的是，GyrA是環(huán)丙沙星的靶之一。對于這個位置，三個AA交換S83L、S83W、S83A在UniProt中注釋為賦予對喹諾酮的抗性。對于這個位點(diǎn)，僅發(fā)現(xiàn)5個假陽性（0.4%）和18個假陰性樣品（1.6%），而1,139個樣品被正確識別，分別對應(yīng)于98.0%、99.4%和93.8%的準(zhǔn)確度、特異性和靈敏度（圖1）。類似地，GyrA中的第二最顯著位點(diǎn)D87N / D87Y揭示僅12個假陽性和10個假陰性，相應(yīng)的p值為10^-206，并且準(zhǔn)確度為98.1%。同樣，對于這個位點(diǎn)，D87N交換在UniProt中注釋為賦予喹諾酮抗性。對于位于第二環(huán)丙沙星靶ParC中的第三和第四最顯著位點(diǎn)（S80I、E84G），抗性相關(guān)變體也已得到描述。在圖2中，對于不具有在GyrA（S83/D87）和ParC（S80）中的變體的樣品、具有在GyrA S83或D87而不是ParC中的僅一個突變的樣品、具有在GyrA而不是ParC中的兩個突變的樣品、以及具有所有三個突變的樣品，本發(fā)明人提供了針對環(huán)丙沙星的MIC的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。有利的是，平均MIC值從對于無突變體或單一突變體低于1.0增加到對于雙重或三重突變體高于7.8，其顯示在這種情況下，突變的組合是達(dá)到針對環(huán)丙沙星的更高抗性水平所必需的。

除II型拓?fù)洚悩?gòu)酶藥物靶（GyrA/ParC）中的突變外，基因ygiF（A110T，p=10^-67，準(zhǔn)確度=86%，特異性=89.5%，靈敏度=69.9%）和ygj（A68V，p=10^-63，準(zhǔn)確度=89.9%，特異性=94.4%，靈敏度=67.1%）中的突變也具有高顯著性。與上述AA交換相比較，這兩個位點(diǎn)表現(xiàn)出大幅降低的靈敏度和陽性預(yù)測值（PPV）。雖然關(guān)于GyrA和ParC中的四個AA交換的PPV在94.8%和98.2%之間，但這兩個交換的PPV下降至59.0%和70.8%。這意味著給定交換AA抗性的可能性與給定交換AA敏感的可能性幾乎一樣高，限制了相應(yīng)的AA交換是原因的概率。

為了發(fā)現(xiàn)可能是藥物抗性原因的其他AA交換，本發(fā)明人過濾所有25,744個位點(diǎn)的列表（至少150個抗性大腸桿菌分離物攜帶AA交換，NPV>50%、PPV>75%）。這種過濾揭示127個候選位點(diǎn)（還參見表4）。除已經(jīng)描述的GyrA和ParC中的交換外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)YdjO中的AA交換與針對不同α-內(nèi)酰胺（V121E、S120C、V118F、I114V、K111E和D112N）的預(yù)測抗性相關(guān)。同樣地，對于內(nèi)酰胺，本發(fā)明人報告了以下AA交換：YcbS（E848Q、E848*）、RhsC（R717Q、W492C）、YcbQ（T86I）、YagR（S274T）和YeaU（N293K）。最后，本發(fā)明人在YhaL中發(fā)現(xiàn)了與喹諾酮、四環(huán)素和內(nèi)酰胺有關(guān)的AA交換（總共23個不同位點(diǎn)）。另外，本發(fā)明人計算對于每種樣品最顯著的非同義AA交換（p值閾值<10^-9）。在21種測試藥物中，僅兩種（亞胺培南、美羅培南）未發(fā)現(xiàn)與具有此類低p值的AA交換相關(guān)。有趣的是，GyrA中的S83L突變是15種藥物中主要的交換。然而，對于其中以GyrA作為靶的藥物環(huán)丙沙星和左氧氟沙星， 其p值比與剩余13種藥物相關(guān)的這個突變的p值低得多（>10^-62相對于<10^-209）。另外，本發(fā)明人在這些情況下再次觀察到靈敏度和/或PPV的顯著降低：不以GyrA作為靶的藥物的靈敏度或PPV低于55%，證實(shí)這些測量能有效地從其它中分離出真正靶中的突變。

已知藥物靶中的突變

在9種情況下，本發(fā)明人在還編碼相應(yīng)藥物的靶的基因中檢測到與藥物相關(guān)的突變。這包括在GyrA（S83L、D87N、D87Y、D678E、E574D）和ParC（S80I、E84G、E84V、E84A、A192V、Q481H、A471G、T718A、Q198H）中與環(huán)丙沙星和左氧氟沙星相關(guān)的突變，在AmpC（K40R、I300V、T335I、A210P、Q196H、A236T、R248C）中與頭孢噻吩相關(guān)的突變，在FolC（A319T、R88C、G217S）中與磺胺甲噁唑相關(guān)的突變，在MrcB（D839E、QQQP815Q、R556C）和PbpC（L357V、V348A、A15T、A217V、Q495L、V768F、A701E、K766R、K766T、T764S、T764A、R602L、E446G、R669H、A202T）中與頭孢唑啉相關(guān)的突變，以及在PbpG（A28V）中與頭孢他啶相關(guān)的突變。

最受影響的基因和多藥抗性位點(diǎn)

突變并非跨越大腸桿菌基因均勻分布的：例如，yfaL、fhuA、yehL、yjgL和yeeJ攜帶超過120個非同義變體/基因（圖3A）；在yfaL中，發(fā)現(xiàn)多達(dá)182個顯著交換。為了發(fā)現(xiàn)與多藥抗性有關(guān)的位點(diǎn)，本發(fā)明人計算與至少3個藥物類別顯著相關(guān)的AA交換數(shù)目（圖3B），并且在圖3C中標(biāo)繪每種基因的相應(yīng)位點(diǎn)計數(shù)。平均起來，全部顯著位點(diǎn)中有35%與至少三種藥物相關(guān)。雖然三種基因yfaL、yehL和yjgL具有最高數(shù)目的AA交換，但yjgN具有與多藥抗性相關(guān)的大幅增加的位點(diǎn)數(shù)目（64個位點(diǎn)中的53個，83%），而yeeJ（122個位點(diǎn)中的15個，12%）和fhuA（166個位點(diǎn)中的12個，7%）攜帶少于預(yù)期的與多個藥物類別有關(guān)的位點(diǎn)。在yjgN中，與多個藥物類別顯著相關(guān)的位置集中于基因的末端區(qū)域中（圖3D）。

覆蓋率分析

藥物抗性的一個潛在原因是基因復(fù)制或缺失，其可以通過檢查抗性和敏感分離物組中的不同基因的讀數(shù)覆蓋率，在我們的數(shù)據(jù)集中觀察到。為了估計覆蓋率中的差異，本發(fā)明人計算了兩組中的標(biāo)準(zhǔn)化的中值覆蓋率/基因的AUC值。本發(fā)明人總共發(fā)現(xiàn)在抗性和敏感細(xì)菌之間的基因覆蓋率中的23個異常差異情況，其導(dǎo)致AUC > 0.75（圖4A）。本發(fā)明人報告了與三種α-內(nèi)酰胺和兩種喹諾酮的聯(lián)系。關(guān)鍵基因是mmuP和mmuM，其分別編碼假定的S-甲基甲硫氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和同型半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶，其覆蓋率在對所有5種藥物均有抗性的細(xì)菌中高得多。在對左氧氟沙星和環(huán)丙沙星抗性的菌株中，內(nèi)膜蛋白質(zhì)Yiel和InsN-1（插入元件調(diào)節(jié)物）同樣更豐富。相比之下，編碼葡糖基轉(zhuǎn)移酶YaiP、YaiO、外膜蛋白質(zhì)NmpC和DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄阻遏物MngR的基因在對這些藥物抗性的菌株中更少覆蓋。圖4B和4C顯示了在對環(huán)丙沙星抗性的菌株中關(guān)于較不豐富覆蓋的yaiP和更豐富覆蓋的mmuP的示例覆蓋率曲線。針對環(huán)丙沙星和基因mmuP得到了最佳診斷準(zhǔn)確度，其具有0.923的AUC值，證實(shí)該定量信息允許抗性和敏感菌株之間的準(zhǔn)確分離。

討論

由多藥抗性病原體引起的客觀并持續(xù)增長的感染對于尤其是在醫(yī)院環(huán)境下的患者存在重大威脅。新藥物的開發(fā)是長期和昂貴的探索，并且近年來，盡管對于研究和開發(fā)的投資日益增加，依然處于停滯不前的狀態(tài)，。2012年9月，F(xiàn)DA宣布組建了內(nèi)部任務(wù)組用于支持新抗微生物藥物開發(fā)，強(qiáng)調(diào)了這一主題的重要性。在這些藥物變得可用之前，本發(fā)明人必須了解如何最有效地應(yīng)用現(xiàn)有的藥物。濫用廣譜抗生素會促進(jìn)多藥抗性的發(fā)展，因此需要更小心地選擇藥物。因此，本發(fā)明人需要可以快速分類患者并為其提供最佳療法的方法。識別出傳染劑中主要負(fù)責(zé)所觀察到的抗性或敏感性的遺傳基因座是至關(guān)重要的一點(diǎn)。

此處，本發(fā)明人分析了1,162個大腸桿菌臨床分離物的針對21種FDA批準(zhǔn)藥物的敏感性，并且結(jié)合此信息與全基因組NGS數(shù)據(jù)，以識別出可能是所觀察到的抗性模式的原因的潛在變體。本發(fā)明人總共發(fā)現(xiàn)了25,744個顯著位點(diǎn)（p值< 10^-9）。該方法正確識別出在九個基因/藥物組合中的已知藥物靶：gyrA（環(huán)丙沙星、左氧氟沙星）、parC（環(huán)丙沙星、左氧氟沙星）、ampC（頭孢噻吩）、folC（甲氧芐啶磺胺甲噁唑）、mrcB（頭孢唑啉）、pbpC（頭孢唑啉）和pbpG（頭孢他啶）。為了識別可能是次級藥物靶的其他潛在位點(diǎn)，本發(fā)明人應(yīng)用了使用測量NPV/PPV的過濾標(biāo)準(zhǔn)，其允許本發(fā)明人將潛在相關(guān)位點(diǎn)數(shù)目從25,744減少到127個位點(diǎn)。

考慮根據(jù)計算的p值的最佳藥物-靶組合，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)GyrA中的AA交換S83L是針對15種藥物的主要突變。由于僅環(huán)丙沙星或左氧氟沙星是獲批用于GyrA的藥物，所以與這種蛋白質(zhì)的其他相關(guān)可能是多藥抗性的副作用。本發(fā)明人顯示采用另外的測量（例如靈敏度、PPV和NPV）會促進(jìn)分離來自其他變體的原因藥物靶，如在這種情況下例示的。

相比僅使用單一變體，若干個變體位置的組合可以改善預(yù)測準(zhǔn)確度且進(jìn)一步減少受其他因素影響的假陽性發(fā)現(xiàn)。

由于基因復(fù)制和/或缺失還可能在抗性發(fā)展機(jī)制中起作用，所以本發(fā)明人分析了與抗性數(shù)據(jù)組合的基因覆蓋率，并且發(fā)現(xiàn)在抗性和敏感細(xì)菌之間的基因覆蓋率中的23個異常差異情況。有趣的是，本發(fā)明人不僅發(fā)現(xiàn)例如mmuP、mmuM和yiel抗性細(xì)菌中的遺傳材料增加，還發(fā)現(xiàn)某些基因例如mngB和mngR中的減少。雖然對于膜或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，通過禁止藥物滲透膜或?qū)⑵涓行У剞D(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，基因劑量的增加或減少均可以影響藥物敏感性，但在這個背景下不容易解釋代謝酶或轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量的減少，并且可能或多或少與分離物的適合性直接相關(guān)。

可能改善我們分析的準(zhǔn)確度的另一個信息來源是菌株特異性質(zhì)粒。針對這些質(zhì)粒標(biāo)定測序數(shù)據(jù)將拓展我們關(guān)于另外的抗性機(jī)制的了解。在第一種方法中，本發(fā)明人將測序數(shù)據(jù)亞集對約300個大腸桿菌質(zhì)粒進(jìn)行標(biāo)定。其中具有最顯著變體位點(diǎn)的基因是例如repAl、trbI、psiB和traG，其直接涉及復(fù)制、質(zhì)粒轉(zhuǎn)移和維持，并且通過給予其宿主促進(jìn)抗性基因擴(kuò)展的能力，可能在抗性發(fā)展中起間接作用。

與使用MALDI-TOF MS的方法相比較，本文方法的優(yōu)點(diǎn)在于其覆蓋了幾乎整個基因組并因此允許我們識別可能與抗性有關(guān)的潛在基因組位點(diǎn)。雖然MALDI-TOF MS也可以用于識別細(xì)菌蛋白質(zhì)中的點(diǎn)突變³³，但這種技術(shù)僅檢測蛋白質(zhì)亞集并且這些之中并非全部被同樣良好地覆蓋。另外，對某些相關(guān)菌株的識別和區(qū)分不總是可行的。

本文方法允許計算用于將分離物分成抗性和敏感組的最佳斷點(diǎn)。本發(fā)明人設(shè)計了靈活的軟件工具，其允許除最佳斷點(diǎn)外還考慮由不同準(zhǔn)則（例如歐洲和美國準(zhǔn)則）限定的值，所述不同準(zhǔn)則是針對GAST在不同國家中的應(yīng)用而準(zhǔn)備的。

本研究的另一個關(guān)鍵點(diǎn)在于其分析僅包括培養(yǎng)的細(xì)菌菌株。若干項研究使用來自尿、糞便樣品或陰道拭子的不依賴于培養(yǎng)物的樣品，并應(yīng)用NGS以直接識別或表征病原體。NGS技術(shù)的進(jìn)展包括新的長讀測序儀如PacBio和Oxford Nanopore的開發(fā)，將在未來進(jìn)一步改善并加速我們的程序，以開發(fā)基于NGS數(shù)據(jù)的不依賴于培養(yǎng)物的診斷測試。

本發(fā)明人證實(shí)本文方法能夠識別基因中已知作為藥物靶的突變，以及檢測潛在新的靶位點(diǎn)。

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