本申請(qǐng)要求2014年2月24日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/943,944的權(quán)益，其內(nèi)容經(jīng)此引用并入本文。

關(guān)于聯(lián)邦政府資助研究的聲明

本發(fā)明在美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health)授予的RR026314和HG006828在政府支持下完成。政府在本發(fā)明中擁有某些權(quán)利。

發(fā)明領(lǐng)域

本文中公開的本發(fā)明通常涉及用于疼痛管理的方法與組合物。

發(fā)明背景

安全和有效的鎮(zhèn)痛是重要的未滿足的醫(yī)療需求。參見例如Sadhasivam和Chidambaran,Pharmacogenomics(2012)13(15):1719-1740；Caldas,J.等人,Paediatr.Anaesth.,14:910-5(2004)；Duedahl,T.和Hansen,E.,Paediatr.Anaesth.,17:756-74(2007)。阿片類藥物是用于管理術(shù)后疼痛的常用鎮(zhèn)痛藥。盡管它們具有顯著的鎮(zhèn)痛藥強(qiáng)度，阿片類藥物還具有狹窄的治療指數(shù)和大量相關(guān)不良反應(yīng)，包括例如呼吸抑制、瞳孔縮小、困倦、惡心、嘔吐和便秘。嗎啡是圍手術(shù)期過程中最常用的阿片樣物質(zhì)。嗎啡在阿片樣物質(zhì)響應(yīng)方面不可預(yù)測(cè)的患者間差異和狹窄的治療指數(shù)導(dǎo)致嗎啡誘導(dǎo)的呼吸抑制的高發(fā)生率。阿片樣物質(zhì)誘導(dǎo)的呼吸抑制是阿片類藥物最嚴(yán)重的不良反應(yīng)，造成高達(dá)50％的術(shù)后呼吸衰竭事件(Fecho K.等人,Therapeut.and Clin.Risk Mgmt.5:961-8(2009))。對(duì)于來自阿片類藥物的呼吸抑制，雙生子研究已經(jīng)揭示了顯著的遺傳可能性(30％)(Angst M.等人,Anesthesiology 117:22-37(2012))。對(duì)嗎啉的臨床響應(yīng)方面大約50％的個(gè)體間差異可以通過涉及疼痛機(jī)制和阿片樣物質(zhì)代謝、運(yùn)輸和受體信號(hào)傳導(dǎo)的基因中的SNP來解釋。還描述了貢獻(xiàn)非遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素如女性性別、種族、醫(yī)學(xué)共存病和其它遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素如CYP2D6變體(Ramachandran S.等人,J.Clin.Anesth.23:207-13(2011)；Niesters M.等人,British Journal of Anaesthesia 110:175-82(2013))。預(yù)測(cè)對(duì)阿片類藥物的患者反應(yīng)的努力對(duì)于臨床醫(yī)生能夠使鎮(zhèn)痛個(gè)性化以最大程度緩解疼痛并同時(shí)使其不良反應(yīng)最小化有很大的影響。

扁桃體切除術(shù)是兒童經(jīng)受的最常見和顯著疼痛的外科手術(shù)之一。每年僅在美國(guó)就進(jìn)行大約530,000例扁桃體切除術(shù)(Erickson B.等人,Otolaryngol.Head Neck Surg.,140:894-901(2009))。大約八個(gè)美國(guó)兒童中就有一個(gè)經(jīng)受扁桃體切除術(shù)(Marcus,C.等人,The New England Journal of Medicine,368:2366-76(2013)；Brouillette,R.The New England Journal of Medicine,368:2428-9(2013))。嗎啡是在住院環(huán)境中給予兒童的前十種藥物之一(Lasky,T.等人,Clin.Ther.,34:720-727(2012))，并且其常常在兒童扁桃體切除術(shù)期間和之后用于管理疼痛。阻塞性睡眠呼吸暫停(這是扁桃體切除術(shù)的適應(yīng)癥)使得兒童對(duì)阿片類藥物的中樞抑制作用(包括呼吸抑制)尤其敏感(Brown,K.等人,Anesthesiology,105:665-669(2006))。扁桃體切除術(shù)后死亡的最大原始報(bào)告的近期研究表明，使用阿片樣物質(zhì)疼痛藥物導(dǎo)致了多數(shù)死亡和缺氧性腦損傷(Goldman,J.等人,The Laryngoscope 123:2544-53(2013))。在2013年2月，美國(guó)食品和藥物管理局基于多起死亡和嚴(yán)重不良反應(yīng)(不論CYP2D6基因型和代謝狀態(tài))報(bào)告針對(duì)經(jīng)受扁桃體切除術(shù)的兒童使用可待因(嗎啡前藥)發(fā)出了警告(Food and Drug Administration,“Safety review update of codeine use in children；new boxed warning and contraindication on use after tonsillectomy and/or adenoidectomy”,在FDA Drug Safety Communication 2013中)。

發(fā)明概述

本發(fā)明提供了對(duì)需要鎮(zhèn)痛的患者選擇鎮(zhèn)痛藥物的方法和鑒定處于嚴(yán)重的阿片樣物質(zhì)誘導(dǎo)的不良事件風(fēng)險(xiǎn)下的患者的方法，該方法包括確定或接收患者對(duì)至少一種遺傳變體的基因型，并至少部分基于患者對(duì)該至少一種遺傳變體的基因型將患者分配到嚴(yán)重的阿片樣物質(zhì)誘導(dǎo)不良事件的兩個(gè)風(fēng)險(xiǎn)組，即低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組之一中。在一個(gè)實(shí)施方案中，如果患者被分配到高風(fēng)險(xiǎn)組的話，該藥物選自非嗎啡阿片樣物質(zhì)鎮(zhèn)痛藥或非阿片樣物質(zhì)鎮(zhèn)痛藥，如果患者被分配到低風(fēng)險(xiǎn)組的話，該藥物選自嗎啡或另一種阿片樣物質(zhì)鎮(zhèn)痛藥。在一個(gè)實(shí)施方案中，該非阿片樣物質(zhì)鎮(zhèn)痛藥選自撲熱息痛(也稱為對(duì)乙酰氨基酚)和非甾體抗炎藥(NSAIDs)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述非嗎啡的阿片樣物質(zhì)鎮(zhèn)痛藥選自芬太尼、二氫嗎啡酮、可待因、羥考酮、氫可酮、曲馬多、昂丹司瓊、地塞米松、美沙酮、阿芬太尼和雷米芬太尼。在一個(gè)實(shí)施方案中，分配到高風(fēng)險(xiǎn)組的患者被鑒定為處于嚴(yán)重的阿片樣物質(zhì)誘導(dǎo)的不良事件風(fēng)險(xiǎn)下的患者。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種遺傳變體包含選自ABCB1 rs9282564、ABCC3 rs4148412和ABCC3kgp8560677的至少一種變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，將該變體如下分配到兩個(gè)風(fēng)險(xiǎn)組之一，并且所述嚴(yán)重的阿片樣物質(zhì)誘導(dǎo)的不良事件選自呼吸抑制[RD]、因RD而處于延長(zhǎng)的恢復(fù)[延長(zhǎng)的RD]和手術(shù)后惡心與嘔吐[PONV](其也可能是頑固性PONV)：

ABCB1 rs9282564GG高，AG高，AA低[RD]；

ABCC3 rs4148412AA高，AG高，GG低[延長(zhǎng)的RD]；和

ABCC3 kgp8560677AA高，AG高，GG低[PONV]。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種遺傳變體包含或進(jìn)一步包含至少一種選自O(shè)PRM1 rs1799971、ABCC3 rs739923、FAAH rs 324420和ABCB1 rs1045642的變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，將該變體如下分配到兩個(gè)風(fēng)險(xiǎn)組之一，并且所述嚴(yán)重的阿片樣物質(zhì)誘導(dǎo)的不良事件選自呼吸抑制[RD]、因RD而處于延長(zhǎng)的恢復(fù)[延長(zhǎng)的RD]和手術(shù)后惡心與嘔吐[PONV](其也可能是頑固性PONV)：

OPRM1 rs1799971 GG高，AG高，AA低[RD]；

ABCC3 rs739923 GG空；AG低；AA低[延長(zhǎng)的RD]；

FAAH rs324420 AA高，AC高，CC低[PONV]；和

ABCB1 rs1045642 TT高，TC高，CC低[RD]。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種遺傳變體包含由FAAH rs2295632、ABCB1 rs1045642和ADRB2 rs1042713組成的至少三種變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，將該變體如下分配到兩個(gè)風(fēng)險(xiǎn)組之一，并且所述嚴(yán)重的阿片樣物質(zhì)誘導(dǎo)的不良事件是呼吸抑制[RD]：

FAAH rs2295632 AA高，CA高，CC低；

ABCB1 rs1045642 TT高，TC高，CC低；和

ADRB2 rs1042713 GG高，GA高，AA低。

按照任何上述方法，可以進(jìn)行該分配，優(yōu)選通過計(jì)算機(jī)實(shí)施的方法來進(jìn)行該分配。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述計(jì)算機(jī)實(shí)施的方法包括決策規(guī)則。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述計(jì)算機(jī)實(shí)施的方法包括編碼該基因型，以使得各SNP產(chǎn)生兩個(gè)耦合的二進(jìn)制變量。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過包括決策規(guī)則的計(jì)算機(jī)實(shí)施的方法來進(jìn)行該分配，所述決策規(guī)則包括：

IF[(rs9282564＝AA)OR(rs4148412＝GG)OR(kgp8560677＝GG)]THEN RISK＝NO(低)

ELSE RISK＝Y(jié)ES(高)。

在另一實(shí)施方案中，通過包括決策規(guī)則的計(jì)算機(jī)實(shí)施的方法來進(jìn)行該分配，所述決策規(guī)則包括：

IF[(rs2295632＝CC)OR(rs1045642＝CC)OR(rs1042713＝AA)]THEN RISK＝NO(低)

ELSE RISK＝Y(jié)ES(高)。

在本文中描述的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種額外的非遺傳因素用于完善將患者分配到兩個(gè)風(fēng)險(xiǎn)組之一和/或選擇藥物劑量，所述藥物劑量與用于與患者年齡、體重、性別和種族相同的對(duì)象的標(biāo)準(zhǔn)劑量不同。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種額外的非遺傳因素選自性別、種族、年齡和診斷。

按照任何本文中所述的方法，在一個(gè)實(shí)施方案中，該患者是兒科患者。在一個(gè)實(shí)施方案中，該患者具有白人血統(tǒng)。

在一個(gè)特定實(shí)施方案中，該患者是分配至低風(fēng)險(xiǎn)組的具有白人血統(tǒng)的女性兒科患者，并且施用該阿片樣物質(zhì)藥物以使得總劑量不超過0.15毫克/千克、0.2毫克/千克或0.275毫克/千克。

在一個(gè)實(shí)施方案中，選擇鎮(zhèn)痛藥物的方法進(jìn)一步包括對(duì)分配至低風(fēng)險(xiǎn)組的患者調(diào)節(jié)阿片鎮(zhèn)痛藥的劑量，該方法包括確定或接收患者對(duì)至少一種與阿片樣物質(zhì)敏感度相關(guān)的另外的遺傳變體的基因型。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種與阿片樣物質(zhì)敏感度相關(guān)的另外的遺傳變體是ABCB1 rs2229109。根據(jù)該實(shí)施方案，對(duì)于具有ABCB1 rs2229109 CC基因型的患者，阿片鎮(zhèn)痛藥的劑量由標(biāo)準(zhǔn)劑量上調(diào)，對(duì)于具有ABCB1 rs2229109 AA基因型的患者，該劑量下調(diào)。在一個(gè)實(shí)施方案中，將該劑量調(diào)節(jié)0.04毫克/千克。本文中所用的標(biāo)準(zhǔn)劑量指的是對(duì)具有患者的年齡、體重、性別、種族和/或診斷的對(duì)象在FDA批準(zhǔn)的產(chǎn)品標(biāo)簽上標(biāo)示的劑量。

根據(jù)任何本文中所述的方法，在一個(gè)實(shí)施方案中，該患者的基因型直接接收自用于確定患者的基因型的設(shè)備。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過包括以下步驟的方法確定患者的基因型：獲得或接收來自患者的生物樣品，從該樣品中提取DNA，并分析該DNA以確定患者在該組(panel)中的各遺傳變體處的基因型。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的基因分型平臺(tái)分析該DNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，該基因分型平臺(tái)采用5’端核酸酶測(cè)定法來擴(kuò)增和檢測(cè)特定的遺傳變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，該生物樣品選自血液樣品和頰粘膜拭子。

本發(fā)明還提供了診斷試劑盒或“生物測(cè)定試劑盒”。在一個(gè)實(shí)施方案中，該生物測(cè)定試劑盒包含以下組件：(i)一組序列特異性正向和反向引物，其有效擴(kuò)增下列各SNP OPRMI rs1799971、ABCB1 rs9282564、ABCB1 rs1045642和ADRB2 rs1042713；(ii)兩個(gè)標(biāo)記的DNA探針，各自有效地雜交至該SNP的不同等位基因；和(iii)具有5’端核酸酶活性的DNA聚合酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，該生物測(cè)定試劑盒包含以下組件：(i)一組序列特異性正向和反向引物，其有效擴(kuò)增選自ABCB1 rs9282564、ABCC3 rs4148412和ABCC3 kgp8560677的一種或多種遺傳變體；(ii)兩個(gè)標(biāo)記的DNA探針，各自有效地雜交至該SNP的不同等位基因；和(iii)具有5’端核酸酶活性的DNA聚合酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，該生物測(cè)定試劑盒包含，本發(fā)明的生物測(cè)定試劑盒進(jìn)一步包含有效擴(kuò)增選自O(shè)PRM1 rs1799971、ABCC3 rs739923、FAAH rs 324420和ABCB1rs1045642的一種或多種另外的遺傳變體的一組序列特異性正向和反向引物。在一個(gè)實(shí)施方案中，該生物測(cè)定試劑盒包含以下組件：(i)一組序列特異性正向和反向引物，其有效擴(kuò)增由FAAH rs2295632、ABCB1 rs1045642和ADRB2 rs1042713組成的至少三種變體；(ii)兩個(gè)標(biāo)記的DNA探針，各自有效地雜交至該SNP的不同等位基因；和(iii)具有5’端核酸酶活性的DNA聚合酶。

附圖概述

圖1.由46.86Mb至46.89Mb的FAAH的擴(kuò)展區(qū)，其中鑒定了顯著相關(guān)的區(qū)域。存在11種受試的SNP。對(duì)單一SNP與PONY(上圖)、呼吸抑制(中圖)和總嗎啡量(毫克/千克)(下圖)的相關(guān)性顯示該-log10(p值)。

圖2.在腺樣體扁桃體切除術(shù)小組研究中觀察到的嗎啡清除率和M3G/M-6G形成清除率隨OCT1、ABCC3和ABCB1基因型的變化。

圖3A.在我們的研究中觀察到的隨ABCC3rs4793665基因型在嗎啡CL與代謝產(chǎn)物(M3G/M6G)形成清除率(FCLM3G&FCLM6G)方面的個(gè)體間差異。上圖總結(jié)了來自經(jīng)受腺樣體扁桃體切除術(shù)的研究的結(jié)果，而下圖總結(jié)了來自脊柱外科手術(shù)的結(jié)果。ABCC3 rs4793665基因型沿x軸改變。來自Nonmem分析的個(gè)體嗎啡CL(ηMor，CL)、M3G形成CL(ηM3G，F(xiàn)CL)和M6G形成CL(ηM6G，F(xiàn)CL)的經(jīng)驗(yàn)貝葉斯估計(jì)分別在y軸上繪制為左圖、中圖和右圖。

圖3B.在我們的研究中觀察到的隨ABCC3rs4148412基因型在嗎啡CL與代謝產(chǎn)物(M3G/M6G)形成清除率(FCLM3G&FCLM6G)方面的個(gè)體間差異。上圖總結(jié)了來自經(jīng)受腺樣體扁桃體切除術(shù)的研究的結(jié)果，而下圖總結(jié)了來自脊柱外科手術(shù)的結(jié)果。ABCC3 rs4148412基因型沿x軸改變。來自Nonmem分析的個(gè)體嗎啡CL(ηMor，CL)、M3G形成CL(ηM3G，F(xiàn)CL)和M6G形成CL(ηM6G，F(xiàn)CL)的經(jīng)驗(yàn)貝葉斯估計(jì)分別在y軸上繪制為左圖、中圖和右圖。

圖4A.在我們的研究中觀察到的隨ABCC3rs739923基因型在嗎啡CL和代謝產(chǎn)物(M3G/M6G)形成清除率(FCLM3G&FCLM6G)方面的個(gè)體間差異。上圖總結(jié)了來自經(jīng)受腺樣體扁桃體切除術(shù)的研究的結(jié)果，而下圖總結(jié)了來自脊柱外科手術(shù)的結(jié)果。ABCC3 rs739923基因型沿x軸改變。來自Nonmem分析的個(gè)體嗎啡CL(ηMor，CL)、M3G形成CL(ηM3G，F(xiàn)CL)和M6G形成CL(ηM6G，F(xiàn)CL)的經(jīng)驗(yàn)貝葉斯估計(jì)分別在y軸上繪制為左圖、中圖和右圖。

圖4B.在我們的研究中觀察到的隨ABCC3 kgp8560677基因型在嗎啡CL與代謝產(chǎn)物(M3G/M6G)形成清除率(FCLM3G&FCLM6G)方面的個(gè)體間差異。上圖總結(jié)了來自經(jīng)受腺樣體扁桃體切除術(shù)的研究的結(jié)果，而下圖總結(jié)了來自脊柱外科手術(shù)的結(jié)果。ABCC3 kgp8560677基因型沿x軸改變。來自Nonmem分析的個(gè)體嗎啡CL(ηMor，CL)、M3G形成CL(ηM3G，F(xiàn)CL)和M6G形成CL(ηM6G，F(xiàn)CL)的經(jīng)驗(yàn)貝葉斯估計(jì)分別在y軸上繪制為左圖、中圖和右圖。

圖5.在我們的研究中觀察到的隨ABCC3rs4148412基因型在嗎啡CL和代謝產(chǎn)物(M3G/M6G)形成清除率(FCLM3G&FCLM6G)方面的個(gè)體間差異。上圖總結(jié)了來自經(jīng)受腺樣體扁桃體切除術(shù)的研究的結(jié)果，而下圖總結(jié)了來自脊柱外科手術(shù)的結(jié)果。ABCC3 rs4148412基因型沿x軸改變。來自Nonmem分析的個(gè)體嗎啡CL(ηMor，CL)、M3G形成CL(ηM3G，F(xiàn)CL)和M6G形成CL(ηM6G，F(xiàn)CL)的經(jīng)驗(yàn)貝葉斯估計(jì)分別在y軸上繪制為左圖、中圖和右圖。

圖6.在經(jīng)受脊柱后路融合手術(shù)的青少年中驗(yàn)證ABCC3 rs733392與呼吸抑制之間的相關(guān)性。ABCC3 SNP rs733392在脊柱外科手術(shù)人群中與呼吸抑制相關(guān)聯(lián)，與在扁桃體切除術(shù)人群中發(fā)現(xiàn)的相關(guān)性一致。ABCC3 rs733392與rs733923是連鎖不平衡的；兩者均在扁桃體切除術(shù)人群中與呼吸抑制相關(guān)聯(lián)。

圖7A-7C.該圖說明了OPRM1 rs1799971變異在手術(shù)后第1天和第2天對(duì)嗎啡誘導(dǎo)的呼吸抑制(MIRD)和疼痛結(jié)果的影響。在不同基因型中MIRD的發(fā)病率(A)；在不同基因型中MIRD的風(fēng)險(xiǎn)(B)；不同基因型的疼痛評(píng)分和累積嗎啡劑量(C)。

圖8A-8B.使用SNP標(biāo)記來鑒定在需要手術(shù)后干預(yù)的患者中高vs.低風(fēng)險(xiǎn)亞型，3種SNP能夠使得大部分信號(hào)被捕獲。在各群集中RD病例的百分比；將患者分為低vs.高風(fēng)險(xiǎn)階層的決策樹，其中rs2295632_A＝No表示缺乏A等位基因，即CC，并且rs2295632＝Y(jié)es對(duì)應(yīng)于CA和AA基因型(B)。

圖9.手術(shù)后呼吸抑制與來自人Illumina Omni5GWAS芯片的ABCC3SNP之間的相關(guān)性。

圖10.嗎啡劑量與種族、性別、OSA(非OSA：左側(cè)箱型圖；OSA：右側(cè)箱型圖)與RD(無RD：左側(cè)箱型圖；RD：右側(cè)箱型圖)的相關(guān)性。OSA患者具有較低的總劑量，并且RD風(fēng)險(xiǎn)隨提高的嗎啡劑量而增加。這些結(jié)果包括了274名患者的組。

圖11.符合關(guān)系圖(consort diagram)說明了通過該臨床試驗(yàn)的研究參與者的流程。報(bào)道了合格的參與者、排除理由和入選患者。IRB＝機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)。

圖12A-12B.麻醉后恢復(fù)室(PACU)中在嗎啡相關(guān)的手術(shù)后惡心與嘔吐(PONV)方面的性別特異性差異。A：PACU中嗎啡相關(guān)PONY方面的性別特異性差異。總嗎啡劑量在x軸中繪制，嗎啡相關(guān)PONY的概率在y軸中對(duì)男孩和女孩繪制。當(dāng)總嗎啡劑量提高時(shí)，在PACU中女孩的阿片樣物質(zhì)相關(guān)PONV的總發(fā)病率與男孩相比相對(duì)較高。B：導(dǎo)致在PACU中延長(zhǎng)的停留的嗎啡相關(guān)PONY方面的性別特異性差異?？倖岱葎┝吭趚軸中繪制，PONY造成的延長(zhǎng)的PACU停留的概率在y軸中對(duì)男孩和女孩繪制。當(dāng)總嗎啡劑量提高時(shí)，導(dǎo)致延長(zhǎng)的PACU停留的PONV的概率在女孩中與男孩相比相對(duì)較高。

圖13A-13B.PACU中在嗎啡相關(guān)的呼吸抑制(RD)方面的性別特異性差異。A：PACU中嗎啡相關(guān)RD方面的性別特異性差異?？倖岱葎┝吭趚軸中繪制，嗎啡相關(guān)呼吸抑制的概率在y軸中對(duì)男孩和女孩繪制。當(dāng)總嗎啡劑量提高時(shí)，在PACU中女孩的阿片樣物質(zhì)相關(guān)呼吸抑制的總發(fā)病率與男孩相比相對(duì)較高。B：導(dǎo)致在PACU中延長(zhǎng)的停留的嗎啡相關(guān)RD方面的性別特異性差異?？倖岱葎┝吭趚軸中繪制，RD造成的延長(zhǎng)的PACU停留的概率在y軸中對(duì)男孩和女孩繪制。當(dāng)總嗎啡劑量提高時(shí)，導(dǎo)致延長(zhǎng)的PACU停留的RD的概率在女孩中與男孩相比相對(duì)較高。

圖14.在低(<0.3毫克/千克)與高(≥0.3毫克/千克)總嗎啡劑量之間在PACU中停留的持續(xù)時(shí)間方面的性別特異性差異。接受≥0.3毫克/千克總嗎啡的白人女孩在PACU中比接受<0.3毫克/千克總嗎啡的女孩(82.2±3.3分鐘)在PACU中停留更長(zhǎng)時(shí)間(111.1±6.6分鐘)。接受≥0.3毫克/千克總嗎啡的白人男孩在PACU中停留99.7±6.4分鐘，而接受<0.3毫克/千克嗎啡的男孩在PACU中停留88.3±3.6分鐘。雖然在PACU中停留的持續(xù)時(shí)間的差異在臨床上是顯著的，在低與高總嗎啡劑量之間在白人女孩中多停留大約30分鐘，其在對(duì)年齡、體重、OSA病史進(jìn)行調(diào)整后并未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著(p＝0.09)。即使在采用高劑量的女孩中延長(zhǎng)的PACU停留與在男孩中的差異并不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p＝0.09)，在通過性別分層的分析中，采用高劑量的女孩具有比采用低劑量的女孩更長(zhǎng)的PACU停留(p＝0.0002)。但是在男孩中，該差異并非統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的(p＝0.11)。

圖15.符合關(guān)系圖(consort diagram)說明了通過該臨床試驗(yàn)的研究對(duì)象的流程。報(bào)告了合格的參與者、排除理由、入選和分析的患者。IRB＝機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)。

圖16A-16C.五種ABCB1 SNP和臨床結(jié)果的遺傳相關(guān)性。繪制了在加性模型中測(cè)試的單一SNP相關(guān)性的–log10(p值)。基準(zhǔn)線顯示了–log10(0.05的p值)水平。在白人(A)、黑人(B)和混合種族(C)中進(jìn)行試驗(yàn)。在兩種種族中，該ABCB1 SNP,rs9282564一致地具有與呼吸抑制造成的延長(zhǎng)的PACU停留的顯著相關(guān)性；并且ABCB1 SNP,rs2229109與手術(shù)后嗎啡需求相關(guān)聯(lián)。RD＝呼吸抑制；PACU＝麻醉后恢復(fù)室；FLACC＝面部腿部活動(dòng)哭叫和可安慰性疼痛量表。

圖17.ABCB1基因型與呼吸抑制的風(fēng)險(xiǎn)。與具有GA基因型的兒童相比，具有rs9282564的GG基因型的兒童具有高4.7倍的導(dǎo)致在PACU中延長(zhǎng)的停留的呼吸抑制的幾率(95％CI：2.1-10.8，p＝0.0002)。與具有GA基因型的兒童相比，具有rs9282564的AA基因型的兒童具有更低[0.2(0.1-0.5)]的導(dǎo)致在PACU中延長(zhǎng)的停留的呼吸抑制的幾率。PACU＝麻醉后恢復(fù)室。

圖18.ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)和非同義多態(tài)性的基因作圖(mapping)。使用序列比對(duì)，將小鼠直系同源的3種非同義SNP的二級(jí)結(jié)構(gòu)與TM螺旋預(yù)測(cè)(http<colon slash slash>sable<dot>cchmc<dot>org)和解析結(jié)構(gòu)映射至位置21(未解析N末端片段中的紅色位點(diǎn))、400(在第一ATP結(jié)合位點(diǎn)附近顯示的藍(lán)色側(cè)鏈模型)和893(在TM10的胞內(nèi)延伸中的品紅色位點(diǎn))。對(duì)于該結(jié)構(gòu)的其余部分，黃色用于表示疏水性殘基，而紅色、橙色和棕色分別表示帶電荷和親水性殘基。該膜用符號(hào)顯示為藍(lán)色矩形。Polyview-3D(http<colon slash slash>polyview<dot>cchmc<dot>org)用于生成該圖。ABCB1SNP的效應(yīng)的基于結(jié)構(gòu)的分析：在分析的ABCB1 SNP中，rs9282564、rs2229109和rs2032582是非同義的，并分別導(dǎo)致在位置21(N vs.D)、400(S vs.N)和893(S vs.A vs.T)處的氨基酸序列改變。所有三種受影響的殘基位于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的胞漿“臂”之一中，如紅色、品紅和藍(lán)色位點(diǎn)所示。這些位點(diǎn)的第一種(殘基21)位于柔性N末端胞質(zhì)區(qū)段中，直接進(jìn)行跨膜螺旋TM1。該N末端結(jié)構(gòu)域高度可變，并含有多個(gè)帶正電荷的殘基。雖然其能夠與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白胞質(zhì)部分的其余部分相互作用，或與ABCB1輔因子相互作用，仍然需要關(guān)于此類相互作用的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)以及進(jìn)一步測(cè)序以深入了解該位點(diǎn)的功能作用。另一方面，第二變體(藍(lán)色位點(diǎn))的結(jié)構(gòu)背景的詳細(xì)分析表明，其有可能在調(diào)節(jié)ABCB1功能方面起到直接作用。位置400，雖然本身在進(jìn)化上并不保守，在側(cè)面與形成FSY基序的2個(gè)強(qiáng)保守芳族殘基相接。這兩個(gè)殘基接觸另一保守位點(diǎn)，包括殘基442-445(RLYD)。這兩個(gè)暴露于溶劑的環(huán)一起構(gòu)成該ATP結(jié)合位點(diǎn)的直接鄰近區(qū)域(盡管它們并未與之直接接觸)，其包括殘基427-434(顯示為綠色)，當(dāng)這些環(huán)被預(yù)測(cè)在ATP水解時(shí)發(fā)生構(gòu)象變化時(shí)，Asn400等位基因可能影響這些變化如何通過整體結(jié)構(gòu)傳播并有助于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的開啟與關(guān)閉。剩余的2種SNP，即rs1128503和rs1045642，是同義的。有趣的是，這2種SNP彼此相對(duì)強(qiáng)連鎖，以及與非同義的rs2032582(但不與其它2個(gè)非同義SNP，rs9282564與rs2229109)強(qiáng)連鎖。在1000種基因組CEU群組中，在rs2032582與這2種非同義SNP之間觀察到0.87和0.51的r2。所有這些SNP可能是另一種多態(tài)性連鎖不平衡的有效標(biāo)記物，例如影響ABCB1蛋白的表達(dá)。將需要進(jìn)一步的測(cè)序、結(jié)構(gòu)與生化研究來確認(rèn)真實(shí)的功能標(biāo)記物。

圖19.主組分一和二的散點(diǎn)圖。使用Golden Helix Software與218種祖先信息標(biāo)記(AIM)進(jìn)行主組分分析。研究組的自行報(bào)告的種族(白色人種顯示為紅色圓圈，黑色人種顯示為藍(lán)色圓圈)與來自HapMap項(xiàng)目的參考人群(空心三角形)作圖。參考人群通過下列縮寫和如下的不同顏色的空心三角形來表示：ΔCEU＝具有北歐和西歐血統(tǒng)的猶他州居民；ΔASW＝在美國(guó)西南部的非洲血統(tǒng)；ΔLWK＝在肯尼亞韋布耶(Webuye,Kenya)的盧希亞族(Luhya)；ΔMKK＝在肯尼亞肯雅瓦(Kinyawa,Kenya)的馬賽人(Maasai)；ΔYRI＝在尼日利亞伊巴丹(Ibadan,Nigeria)的約魯巴人(Yoruba)；ΔCHD＝在科羅拉多州丹佛大都市(Metropolitan Denver,Colorado)的中國(guó)人；ΔCHB＝在中國(guó)北京的中國(guó)漢族人；ΔJPT＝在日本東京的日本人；并且ΔGIH＝在得克薩斯州休斯敦(Houston,Texas)的古吉拉特印度人(Gujarati Indians)。

圖20.本文中描述的系統(tǒng)的示意圖。

發(fā)明詳述

本發(fā)明提供了對(duì)需要鎮(zhèn)痛的患者選擇鎮(zhèn)痛藥物的方法和鑒定處于嚴(yán)重的阿片樣物質(zhì)誘導(dǎo)的不良事件風(fēng)險(xiǎn)下的患者的方法，該方法包括確定或接收患者對(duì)至少一種遺傳變體的基因型，并至少部分基于患者對(duì)至少一種遺傳變體的基因型將患者分配到兩個(gè)嚴(yán)重阿片樣物質(zhì)誘導(dǎo)不良事件的風(fēng)險(xiǎn)組，即低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組之一中。本發(fā)明還提供了對(duì)需要鎮(zhèn)痛藥物的患者調(diào)節(jié)鎮(zhèn)痛藥物劑量的方法，該方法包括確定或接收患者對(duì)至少一種遺傳變體的基因型并由此如本文中所述調(diào)節(jié)該藥物的劑量。在一個(gè)實(shí)施方案中，該鎮(zhèn)痛藥物是阿片樣物質(zhì)鎮(zhèn)痛藥。在一個(gè)實(shí)施方案中，該阿片樣物質(zhì)鎮(zhèn)痛藥是嗎啡。在一方面，本發(fā)明提供遺傳變體，其單獨(dú)或與其它遺傳變體或非遺傳因素結(jié)合指示對(duì)具有特定基因型的患者的一種或多種阿片樣物質(zhì)相關(guān)不良事件的更高風(fēng)險(xiǎn)，或較差的疼痛控制，或兩者。在一個(gè)實(shí)施方案中，該遺傳變體是單核苷酸多態(tài)性或SNP。

本發(fā)明還提供了結(jié)合本文中描述的遺傳相關(guān)性以形成可用于提供個(gè)性化干預(yù)來降低不良事件風(fēng)險(xiǎn)和提高鎮(zhèn)痛藥效力的臨床結(jié)果的預(yù)測(cè)模型的決策樹和算法。這些決策樹和算法還可用于評(píng)價(jià)施用阿片類藥物和/或鎮(zhèn)痛藥的效力和安全性。使用本文中描述的決策樹和算法可以通過以最小的不良反應(yīng)提供更好的鎮(zhèn)痛來改善圍手術(shù)期的臨床結(jié)果，以及通過減少延長(zhǎng)的PACU停留、疼痛控制不足的急診患者、阿片樣物質(zhì)誘導(dǎo)的嘔吐后的脫水、以及需要氧氣和強(qiáng)烈的呼吸支持措施的呼吸抑制來改進(jìn)經(jīng)濟(jì)成果。這些臨床決策算法能夠定制阿片樣物質(zhì)的選擇和計(jì)量給藥以最大程度地緩解疼痛，同時(shí)盡量減少嚴(yán)重不良事件的風(fēng)險(xiǎn)。這些發(fā)現(xiàn)可以推斷至需要阿片類藥物的具有手術(shù)或非手術(shù)疼痛的成人和兒童。除非另行說明，術(shù)語(yǔ)由相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)常規(guī)用法來理解。

“單核苷酸多態(tài)性”或“SNP”是當(dāng)基因組中的特定位置處的單一核苷酸在物種成員之間或在個(gè)體中的成對(duì)染色體之間不同時(shí)發(fā)生的DNA序列變異。大多數(shù)SNP多態(tài)性具有兩個(gè)等位基因。各個(gè)體在這種情況下對(duì)該多態(tài)性的一種等位基因是純合的(即該個(gè)體的兩種染色體復(fù)制在該SNP位置處具有相同的核苷酸)，或該個(gè)體是雜合的(即該個(gè)體的兩個(gè)姊妹染色體含有不同的核苷酸)。本文中報(bào)道的SNP命名法指的是由國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)分配給每個(gè)獨(dú)特的SNP的官方參考SNP(rs)ID鑒定標(biāo)簽或確定與鑒定的多態(tài)性相關(guān)的殘基變化。

本文中所用的術(shù)語(yǔ)“查找表”是將一種數(shù)據(jù)形式關(guān)聯(lián)至另一種形式，或?qū)⒁环N或多種數(shù)據(jù)形式關(guān)聯(lián)至該數(shù)據(jù)與之相關(guān)的預(yù)測(cè)結(jié)果(如表型或性狀)的表格。例如，查找表可以包括在本文中所述的遺傳變體與特定的性狀或表型(例如與藥物相關(guān)的不良事件的風(fēng)險(xiǎn)或標(biāo)準(zhǔn)劑量下不足的藥物活性)之間的相關(guān)性，攜帶該變體的個(gè)體與未攜帶該變體的個(gè)體相比可能顯示，或更可能顯示所述相關(guān)性。查找表可以是多維的，即它們可以含有關(guān)于多種遺傳變體，例如等位基因、SNP、基因刪除或插入的信息，或者它們可以含有關(guān)于多種變體的信息；它們還可以包含其它非遺傳因素，包括患者特異性臨床數(shù)據(jù)，如診斷、性別、種族、合并癥等等，以及關(guān)于治療選項(xiàng)的信息，包括例如治療方法與藥物。

本文中所用的術(shù)語(yǔ)“決策樹”指的是用于多變量數(shù)據(jù)分析與分類的標(biāo)準(zhǔn)機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)(Hastie,T.,等人The Elements of Statistical Learning,第二版,Springer(2009)；Witten,I.和Frank,E.Data Mining:Practical Machine Learning Tools and Techniques,第二版,Morgan Kaufmann,San Francisco(2005)；Hothorn,T.Journal of Computational and Graphical Statistics,15:651-74(2010))。決策樹可用于導(dǎo)出用于決策支持系統(tǒng)的容易解釋和直觀的規(guī)則。

本發(fā)明的實(shí)施方案包括單獨(dú)地使用各遺傳變體作為診斷或預(yù)后標(biāo)記，或使用合并為一組的兩種或更多種變體，其中該組是該表型的更好的預(yù)測(cè)工具(例如藥物誘導(dǎo)或藥物相關(guān)的不良事件，或標(biāo)準(zhǔn)劑量下藥物的無效)。

遺傳變體與非遺傳因素

本發(fā)明提供了用于臨床決策支持的方法，例如對(duì)有需要的患者選擇適當(dāng)?shù)逆?zhèn)痛藥物的方法，以及鑒定處于嚴(yán)重的藥物誘導(dǎo)(或藥物相關(guān))的不良事件風(fēng)險(xiǎn)下的患者的方法。該方法單獨(dú)或與其它遺傳或非遺傳因素如年齡、性別、種族、合并癥、診斷等等結(jié)合地利用關(guān)于病人在特定遺傳變體處的基因型的信息以報(bào)告對(duì)該患者的適當(dāng)藥物選擇和鑒定處于嚴(yán)重的藥物誘導(dǎo)(或藥物相關(guān))不良事件的風(fēng)險(xiǎn)下的患者，尤其是高風(fēng)險(xiǎn)的那些。

ATP結(jié)合盒B1(ABCB1)(也稱為MCR1)

嗎啡在大腦中的濃度受血腦屏障處的P-糖蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，ABCB1的影響。ABCB1的多態(tài)性，3435C>T，已經(jīng)與成人體內(nèi)嗎啡的血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)活性聯(lián)系在一起，并且純合的TT基因型與高于其它基因型的最大CSF嗎啡濃度相關(guān)聯(lián)(Meineke,I.等人,British Journal of Clinical Pharmacology,54:592-603(2002))。此前，同樣的ABCB1多態(tài)性，3435C>T，已經(jīng)與接收另一種阿片樣物質(zhì)——芬太尼的韓國(guó)成年人中增加的呼吸抑制相關(guān)聯(lián)(Park,H.等人,Clin.Pharmacol.Ther.,81:539-546(2007))，但是在實(shí)施例7中詳細(xì)描述的研究之前，ABCB1變體是否與兒童中嗎啡誘導(dǎo)的呼吸抑制相關(guān)聯(lián)還是未知的。如該實(shí)施例中所述，ABCB1 rs9282564在白種人和非洲裔美國(guó)人兒童中與呼吸抑制導(dǎo)致的延長(zhǎng)的PACU停留高度相關(guān)(沒有檢測(cè)到種族特異性影響)。因此，ABCB1 rs9282564 GG純合子具有增加的導(dǎo)致延長(zhǎng)住院的呼吸抑制風(fēng)險(xiǎn)。在這項(xiàng)研究中觀察到的另一臨床相關(guān)性是在PACU中需要拯救劑量的嗎啡的兒童中在ABCB1 rs2229109與手術(shù)后嗎啡劑量之間。ABCB1 rs2229109的次要等位基因(A)的每個(gè)額外拷貝將手術(shù)后嗎啡劑量降低0.04毫克/千克(95％CI：0.01-0.07)。因此，當(dāng)需要手術(shù)后鎮(zhèn)痛藥干預(yù)時(shí)，ABCB1 rs2229109 CC純合子需要更多的嗎啡，而具有AA基因型的兒童對(duì)嗎啡更敏感，需要較少的嗎啡。

ABCC3

淚小管多特異性有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2由ABCC3基因編碼，其主要在肝細(xì)胞的基底外側(cè)表面中表達(dá)(Scheffer,G.,等人,Lab Invest.,82:193-201(2002))并已經(jīng)報(bào)道對(duì)葡糖苷酸類(包括嗎啡的活性代謝產(chǎn)物M3G和M6G)具有高親和力(Zelcer,N.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,102:7274-9(2005))。已經(jīng)報(bào)道具有-211C>T TT基因型的受試者與CC基因型相比在肝臟組織中mRNA表達(dá)降低，假設(shè)由于降低的核蛋白對(duì)該基因的啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合(Lang,T.等人,Pharmacogenetics,14:155-64(2004)；Gradhand,U.等人,Life Sci.,80:1490-4(2007))。如在實(shí)施例2中詳細(xì)描述的那樣，在ABCC3 rs4793665處具有C/C基因型的兒童的兩種嗎啡活性代謝產(chǎn)物形成高41至46％，表明這種基因型對(duì)嗎啡的藥代動(dòng)力學(xué)具有顯著影響，并提供了與非洲裔美國(guó)人相比在白種人中較低的嗎啡清除率和更高的嗎啡不良反應(yīng)發(fā)病率的可能解釋，因?yàn)檫@種基因型更常見于白種人。如實(shí)施例3中所討論的那樣，ABCC3 rs4793665的藥代動(dòng)力學(xué)效果得到了證實(shí)，并且鑒定了具有顯著藥代動(dòng)力學(xué)效果的另一ABCC3變體。還發(fā)現(xiàn)該ABCC3 rs4148412 AA基因型相對(duì)于其它基因型與更多嗎啡活性代謝產(chǎn)物形成相關(guān)聯(lián)。此外，多種ABCC3變體被確定為與包括不良事件(例如手術(shù)后惡心和嘔吐，以及呼吸抑制造成的延長(zhǎng)的恢復(fù))的臨床結(jié)果和總嗎啡需求量顯著相關(guān)。這些包括例如ABCC3 rs4148412、rs739923和kgp8560677。其它在實(shí)施例3中描述。

脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)

脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)是內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)的一部分，負(fù)責(zé)花生四烯酸乙醇胺分解代謝。花生四烯酸乙醇胺是嘔吐的神經(jīng)調(diào)節(jié)劑。作為CB受體的內(nèi)源性激動(dòng)劑，F(xiàn)AAH降解花生四烯酸乙醇胺。Canniboid激動(dòng)劑是通過CB1受體針對(duì)阿片類藥物的有效止吐藥。如實(shí)施例1中詳細(xì)描述的那樣，在PONV與三種SNP(rs324420、rs2295632和kgp12517369)之間，和在總嗎啡劑量與白種人患者中的rs647325之間檢測(cè)到顯著的相關(guān)性。但是，在非洲裔美國(guó)人患者中，對(duì)任何結(jié)果僅檢測(cè)到象征性的相關(guān)性。在白種人中，增加FAAH rs4141964、FAAH rs3766246、FAAH rs324420、FAAH rs2295632和FAAH kgp12517369的次要等位基因的一個(gè)拷貝分別將PONV的幾率提高2.42倍、2.42倍、2.73倍、2.61倍和2.61倍(P<0.0018)。FAAH rs324420與PONV顯著相關(guān)(P＝0.0053)，增加次要等位基因(A)的一個(gè)拷貝可以將比值比提高2.0倍；并且其還與導(dǎo)致延長(zhǎng)的PACU停留的PONV相關(guān)(P＝0.0209)，增加次要等位基因(A)的一個(gè)拷貝可以將比值比提高2.2倍。如實(shí)施例3中所述，用更大的樣本進(jìn)一步驗(yàn)證了FAAH rs324420與PONV的強(qiáng)相關(guān)性。

阿片樣物質(zhì)受體μ1(OPRM1)

編碼該受體的阿片樣物質(zhì)受體mu 1(OPRM1)基因可以是改變疼痛感覺和響應(yīng)阿片類藥物的候選基因(Mogil,J.Proc.Natl.Adac.Sci.U.S.A.,96:7744-51(1999))。OPRM1rs1799971(A118G)導(dǎo)致在腦中降低的μ-受體結(jié)合潛力(Ray,R.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,108:9268-73(2011))。該GG純合基因型的成人攜帶者可能需要比AA變體高達(dá)2-4倍的嗎啡劑量。實(shí)施例4描述了首次前瞻性臨床試驗(yàn)，該試驗(yàn)表明，與AG/GG基因型的攜帶者相比，呼吸抑制風(fēng)險(xiǎn)在OPRM1AA基因型攜帶者中更高，盡管他們對(duì)嗎啡的需求量更低，且該試驗(yàn)進(jìn)一步表明，存在G等位基因具有保護(hù)效果。這種相關(guān)性可用于鑒定呼吸抑制風(fēng)險(xiǎn)更高的兒童，并個(gè)性化嗎啡在兒童中的使用以最大程度地緩解疼痛并同時(shí)盡量減少嚴(yán)重不良事件的可能性。

OCT1

雖然嗎啡作為OCT1的底物已經(jīng)充分表征，實(shí)施例2中描述的OCT1在其活性代謝產(chǎn)物的攝取中的作用是此前未知的。實(shí)施例2中呈現(xiàn)的結(jié)果表明，OCT1對(duì)嗎啡清除率的效果可能遠(yuǎn)高于目前估計(jì)的16％，意味著純合的受試者將體驗(yàn)更好的鎮(zhèn)痛，但是將體驗(yàn)響應(yīng)嗎啡計(jì)量給藥的更嚴(yán)重的不良反應(yīng)。

阻塞性睡眠呼吸暫停(OSA)

阻塞性睡眠呼吸暫停(OSA)在非洲裔美國(guó)人患者中比例偏大，其反過來更有可能具有更高的疼痛緩解不足的風(fēng)險(xiǎn)。OSA和種族因此代表了重要的協(xié)變量；這通過以下發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步得到了強(qiáng)調(diào)：ADRB2和FAAH基因多態(tài)性可用于相對(duì)準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)種族(具有～80％的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度)。OSA本身似乎還具有相對(duì)較強(qiáng)(盡管難以理解的)的遺傳組分(Larkin,E.等人Resp.Crit.Care Med.182:947-53(2010))。OSA還是扁桃體切除術(shù)的指征。

性別

盡管許多臨床前和實(shí)驗(yàn)研究表明在雄性與雌性嚙齒類動(dòng)物之間在疼痛調(diào)控方面存在差異，并且在成人中，就雌性中增加的疼痛和阿片樣物質(zhì)敏感度而言，研究術(shù)后疼痛和性別差異的臨床試驗(yàn)是不一致的。此外，來自成人試驗(yàn)的涉及阿片樣物質(zhì)鎮(zhèn)痛藥的性別差異的數(shù)據(jù)不足以可靠地指導(dǎo)兒科臨床實(shí)踐(Hurley R.和Adams M.Anesth.Analg.,107:309-17(2008))。如在實(shí)施例6中詳細(xì)討論的那樣，在手術(shù)后惡心與嘔吐(PONV,p＝0.001)和PONY導(dǎo)致的延長(zhǎng)的PACU停留(p＝0.010)中檢測(cè)到顯著的性別特異性效應(yīng)。在女孩中，具有這些不良反應(yīng)的概率隨總嗎啡劑量而提高。

對(duì)標(biāo)記物和單倍型的評(píng)估

檢測(cè)特定的多態(tài)性標(biāo)記物和/或單倍型可以通過本領(lǐng)域已知用于檢測(cè)多態(tài)性位點(diǎn)處的序列的方法來實(shí)現(xiàn)。例如，可以使用對(duì)SNP和/或微衛(wèi)星標(biāo)記物存在進(jìn)行基因分型的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如基于熒光的技術(shù)(例如Chen,X.等人,Genome Res.9(5):492-98(1999)；Kutyavin等人,Nucleic Acid Res.34:e128(2006))，采用PCR、LCR、巢式PCR和用于核酸擴(kuò)增的其它技術(shù)?？捎糜赟NP基因分型的具體商業(yè)方法包括但不限于TaqMan基因分型測(cè)定和SNPlex平臺(tái)(Applied Biosystems)、凝膠電泳(Applied Biosystems)、質(zhì)譜分析法(例如來自Sequenom的MassARRAY系統(tǒng))、微測(cè)序法、實(shí)時(shí)PCR、Bio-Plex系統(tǒng)(BioRad)、CEQ和SNPstream系統(tǒng)(Beckman)、陣列雜交技術(shù)(例如Affymetrix GeneChip；Perlegen)、BeadArray Technologies(例如Illumina GoldenGate和Infinium測(cè)定)、陣列標(biāo)簽技術(shù)(例如Parallele)和基于核酸內(nèi)切酶的熒光雜交技術(shù)(Invader；Third Wave)。因此，通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員可得的這些或其它方法，可以鑒定在多態(tài)性標(biāo)記處的一個(gè)或多個(gè)等位基因，包括微衛(wèi)星、SNP或其它類型的多態(tài)性標(biāo)記物。

對(duì)疾病或形狀具有提高的易感性(即增加的風(fēng)險(xiǎn))的個(gè)體是其中在一種或多種賦予對(duì)疾病或形狀的提高的易感性的多態(tài)性標(biāo)記物或單倍型(即高危標(biāo)記物等位基因或單倍型)處的至少一個(gè)特異性等位基因被鑒定的個(gè)體。所述高危標(biāo)記物或單倍型是賦予增加的疾病風(fēng)險(xiǎn)(提高的易感性)的高危標(biāo)記物或單倍型。在一些實(shí)施方案中，與標(biāo)記物或單倍型相關(guān)聯(lián)的顯著性通過相對(duì)危險(xiǎn)度(RR)來量度。在一些實(shí)施方案中，與標(biāo)記物或單倍型相關(guān)聯(lián)的顯著性通過比值比(OR)來量度。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該顯著性通過百分比來量度。

本文中所述的高危多態(tài)性標(biāo)記物或單倍型是這樣的多態(tài)性標(biāo)記物或單倍型：與其在比較組(對(duì)照物)中存在的頻率相比，至少一種標(biāo)記物或單倍型的至少一個(gè)等位基因更頻繁地存在于存在性狀風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體中，例如存在緩解疼痛不足或來自鎮(zhèn)痛藥(尤其是阿片類藥物)的不良反應(yīng)(例如手術(shù)后惡心和嘔吐，其可能是頑固性的，呼吸抑制，以及呼吸抑制導(dǎo)致的處于延長(zhǎng)的恢復(fù))的風(fēng)險(xiǎn)，特別是在圍手術(shù)期疼痛的治療過程中的風(fēng)險(xiǎn)，使得該標(biāo)記物或單倍型指示對(duì)該性狀的易感性。在一些實(shí)施方案中，該對(duì)照組可以是人群抽樣，即來自一般人群的隨機(jī)樣本。在一些實(shí)施方案中，該對(duì)照組的特征在于不存在一種或多種額外的非遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素，例如性別、年齡和種族。在一些實(shí)施方案中，該風(fēng)險(xiǎn)因素包含至少一種額外的遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，具有對(duì)性狀的降低的易感性(即具有降低的風(fēng)險(xiǎn))的個(gè)體是其中在一種或多種賦予降低的易感性的多態(tài)性標(biāo)記物或單倍型處的至少一個(gè)特異性等位基因被鑒定的個(gè)體。賦予降低風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)記物等位基因和/或單倍型也被稱為是保護(hù)性的。在一些實(shí)施方案中，所述保護(hù)性標(biāo)記物或單倍型是賦予對(duì)性狀的顯著降低風(fēng)險(xiǎn)(或易感性)的標(biāo)記物或單倍型。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，對(duì)于存在于所研究的人群中的具有兩個(gè)等位基因的標(biāo)記(如SNP)，并且其中與對(duì)照組相比在該人群中在具有一種性狀的個(gè)體組中發(fā)現(xiàn)一個(gè)等位基因的頻率提高，該標(biāo)記物的另一等位基因與對(duì)照組相比被發(fā)現(xiàn)在具有所述性狀的所述個(gè)體組中的頻率將降低。在這種情況下，該標(biāo)記物的一個(gè)等位基因(在具有該性狀的個(gè)體中被發(fā)現(xiàn)頻率提高的所述等位基因)將是高危等位基因，而另一個(gè)等位基因?qū)⑹潜Ｗo(hù)性等位基因。

與性狀相關(guān)聯(lián)的遺傳變體可以單獨(dú)用于預(yù)測(cè)對(duì)給定基因型的疾病風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于雙等位基因標(biāo)記物，如SNP，存在三種可能的基因型：該高危變體的純合子、雜合子，以及該高危變體的非攜帶者。與多個(gè)基因座處的變體相關(guān)聯(lián)的風(fēng)險(xiǎn)可用于評(píng)估整體風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于多SNP變體，存在k種可能的基因型，k＝3ⁿ×2^p；其中n是常染色體基因座的數(shù)量，p是生殖體(性染色體)基因座的數(shù)量。對(duì)于多種風(fēng)險(xiǎn)變體的整體風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估計(jì)算通常假定不同的遺傳變體的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)相乘，即與特定基因型組合相關(guān)聯(lián)的整體風(fēng)險(xiǎn)(例如RR或OR)是各基因座處的基因型的風(fēng)險(xiǎn)值的乘積。如果呈現(xiàn)的風(fēng)險(xiǎn)是與具有相匹配的性別與種族的參考人群相比對(duì)一個(gè)人或一個(gè)人的特定基因型的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)，那么組合風(fēng)險(xiǎn)是基因座特異性風(fēng)險(xiǎn)值的乘積，并且其還對(duì)應(yīng)于與該人群相比的整體風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。如果一個(gè)人的風(fēng)險(xiǎn)基于對(duì)高危等位基因的非攜帶者的比較，那么組合風(fēng)險(xiǎn)對(duì)應(yīng)于將帶有在所有基因座處的基因型的給定組合的人與在任何這些基因座處未攜帶風(fēng)險(xiǎn)變體的個(gè)體組進(jìn)行比較的評(píng)估。任何高危變體的非攜帶者的組具有最低的評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)，并具有與其自身(即非攜帶者)相比為1.0的組合風(fēng)險(xiǎn)，但是具有與該人群相比小于1.0的整體風(fēng)險(xiǎn)。應(yīng)當(dāng)注意，非攜帶者的組可能非常小，尤其是對(duì)于大量基因座，并且在這種情況下，其相關(guān)性相應(yīng)地較小。

該增殖模型是通常相當(dāng)出色地適合復(fù)雜性狀的數(shù)據(jù)的簡(jiǎn)約模型。在常見疾病的常見變體背景下極少描述來自多樣性的偏差，如果報(bào)道的話，通常僅僅是暗示性的，因?yàn)橥ǔＰ枰浅４蟮臉悠妨恳员隳軌蛘故净蜃g的統(tǒng)計(jì)交互作用。

舉例而言，考慮已經(jīng)描述與前列腺癌相關(guān)聯(lián)的總計(jì)八種變體(Gudmundsson等人,Nat Genet 39:631-7(2007)；Gudmundsson等人,Nat Genet 39:977-83(2007)；Yeager等人,Nat Genet 39:645-49(2007)；Amundadottir等人,Nat Genet 38:652-8(2006)；Haiman等人,Nat Genet 39:638-44(2007))。這些基因座的七種在常染色體上，剩下的基因座在染色體X上。理論基因型組合的總數(shù)由此為37×21＝4374。這些基因型類別的一部分是非常罕見的，但仍然是可能的，這些可以考慮用于整體風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。在多種遺傳變體的情況下應(yīng)用的增殖模型與非遺傳風(fēng)險(xiǎn)變體結(jié)合也是有效的，假定該遺傳變體并未明確地與“環(huán)境”因素相關(guān)。換句話說，可以在該增殖模型下評(píng)定該遺傳和非遺傳高危變體以評(píng)估組合風(fēng)險(xiǎn)，假定該非遺傳和遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素并未相互作用。

采用相同的量化方法，可以評(píng)價(jià)與不良麻醉反應(yīng)相關(guān)聯(lián)的多種變體相關(guān)的組合或整體風(fēng)險(xiǎn)，包括本文中公開的標(biāo)記物和/或多態(tài)性的任意一種，或與其存在連鎖不平衡的標(biāo)記物的組合。

風(fēng)險(xiǎn)計(jì)算

創(chuàng)建計(jì)算整體遺傳風(fēng)險(xiǎn)的模型包括兩個(gè)步驟：i)將單個(gè)遺傳變體的比值比轉(zhuǎn)化成相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)；和ii)將來自不同遺傳基因座的多種變體的風(fēng)險(xiǎn)組合成單一相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)值。

從比值比推導(dǎo)風(fēng)險(xiǎn)

因其追溯性設(shè)置，迄今為止已經(jīng)在權(quán)威刊物中公開的大多數(shù)對(duì)復(fù)雜疾病或性狀的基因發(fā)現(xiàn)研究都采用了病例對(duì)照設(shè)計(jì)。這些研究樣本和基因型選擇一組病例(患有特定疾病病癥的人)和對(duì)照個(gè)體。目的在于其在病例與對(duì)照樣本中的頻率明顯不同的遺傳變體(等位基因)。

該結(jié)果通常以比值比來報(bào)道，比值比描述了在受影響的組中風(fēng)險(xiǎn)變體(攜帶者)對(duì)非風(fēng)險(xiǎn)變體(非攜帶者)的分?jǐn)?shù)(概率)與對(duì)照組中風(fēng)險(xiǎn)變體(攜帶者)對(duì)非風(fēng)險(xiǎn)變體(非攜帶者)的分?jǐn)?shù)(概率)的比，即表示為受影響狀態(tài)條件下的概率：

OR＝(Pr(c|A)/Pr(nc|A))/(Pr(c|C)/Pr(nc|C))

在一些實(shí)施方案中，該疾病或性狀的絕對(duì)風(fēng)險(xiǎn)是確定的風(fēng)險(xiǎn)，即患有該疾病的攜帶該風(fēng)險(xiǎn)變體的那些個(gè)體的分?jǐn)?shù)，或者換句話說，患上該疾病的概率。該數(shù)字不能在病例對(duì)照研究中直接測(cè)量，部分是由于病例對(duì)對(duì)照組的比通常不同于在一般人群中的比。但是，在某些假設(shè)下，該風(fēng)險(xiǎn)可以由該比值比的值計(jì)算。

組合來自多種標(biāo)記物的風(fēng)險(xiǎn)

當(dāng)許多SNP變體的基因型用于評(píng)估個(gè)體的風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，除非另行說明，可以假定風(fēng)險(xiǎn)的增殖模型。這意味著相對(duì)于該人群的綜合遺傳風(fēng)險(xiǎn)計(jì)算為個(gè)別標(biāo)記物的相應(yīng)評(píng)估值的乘積，例如，對(duì)于兩種標(biāo)記物g1和g2：

RR(g1,g2)＝RR(g1)RR(g2)

基本假設(shè)在于：風(fēng)險(xiǎn)因素獨(dú)立地發(fā)生和起作用，即聯(lián)合條件概率可以表現(xiàn)為以下的乘積：

Pr(A|g1,g2)＝Pr(A|g1)Pr(A|g2)/Pr(A)和Pr(g1,g2)＝Pr(g1)Pr(g2)

在其中標(biāo)記物在基因組上緊密間隔的實(shí)施方案中，即存在連鎖不平衡以使得兩個(gè)或更多個(gè)風(fēng)險(xiǎn)等位基因的同步發(fā)生是相關(guān)的，可以使用單倍型建模，其中對(duì)相關(guān)SNP的所有等位基因組合進(jìn)行定義比值比。

作為實(shí)例，考慮在四種標(biāo)記物處具有下列基因型的個(gè)體，所述四種標(biāo)記物與II型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)以及在各標(biāo)記物處相對(duì)于該人群的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)：

Chromo 3PPARG CC計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)：RR(CC)＝1.03

Chromo 6CDKAL1GG計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)：RR(GG)＝1.30

Chromo 9CDKN2A AG計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)：RR(AG)＝0.88

Chromo 11TCF7L2TT計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)：RR(TT)＝1.54

該個(gè)體的相對(duì)于該人群的組合的、整體風(fēng)險(xiǎn)為：1.03×1.30×0.88×1.54＝1.81。

風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

本發(fā)明的實(shí)施方案可以涉及評(píng)估包含來自個(gè)體的基因組DNA的樣品是否存在與不良藥物反應(yīng)(具體為阿片類藥物，特別是嗎啡)相關(guān)的本文中所述的變體的方法。此類方法通常包括使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知并在本文中進(jìn)一步描述的方法檢測(cè)至少一種多態(tài)性標(biāo)記物的至少一個(gè)等位基因的存在或不存在，并基于此類評(píng)估的結(jié)果，確定獲取該樣品的個(gè)體處于增加還是降低的不良麻醉反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)(提高或降低的易感性)。在一些實(shí)施方案中，可以通過獲得關(guān)于鑒定至少一種多態(tài)性標(biāo)記物的至少一個(gè)等位基因的特定人類個(gè)體的核酸序列數(shù)據(jù)來進(jìn)行多態(tài)性標(biāo)記物的特定等位基因的檢測(cè)。該至少一種標(biāo)記物的不同等位基因與人體中對(duì)此類反應(yīng)的不同易感性相關(guān)。獲得核酸序列數(shù)據(jù)可以包括確定單一核苷酸位置處的核酸序列，其足以確定在SNP處的等位基因。該核酸序列數(shù)據(jù)還可以包含在任何其它數(shù)量的核苷酸位置處的序列信息，特別是對(duì)于包含多個(gè)核苷酸位置的遺傳標(biāo)記物，并可以是兩個(gè)至數(shù)十萬個(gè)，可能甚至數(shù)百萬個(gè)核苷酸的任何位置(特別是在CNV的情況下)。

在一些實(shí)施方案中，該方法包括利用包含關(guān)于與疾病或形狀相關(guān)的至少一種多態(tài)性標(biāo)記物(或與該疾病或形狀相關(guān)的至少一種標(biāo)記物存在連鎖不平衡的標(biāo)記物)的基因型狀態(tài)的信息的數(shù)據(jù)集。換句話說，含有關(guān)于此類遺傳狀態(tài)的信息的數(shù)據(jù)集，所述信息例如為序列數(shù)據(jù)、在特定多態(tài)性標(biāo)記物處的基因型計(jì)數(shù)或多種標(biāo)記物(例如指示存在或不存在某些高危等位基因)，或?qū)σ环N或多種標(biāo)記物的實(shí)際基因型的形式，可以查詢與該疾病或性狀相關(guān)聯(lián)的本文中公開的在某些多態(tài)性標(biāo)記物處存在或不存在某些高危等位基因。與該疾病或性狀相關(guān)聯(lián)的變體(例如標(biāo)記物等位基因)的陽(yáng)性結(jié)果指示該個(gè)體(該數(shù)據(jù)集衍生自該個(gè)體)處于該疾病的提高的易感性(增加的風(fēng)險(xiǎn))。

在一些實(shí)施方案中，通過將該多態(tài)性標(biāo)記物的基因型數(shù)據(jù)參考包含該多態(tài)性的至少一個(gè)等位基因與該疾病之間的關(guān)聯(lián)的查找表，由此將多態(tài)性標(biāo)記物與疾病或性狀相關(guān)聯(lián)。在一些實(shí)施方案中，該表包含對(duì)一種多態(tài)性的關(guān)聯(lián)。在一些實(shí)施方案中，該表包含對(duì)多種多態(tài)性的關(guān)聯(lián)。通過參考提供標(biāo)記物與疾病之間的關(guān)聯(lián)的指示的查找表，可以在獲取該樣品的個(gè)體中鑒定對(duì)該疾病或性狀的風(fēng)險(xiǎn)或?qū)υ摷膊』蛐誀畹囊赘行浴Ｔ谝恍?shí)施方案中，該關(guān)聯(lián)性報(bào)道為統(tǒng)計(jì)量度。統(tǒng)計(jì)度量可以報(bào)道為風(fēng)險(xiǎn)量度，如相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)(RR)、絕對(duì)風(fēng)險(xiǎn)(AR)或比值比(OR)。

本文中描述的標(biāo)記物可以單獨(dú)或結(jié)合地用于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和診斷目的?；诒疚闹兴鰳?biāo)記物的遭受不良麻醉反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)結(jié)果也可以與不良麻醉反應(yīng)的其它遺傳標(biāo)記物或風(fēng)險(xiǎn)因素的數(shù)據(jù)結(jié)合以建立整體風(fēng)險(xiǎn)。因此，即使在其中通過個(gè)別標(biāo)記物在風(fēng)險(xiǎn)方面的增加相對(duì)適度(例如大約10-30％)的情況下，該相關(guān)性可能具有顯著的影響。因此，相對(duì)常見的變體可能對(duì)整體風(fēng)險(xiǎn)具有顯著作用(人群歸因危險(xiǎn)度高)，或者標(biāo)記物的組合可用于限定根據(jù)該標(biāo)記物的組合風(fēng)險(xiǎn)處于發(fā)展不良麻醉反應(yīng)導(dǎo)致的并發(fā)癥的顯著組合風(fēng)險(xiǎn)下的個(gè)體組。

因此，在一些實(shí)施方案中，多種變體(遺傳標(biāo)記物、生物標(biāo)記和/或單倍型)用于整體風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。在一些實(shí)施方案中，這些變體可以選自本文中所公開的變體。在一些實(shí)施方案中，使用本文中公開的變體結(jié)合已知可用于診斷對(duì)不良麻醉反應(yīng)的易感性的其它變體。在此類實(shí)施方案中，在個(gè)體中確定多種標(biāo)記物和/或單倍型的基因型狀態(tài)，并將該個(gè)體的狀態(tài)與相關(guān)聯(lián)的變體的人群頻率或臨床健康受試者(如年齡匹配和性別匹配的受試者)中該變體的頻率進(jìn)行比較。本領(lǐng)域中已知的方法，如多變量分析或聯(lián)合風(fēng)險(xiǎn)分析，或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法，可以隨后用于確定基于多個(gè)基因座處的基因型狀態(tài)所賦予的整體風(fēng)險(xiǎn)。基于此類分析評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)可以隨后如本文中所述用于本發(fā)明的方法、用途和試劑盒。

對(duì)遭受不良麻醉反應(yīng)的高危變體是純合的個(gè)體可能處于特別高的形成此類反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)下。這是由于高危等位基因的劑量依賴性效應(yīng)，使得對(duì)純合的攜帶者的風(fēng)險(xiǎn)通常評(píng)估為各等位基因的風(fēng)險(xiǎn)的平方。

對(duì)于本文中描述的SNP標(biāo)記物，與被發(fā)現(xiàn)在患者體內(nèi)過量的等位基因(高危等位基因)相對(duì)的等位基因被發(fā)現(xiàn)在觀察到來自麻醉劑和鎮(zhèn)痛劑的不良反應(yīng)的情況下頻率降低。在LD中和/或與其它因素，包括年齡、種族、體重(或身體質(zhì)量指數(shù)BMI)一起包含此類標(biāo)記物的這些標(biāo)記物和單倍型因此此對(duì)不良麻醉劑和鎮(zhèn)痛藥反應(yīng)是保護(hù)性的，即它們賦予攜帶這些標(biāo)記物和/或單倍型的個(gè)體產(chǎn)生疼痛和/或來自麻醉劑與鎮(zhèn)痛藥的不良反應(yīng)的降低的風(fēng)險(xiǎn)或易感性。

在一些實(shí)施方案中，本文中公開的變體，包括某些單倍型，可以包含各種遺傳標(biāo)記物(例如SNP和微衛(wèi)星)的組合?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域中已知和/或本文中描述的用于檢測(cè)多態(tài)性位點(diǎn)處的序列的方法來實(shí)現(xiàn)檢測(cè)單倍型。此外，某些單倍型或標(biāo)記物的集合與疾病表型之間的相關(guān)性可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來驗(yàn)證。用于相關(guān)性的簡(jiǎn)單測(cè)試的一個(gè)代表性實(shí)例是在二乘二表上的Fisher精確檢驗(yàn)。

預(yù)測(cè)模型

決策樹是用于多變量數(shù)據(jù)分析與分類的標(biāo)準(zhǔn)機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)，可用于導(dǎo)出用于決策支持系統(tǒng)的容易解釋和直觀的規(guī)則。決策樹可以視為遞歸分割方法，其中數(shù)據(jù)通過簡(jiǎn)單的邏輯規(guī)則分等級(jí)地分成層級(jí)。決策樹的優(yōu)點(diǎn)在于其簡(jiǎn)單、能夠處理類別和數(shù)值變量以及缺失值、對(duì)離群值和縮放的魯棒性，以及結(jié)合特征選擇與分層和分類的能力。決策樹還可用于導(dǎo)出用于決策支持系統(tǒng)的容易解釋和直觀的規(guī)則。

決策樹用于選擇最具預(yù)測(cè)性的SNP并將其與人口統(tǒng)計(jì)學(xué)特征、臨床特征和其它輸入特征結(jié)合成能夠用于分類患者并預(yù)測(cè)不良反應(yīng)的簡(jiǎn)單的邏輯規(guī)則，由此能夠健全和準(zhǔn)確地現(xiàn)場(chǎng)預(yù)測(cè)不充足的疼痛緩解和阿片樣物質(zhì)相關(guān)的不良反應(yīng)。此類知識(shí)允許個(gè)體化的治療。

觀察到的不同層級(jí)和復(fù)雜的相互作用模式導(dǎo)致了系統(tǒng)確定基因的特定多態(tài)性的相互作用(如涉及阿片樣物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、傳感和代謝的那些)是否顯著影響嗎啡在兒童體內(nèi)的不良反應(yīng)。由于現(xiàn)有方法的限制，需要能夠提供用于個(gè)性化干預(yù)的更健全和精確的決策規(guī)則的定制解決方案與擴(kuò)展。

首先采用標(biāo)準(zhǔn)遞歸分割方法(或基于決策樹的方法)如CART來鑒定和分析在不良反應(yīng)、疼痛敏感度和其它臨床表型的背景下與基因-基因相互作用的特定模式相關(guān)聯(lián)的不同層級(jí)?；蚍中?、人口統(tǒng)計(jì)以及相關(guān)臨床數(shù)據(jù)隨后結(jié)合以導(dǎo)出用于預(yù)測(cè)患者具有不良反應(yīng)的高vs.低風(fēng)險(xiǎn)的邏輯規(guī)則，所述不良反應(yīng)包括阿片樣物質(zhì)誘導(dǎo)呼吸抑制結(jié)果。這種模型的預(yù)測(cè)能力受限于固有的生物噪音、有限的樣本大小和代表可能導(dǎo)致分子與最終臨床結(jié)果方面的變化的多種機(jī)理的相互作用的復(fù)雜模式。也可能存在本身只能在特定層級(jí)背景下顯現(xiàn)的更弱的相關(guān)性，但是更難以檢測(cè)。

決策樹與相關(guān)的邏輯規(guī)則通過并入等位基因(相加)、顯性模型和隱性模型，以及其中去耦的各基因型值也被實(shí)施以促進(jìn)鑒定和分析不同層級(jí)的三叉樹來增強(qiáng)。此外，使用相位模型和類似的基于人群的模型，并入對(duì)各基因的單倍型重建(對(duì)其中包括的幾種基因觀察到LD的強(qiáng)模式)，能夠簡(jiǎn)化決策規(guī)則并考慮在數(shù)據(jù)中觀察到的許多隱性相互作用。整合了經(jīng)典決策樹、支持向量機(jī)(SVMs)和層次混合專家(HME)模型。

該HME方法可以被視為一種概率決策樹(參見Hasti等人,第9章及其中的參考文獻(xiàn))。在示例性HME決策樹中，終端節(jié)點(diǎn)被稱為“專家”(或?qū)＜揖W(wǎng)絡(luò))，其提供響應(yīng)(例如不良反應(yīng))的個(gè)體(以及背景相關(guān)性)預(yù)測(cè)。這些個(gè)體預(yù)測(cè)通過非終端節(jié)點(diǎn)的決策模型(“門控網(wǎng)絡(luò)”)來組合。通常，使用輸入值的線性組合，在各終端節(jié)點(diǎn)中擬合線性或邏輯回歸模型，例如，如在下面作為基因和其它預(yù)測(cè)工具的函數(shù)的目標(biāo)術(shù)后疼痛得分(P)的模型中那樣：

E(P|X)＝β0+β1年齡+β2性別+β3種族+β4GCH1+β5COMT+β6ABCB1+其它因素

在上面的等式中，E(Y|X)表示給定預(yù)測(cè)工具變量(特征)X的向量的Y的期望值。專家模型可以使用其它合適的分類(或回歸)方法來概括，例如通過使用強(qiáng)大的線性SVM預(yù)測(cè)工具。在這種方法中，終端SVM模型可以被視為以背景依賴性方式優(yōu)化的專家分類器的集合(如果適用的話包括一類SVM)。

這可以與開發(fā)對(duì)數(shù)據(jù)的不同子集優(yōu)化的分類器的集合(如在交叉驗(yàn)證的情況下)進(jìn)行比較，其經(jīng)組合以提供更強(qiáng)大的結(jié)果和相關(guān)的置信水平(其在該集合中的一致性方面來定義)。這里，此類子集通過使用標(biāo)準(zhǔn)決策樹(可能采用重新取樣和加強(qiáng))獲得的健全的不同層級(jí)來限定。因此，此類擴(kuò)展HME模型的樹型拓?fù)鋵㈩A(yù)期代表在原始決策樹分析中鑒定的穩(wěn)定層級(jí)，解決了HME方法的限制之一，即缺少用于發(fā)現(xiàn)良好的樹型拓?fù)涞姆椒?。因此，所得樹保持了解釋決策規(guī)則的簡(jiǎn)易性，同時(shí)提高了準(zhǔn)確率。

其它標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)和機(jī)器學(xué)習(xí)方法，包括神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、原型、以及基于內(nèi)核的方法，也適用于進(jìn)一步分析基因-基因相互作用的模式和評(píng)估它們的預(yù)測(cè)能力(并評(píng)估新方法的相對(duì)優(yōu)點(diǎn))。交叉驗(yàn)證，其中整體訓(xùn)練組被反復(fù)(和隨機(jī)地)分成訓(xùn)練子集和驗(yàn)證子集，用于評(píng)價(jià)準(zhǔn)確率和評(píng)估所得決策規(guī)則與觀察到的層級(jí)的穩(wěn)定性。準(zhǔn)確率的標(biāo)準(zhǔn)量度，包括整體分類準(zhǔn)確率、精確度、召回率和ROC曲線下的面積，用于根據(jù)提出的混合遞歸分割模型評(píng)估該決策規(guī)則的準(zhǔn)確率。

可尋址人群

在一般意義上，本發(fā)明的方法和試劑盒可用于來自任何來源和來自任何個(gè)體的含有核酸材料(DNA或RNA)的樣品，或用于衍生自此類樣品的基因型數(shù)據(jù)。在一些實(shí)施方案中，該個(gè)體是人類個(gè)體。個(gè)體可以是成人、兒童或胎兒。該核酸來源可以是包含核酸材料的任何樣品，包括生物樣品，或包含由此衍生的核酸材料的樣品。本發(fā)明的實(shí)施方案還提供了在作為目標(biāo)人群成員的個(gè)體中評(píng)估標(biāo)記物和/或單倍型。此類目標(biāo)人群在一個(gè)實(shí)施方案中是基于其它參數(shù)(如遺傳因素、生物標(biāo)記物、生物物理參數(shù)、麻醉相關(guān)并發(fā)癥史、對(duì)麻醉的過敏反應(yīng)、麻醉相關(guān)并發(fā)癥的家族史等等)處于發(fā)生不良麻醉反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)下的個(gè)體的人群或組。

在一些實(shí)施方案中，所述目標(biāo)人群包括來自特定年齡亞組的個(gè)體，如18歲以下的那些、16歲以下的那些，或12歲或10歲以下的那些。該個(gè)體的性別可以為男性或女性。

據(jù)信，本文中公開的被發(fā)現(xiàn)與不良鎮(zhèn)痛和/或阿片樣物質(zhì)反應(yīng)相關(guān)的標(biāo)記物可以在目前研究中所采用的人群之外的其它人群中顯示類似的相關(guān)性。在一些實(shí)施方案中，人類受試者來自一個(gè)或多個(gè)人群或族群，包括但不限于白種人群、歐洲人群、美國(guó)人群、歐亞人群、亞洲人群、中亞/南亞人群、東亞人群、中東人群、非洲人群、西班牙裔人群和大洋洲人群。

個(gè)體受試者的種族貢獻(xiàn)也可以通過遺傳分析來確定?？梢允褂梦催B接的微衛(wèi)星標(biāo)記物進(jìn)行血統(tǒng)的遺傳分析，所述未連接的微衛(wèi)星標(biāo)記物例如在Smith等人,Am J Hum Genet 74,1001-13(2004)中描述的那些。

除非另行定義，本文中使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。Singleton等人,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology第3版,J.Wiley&Sons(New York,NY 2001)；March,Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure第5版,J.Wiley&Sons(New York,NY 2001)；和Sambrook與Russel,Molecular Cloning:A Laboratory Manual第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor,NY 2001)向本領(lǐng)域技術(shù)人員提供了本申請(qǐng)中使用的許多術(shù)語(yǔ)的一般指導(dǎo)。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到類似或等效于本文中描述的那些的許多方法和材料，其可用于本發(fā)明的實(shí)踐中。事實(shí)上，本發(fā)明絕不限于所述的方法與材料。

診斷方法

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，提供了評(píng)價(jià)或幫助評(píng)價(jià)處于遭受來自施用的麻醉、鎮(zhèn)痛和/或阿片樣物質(zhì)的不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)下的患者的方法，該方法包括在與此類反應(yīng)相關(guān)的遺傳標(biāo)記物處檢測(cè)特定的等位基因。在一些實(shí)施方案中，提供了確定發(fā)展對(duì)施用的麻醉、鎮(zhèn)痛和/或阿片樣物質(zhì)的不良反應(yīng)的易感性的方法，該方法包括檢測(cè)至少一種多態(tài)性標(biāo)記物(例如本文中所述的標(biāo)記物)的至少一個(gè)等位基因。如本文中所公開的那樣，特定的標(biāo)記物或單倍型的特定等位基因指示遭受來自施用的鎮(zhèn)痛劑的不良反應(yīng)的易感性。評(píng)價(jià)患者對(duì)此類反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)或易感性的預(yù)后或預(yù)測(cè)測(cè)定還可用于開發(fā)在涉及施用麻醉劑、鎮(zhèn)痛藥和/或阿片樣物質(zhì)的步驟之前和期間對(duì)受試者的定制麻醉方案。

在一些實(shí)施方案中，通過使用微陣列或基因芯片技術(shù)分析樣品存在或不存在至少一種與疼痛感覺、持續(xù)性手術(shù)后/慢性疼痛和/或麻醉劑、鎮(zhèn)痛藥和/或阿片樣物質(zhì)相關(guān)不良反應(yīng)相關(guān)聯(lián)的多態(tài)性來進(jìn)行鑒定處于遭受來自施用的麻醉劑、鎮(zhèn)痛和/或阿片樣物質(zhì)的不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)下的患者的方法，其中該微陣列或基因芯片包含所述至少一種多態(tài)性。

在一些實(shí)施方案中，該基因芯片包含低密度陣列。

在一些實(shí)施方案中，該方法包括評(píng)價(jià)額外臨床信息以定制疼痛療法與麻醉，并盡量減少麻醉與鎮(zhèn)痛藥物相關(guān)的不良反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，該方法包括評(píng)價(jià)額外臨床信息以定制疼痛療法與阿片類藥物，并盡量減少阿片樣物質(zhì)與鎮(zhèn)痛藥物相關(guān)的不良反應(yīng)。用于此類方法的另外臨床信息包括但不限于患者年齡、種族、體重(或BMI)、睡眠障礙性呼吸、性別、過敏、敏感或影響遞送的麻醉劑、鎮(zhèn)痛和/或阿片樣物質(zhì)的給藥途徑的病癥。其它因素，如種族、病史、藥物相互作用、心理焦慮、壓力水平和生活方式也可以作為該方法的一部分進(jìn)行評(píng)估。

本發(fā)明的實(shí)施方案還涉及使用遞歸分割和決策樹來分析基因型-表型的聯(lián)系并鑒定具有基因與其它非遺傳變量之間相互作用的不同模式的推定層級(jí)。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，該方法包括從用于分析的個(gè)體獲得含有基因組DNA的樣品。該樣品可以是例如頰粘膜拭子、唾液樣品、血液樣品或本文中公開的含有基因組DNA的其它合適樣品等等?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員可用的任何常見技術(shù)，例如高通量或低密度陣列技術(shù)等等來分析該基因組DNA。來自此類基因分型的結(jié)果可以隨后分析是否存在已知作為特定病癥的易感性變體的某些變體，如本文中公開的遺傳變體。對(duì)個(gè)體計(jì)算由特定基因型提供的風(fēng)險(xiǎn)可以基于將個(gè)體的基因型與預(yù)先對(duì)該基因型，例如對(duì)特定病癥或性狀(例如對(duì)來自施用的麻醉劑的不良反應(yīng))的高危變體的雜合攜帶者所確定的風(fēng)險(xiǎn)(例如表示為相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)(RR)或比值比(OR))進(jìn)行比較。對(duì)該個(gè)體的計(jì)算的風(fēng)險(xiǎn)可以是與具有匹配的性別和種族的平均人群相比對(duì)人，或?qū)θ说奶囟ɑ蛐偷南鄬?duì)風(fēng)險(xiǎn)。該平均人群風(fēng)險(xiǎn)可以表示為不同基因型的風(fēng)險(xiǎn)的加權(quán)平均值，使用來自參比人群的結(jié)果，并且隨后可以進(jìn)行適當(dāng)?shù)挠?jì)算以計(jì)算相對(duì)于該人群的基因型組的風(fēng)險(xiǎn)?；蛘?，對(duì)個(gè)體的風(fēng)險(xiǎn)基于比較特定基因型，例如與高危等位基因的非攜帶者比較的標(biāo)記物的高危等位基因的雜合攜帶者。在一些實(shí)施方案中，使用人群平均值可能更加方便，因?yàn)樗峁┝艘子趯?duì)用戶解釋的量度，即基于他/她的基因型，與人群中的平均值相比給出了該個(gè)體的風(fēng)險(xiǎn)的量度。

多種風(fēng)險(xiǎn)變體的整體風(fēng)險(xiǎn)可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。例如，假定增殖模型，即假定個(gè)體風(fēng)險(xiǎn)變體的風(fēng)險(xiǎn)相乘以建立整體效果，能夠直截了當(dāng)?shù)赜?jì)算多種標(biāo)記物的整體風(fēng)險(xiǎn)。

組成樣品中特定單倍型的特定遺傳標(biāo)記物等位基因的檢測(cè)可以通過本文中所述和/或本領(lǐng)域中已知的多種方法來進(jìn)行。例如，可以在核酸水平(例如通過直接核苷酸測(cè)序或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它基因分型手段)或在氨基酸水平——如果該遺傳標(biāo)記物影響蛋白質(zhì)的編碼序列(例如通過蛋白質(zhì)測(cè)序或通過使用識(shí)別此類蛋白質(zhì)的抗體的免疫測(cè)定)來檢測(cè)該遺傳標(biāo)記物。本文中公開的標(biāo)記物等位基因或單倍型對(duì)應(yīng)于與施用的麻醉劑、鎮(zhèn)痛和/或阿片樣物質(zhì)的不良反應(yīng)的發(fā)展相關(guān)聯(lián)的基因組區(qū)段(例如基因)的片段。此類片段涵蓋了相關(guān)多態(tài)性標(biāo)記物或單倍型的DNA序列，但是還可包括與該標(biāo)記物或單倍型強(qiáng)LD(連鎖不平衡)的DNA區(qū)段。在一些實(shí)施方案中，此類區(qū)段包含通過大于0.2的r2和/或|D’|>0.8的值所確定的與該標(biāo)記物或單倍型LD的區(qū)段。

在一些實(shí)施方案中，可以使用雜交方法確定發(fā)展施用的麻醉的不良反應(yīng)的易感性(參見Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel,F.等人編輯,John Wiley&Sons,包括所有補(bǔ)充內(nèi)容)。特定標(biāo)記物等位基因的存在可以通過對(duì)特定等位基因特異性的核酸探針的序列特異性雜交來指示。超過一個(gè)特定標(biāo)記物等位基因或特定單倍型的存在可以使用幾種序列特異性核酸探針來指示，各核酸探針對(duì)特定等位基因是特異性的。序列特異性探針可以經(jīng)引導(dǎo)以與基因組DNA、RNA或cDNA雜交?！昂怂崽结槨笨梢允请s交到互補(bǔ)序列上的DNA探針或RNA探針。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知曉如何設(shè)計(jì)此類探針，以便只有當(dāng)特定等位基因存在于來自測(cè)試樣品的基因組序列中時(shí)才發(fā)生序列特異性雜交。本發(fā)明還可以使用任何方便的基因分型方法，包括用于基因分型特定多態(tài)性標(biāo)記物的商業(yè)上可用的技術(shù)和方法來實(shí)際應(yīng)用。

雜交樣品可以通過使含有麻醉不良反應(yīng)相關(guān)的核酸的測(cè)試樣品(如基因組DNA樣品)與至少一種核酸探針接觸來形成。用于檢測(cè)mRNA或基因組DNA的探針的非限制性實(shí)例是標(biāo)記的核酸探針，其能夠與本文中所述的mRNA或基因組DNA序列雜交。該核酸探針可以是例如全長(zhǎng)核酸分子或其一部分，如在嚴(yán)格條件下足以與合適的mRNA或基因組DNA特異性雜交的長(zhǎng)度為至少15、30、50、100、250或500個(gè)核苷酸的寡核苷酸?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行雜交(參見例如Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel,F.等人編輯,John Wiley&Sons,包括所有補(bǔ)充內(nèi)容)。在一些實(shí)施方案中，雜交指的是特異性雜交，即不具有錯(cuò)配的雜交(精確雜交)。在一些實(shí)施方案中，特異性雜交的雜交條件是高嚴(yán)格度的。

使用標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)特異性雜交(如果存在的話)。如果在核酸探針與測(cè)試樣品中的核酸之間發(fā)生雜交，那么該樣品含有與核酸探針中存在的核苷酸互補(bǔ)的等位基因。該方法可以對(duì)任何本文中公開的標(biāo)記物、或構(gòu)成本文中公開的單倍型的標(biāo)記物重復(fù)進(jìn)行，或者多個(gè)探針可以同時(shí)用于一次性檢測(cè)超過一個(gè)的標(biāo)記物等位基因。還可以設(shè)計(jì)單一探針，其中該探針含有特定單倍型的超過一個(gè)標(biāo)記物等位基因(例如含有與構(gòu)成特定單倍型的2、3、4、5種或所有標(biāo)記物互補(bǔ)的等位基因的探針)。檢測(cè)樣品中該單倍型的特定標(biāo)記物指示樣品來源具有特定的單倍型(例如一種單倍型)，并因此對(duì)遭受來自施用的麻醉的不良反應(yīng)易感，或處于遭受來自施用的麻醉的不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)下。

該檢測(cè)探針可以具有任何合適的大小，盡管該探針優(yōu)選相對(duì)較短。在一些實(shí)施方案中，該探針的長(zhǎng)度為5-100個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，該探針的長(zhǎng)度為10-50個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，該探針的長(zhǎng)度為12-30個(gè)核苷酸。也可以設(shè)想該探針的其它長(zhǎng)度，并在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的技能范圍內(nèi)。

在一些實(shí)施方案中，含有該SNP多態(tài)性的DNA模板在檢測(cè)前通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增。在此類實(shí)施方案中，擴(kuò)增的DNA充當(dāng)檢測(cè)探針和增強(qiáng)子探針的模板。

在一些實(shí)施方案中，該檢測(cè)探針、該增強(qiáng)子探針和/或用于通過PCR擴(kuò)增該模板的引物包括使用修飾的堿基，包括修飾的A和修飾的G。使用修飾的堿基可用于調(diào)節(jié)核苷酸分子(探針和/或引物)對(duì)模板DNA的解鏈溫度，例如用于提高含有低百分比的G或C堿基的區(qū)域中的解鏈溫度，其中可以使用與其互補(bǔ)T能夠形成三個(gè)氫鍵的修飾A，或用于降低含有高百分比的G或C堿基的區(qū)域中的解鏈溫度，例如，通過使用在雙鏈DNA分子中與其互補(bǔ)C堿基僅形成兩個(gè)氫鍵的修飾G堿基。在一些實(shí)施方案中，在檢測(cè)核苷酸探針的設(shè)計(jì)中使用修飾堿基。在這些方法中可以選擇技術(shù)人員已知的任何修飾堿基，并且基于本文中的教導(dǎo)和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的可獲自商業(yè)來源的已知堿基，選擇合適的堿基完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的范圍內(nèi)。

在一些實(shí)施方案中，在本文中描述的雜交方法中除了核酸探針之外可以使用肽核酸(PNA)探針，或使用肽核酸(PNA)探針取代核酸探針。PNA是具有肽狀無機(jī)骨架如N-(2-氨基乙基)甘氨酸單元的DNA模擬物，有機(jī)堿基(A、G、C、T或U)經(jīng)由亞甲基羰基連接基團(tuán)連接到甘氨酸氮上(參見例如Nielsen,P.,等人,Bioconjug.Chem.5:3-7(1994))。該P(yáng)NA探針可以設(shè)計(jì)為特異性雜交到懷疑含有與施用的麻醉的不良反應(yīng)相關(guān)的一種或多種標(biāo)記物等位基因或單倍型的樣品中的分子上。該P(yáng)NA探針的雜交因此診斷對(duì)這種反應(yīng)的易感性。

本發(fā)明的實(shí)施方案還涉及檢測(cè)一組基因中的SNP，檢測(cè)方法包括但不限于例如使用SNP微陣列、基因芯片、動(dòng)態(tài)等位基因-特異性雜交、分子信標(biāo)、基于限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)的方法、基于PCR的方法、基于瓣?duì)詈怂醿?nèi)切酶的方法、引物延伸、基于5’-核酸酶的方法、寡核苷酸連接酶測(cè)定、單鏈構(gòu)象多態(tài)性方法、溫度梯度凝膠電泳、變性高效液相色譜法、高分辨率熔解曲線分析、DNA錯(cuò)配結(jié)合法、毛細(xì)管電泳法和下一代測(cè)序方法等等。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，收集獲自受試者的含有基因組DNA的測(cè)試樣品，并使用PCR來擴(kuò)增包含一種或多種本發(fā)明的標(biāo)記物或單倍型的片段。如本文中所公開，可以使用多種方法(例如序列分析、限制性酶切分析、特異性雜交、單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(cè)(SSCP)、電泳分析法等等)來實(shí)現(xiàn)特定標(biāo)記物等位基因或單倍型的鑒定。在一些實(shí)施方案中，通過表達(dá)分析，例如通過使用定量PCR(動(dòng)態(tài)熱循環(huán))來實(shí)現(xiàn)診斷。這種技術(shù)可以例如采用市售的技術(shù)，如TaqMan.RTM(Applied Biosystems,Foster City,Calif.)。該技術(shù)可以評(píng)估多肽或剪接變體的表達(dá)或組成中的改變的存在。此外，該變體的表達(dá)可以定量為物理或功能上不同。

在一些實(shí)施方案中，該DNA模板可以在評(píng)估本發(fā)明中所述的特定多態(tài)性標(biāo)記物的存在之前借助全基因組擴(kuò)增(WGA)方法來擴(kuò)增。可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知實(shí)施WGA的標(biāo)準(zhǔn)方法，并且在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

在一些實(shí)施方案中，如果特定的等位基因?qū)е孪鄬?duì)于參考序列生成或消除限制性位點(diǎn)的話，限制性酶切分析可用于檢測(cè)該等位基因?？梢赃M(jìn)行RFLP分析，例如如Molecular Biology(同上)中的Current Protocols中所述。相關(guān)DNA片段的消化模式指示樣品中存在或不存在特定的等位基因。

序列分析也可用于檢測(cè)特異性等位基因或單倍型。因此，在一些實(shí)施方案中，測(cè)定特定標(biāo)記物等位基因或單倍型的存在或不存在包括獲自受試者或個(gè)體的的DNA或RNA的測(cè)試樣品的序列分析。PCR或其它適當(dāng)方法可用于擴(kuò)增含有多態(tài)性標(biāo)記物或單倍型的一部分核酸，并且隨后可以通過對(duì)樣品中基因組DNA的多態(tài)性位點(diǎn)(或單倍型中的多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn))進(jìn)行測(cè)序來直接檢測(cè)特異性等位基因的存在。

在一些實(shí)施方案中，與來自受試者的靶核酸序列區(qū)段互補(bǔ)的寡核苷酸探針陣列可用于鑒定多態(tài)性位點(diǎn)處的特定等位基因。例如可以使用寡核苷酸陣列。寡核苷酸陣列通常包含多個(gè)不同的寡核苷酸探針，其在不同的已知位置處偶聯(lián)到底物表面。這些陣列通常可以使用機(jī)械合成方法或引入光刻法與固相寡核苷酸合成方法的組合的光引導(dǎo)合成方法，或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法制得(參見例如Bier等人Adv Biochem Eng Biotechnol 109:433-53(2008)；Hoheisel,J.D.,Nat Rev Genet.7:200-10(2006)；Fan等人,Methods Enzymol 410:57-73(2006)；Raqoussis,J.和Elvidge,G.,Expert Rev Mol Diagn 6:145-52(2006)；和Mockler等人,Genomics 85:1-15(2005)，其各自經(jīng)此引用全文并入本文)。用于檢測(cè)多態(tài)性的寡核苷酸陣列的制備與使用的許多附加描述可以例如在美國(guó)專利號(hào)6,858,394、美國(guó)專利號(hào)6,429,027、美國(guó)專利號(hào)5,445,934、美國(guó)專利號(hào)5,700,637、美國(guó)專利號(hào)5,744,305、美國(guó)專利號(hào)5,945,334、美國(guó)專利號(hào)6,054,270、美國(guó)專利號(hào)6,300,063、美國(guó)專利號(hào)6,733,977、美國(guó)專利號(hào)7,364,858、EP 619 321和EP 373 203中找到，其各自經(jīng)此引用全文并入本文。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可用的其它核酸分析方法可用于檢測(cè)多態(tài)性位點(diǎn)處的特定等位基因。代表性方法包括例如直接手動(dòng)測(cè)序(Church和Gilbert,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:1991-1995(1988)；Sanger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74:5463-5467(1977)；Beavis等人,美國(guó)專利號(hào)5,288,644)；自動(dòng)熒光測(cè)序；單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(cè)(SSCPs)；夾式變性凝膠電泳法(CDGE)；變性梯度凝膠電泳法(DGGE)(Sheffield等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:232-236(1989))；遷移率變動(dòng)分析(Orita等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:2766-2770(1989))；限制性酶切分析(Flavell等人,Cell,15:25-41(1978)；Geever等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78:5081-5085(1981))；異源雙鏈分析；化學(xué)錯(cuò)配裂解法(CMC)(Cotton等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:4397-4401(1985))；核糖核酸酶保護(hù)測(cè)定(Myers等人,Science,230:1242-1246(1985))；使用識(shí)別核苷酸錯(cuò)配的多肽如E.coli mutS蛋白；以及等位基因特異性PCR等等。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以識(shí)別可用于這些目的的其它技術(shù)。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，在本文中公開的遺傳標(biāo)記物或單倍型導(dǎo)致多肽組成或表達(dá)改變的那些情況下，可以通過檢查與對(duì)施用麻醉的不良反應(yīng)相關(guān)聯(lián)的核酸所編碼的多肽的表達(dá)和/或組成來測(cè)定發(fā)展對(duì)施用的麻醉、鎮(zhèn)痛藥和/或阿片樣物質(zhì)的不良反應(yīng)的易感性或風(fēng)險(xiǎn)。因此，在本發(fā)明的遺傳標(biāo)記物或單倍型導(dǎo)致多肽組成或表達(dá)改變的那些情況下，可以通過檢查與對(duì)施用麻醉的不良反應(yīng)相關(guān)聯(lián)的核酸所編碼的這些多肽之一或另一多肽的表達(dá)和/或組成來測(cè)定發(fā)展對(duì)施用的麻醉、鎮(zhèn)痛藥和/或阿片樣物質(zhì)的不良反應(yīng)的易感性。

多種方法可用于檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)水平，包括例如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、蛋白質(zhì)印跡、免疫沉淀反應(yīng)和免疫熒光法等等。來自受試者的測(cè)試樣品可以評(píng)估在被特定核酸編碼的多肽的表達(dá)改變和/或組成改變的存在。由該核酸編碼的多肽的表達(dá)改變可以是例如定量多肽表達(dá)的改變(即產(chǎn)生的多肽的量)。由該核酸編碼的多肽的組成改變是定性多肽表達(dá)的改變(例如突變體多肽或不同剪接變體的表達(dá))。在一些實(shí)施方案中，通過檢測(cè)由與發(fā)展此類不良反應(yīng)相關(guān)聯(lián)的核酸所編碼的特定剪接變體或剪接變體的特定模式來測(cè)定發(fā)展對(duì)施用的麻醉的不良反應(yīng)的易感性。

這兩種改變(定量和定性)也可能均存在。本文中所用的多肽表達(dá)或組成的“改變”指的是與對(duì)照樣品中多肽的表達(dá)或組成相比，在測(cè)試樣品中的表達(dá)或組成的改變。對(duì)照樣品是對(duì)應(yīng)于測(cè)試樣品(例如來自相同類型的細(xì)胞)并來自于不受對(duì)施用的麻醉的不良反應(yīng)影響和/或不具有發(fā)展對(duì)施用的麻醉的不良反應(yīng)的易感性的受試者的樣品。在一些實(shí)施方案中，該對(duì)照樣品來自于不具有本文中公開的與對(duì)施用的麻醉的不良反應(yīng)的發(fā)展相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記物等位基因或單倍型的受試者。類似地，與對(duì)照樣品相比，在測(cè)試樣品中存在一種或多種不同的剪接變體或在測(cè)試樣品中存在顯著不同量的不同剪接變體可以指示發(fā)展對(duì)施用的麻醉的不良反應(yīng)的易感性。在特異性等位基因相對(duì)于對(duì)照樣品中的參照物改變剪接位點(diǎn)的情況下，如與對(duì)照樣品比較，測(cè)試樣品中多肽的表達(dá)或組成的改變可以指示該等位基因。檢查由核酸編碼的多肽的表達(dá)或組成的各種方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且可以使用，包括光譜法、比色法、電泳法、等電聚焦和免疫測(cè)定(例如David等人,美國(guó)專利號(hào)4,376,110)，如免疫印跡(參見例如Current Protocols in Molecular Biology,特別是第10章，見上文)。

例如，在一些實(shí)施方案中，可以使用能夠結(jié)合到與對(duì)施用的麻醉的不良反應(yīng)的發(fā)展相關(guān)聯(lián)的核酸編碼的多肽的抗體(例如具有可檢測(cè)標(biāo)記的抗體)?？贵w可以是多克隆或單克隆的?？梢允褂猛暾贵w或其片段(例如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2)。術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記的”就探針或抗體而言包括通過將可檢測(cè)物質(zhì)偶聯(lián)(即物理連接)到該探針或抗體上來直接標(biāo)記所述探針或抗體，以及通過與另一直接標(biāo)記的試劑反應(yīng)來間接標(biāo)記所述探針或抗體。間接標(biāo)記的實(shí)例包括使用標(biāo)記的二級(jí)抗體(例如熒光標(biāo)記的二級(jí)抗體)和用生物素末端-標(biāo)記DNA探針以使其可以用熒光標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白檢測(cè)來檢測(cè)初級(jí)抗體。

在一些實(shí)施方案中，將測(cè)試樣品中多肽的水平或量與對(duì)照樣品中的多肽的水平或量進(jìn)行比較。高于或低于對(duì)照樣品中多肽的水平或量以使差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的測(cè)試樣品中多肽的水平或量指示由該核酸編碼的多肽的表達(dá)改變，并且診斷造成表達(dá)差異的特定等位基因或單倍型?；蛘撸瑢y(cè)試樣品中多肽的組成與對(duì)照樣品中多肽的組成進(jìn)行比較。在一些實(shí)施方案中，可以在測(cè)試樣品與對(duì)照樣品中評(píng)估多肽的水平或量與組成。

在一些實(shí)施方案中，通過檢測(cè)至少一種本文中公開的標(biāo)記物或單倍型，以及另外的基于蛋白質(zhì)的、基于RNA的或基于DNA的測(cè)定來確定對(duì)發(fā)展對(duì)施用的麻醉的不良反應(yīng)的易感性。在一些實(shí)施方案中，通過檢測(cè)至少一種本文中公開的標(biāo)記物或單倍型，以及另外的基于蛋白質(zhì)的、基于RNA的或基于DNA的測(cè)定來確定對(duì)疼痛緩解不足的易感性或敏感度。在一些實(shí)施方案中，通過檢測(cè)至少一種本文中公開的標(biāo)記物或單倍型，以及另外的基于蛋白質(zhì)的、基于RNA的或基于DNA的測(cè)定來確定對(duì)OSA的易感性。在一些實(shí)施方案中，通過檢測(cè)至少一種本文中公開的標(biāo)記物或單倍型，以及另外的基于蛋白質(zhì)的、基于RNA的或基于DNA的測(cè)定來確定OSA的發(fā)生率，由此確定對(duì)發(fā)展對(duì)施用的麻醉、鎮(zhèn)痛藥和/或阿片樣物質(zhì)的不良反應(yīng)的易感性。

在一些實(shí)施方案中，通過檢測(cè)至少一種本文中公開的標(biāo)記物或單倍型，以及另外的基于蛋白質(zhì)的、基于RNA的或基于DNA的測(cè)定來確定對(duì)發(fā)展對(duì)施用的阿片樣物質(zhì)的不良反應(yīng)的易感性。在一些實(shí)施方案中，施用的阿片樣物質(zhì)是嗎啡。在一些實(shí)施方案中，施用的阿片樣物質(zhì)是可待因。在一些實(shí)施方案中，該OCT1基因型的表征用于測(cè)定對(duì)發(fā)展對(duì)施用的阿片樣物質(zhì)的不良反應(yīng)的易感性。在一些實(shí)施方案中，測(cè)定該UGT2B7rs7438135等位基因。在一些實(shí)施方案中，表征該rs622342等位基因。

試劑盒

可用于本發(fā)明的方法的試劑盒包括可用于本文中公開的任一方法的組分，包括例如用于核酸擴(kuò)增的引物、雜交探針、限制性內(nèi)切酶(例如用于RFLP分析)、等位基因特異性寡核苷酸、結(jié)合到由本文中公開的核酸編碼的改變的多肽(例如包含至少一種本發(fā)明的多態(tài)性標(biāo)記物和/或單倍型的基因組區(qū)段)上或結(jié)合到由本文中所述的本發(fā)明的核酸編碼的未改變的(天然)多肽上的抗體、用于與發(fā)展對(duì)施用的麻醉的不良反應(yīng)相關(guān)的核酸擴(kuò)增的裝置、用于分析與發(fā)展對(duì)施用的麻醉的不良反應(yīng)相關(guān)的核酸的核酸序列的裝置、用于分析由與發(fā)展對(duì)施用的麻醉的不良反應(yīng)相關(guān)的核酸編碼的多肽的氨基酸序列的裝置等等。該試劑盒例如可以包括必需的緩沖劑、用于擴(kuò)增本發(fā)明的核酸的核酸引物(例如包含一種或多種本文中所述的多態(tài)性標(biāo)記物的核酸區(qū)段)，和使用此類引物和必需的酶(例如DNA聚合酶)用于擴(kuò)增的片段的等位基因特異性檢測(cè)的試劑，等等。此外，試劑盒可以提供用于與本文中公開的方法結(jié)合使用的測(cè)定的試劑，例如用于使用確定對(duì)發(fā)展對(duì)施用的麻醉的不良反應(yīng)的易感性的其它診斷測(cè)定的試劑。在一些實(shí)施方案中，在試劑盒中包括用于進(jìn)行WGA的試劑。

在一些實(shí)施方案中，提供用于測(cè)定來自受試者的樣品以檢測(cè)在受試者中對(duì)發(fā)展對(duì)施用的麻醉、鎮(zhèn)痛藥和/或阿片樣物質(zhì)的不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)或易感性的試劑盒，其中該試劑盒包含在個(gè)體的基因組中選擇性檢測(cè)本文中所公開的至少一種多態(tài)性的至少一個(gè)等位基因所必需的試劑。在一些實(shí)施方案中，該試劑包括至少一種連續(xù)寡核苷酸，所述寡核苷酸雜交到包含至少一種本文中公開的多態(tài)性的個(gè)體的基因組的片段。在一些實(shí)施方案中，該試劑包含至少一對(duì)寡核苷酸，所述寡核苷酸雜交到獲自受試者的基因組區(qū)段的相對(duì)鏈，其中各寡核苷酸引物對(duì)被設(shè)計(jì)成選擇性擴(kuò)增個(gè)體的基因組的片段，其包括至少一種與發(fā)展對(duì)施用的麻醉的不良反應(yīng)相關(guān)的多態(tài)性。在一些實(shí)施方案中，該試劑包含至少一對(duì)寡核苷酸，所述寡核苷酸雜交到獲自受試者的基因組區(qū)段的相對(duì)鏈，其中各寡核苷酸引物對(duì)被設(shè)計(jì)成選擇性擴(kuò)增個(gè)體的基因組的片段，其包括至少一種與發(fā)展對(duì)施用的阿片樣物質(zhì)的不良反應(yīng)相關(guān)的多態(tài)性。在一些實(shí)施方案中，該片段的大小為至少20個(gè)堿基對(duì)。此類寡核苷酸或核酸(例如寡核苷酸引物)可以經(jīng)設(shè)計(jì)使用作為與發(fā)展對(duì)施用的麻醉的不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的多態(tài)性(例如SNP或微衛(wèi)星)側(cè)翼的核酸序列的部分。在一些實(shí)施方案中，該試劑盒包含能夠進(jìn)行一種或多種特異性多態(tài)性標(biāo)記物或單倍型的等位基因特異性檢測(cè)的一種或多種標(biāo)記的核酸，以及用于檢測(cè)該標(biāo)記的試劑。合適的標(biāo)記包括例如放射性同位素、熒光標(biāo)記、酶標(biāo)記、酶輔因子標(biāo)記、磁性標(biāo)記、自旋標(biāo)記、表位標(biāo)記等等。

在某些實(shí)施方案中，該試劑盒進(jìn)一步包含使用該試劑盒包含的試劑的一組說明書。

鎮(zhèn)痛藥

鎮(zhèn)痛藥包括撲熱息痛(也稱為對(duì)乙酰氨基酚)、非甾體抗炎藥(NSAIDs)，包括例如水楊酸鹽，以及阿片樣物質(zhì)藥物如嗎啡、芬太尼、二氫嗎啡酮、可待因、羥考酮、氫可酮、曲馬多、昂丹司瓊、地塞米松、美沙酮、阿芬太尼、雷米芬太尼及其衍生物，以及非阿片樣物質(zhì)鎮(zhèn)痛藥，包括對(duì)乙酰氨基酚、NSAIDs及其組合與衍生物。

已經(jīng)詳細(xì)描述本發(fā)明，顯而易見的是，在不離開所附權(quán)利要求書中限定的本發(fā)明的范圍的情況下，修改、變化和等效實(shí)施方案是可能的。本公開中所有實(shí)施例作為非限制性實(shí)施例提供。

系統(tǒng)

圖20顯示了可以實(shí)施本文中描述的一個(gè)或多個(gè)特征的系統(tǒng)的實(shí)例。這里，系統(tǒng)200包括處理器210和存儲(chǔ)器220。系統(tǒng)200還包括用戶界面250，其允許所述系統(tǒng)通過例如一個(gè)或多個(gè)輸入裝置260和一個(gè)或多個(gè)顯示器270與使用者進(jìn)行交互。

系統(tǒng)200還可以包括實(shí)施本文中描述的一個(gè)或多個(gè)特征的一個(gè)或多個(gè)模塊和/或引擎。例如，系統(tǒng)200可以包括風(fēng)險(xiǎn)組分配引擎230，其可以根據(jù)患者對(duì)至少一種遺傳變體的基因型將患者分配到風(fēng)險(xiǎn)組中。系統(tǒng)200還可以包括藥物選擇引擎240，其可以根據(jù)患者分配的風(fēng)險(xiǎn)組對(duì)患者選擇藥物。

在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)200可以配置成接收來自基因型測(cè)定設(shè)備280的患者數(shù)據(jù)。在一些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)患者數(shù)據(jù)可以儲(chǔ)存在數(shù)據(jù)存儲(chǔ)器或數(shù)據(jù)庫(kù)290中，其經(jīng)由數(shù)據(jù)連接與該系統(tǒng)連接。

本文中所述的主題的一個(gè)或多個(gè)方面或特征可以在數(shù)字電子電路、集成電路、專門設(shè)計(jì)的專用集成電路(ASIC)、現(xiàn)場(chǎng)可編程門陣列(FPGA)計(jì)算機(jī)硬件、固件、軟件和/或其組合中實(shí)現(xiàn)。這些各種方面或特征可以包括在一個(gè)或多個(gè)計(jì)算機(jī)程序中實(shí)施，所述計(jì)算機(jī)程序在包括至少一個(gè)可編程處理器的可編程系統(tǒng)上是可執(zhí)行和/或可解讀的，所述可編程處理器可以是特殊或通用的，連接以便從存儲(chǔ)系統(tǒng)、至少一個(gè)輸入裝置和至少一個(gè)輸出裝置接收數(shù)據(jù)和指令，并向存儲(chǔ)系統(tǒng)、至少一個(gè)輸入裝置和至少一個(gè)輸出裝置傳輸數(shù)據(jù)和指令。該可編程系統(tǒng)或計(jì)算系統(tǒng)可以包括客戶端和服務(wù)器?？蛻舳撕头?wù)器通常彼此遠(yuǎn)離并典型地通過通信網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行交互?？蛻舳伺c服務(wù)器的聯(lián)系通過在相應(yīng)的計(jì)算機(jī)上運(yùn)行并具有對(duì)彼此的客戶端-服務(wù)器聯(lián)系的計(jì)算機(jī)程序來產(chǎn)生。

這些計(jì)算機(jī)程序(也稱為程序、模塊、模型生成器、計(jì)算機(jī)指令、軟件、軟件應(yīng)用、應(yīng)用、組件或代碼)包括用于可編程處理器的機(jī)器指令，并可以以高級(jí)程序語(yǔ)言、面向?qū)ο缶幊陶Z(yǔ)言、函數(shù)編程語(yǔ)言、邏輯編程語(yǔ)言和/或以匯編/機(jī)器語(yǔ)言來實(shí)現(xiàn)。本文中所用的術(shù)語(yǔ)“機(jī)器可讀介質(zhì)”指的是用于向可編程處理器提供機(jī)器指令和/或數(shù)據(jù)的任何計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品、設(shè)備和/或裝置，如磁盤、光盤、存儲(chǔ)器和可編程邏輯裝置(PLD)，包括接收機(jī)器指令作為機(jī)器可讀信號(hào)的機(jī)器可讀介質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“機(jī)器可讀信號(hào)”指的是用于向可編程處理器提供機(jī)器指令和/或數(shù)據(jù)的任何信號(hào)。該機(jī)器可讀介質(zhì)可以非暫時(shí)地儲(chǔ)存此類機(jī)器指令，如，例如非暫時(shí)固態(tài)存儲(chǔ)器或磁性硬盤驅(qū)動(dòng)器或任何等效存儲(chǔ)介質(zhì)那樣?；蛘呋虼送?，該機(jī)器可讀介質(zhì)可以以瞬時(shí)方式儲(chǔ)存此類機(jī)器指令，如，例如處理器緩存或與一個(gè)或多個(gè)物理處理器核心相關(guān)聯(lián)的其它隨機(jī)存取存儲(chǔ)器那樣。

為了提供與使用者的交互，本文中所述的主題的一個(gè)或多個(gè)方面或特征可以在計(jì)算機(jī)上實(shí)施，所述計(jì)算機(jī)具有用于向使用者顯示信息的顯示器裝置(所述顯示器如，例如陰極射線管(CRT)或液晶顯示器(LCD)或發(fā)光二極管(LED)監(jiān)視器)，和使用者可以由此向計(jì)算機(jī)提供輸入的鍵盤與指示設(shè)備(如，例如鼠標(biāo)或軌跡球)。其它類型的裝置也可用于提供與使用者的交互。例如，提供給使用者的反饋可以是任何形式的感覺反饋，如，例如視覺反饋、聽覺反饋或觸覺反饋；來自使用者的輸入可以以任何形式接收，包括但不限于聲學(xué)、語(yǔ)言或觸覺輸入。其它可能的輸入設(shè)備包括但不限于觸摸屏或其它觸敏設(shè)備，如單點(diǎn)或多點(diǎn)電阻或電容軌跡板、語(yǔ)音識(shí)別硬件和軟件、光學(xué)掃描儀、光學(xué)指針、數(shù)字圖像捕獲裝置和相關(guān)的解讀軟件等等。

實(shí)施例

提供下列非限制性實(shí)施例以進(jìn)一步描述本文中公開的本發(fā)明的實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，下面的實(shí)施例中公開的技術(shù)代表已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明的實(shí)踐中良好地起作用的方法，因此可以被視為構(gòu)成其實(shí)踐模式的實(shí)例。但是，根據(jù)本公開本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，在不脫離本發(fā)明的精神與范圍的情況下可以在公開的具體實(shí)施方案中進(jìn)行許多改變并仍獲得相同或相近的結(jié)果。

實(shí)施例1：FAAH遺傳變體與手術(shù)后中樞阿片樣物質(zhì)相關(guān)不良事件之間的新相關(guān)性在該實(shí)施例中，評(píng)價(jià)了來自全基因組陣列的脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)的所有重要的遺傳變體對(duì)兒童中圍手術(shù)期的阿片樣物質(zhì)相關(guān)不良反應(yīng)的影響。該實(shí)施例隨后公開為Sahasivam等人,The Pharmacogenomics Journal(2015)1-7，其內(nèi)容經(jīng)此引用并入本文。

研究設(shè)計(jì)、參與者和步驟

這是在經(jīng)受采用標(biāo)準(zhǔn)圍手術(shù)期的麻醉藥、外科手術(shù)和護(hù)理的門診腺樣體扁桃體切除術(shù)的兒童的大型群組中的前瞻性的、基因型盲的、臨床觀察研究。該研究是更大的正在進(jìn)行的臨床研究的一部分，所述研究題為“兒童中的個(gè)性化圍手術(shù)期嗎啡鎮(zhèn)痛”(Personalizing Perioperative Morphine Analgesia in Children),其以clinicaltrials.gov,NCT01140724注冊(cè)。這項(xiàng)采用標(biāo)準(zhǔn)圍手術(shù)期護(hù)理的大型前瞻性臨床試驗(yàn)(臨床護(hù)理團(tuán)隊(duì)不知患者的基因型)評(píng)估了導(dǎo)致兒童中響應(yīng)圍手術(shù)期的阿片類藥物在鎮(zhèn)痛藥和不良效果方面的個(gè)體間差異的因素。該研究由機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)批準(zhǔn)，從父母處獲得知情同意書，并在入選前在適當(dāng)情況下從年齡大于7歲的兒童處獲得同意。

在手術(shù)當(dāng)天招募經(jīng)受選擇性門診扁桃體切除術(shù)或腺樣體扁桃體切除術(shù)的6-15歲的兒童進(jìn)行該研究。樣本納入標(biāo)準(zhǔn)是指定具有美國(guó)麻醉學(xué)家學(xué)會(huì)(ASA)體格狀態(tài)1或2的兒童，所述兒童由于反復(fù)扁桃體炎、扁桃體肥大或阻塞性睡眠呼吸暫停(OSA)而排期進(jìn)行扁桃體切除術(shù)或腺樣體扁桃體切除術(shù)。具有打鼾加持續(xù)超過10秒的睡眠暫?；虬滋焓人牟∈返木哂兴哒系K性呼吸的兒童被視為OSA的臨床癥狀，如在術(shù)前手術(shù)記錄中所記載的那樣，這些兒童中扁桃體切除術(shù)的指征是OSA的臨床診斷。此外，小兒睡眠問卷調(diào)查(PSQ)(Chervin R.等人,Sleep Med,1:21-32(2000)；Chervin R.等人,Arch.Otolaryngol.Head Neck Surg.,133:216-22(2007))，一種得到驗(yàn)證的工具用于評(píng)估兒童的睡眠障礙。如果研究?jī)和母改笇?duì)PSQ中22個(gè)問題中的8個(gè)或更多個(gè)報(bào)告為“是”，該兒童被認(rèn)為患有OSA。

如果兒童或他們的父母不講英語(yǔ)的話，排除該兒童。排除對(duì)研究藥物過敏或患有發(fā)育遲緩、肝或腎疾病、或需要鎮(zhèn)痛藥的術(shù)前疼痛(例如慢性扁桃體炎)的兒童。由于本研究的研究協(xié)調(diào)員有限的可用性，本研究無法招募所有符合條件的受試者以便進(jìn)行方便的抽樣。

所有參與者接受統(tǒng)一的圍手術(shù)期護(hù)理，包括標(biāo)準(zhǔn)化的外科手術(shù)與麻醉技術(shù)。使用七氟烷后接異丙酚(2毫克/千克)推注來誘導(dǎo)麻醉以促進(jìn)氣管內(nèi)插管。用七氟烷維持麻醉，而不使用神經(jīng)肌肉阻滯。在手術(shù)切開前，患者接受嗎啡。具有OSA史的兒童接受0.1毫克/千克的嗎啡，而不具有OSA診斷的那些兒童接受0.2毫克/千克。如果在手術(shù)切開和燒灼后存在任何指示疼痛的跡象(心率和血壓的臨床顯著升高)，臨床麻醉團(tuán)隊(duì)在必要時(shí)在手術(shù)中以0.05毫克/千克的增量提供額外的嗎啡。所有兒童在手術(shù)中接受預(yù)防性的昂丹司瓊(0.1毫克/千克)和地塞米松(0.1毫克/千克)。在手術(shù)后麻醉護(hù)理室(PACU)中用拯救劑量的嗎啡(0.05毫克/千克增量)管理以面部表情；腿部運(yùn)動(dòng)；活動(dòng)；哭叫；和可安慰性(FLACC)疼痛評(píng)分量度為≥4/10的顯著術(shù)后疼痛(Merkel S.等人,Pediatr.Nurs.,23:293-7(1997))。

臨床結(jié)果測(cè)量

對(duì)各參與者記錄對(duì)鎮(zhèn)痛藥效力和阿片樣物質(zhì)相關(guān)不良反應(yīng)的量度。該研究集中于兩種阿片樣物質(zhì)相關(guān)不良反應(yīng)結(jié)果：臨床呼吸抑制(RD)和頑固性PONV。作為鎮(zhèn)痛藥效力的量度，還檢查了總嗎啡需要量(毫克/千克體重)。在該研究中，RD定義為<10次呼吸/分鐘的持續(xù)(>1分鐘)呼吸率或<92％的氧飽和度降低，其在不存在臨床明顯的上呼吸道阻塞的情況下需要補(bǔ)充氧氣以保持SpO2>92％。PONV定義為嘔吐的實(shí)際經(jīng)歷和/或需要進(jìn)行止吐干預(yù)的主訴持續(xù)惡心的經(jīng)歷。

遺傳分析

為了FAAH SNP的基因分型，在手術(shù)室中在靜脈內(nèi)導(dǎo)管放置時(shí)在麻醉下抽血用于DNA。在同一天分離DNA并在-20℃下冷凍。使用TaqMan等位基因鑒別系統(tǒng)測(cè)定(Life Technologies,Applied Biosystems,Forest City,California)選擇六種之前研究過的常見SNP來進(jìn)行基因分型。這些包括rs932816、rs4141964、rs3766246、rs324420、rs324419和rs2295632。此外，使用Illumina Human Omni 5Genome-Wide Human Array進(jìn)行全基因組基因分型?？傆?jì)3097種SNP被基因分型，其用于在PLINK中由中位數(shù)χ2統(tǒng)計(jì)值來評(píng)估基因組膨脹因子(λ)。在3097種SNP中，66種在FAAH基因中，包括rs3766246和rs324420。該陣列還基因分型244種祖先信息標(biāo)記(AIM)，其用于驗(yàn)證自我報(bào)告的種族和正確的人群分層和通過遺傳血統(tǒng)標(biāo)記物進(jìn)行的驗(yàn)證。

為了評(píng)估自我報(bào)告的白人和黑人種族是否與遺傳血統(tǒng)良好匹配，1397名HapMap受試者用作參考人群。在基因分型的244種AIM中，在HapMap數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)了218種。因此，使用SVS 7.7.6(Golden Helix,Bozeman,MT)用218種AIM進(jìn)行主成分分析。在統(tǒng)計(jì)建模中還采用多達(dá)10種PCs以測(cè)試人群分層導(dǎo)致的潛在混雜。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用Statistical Analysis Software(SAS),版本9.3，JMP Genomics,版本6.0(SAS Institute Inc.,Cary,NC)和R進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

在分析之前，檢查數(shù)據(jù)的質(zhì)量。分別在非洲裔美國(guó)人和白種人兒童中檢查了患者的特征和SNP的性質(zhì)。測(cè)試了哈迪-溫伯格平衡(HWE)(Stern C.,Science,97:137-8(1943))。為了分析二元結(jié)果RD和PONV，進(jìn)行了邏輯回歸。為了分析總嗎啡需要量，采用了線性回歸。在評(píng)價(jià)FAAH變體之前，測(cè)試了協(xié)變量的影響。對(duì)于總嗎啡劑量，評(píng)價(jià)了年齡、性別、BMI z評(píng)分和OSA。對(duì)于不良反應(yīng)結(jié)果RD和PONV，總嗎啡量被視為額外的協(xié)變量。為了選擇最佳擬合模型，比較對(duì)數(shù)似然值、Akaike和貝葉斯信息準(zhǔn)則，并檢查殘差。顯著改善模型擬合(p<0.05)的協(xié)變量保留用于隨后的遺傳分析。為了評(píng)估與結(jié)果的單一SNP相關(guān)性，使用加性模型，其中該基因型被重新編碼或作為連續(xù)變量測(cè)試。根據(jù)整個(gè)群體組的次要等位基因的數(shù)量，將基因型重新編碼為0、1和2。分別用白人和黑人患者進(jìn)行統(tǒng)計(jì)建模。

結(jié)果

人口統(tǒng)計(jì).參與者主要是白人，女性略多于男性。與白人兒童相比，黑人兒童略微更重，并具有更高的OSA頻率。在研究的269名非洲裔美國(guó)人和白種人兒童中，自我報(bào)告的種族與起源的遺傳血統(tǒng)充分相關(guān)。

FAAH SNP性質(zhì).在FAAH基因中總計(jì)70種SNP通過TaqMan或Omni 5技術(shù)進(jìn)行基因分型。SNP rs3766246和rs324420通過兩種方法進(jìn)行基因分型；觀察到相同的基因型，顯示了基因型數(shù)據(jù)的可靠性。在70種SNP中，39種在白人與黑人患者中均具有>＝0.05的次要等位基因頻率(MAF)。對(duì)哈迪-溫伯格平衡(HWE)的試驗(yàn)表明，這39種SNP在HWE中均處在alpha＝0.001水平處(39次試驗(yàn)的Bonferroni校正)。因此，在遺傳相關(guān)性分析中包括39種SNP。

自我報(bào)告的種族和遺傳血統(tǒng).自我報(bào)告的白人和黑人種族與由218種AIM評(píng)估的遺傳血統(tǒng)進(jìn)行比較。在總計(jì)259名患者中的250名中(>95％)，自我報(bào)告的種族以CEU和非洲血統(tǒng)聚集良好。主組分(PC)1和2成功地分開白人和黑人種族。在該研究中，該分析通過自我報(bào)告的種族進(jìn)行分層，因?yàn)槠渑cAIM相比對(duì)臨床醫(yī)生易于獲得。

與臨床結(jié)果的遺傳相關(guān)性.分別在白人和黑人中用PONY、RD和總嗎啡劑量測(cè)試了單一SNP相關(guān)性。黑人患者需要更高的總嗎啡劑量(p<0.05，t檢驗(yàn))并傾向于具有較低的PONV發(fā)病率(p＝0.159，F(xiàn)isher’s精確檢驗(yàn))，但是RD的發(fā)病率在黑人與白人之間是相當(dāng)?shù)?p＝0.376，F(xiàn)isher’s精確檢驗(yàn))。

單一SNP相關(guān)性試驗(yàn)的結(jié)果概括在表1和圖1中。在白人患者中，在PONY與三種SNP(rs324420、rs2295632和kgp12517369)之間檢測(cè)到顯著的相關(guān)性，并在總嗎啡劑量與rs647325之間檢測(cè)到顯著的相關(guān)性。此外，觀察到幾種標(biāo)稱相關(guān)性。但是，在黑人患者中，對(duì)任何結(jié)果僅檢測(cè)到標(biāo)稱相關(guān)性(表1)。

表1.單一SNP相關(guān)性

在單一SNP相關(guān)性測(cè)試的基礎(chǔ)上，由46865040bp至46882118bp鑒定相關(guān)區(qū)域(圖1)。在該區(qū)域中包含的11種SNP中，在白人中，7種與PONV相關(guān)，5種與RD相關(guān)。連鎖分析顯示高D’和R2并建議該11種SNP屬于一個(gè)單倍型域。

基因組膨脹.為了評(píng)價(jià)在白人兒童中混合物對(duì)于與PONY的顯著遺傳相關(guān)性的影響，使用3097種SNP的全基因組評(píng)價(jià)基因組膨脹因子(λ)。該分析發(fā)現(xiàn)，λ為1，表明不存在人群分層造成的強(qiáng)混淆。當(dāng)用最多10種PCs調(diào)節(jié)時(shí)，在白人中與PONY的遺傳相關(guān)性依然顯著。

與PONY的FAAH遺傳相關(guān)性的可靠性由于FAAH SNP、rs324420和PONV之間的生物學(xué)和顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著相關(guān)性，為了驗(yàn)證相關(guān)性，我們用已經(jīng)以類似方案進(jìn)行扁桃體切除術(shù)的另外的66名白人兒童重新分析了相關(guān)性。更大的群組(216名白人兒童的原始群組加上66名另外的白人兒童)按照一致和顯著的相關(guān)性重現(xiàn)。該FAAH SNP，rs324420，與PONV顯著相關(guān)(P＝0.0053)，增加次要等位基因(A)的一個(gè)拷貝將OR提高2.0倍；并且其還與導(dǎo)致延長(zhǎng)的PACU停留的PONV相關(guān)聯(lián)(P＝0.0209)，增加次要等位基因(A)的一個(gè)拷貝將OR提高2.2倍。盡管在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并不顯著，rs324420AA基因型兒童整體在PACU中停留(97.9(84.3–113.6)分鐘)比CC和CA基因型兒童(83.9(79.9–88.2)分鐘，P＝0.072)更長(zhǎng)，這在常見門診手術(shù)后在臨床和經(jīng)濟(jì)上是相關(guān)的。

我們的研究顯示了在常見門診手術(shù)——扁桃體切除術(shù)后在FAAH多態(tài)性與頑固性PONV之間顯著的相關(guān)性。此外，在白人兒童組中鑒定了阿片樣物質(zhì)誘導(dǎo)的RD、以及PONY導(dǎo)致的延長(zhǎng)的恢復(fù)室停留與特異性FAAH SNP之間的標(biāo)稱相關(guān)性。具體而言，在白人兒童中，增加rs4141964、rs3766246、rs324420、rs2295632和kgp12517369的次要等位基因的一個(gè)拷貝分別將PONY的幾率提高了2.42倍、2.42倍、2.73倍、2.61倍和2.61倍(P<0.0018，表1)。包括錯(cuò)義多態(tài)性rs324420的這五種FAAH SNP具有與阿片樣物質(zhì)相關(guān)RD和頑固性PONV導(dǎo)致的在PACU中的延長(zhǎng)停留的標(biāo)稱相關(guān)性，凸顯了阿片樣物質(zhì)與內(nèi)源性大麻素途徑之間可能的生物協(xié)同相互作用。

未知的遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素(例如可待因在超速代謝者中)甚至在健康患者中也會(huì)增加呼吸抑制、缺氧和死亡的風(fēng)險(xiǎn)(Kelly L.等人,Pediatrics,129:e1343-7(2012)；Sadhasivam S.和Myer C.,Pain Med.,13:982-3,作者回復(fù)4(2012))。主動(dòng)風(fēng)險(xiǎn)鑒定、分層和預(yù)防措施對(duì)于最大程度減少阿片樣物質(zhì)相關(guān)的呼吸抑制與其它不良反應(yīng)如PONV的負(fù)面影響非常重要。盡管有預(yù)防性止吐藥，PONV仍然是大的麻醉后問題，并常常與阿片類藥物相關(guān)。

總之，在經(jīng)受扁桃體切除術(shù)的兒童中發(fā)現(xiàn)了在FAAH多態(tài)性與手術(shù)后阿片樣物質(zhì)相關(guān)的呼吸抑制、PONV和在PACU中的延長(zhǎng)的停留之間的新的相關(guān)性。在經(jīng)受主要脊椎融合的年紀(jì)較大的青少年的不同人群中驗(yàn)證了這些相關(guān)性。這些結(jié)果表明，在兒童的手術(shù)后，F(xiàn)AAH的特異性遺傳變體一致地與阿片樣物質(zhì)誘導(dǎo)的呼吸抑制、PONV和在PACU中延長(zhǎng)的停留相關(guān)，這可以推廣到具有類似種族和醫(yī)療背景的成人。當(dāng)管理兒童的疼痛時(shí)，在具有某些FAAH遺傳變體的兒童中，臨床醫(yī)生需要預(yù)期阿片樣物質(zhì)誘導(dǎo)的呼吸抑制和PONV的可能更高的發(fā)病率。

實(shí)施例2：ABCC3與OCT1基因型影響嗎啡的藥代動(dòng)力學(xué)

我們假設(shè)，編碼關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和酶(包括OCT1、ABCC3、ABCB1、ABCC2和UGT2B7)的基因的常見功能缺陷遺傳多態(tài)性可以極大改變嗎啡及其代謝產(chǎn)物的PK。該前瞻性臨床研究的目的是評(píng)價(jià)在經(jīng)受扁桃體切除術(shù)的兒童的擴(kuò)展同類群組中關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與酶的所選擇的遺傳變體對(duì)靜脈內(nèi)嗎啡PK的潛在影響。該實(shí)施例隨后公開為Venkatasubramanian等人,Pharmacogenomics(2014)15(10):1297-1309,其內(nèi)容經(jīng)此引用并入本文。

研究設(shè)計(jì)、參與者和步驟

該研究是更大的正在進(jìn)行的觀察性臨床研究的一部分，所述研究題為“兒童中的個(gè)性化圍手術(shù)期嗎啡鎮(zhèn)痛”(Personalizing Perioperative Morphine Analgesia in Children),其以clinicaltrials.gov(NCT01140724)注冊(cè)。除了先前報(bào)道的那些(Fukuda,T.等人,Pharmacogenomics,14:1141-51(2013),其經(jīng)此引用全文并入本文)之外，目前的藥代動(dòng)力學(xué)-藥理遺傳學(xué)研究包括受試者的擴(kuò)展群組，本研究設(shè)計(jì)為接受門診腺樣體扁桃體切除術(shù)的兒童的大型群組中采用標(biāo)準(zhǔn)圍手術(shù)期護(hù)理的前瞻性的、基因型盲的研究，以便評(píng)價(jià)導(dǎo)致響應(yīng)圍手術(shù)期的阿片類藥物的鎮(zhèn)痛藥和不良反應(yīng)的個(gè)體間差異的因素。該研究由辛辛那提兒童醫(yī)院醫(yī)療中心的機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)批準(zhǔn)，在入選前從父母處獲得知情同意書，并在適當(dāng)情況下從年齡大于7歲的兒童處獲得同意。

在該研究中納入6-15歲的青少年與兒童，其具有美國(guó)麻醉學(xué)家學(xué)會(huì)體格狀態(tài)1或2，并由于反復(fù)扁桃體炎、扁桃體肥大或OSA而排期進(jìn)行扁桃體切除術(shù)或腺樣體扁桃體切除術(shù)。從該研究中排除具有嗎啡過敏癥、出生后發(fā)育遲緩、肝/腎疾病、因術(shù)前疼痛存在長(zhǎng)期鎮(zhèn)痛藥需要和兒童或父母不能講英語(yǔ)的兒童(Fukuda,T.等人,Pharmacogenomics,14:1141-51(2013)；Sadhasivam,S.等人,Pediatrics,129:832-8(2012)；Sadhasivam,S.等人,J.Opioid Manag.,8:217-26(2012))。納入該研究的兒童接受標(biāo)準(zhǔn)圍手術(shù)期護(hù)理以及0.2毫克/千克的術(shù)中麻醉嗎啡劑量，除了患有OSA的兒童，其接受0.1毫克/千克的劑量。

藥代動(dòng)力學(xué)取樣與分析

從個(gè)體兒童獲得系列血液樣品以定量嗎啡及其活性代謝產(chǎn)物M3G和M6G的全身濃度。在來自IV管的IV嗎啡推注給藥之前獲得給藥前樣品。在首次推注嗎啡靜脈內(nèi)給藥后0-5分鐘、10-15分鐘和30-45分鐘使用獨(dú)立的靜脈針獲得其它樣品。出于倫理的原因，在恢復(fù)室中在兒童從麻醉中完全恢復(fù)之前收集嗎啡給藥后獲得的血液樣品(1-3號(hào))。采用建立和驗(yàn)證的半自動(dòng)液相色譜-質(zhì)譜分析法/質(zhì)譜分析法測(cè)定在EDTA血漿中定量嗎啡M3G和M6G。已經(jīng)在其它地方描述了該分析方法的細(xì)節(jié)(Clavijo,C.等人,Anal.Bioanal.Chem.,400:715-28(2011))?？煽康亩肯薅葘?duì)嗎啡為0.25-1000納克/毫升(r2>0.99)，對(duì)M3G和M6G為1-1000納克/毫升(r2>0.99)?？偟牟粶?zhǔn)確性小于15％。日間精度在85-115％之內(nèi)。不存在干擾分析物定量的攜帶污染、基質(zhì)干擾或離子抑制/增強(qiáng)。

基因分型和遺傳取樣

在手術(shù)室中使用放置用于麻醉的靜脈內(nèi)導(dǎo)管收集血液樣品用于基因分型相關(guān)多態(tài)性。在同一天分離DNA，在-20℃下冷凍并測(cè)試在功能上重要的基因(OCT1、ABCC3、ABCB1和UGT2B7)的預(yù)先選擇的名單中的特異性SNP，使用市售的TaqMan SNP基因分型分析來測(cè)定。Human Omni 5Genome-Wide Human Array用于鑒定上面選擇的基因中額外的重要SNP。對(duì)參與者基于OCT1基因中的四種非同義SNP進(jìn)行基因分型，所述非同義SNP導(dǎo)致OCT1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的降低或損失，包括Arg61Cys(rs12208357)、Gly401Ser(rs34130495)、Gly465Arg(rs34059508)和Met420缺失(rs72552763)。此外，對(duì)rs4793665(-211C>T)，已知改變影響核因子結(jié)合的mRNA表達(dá)的在ABCC3的啟動(dòng)子區(qū)中的一種SNP，進(jìn)行基因分型。還包括的是ABCB13435T等位基因，因?yàn)槠湟呀?jīng)與癌癥相關(guān)疼痛中更高的嗎啡鎮(zhèn)痛和在混合慢性疼痛人群中較低的嗎啡劑量需求相關(guān)聯(lián)，以及UGT2B7-161C>T，因?yàn)榛蛐虲C受試者與提高的拉莫三嗪清除率相關(guān)。

嗎啡PK模型開發(fā)與評(píng)估

使用NONMEM(版本7.2,ICON Dev.Soln.,MD,USA)以PsN-Toolkit(版本3.5.3)作為界面對(duì)嗎啡數(shù)據(jù)開發(fā)了非線性、混合效應(yīng)、人群藥代動(dòng)力學(xué)模型。使用統(tǒng)計(jì)包R(版本2.15)來進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理、后處理和可視化。兩房室結(jié)構(gòu)用于描述嗎啡濃度-時(shí)間曲線。在該模型中并入延遲房室，將向假想房室輸送嗎啡的延遲和代謝產(chǎn)物形成建模為依賴于假想房室中的嗎啡濃度。

首先測(cè)試采用體重作為協(xié)變量的效應(yīng)，并包括在具有異速生長(zhǎng)模型的藥代動(dòng)力學(xué)模型中。將個(gè)體參數(shù)的評(píng)估建模為依賴于平均人群參數(shù)和具有對(duì)數(shù)正態(tài)分布的潛在個(gè)體間差異。細(xì)節(jié)參見Venkatasubramanian等人,Pharmacogenomics 2014 15(10):1297-1309。

使用一系列標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估該模型的質(zhì)量，包括目標(biāo)函數(shù)值(OFV)、殘差診斷和使用自舉(bootstrap)驗(yàn)證技術(shù)的模型穩(wěn)定性考慮。不同模型之間的初始比較基于被認(rèn)為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的嵌套模型之間3.84(p<0.05,DOF＝1)的OFV下降。除了OFV改進(jìn)之外，使用診斷擬合優(yōu)度曲線(檢查以鑒定暗示模型錯(cuò)誤特征的可能趨勢(shì))、η分布直方圖(檢查以確保單峰性)來評(píng)估模型。通過重新擬合該模型至1000個(gè)隨機(jī)取樣的自舉數(shù)據(jù)集來評(píng)估最終的模型穩(wěn)定性。

藥物基因組學(xué)分析

還進(jìn)行了協(xié)變量分析以測(cè)試作為體重歸一化的(a)嗎啡清除率；和(b)M3G/(c)M6G形成清除率的個(gè)體事后貝葉斯估計(jì)的分類協(xié)變量的所選基因型的顯著性。使用Fisher’s單因素方差分析進(jìn)行初步藥理遺傳學(xué)-藥代動(dòng)力學(xué)分析，p<0.05被視為統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著。隨后通過并入該基因型作為嗎啡清除率與代謝產(chǎn)物形成清除率的分類協(xié)變量在NONMEM中正式地測(cè)試顯著的協(xié)變量。通過一系列標(biāo)準(zhǔn)確定作為嗎啡PK中的協(xié)變量的基因型的顯著性，所述標(biāo)準(zhǔn)包括(a)嵌套模型之間3.84(p<0.05，自由度＝1)的OFV下降；和(b)加性協(xié)變量參數(shù)估計(jì)值的精度。

結(jié)果

入選受試者的人口統(tǒng)計(jì)細(xì)節(jié)、來自納入該研究的223名受試者的嗎啡給藥后收集的嗎啡、M3G和M6G的時(shí)間與濃度概況，以及對(duì)異速生長(zhǎng)(體重)-成比例嗎啡與代謝產(chǎn)物人群PK模型的NONMEM模型參數(shù)估計(jì)值描述在Venkatasubramanian等人,Pharmacogenomics 2014 15(10):1297-1309中。簡(jiǎn)而言之，在220名入選的受試者中，179名是白種人，38名是非洲裔美國(guó)人，其余6名受試者包括1名亞裔兒童、1名印度裔兒童和4名具有一位白種人和一位非洲裔美國(guó)人父母的混血兒。在白種人與非洲裔美國(guó)人群組之間沒有觀察到年齡、體重或身高的顯著差異。

在下表中給出了SNP基因型的分布。如前所述，基于OCT1基因型將受試者分為三個(gè)組(Fukuda,T.等人,Pharmacogenomics,14:1141-51(2013)；Fukuda,T.等人,Clinical Pharmacology&Therapeutics,93:S49-S49(2013)；Tzvetkov,M.等人,Biochemical Pharmacology,86:666-678(2013))?；诨蚍中徒Y(jié)果，58％的兒童是OCT1野生型，36％是OCT1雜合的，5.4％是OCT1純合的。在具有純合的基因型的12名兒童中，11名是白種人，1名是西班牙裔，沒有非洲裔美國(guó)人。在ABCB1C3435T基因型中也觀察到了種族異質(zhì)性，但是在ABCC3的-211C>T位置處的多態(tài)性中沒有觀察到種族差異。

使用對(duì)嗎啡系統(tǒng)清除率(CL)具有個(gè)體間差異的兩房室模型描述嗎啡的藥代動(dòng)力學(xué)。使用對(duì)代謝產(chǎn)物形成清除率具有個(gè)體間差異的單房室模型捕捉代謝產(chǎn)物概況。根據(jù)以前的報(bào)告，固定代謝產(chǎn)物的分布容積和清除率(Bouwmeester,N.等人,Br.J.Anaesth.,92:208-17(2004))，因?yàn)橛捎谌映掷m(xù)時(shí)間短，該概況僅含有關(guān)于它們的形成的信息。對(duì)嗎啡清除率和M3G形成清除率的η-收縮率較低(16.5％和20％)，而對(duì)M6G形成清除率較高(31.8％)，顯示了在該數(shù)據(jù)集中涉及M6G形成的信息有限(Savic,R.和Karlsson,M.,AAPS J.,11:558-69(2009))。代謝產(chǎn)物的形成取決于假想房室中的嗎啡濃度，其滯后于中心房室，導(dǎo)致代謝產(chǎn)物形成的延遲。增加延遲房室導(dǎo)致去除了在早期代謝產(chǎn)物水平的預(yù)測(cè)過高和在晚期的預(yù)測(cè)過低，并獲得了明顯更好的模型(dOFV＝-305)。結(jié)合異速生長(zhǎng)尺度律以解釋體重對(duì)清除率的影響，并且具有0.75和1的指數(shù)的容積被發(fā)現(xiàn)顯著改善模型擬合(dOFV＝-184)(Anderson,B.和Holford,N.,Br.J.Clin.Pharmacol.,72:518-20；作者回復(fù)521-3(2011))。包括種族對(duì)嗎啡清除率的影響改善了該模型，其中非洲裔美國(guó)人具有比白種人高8％的平均清除率(Sadhasivam,S.等人,J.Opioid Manag.,8:217-26(2012))。類似地，性別影響嗎啡藥代動(dòng)力學(xué)，其中女孩具有比男孩高5％的清除率。

使用單因素ANOVA對(duì)體重歸一化的嗎啡清除率和兩種代謝產(chǎn)物的形成清除率的事后貝葉斯估計(jì)進(jìn)行預(yù)先選擇的功能基因型的貢獻(xiàn)的初步協(xié)變量分析。在歸一化體重帶來的貢獻(xiàn)后獲得的這些估計(jì)值代表了在不存在體型作為混雜因素的情況下的個(gè)體清除率值。嗎啡清除率的個(gè)體事后貝葉斯估計(jì)值的目視檢查(圖2)表明純合的OCT基因型受試者具有比我們的研究群組中組合的野生型和雜合性組更低的平均CLM。對(duì)M3G形成清除率觀察到類似的趨勢(shì)，其中OCT1純合組具有比其它組低～50％的平均值。在純合組中較低的M-6G形成清除率(～55％)的證據(jù)是實(shí)質(zhì)性的，盡管其并非統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的(p＝0.09)。與初步的ANOVA分析一致，NONMEM協(xié)變量分析表明，OCT1純合組對(duì)CLM與CLFM3G是顯著的協(xié)變量(dOFV>3.84)，其中純合子具有比其它基因型低16％和48％的清除率。僅在12名純合的受試者的2名定量了M6G濃度(因?yàn)闈舛鹊陀贚OQ和分析問題)，導(dǎo)致了關(guān)于不同組之間M6G形成的差異方面有限的定量信息。

目視檢查相對(duì)于ABCC3-211C>T基因型的個(gè)體清除率的事后貝葉斯估計(jì)的改變(圖2)顯示了在具有漸增數(shù)量的C等位基因的受試者中逐漸提高的代謝產(chǎn)物形成清除率與嗎啡清除率。使用兩個(gè)備選組，即(1)TT+CT vs.CC和(2)TT vs.CT+CC進(jìn)行的初步單因素ANOVA分析表明，在對(duì)所有變量的試驗(yàn)中，前一種分組的證據(jù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上比后一種更顯著(Mizuno,T.等人,Clinical Pharmacology&Therapeutics,93:S63-S63(2013))。該ABCC3基因型作為在NONMEM模型中的潛在協(xié)變量的評(píng)價(jià)表明，CC基因型具有明顯更高的CLFM3G，并且包含該CC基因型極大地改善了模型擬合(dOFV＝-9)。類似地，基于單因素ANOVA(p＝0.03)和在NONMEM模型中的協(xié)變量包含(dOFV＝-4.86)，ABCC3基因型被發(fā)現(xiàn)是CLFM6G的顯著協(xié)變量?；贜ONMEM模型估計(jì)，該CC基因型具有比結(jié)合的TT和CT基因型高46％(95％CI：4.3％-88％)的CLFM3G。對(duì)CLFM6G提高的估計(jì)類似于CLFM3G，盡管對(duì)該參數(shù)的精確度較低。基于1000次自舉估計(jì)采用非參數(shù)的參數(shù)置信區(qū)間估計(jì)的進(jìn)一步評(píng)估證實(shí)，相當(dāng)好地估計(jì)了CLFM6G的提高，其中中值為47％，95％CI為2％-100％。而純合的CC基因型具有更高代謝產(chǎn)物形成的證據(jù)是強(qiáng)有力的，其對(duì)嗎啡清除率的影響不那么顯著。包含ABCC3基因型作為潛在協(xié)變量改善了模型擬合(dOFV＝-2)，盡管其并未顯著改善具有評(píng)估為嗎啡清除率比其它基因型適度提高的CC基因型的模型(8.1％；95％CI：-0.7％:16.8％)。

對(duì)個(gè)體清除率(CLM/CLFM6G)的后估計(jì)的改變(圖2)顯示ABCB1C3435T基因型對(duì)CLM和CLFM6G沒有可辨別的影響。但是，具有結(jié)合的CT與TT基因型的受試者與具有TT基因型的受試者相比似乎具有更高的CLFM3G(圖2)?；趩我蛩谹NOVA分析，這些趨勢(shì)被證實(shí)是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的，其表明CT+TT基因型具有比TT高18.4％的CLFM3G(p＝0.04)，而其對(duì)CLM的影響最小(1％)。這些與來自NONMEM分析的結(jié)果一致，在所述NONMEM分析中，C3435T基因型被鑒定為CLFM3G(dOFV＝-4.32)的顯著協(xié)變量，但不是CLM和CLFM6G的顯著協(xié)變量。

討論

近來，隨著阿片樣物質(zhì)處方的增加，定量不同藥物遺傳學(xué)(PG)因子對(duì)阿片樣物質(zhì)響應(yīng)的變化性的貢獻(xiàn)越來越受到關(guān)注(Branford,R.等人,Clin.Genet.,82:301-10(2012)；Cohen,M.等人,Curr.Opin.Anaesthesiol.,25:419-27(2012)；Sadhasivam,S.和Myer,C.,Pain Med.,13:982-3,作者回復(fù)984(2012)；Eissing,T.等人,Mol.Diagn.Ther.,16:43-53(2012))。目前該研究的焦點(diǎn)在于捕捉PG對(duì)嗎啡藥代動(dòng)力學(xué)(PK)的作用，雖然遺傳變化性對(duì)阿片樣物質(zhì)響應(yīng)的一部分貢獻(xiàn)將歸因于藥代動(dòng)力學(xué)(PD)因素。我們?cè)谶@里展示成功開發(fā)了NONMEM模型以捕捉嗎啡及其代謝產(chǎn)物的時(shí)間曲線。使用具有事后個(gè)體估計(jì)的基于簡(jiǎn)單單因素ANOVA的方法，對(duì)于對(duì)CLM、CLFM3G和CLFM6G的潛在影響來篩選預(yù)先選擇的SNP。基于NONMEM的協(xié)變量分析隨后用于在3種不同的基因(OCT1、ABCC3和ABCB1)中鑒定SNP，這些基因?qū)岱萈K和/或其代謝產(chǎn)物具有顯著的貢獻(xiàn)，盡管并未發(fā)現(xiàn)與UGT2B7或ABCC2基因型的相關(guān)性。

這個(gè)更大群組研究的結(jié)果證實(shí)了我們較早的結(jié)果，表明OCT1純合組具有比組合的野生型和雜合組低大約17％的清除率(Fukuda,T.等人,Pharmacogenomics,14:1141-51(2013)；Fukuda,T.等人,Clinical Pharmacology&Therapeutics,93:S49-S49(2013))。與我們的結(jié)果一致，單獨(dú)的臨床研究表明，具有2個(gè)或更多功能缺陷的等位基因的受試者具有明顯比其他人更低的嗎啡清除率(Tzvetkov,M.等人,Biochemical Pharmacology,86:666-678(2013))。這里顯示的結(jié)果提供了限制嗎啡攝入到肝細(xì)胞中的進(jìn)一步證據(jù)，其中功能缺陷的OCT1基因型直接影響嗎啡CL。與較低的CL的觀察結(jié)果一致，本研究還首次證明，OCT1純合的受試者具有兩種代謝產(chǎn)物M3G和M6G的較低的轉(zhuǎn)化率。在這些受試者中，受限的嗎啡攝入至肝細(xì)胞影響了下游嗎啡的代謝過程，導(dǎo)致較低的嗎啡葡糖苷酸生成。在純合的受試者中較低的嗎啡CL以及M3G/M6G形成的相關(guān)觀察提供了更有力的證據(jù)——嗎啡的OCT1攝取進(jìn)入肝細(xì)胞在嗎啡的PK中起到了關(guān)鍵作用。

在生理pH下，預(yù)期嗎啡處于離子化狀態(tài)，具有帶電荷的酰胺基團(tuán)(pKa＝8.4)，使其成為OCT1的合適底物。體外研究表明，嗎啡具有低轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白獨(dú)立滲透率，并且嗎啡的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白依賴性攝入至肝細(xì)胞占總攝取量的大約60％。此外，這些研究還表明，嗎啡攝取在過度表達(dá)野生型OCT1的肝細(xì)胞中是濃度依賴性的，盡管當(dāng)存在功能喪失多態(tài)性時(shí)攝取率顯著降低(75-100％)?；谶@些結(jié)果，存在缺陷等位基因的影響在代謝產(chǎn)物形成率(～45％)方面比嗎啡清除率(～16％)更高，并且與具有2種或更多種缺陷等位基因的受試者中觀察到的低37％的AUC更為一致。雖然嗎啡作為OCT1的底物已被充分表征，OCT1在葡糖苷酸代謝產(chǎn)物攝取中的作用迄今還不知道。這些結(jié)果表明，OCT1對(duì)嗎啡清除率的影響可能遠(yuǎn)高于目前估計(jì)的16％，意味著純合的受試者響應(yīng)嗎啡給藥將感受到更好的鎮(zhèn)痛和更差的不良反應(yīng)。

此外，本研究表明，在rs4793665(ABCC3)處具有C/C基因型的兒童具有高46％的M6G形成率和高41％的M3G形成率，表明與組合的C/T和T/T基因型相比M6G向血漿中的流入增加。一項(xiàng)早期研究報(bào)道，在來自該研究的受試者亞組中，具有C/T和T/T基因型的患者中M3G/嗎啡和M6G/嗎啡的比率明顯更低(Mizuno,T.等人,Clinical Pharmacology&Therapeutics,93:S63-S63(2013))。目前的基于NONMEM的分析與先前相比更好地解釋了在整個(gè)研究中給藥和重量造成的變化(Mizuno,T.等人,Clinical Pharmacology&Therapeutics,93:S63-S63(2013))，從而有助于更機(jī)械地解釋該結(jié)果。雖然觀察到該基因型清楚地改變了代謝產(chǎn)物形成，但是也觀察到在受試者中提高的嗎啡清除率。沒有明確證據(jù)表明嗎啡是ABCC3的底物，盡管已經(jīng)推測(cè)嗎啡通過ABCC3流入血漿(Tzvetkov,M.等人,Biochemical Pharmacology,86:666-678(2013))。

已經(jīng)報(bào)道了嗎啡給藥后不良反應(yīng)的發(fā)生率在白種人兒童中比在非洲裔美國(guó)人兒童中更高，在拉丁裔兒童中比在非拉丁裔兒童中更高(Sadhasivam S.等人,Pediatrics,129:832-8(2012)；Sadhasivam S.等人,J.Opioid Manag.,8:217-26(2012)；Jimenez,N.等人,J.Health Care Poor Underserved,21:229-36(2010))。我們已經(jīng)報(bào)道了在診所中觀察到的在嗎啡需要量方面的種族差異，與白種人兒童相比，非洲裔美國(guó)人兒童需要更多的嗎啡。我們發(fā)現(xiàn)，白種人具有比非洲裔美國(guó)人低8％的嗎啡CL，當(dāng)包含OCT1基因型與種族一起作為協(xié)變量時(shí)，其進(jìn)一步降低至7％。此外，當(dāng)在多數(shù)種族(白種人：80％)中測(cè)試時(shí)，我們的PK/PG相關(guān)性得到了一致地重現(xiàn)，由此限制了人群分層的影響。如我們較早報(bào)道的那樣，與非洲裔美國(guó)人相比OCT1純合組在白種人中更高的頻率(大約5％)可能是白種人兒童中較低的嗎啡CL的原因之一。

總之，這種大型兒科藥代動(dòng)力學(xué)與藥物遺傳學(xué)研究表明，除了體重之外，OCT1和ABCC3純合的基因型在嗎啡的藥代動(dòng)力學(xué)及其代謝產(chǎn)物方面起到了顯著的作用。具體而言，具有ABCC3rs4793665純合的C/C基因型的兒童比組合的野生型和雜合的基因型相比具有高大約46％的M6G形成率，導(dǎo)致增加的M6G轉(zhuǎn)運(yùn)到血漿中；在純合的C/C基因型中也觀察到一致的高41％的M3G形成。發(fā)現(xiàn)OCT1純合的基因型(n＝12)具有明顯更低的嗎啡清除率(～17％)。在白種人人群中觀察到ABCC3 rs4793665C/C與OCT1純合基因型的更高頻率。這一發(fā)現(xiàn)部分解釋了與非洲裔美國(guó)人相比在白種人中更低的嗎啡清除率和更高的嗎啡不良反應(yīng)發(fā)病率。還觀察到在女孩與男孩之間嗎啡清除率的小差異。

實(shí)施例3：ABCC3、ABCB1和FAAH變體的驗(yàn)證

進(jìn)行進(jìn)一步的工作以擴(kuò)展和驗(yàn)證上面對(duì)ABCC3的結(jié)果。藥代動(dòng)力學(xué)模型和分析如上所述。除了上述扁桃體切除術(shù)群組(T&A研究)之外，該工作還包括經(jīng)受后路脊柱融合的不同的青少年外科手術(shù)人群(脊柱研究)。脊柱研究組包括88名具有特發(fā)性脊柱側(cè)凸的非肥胖青少年，其經(jīng)受后路脊柱融合。所有患者在手術(shù)后接受嗎啡患者控制的鎮(zhèn)痛并隨訪48小時(shí)。記錄關(guān)于嗎啡消耗、術(shù)后疼痛評(píng)分、使用地西泮和其它鎮(zhèn)痛藥的數(shù)據(jù)。入選的受試者為11-19歲；59％為女性，85％為白種人。

具有異速生長(zhǎng)尺度律的嗎啡和代謝產(chǎn)物人群PK模型的模型參數(shù)估計(jì)值顯示在下表中。

表5：具有異速生長(zhǎng)尺度律的嗎啡和代謝產(chǎn)物人群PK模型的模型參數(shù)估計(jì)值。參數(shù)符號(hào)：CL:清除率；Q:室間清除率；V:容積；FCL:形成清除率；ω2:受試者之間的方差；ε:比例誤差系數(shù)；下標(biāo)：-M:嗎啡；c:中心；p:外周。

^#基于以前的報(bào)告固定這些參數(shù)，并非通過NONMEM估計(jì)

自舉參數(shù)估計(jì)值的第2.5和第97.5百分位數(shù)

^**基于標(biāo)準(zhǔn)誤差估計(jì)值估計(jì)的置信區(qū)間

圖3A顯示了在我們的研究中觀察到的ABCC3rs4793665基因型在嗎啡CL與代謝產(chǎn)物(M3G/M6G)形成清除率(FCLM3G&FCLM6G)方面的個(gè)體間差異?？傊贜ONMEM協(xié)變量分析發(fā)現(xiàn)，rs4793665基因型對(duì)FCLM6G和FCLM3G是顯著協(xié)變量(dOFV分別為-8.41和-7.44)，其中CC基因型分別具有比其它基因型高38％和46％的形成。在脊柱研究中還發(fā)現(xiàn)，具有CC基因型的受試者具有明顯更高的M6G形成CL(高38％；29％RSE)。在腺樣體扁桃體切除術(shù)受試者中觀察到類似的趨勢(shì)，盡管并不明顯。在兩種研究中，CC基因型明顯與更高的M3G形成CL相關(guān)，由腺樣體扁桃體切除術(shù)(高46％；46％RSE)和脊柱(高57％；38％RSE)研究發(fā)現(xiàn)其具有類似的估計(jì)值。

圖3B顯示了在我們的研究中觀察到的ABCC3rs4148412基因型在嗎啡CL與代謝產(chǎn)物(M3G/M6G)形成清除率(FCLM3G&FCLM6G)方面的個(gè)體間差異?；贜ONMEM協(xié)變量分析發(fā)現(xiàn)，rs4148412AA基因型對(duì)FCLM3G是顯著協(xié)變量(dOFV＝-6.54)，AA基因型具有高36％(95％CI[-0.002；0.71])的形成。在具有rs4148412AA基因型的脊柱受試者中發(fā)現(xiàn)了一致的PK-PG相關(guān)性，采用NPNMEM，對(duì)FCLM3G(dOFV＝-3.8)基協(xié)變量分析顯示了強(qiáng)趨勢(shì)協(xié)變量。在脊柱受試者中，rs4148412AA基因型據(jù)估計(jì)具有比其它基因型高48％(95％CI[0.21；1.06])的形成。總之，在腺樣體扁桃體切除術(shù)研究中發(fā)現(xiàn)，具有AA基因型的受試者具有明顯更高的M3G形成CL(高36％；51％RSE)。在脊柱研究中觀察到趨向于顯著性的類似趨勢(shì)(p＝0.06)，其中AA基因型具有高52％(60％RSE)的形成。在兩項(xiàng)研究中，AA基因型均顯示出更高的M6G形成的趨勢(shì)。

圖4A顯示了在我們的研究中觀察到的ABCC3rs739923基因型在嗎啡CL與代謝產(chǎn)物(M3G/M6G)形成清除率(FCLM3G&FCLM6G)方面的個(gè)體間差異。在脊柱受試者中，rs733392基因型對(duì)M3G形成是顯著的協(xié)變量，AA受試者具有比其它基因型低57％的形成。但是在更大的T&A研究中，rs733392基因型不是顯著的協(xié)變量。在ABCC3 rs739923基因型與嗎啡CL和代謝產(chǎn)物形成CL之間沒有發(fā)現(xiàn)顯著的遺傳相關(guān)性。

圖4B顯示了在我們的研究中觀察到的ABCC3 kgp8560677基因型在嗎啡CL與代謝產(chǎn)物(M3G/M6G)形成清除率(FCLM3G&FCLM6G)方面的個(gè)體間差異。在ABCC3 kgp8560677基因型與嗎啡CL和代謝產(chǎn)物形成CL之間沒有發(fā)現(xiàn)顯著的遺傳相關(guān)性。

這些結(jié)果概括在下表中。

表6：來自具有ABCC3變體的隨訪研究的結(jié)果的總結(jié)

使用相同的結(jié)構(gòu)PK模型很好地描述了來自所述兩項(xiàng)研究的嗎啡與代謝產(chǎn)物的藥代動(dòng)力學(xué)，所述模型包括用于嗎啡的中心和外周房室、用于各代謝產(chǎn)物的一個(gè)分布房室和導(dǎo)致代謝產(chǎn)物形成延遲的房室。在兩項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，嗎啡PK模型的模型參數(shù)是類似的，其中脊柱受試者的模型參數(shù)高于T&A受試者。在兩項(xiàng)研究的嗎啡模型中的差異可能歸因于在(a)人群、(b)聯(lián)合用藥和(c)藥代動(dòng)力學(xué)取樣策略方面的差異所導(dǎo)致的研究間差異。M3G的形成清除率相對(duì)于M6G嗎啡清除率估計(jì)值的比發(fā)現(xiàn)在脊柱研究中為7.2，在T&A研究中為9.6。這與M3G代謝產(chǎn)物形成是M6G形成的7-10倍的其它報(bào)道一致。

在早期研究中，我們顯示，具有rs4793665的C/C基因型(ABCC3)的兒童具有比組合的C/T和T/T基因型高46％的M6G形成和高41％的M3G形成，表明代謝產(chǎn)物流入血漿增加。在目前的分析中我們發(fā)現(xiàn)，ABCC3 rs4148412 AA基因型具有更高的M3G形成。rs4148412中的遺傳變異對(duì)ABCC3功能的影響的機(jī)理基礎(chǔ)尚不清楚。發(fā)現(xiàn)ABCC3主要在肝細(xì)胞的基底外側(cè)表面中表達(dá)，并且已經(jīng)報(bào)道對(duì)嗎啡葡糖苷酸具有高親和力。盡管觀察到該基因型明顯改變了代謝產(chǎn)物形成，但是并未觀察到顯著影響嗎啡清除率。

為了進(jìn)一步確定ABCC3SNP的顯著性，我們針對(duì)臨床結(jié)果對(duì)它們進(jìn)行了驗(yàn)證。圖6顯示了在接受脊柱后路融合手術(shù)的青少年中在ABCC3 rs733392與呼吸抑制之間的相關(guān)性的驗(yàn)證。

下表顯示了用臨床結(jié)果驗(yàn)證顯示的ABCC3的變體。對(duì)GWAS ABCC3數(shù)據(jù)的Plink分析(包括在chr17:48710kb與chr17:48770kb之間總計(jì)65種SNP)通過了質(zhì)量控制。白種人和非洲裔美國(guó)人人群在該模型中組合并調(diào)整，以及其它顯著的協(xié)變量。對(duì)于這些分析，比值比計(jì)算為純合的突變體vs.雜合/雜合vs.野生型；PONV＝手術(shù)后惡心與嘔吐；plongRD＝導(dǎo)致延長(zhǎng)的PACU停留的呼吸抑制。

表7：ABCC3變體與臨床結(jié)果的相關(guān)性

下表顯示了在臨界區(qū)域中呼吸抑制導(dǎo)致的延長(zhǎng)的PACU停留對(duì)ABCC3SNP的相關(guān)性，以及描述為比值比(OR)和95％置信區(qū)間的效應(yīng)。該比值比表示當(dāng)次要等位基因(組合的種族)增加一個(gè)拷貝時(shí)的比。圖9顯示了手術(shù)后呼吸抑制與來自人Illumina Omni5 GWAS芯片的ABCC3 SNP之間的相關(guān)性。

此外，我們用更大的樣本分析了上面討論的ABCB1、FAAH和OPRM1數(shù)據(jù)。如下表中詳細(xì)描述的那樣，以0.0002和0.0143的p值驗(yàn)證了ABCB1 rs9282564與導(dǎo)致延長(zhǎng)的PACU停留的呼吸抑制(plongRD)的相關(guān)性和FAAH rs324420與手術(shù)后惡心與嘔吐(PONV)的相關(guān)性的顯著性。該結(jié)果表明，具有該次要等位基因的患者在各種情況下具有這些不良事件的更高風(fēng)險(xiǎn)，如通過比值比所顯示的那樣。

表9：變體與臨床結(jié)果的相關(guān)性

實(shí)施例4：青少年脊柱融合后OPRMI A118G變體與嗎啡誘導(dǎo)的呼吸抑制風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性

進(jìn)行本研究以確定OPRM1A118G變體是否能夠影響對(duì)嗎啡誘導(dǎo)的呼吸抑制(MIRD)的易感性。此實(shí)施例隨后公開為Chidambaran等人ThePharmacogenomics Journal(2014)1-8,其內(nèi)容經(jīng)此引用并入本文。

在IRB批準(zhǔn)和同意后，在經(jīng)受后路脊柱融合的88名具有特發(fā)性脊柱側(cè)凸的非肥胖青少年中進(jìn)行前瞻性基因型盲研究。所有患者在手術(shù)后接受嗎啡患者控制的鎮(zhèn)痛并隨訪48小時(shí)。MIRD結(jié)果定義為手術(shù)后發(fā)生RR<8/分鐘，持續(xù)>3分鐘，需要采取糾正措施。記錄關(guān)于嗎啡消耗、術(shù)后疼痛評(píng)分、使用地西泮和其它鎮(zhèn)痛藥的數(shù)據(jù)。患者對(duì)OPRM1 A118G變體基因分型。影響OIRD的因素的回歸分析包括種族、性別、嗎啡需要量和基因型。比較基因型亞組中的疼痛評(píng)分和相關(guān)變量。入選的受試者為11-19歲；59％為女性，85％為白種人?；贠PRM1遺傳變體，67名對(duì)野生型是純合的(AA)，21名對(duì)變體是雜合的/純合的(AG/GG)。具有AA基因型的37％具有對(duì)POD1/2的MIRD，而具有GG/AG基因型的僅9％具有MIRD(圖7A)。在對(duì)變量進(jìn)行調(diào)整后，具有AA基因型的患者中的MIRD與帶有G等位基因的患者相比明顯更高(>5倍)(OR95％CI:1.5-40.6，p＝0.027)(圖7B)。與AA基因型相比，具有AG/GG基因型的兒童對(duì)POD1/2具有明顯更高的疼痛評(píng)分(p＝0.02)和更高的嗎啡需要量(圖7C)。

這是顯示與AG/GG基因型相比在OPRM1AA基因型中盡管需要更少的嗎啡，但是呼吸抑制風(fēng)險(xiǎn)更高的第一個(gè)前瞻性臨床試驗(yàn)。在A118G變體處存在G等位基因具有針對(duì)MIRD的保護(hù)作用。這種基因型-呼吸抑制相關(guān)性是預(yù)測(cè)兒童處于更高風(fēng)險(xiǎn)和在兒童中個(gè)性化使用嗎啡以最大程度地緩解疼痛并同時(shí)盡量減少嚴(yán)重不良反應(yīng)的可能性的重要步驟。

實(shí)施例5：兒科扁桃體切除術(shù)后阿片樣物質(zhì)誘導(dǎo)的呼吸抑制的遺傳風(fēng)險(xiǎn)特征

為了將遺傳研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化為臨床實(shí)踐和遺傳風(fēng)險(xiǎn)因子的重要意義的更好臨床適應(yīng)性，必須開發(fā)基于多變量預(yù)測(cè)工具的簡(jiǎn)單適用的臨床決策規(guī)則。本研究的目的是開發(fā)用于使用遺傳和非遺傳因素預(yù)測(cè)嗎啡誘導(dǎo)的呼吸抑制的易感性的可靠而穩(wěn)定的模型。此實(shí)施例隨后公開為Biesiada等人,Pharmacogenomics(2014)15(14):1749-1762,其內(nèi)容經(jīng)此引用并入本文。

鑒定呼吸抑制的遺傳風(fēng)險(xiǎn)因子由于基因-基因相互作用(個(gè)體基因/標(biāo)記物與RD的相關(guān)性較弱)以及與種族和血統(tǒng)、各種臨床病癥(如OSA)和甚至文化背景(其可能會(huì)影響疼痛耐受度以及用于改善疼痛的阿片類藥物的所得劑量)的相互作用而復(fù)雜化。結(jié)果，將患者分成不同亞型的策略可以幫助鑒定在SNP(或其它標(biāo)記物)與RD之間的相關(guān)性的更強(qiáng)的(可能在各亞型中不同)模式。

在本研究中，監(jiān)督和無監(jiān)督方法用于實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。使用決策樹的遞歸分割提供了數(shù)據(jù)的固有分層并優(yōu)化了預(yù)測(cè)性SNP(及其組合)的選擇和總準(zhǔn)確度。此外，決策樹提供了容易解釋的決策規(guī)則，其可以用作臨床決策支持的基礎(chǔ)。無監(jiān)督聚類方法可以提供該群組的替代分層，將其分為共享在多個(gè)SNP處的等位基因以及可能與捕獲上述復(fù)雜相互作用相關(guān)的其它特征的患者集群。對(duì)確定不同集群貢獻(xiàn)最多的SNP(以及臨床變量，如OSA)可以被視為這些集群(亞型)的“SNP特征”，類似于例如限定癌癥的分子亞型的基因特征。

采用補(bǔ)充分類(遞歸分割)和聚類(SNP特征)策略也可以促進(jìn)驗(yàn)證結(jié)果和揭示數(shù)據(jù)中的隱藏結(jié)構(gòu)。本研究發(fā)現(xiàn)，兩種方法的結(jié)果產(chǎn)生了大體一致的結(jié)果。發(fā)現(xiàn)幾種SNP有助于兩個(gè)不同的集群，特點(diǎn)在于顯著不同的RD風(fēng)險(xiǎn)。還鑒定了可用于以相對(duì)高的準(zhǔn)確度在特定層級(jí)中預(yù)測(cè)RD的決策規(guī)則。該結(jié)果總結(jié)在下文中。

研究設(shè)計(jì)、參與者和步驟

在適當(dāng)?shù)腎RB批準(zhǔn)和同意后，在273名經(jīng)受扁桃體切除術(shù)的6-15歲的兒童中進(jìn)行前瞻性基因型盲試驗(yàn)，所述兒童接受嗎啡作為標(biāo)準(zhǔn)圍手術(shù)期護(hù)理的一部分。在恢復(fù)室中觀察所有患者的嗎啡需要量、疼痛結(jié)果和RD的發(fā)生，研究主要結(jié)果。RD定義為呼吸率<每分鐘10次呼吸或持續(xù)性氧飽和度降低<92％，其在不存在臨床明顯的上呼吸道阻塞的情況下需要補(bǔ)充氧氣以保持SpO2>92％。使用TaqMan測(cè)定，所有患者對(duì)已知涉及嗎啡藥代動(dòng)力學(xué)和呼吸抑制途徑的15種基因中的48種單核苷酸多態(tài)性(SNP)進(jìn)行基因分型。對(duì)于與RD的風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性分析遺傳和非遺傳因素(種族、性別、OSA)，并使用簡(jiǎn)單的邏輯規(guī)則和決策樹方法構(gòu)建以風(fēng)險(xiǎn)為基礎(chǔ)的逐步算法。

結(jié)果

這項(xiàng)研究考慮了需要額外手術(shù)后劑量的嗎啡以改善他們的疼痛的患者中RD的風(fēng)險(xiǎn)(在273名患者中的170名，其中45名具有RD)。以這種方式對(duì)該分析分層使得該分析能夠更好地慮及在更高的疼痛敏感度、種族和OSA(由于更高的不良反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)，患有OSA的患者獲得較低的起始嗎啡劑量作為預(yù)防)之間的相互作用。對(duì)接受高劑量嗎啡(定義為高于0.3毫克/千克，與非OSA的0.2毫克/千克的基線和OSA患者的0.1毫克/千克相對(duì))的患者子集獲得定性類似的結(jié)果，表明此類鑒定的決策規(guī)則可用于在考慮到預(yù)測(cè)的RD風(fēng)險(xiǎn)的情況下指導(dǎo)關(guān)于額外劑量的嗎啡的臨床決定。

使用無監(jiān)督聚類方法和包括在該分析中的所有SNP(排除彼此處于高LD的那些)，鑒定了5個(gè)集群，具有由“低風(fēng)險(xiǎn)集群”的大約10％至“高風(fēng)險(xiǎn)集群”的大約40％的逐漸提高的RD風(fēng)險(xiǎn)(圖8A)。應(yīng)當(dāng)注意，在該階段使用了幾種臨床/人口統(tǒng)計(jì)變量，包括種族、OSA和性別。但是，雖然偏置聚類結(jié)果，這些變量并未顯示出與鑒定的集群的顯而易見的相關(guān)性。使用此類定義的集群(類似于用于癌癥亞型分類的基于“基因特征”的方法；這里SNP特征用于確定風(fēng)險(xiǎn)亞型)的中心，對(duì)高vs.中vs.低風(fēng)險(xiǎn)分配產(chǎn)生大約82％的準(zhǔn)確度。

分析此類獲得的層級(jí)表明，大多數(shù)差別信號(hào)僅來自于少數(shù)SNP。通過以下事實(shí)凸顯了這一點(diǎn)：三種SNP的組合，即rs2295632(FAAH)、rs1045642(ABCB1)和rs1042713(ADRB2)，與單變量分析相比改善了RD病例的判別。使用衍生自圖8B中顯示的決策樹的簡(jiǎn)單決策規(guī)則產(chǎn)生了0.000003的p值(與頂部判別的單獨(dú)的SNP rs2295632的0.0002相對(duì))，使得能夠?qū)π枰中g(shù)后干預(yù)的患者組以大約70％的平衡準(zhǔn)確度鑒定低vs.高風(fēng)險(xiǎn)層級(jí)：IF[(rs2295632＝CC)OR(rs1045642＝CC)OR(rs1042713＝AA)]THEN RD＝NO(RD的低風(fēng)險(xiǎn))ELSE RD＝Y(jié)ES(RD的高風(fēng)險(xiǎn))。

上述決策規(guī)則將高風(fēng)險(xiǎn)患者鑒定為在包括的所有三個(gè)基因座處具有風(fēng)險(xiǎn)等位基因的那些(圖8B中的樹的最右葉，具有26例RD＝Y(jié)ES和24例RD＝NO)。本文中提出的“SNP特征”使用無監(jiān)督方法導(dǎo)出(并因此不需要對(duì)訓(xùn)練集優(yōu)化模型中的參數(shù))，這充分預(yù)示著它們的普遍化。該數(shù)據(jù)的層次聚類顯示在該工作的出版版本中，Pharmacogenomics,15(14):1749-1762(2014)。

這些發(fā)現(xiàn)通過測(cè)試SNP選擇、等位基因編碼(基于等位基因vs.顯性-隱形)、包含額外分層標(biāo)準(zhǔn)(例如高劑量嗎啡vs.需要的干預(yù))的效果來驗(yàn)證。PVCLUST還用于實(shí)施自舉以進(jìn)一步評(píng)估觀察到的聚類模式的穩(wěn)定性。對(duì)主要的5種集群的支持較高，而它們的整體順序非常不穩(wěn)定，并具有低支持，表明可以實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步改進(jìn)。

對(duì)于獨(dú)立驗(yàn)證，使用一組74名患者，其數(shù)據(jù)自該項(xiàng)目第一階段結(jié)束時(shí)可以獲得。將這些新數(shù)據(jù)點(diǎn)與274名患者的訓(xùn)練集一起聚類再現(xiàn)了對(duì)該274名患者的訓(xùn)練集觀察到的的聚類模式。對(duì)于來自對(duì)照集的需要干預(yù)的新患者，被分配至低風(fēng)險(xiǎn)集群的那些具有比分配至高風(fēng)險(xiǎn)集群的那些(30％)少兩倍的RD病例(16％)。此外，兩個(gè)極端集群(具有最高和最低的RD風(fēng)險(xiǎn))事實(shí)上略微更好地分離，表明當(dāng)甚至更多數(shù)據(jù)可用時(shí)也可以實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步的改進(jìn)(圖10)。在適當(dāng)和獨(dú)立地驗(yàn)證后，基于基因型的決策算法可以有助于主動(dòng)確定潛在的風(fēng)險(xiǎn)和定制圍手術(shù)期的管理，并構(gòu)成了臨床實(shí)施個(gè)性化鎮(zhèn)痛的重要基礎(chǔ)步驟。

實(shí)施例6：在經(jīng)受手術(shù)的兒童中的阿片樣物質(zhì)相關(guān)不良反應(yīng)：對(duì)女孩的不平等負(fù)擔(dān)尚無在鎮(zhèn)痛和不良反應(yīng)方面研究對(duì)阿片類藥物的性別特異性響應(yīng)的在兒童中的臨床研究。

在兒科人群中研究嗎啡作用的性別差異是尤其重要的，因?yàn)樗鼈儩撛诘臋C(jī)制可能受到生理、發(fā)育和激素因素的影響，這可能在青春期兒童、青少年和成人之間改變。與經(jīng)受不同手術(shù)和接受不同圍手術(shù)期藥物的患有不同的共存疾病的成人相比，經(jīng)受一種類型的具有標(biāo)準(zhǔn)化圍手術(shù)期管理的手術(shù)的相當(dāng)大數(shù)量的健康兒童是研究與阿片類藥物相關(guān)的個(gè)體間差異的更好人群。本研究假設(shè)兒童的性別影響使用阿片類藥物的手術(shù)后鎮(zhèn)痛藥和不良結(jié)果。因此，我們的研究的目的是確定兒童性別在確定鎮(zhèn)痛藥性質(zhì)和在經(jīng)受扁桃體切除術(shù)的兒童中的嗎啡不良反應(yīng)中的作用。關(guān)于導(dǎo)致可變的阿片樣物質(zhì)反應(yīng)的因素的知識(shí)將有助于優(yōu)化阿片樣物質(zhì)給藥、鎮(zhèn)痛藥結(jié)果，并在未來提供不良反應(yīng)預(yù)防策略。

研究設(shè)計(jì)、參與者和步驟

這是在扁桃體切除術(shù)人群中采用標(biāo)準(zhǔn)圍手術(shù)期麻醉與手術(shù)實(shí)踐和標(biāo)準(zhǔn)手術(shù)后護(hù)理的前瞻性臨床觀察研究。該研究由辛辛那提兒童醫(yī)院醫(yī)療中心(辛辛那提，俄亥俄州，美國(guó))的機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)批準(zhǔn)，在適當(dāng)情況下從所有父母和參與的兒童處獲得知情同意書和同意。在該項(xiàng)目中，并未對(duì)特定種族進(jìn)行選擇，但是，鑒于在醫(yī)院對(duì)扁桃體切除術(shù)或腺樣體扁桃體切除術(shù)(T/TA)手術(shù)的患者人口統(tǒng)計(jì)，絕大多數(shù)患者是白人(圖11)。雖然可以獲得多種族的數(shù)據(jù)，鑒于非白人男孩和女孩的樣本量小，本研究集中于白人兒童并檢查性別在白人兒童中的影響，因?yàn)橄惹暗难芯匡@示了種族造成的在兒童中阿片樣物質(zhì)相關(guān)不良事件的差異，其中白人兒童具有比黑人兒童相對(duì)更多的不良反應(yīng)(Sadhasivam S.等人,Pediatrics,129:832-8(2012))。

在2008年8月和2012年2月之間，在手術(shù)當(dāng)天接洽和招募符合該研究的條件的經(jīng)受選擇性門診T/TA的6-15歲兒童。種族由父母或孩子自我報(bào)告；自我報(bào)告對(duì)鑒定種族而言是充分接受的(Boehmer U.等人,American Journal of Public Health,92:1471-2(2002)；Dahan A.等人,Anesthesiology,88:903-13(1998))。樣本納入標(biāo)準(zhǔn)是指定具有美國(guó)麻醉學(xué)家學(xué)會(huì)(ASA)體格狀態(tài)1或2的兒童，所述兒童由于反復(fù)扁桃體炎、扁桃體肥大或OSA而排期進(jìn)行T/TA。OSA指定的臨床標(biāo)準(zhǔn)包括具有打鼾加持續(xù)超過10秒的睡眠暫?；虬滋焓人牟∈返乃哒系K性呼吸。如果兒童或他們的父母不講英語(yǔ)的話，從研究中將其排除。排除對(duì)嗎啡過敏或具有發(fā)育遲緩、肝臟或腎臟疾病、或需要阿片樣物質(zhì)鎮(zhèn)痛藥的術(shù)前疼痛(例如慢性扁桃體炎)的兒童。由于本研究的研究協(xié)調(diào)員有限的可用性，無法招募所有符合條件的受試者(圖11)。

作為該機(jī)構(gòu)的T/TA標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐的一部分，所有兒童在手術(shù)中接受預(yù)防性的昂丹司瓊(0.1毫克/千克)和地塞米松(0.1毫克/千克)。經(jīng)由七氟烷吸入誘導(dǎo)后接異丙酚(2毫克/千克)推注以促進(jìn)氣管內(nèi)插管來誘導(dǎo)麻醉。用七氟烷維持麻醉，而不使用神經(jīng)肌肉阻滯。在手術(shù)切開前，患者接受嗎啡用于先行鎮(zhèn)痛。具有OSA史的兒童接受0.1毫克/千克的嗎啡，而不具有OSA診斷的那些兒童接受0.2毫克/千克。如果在手術(shù)切開和燒灼后存在任何指示疼痛的跡象(心率和血壓的臨床顯著升高)，臨床麻醉團(tuán)隊(duì)在必要時(shí)在手術(shù)中提供額外的嗎啡。

結(jié)果

收集了鎮(zhèn)痛藥效力和阿片樣物質(zhì)相關(guān)不良反應(yīng)的結(jié)果。鎮(zhèn)痛藥效力結(jié)果包括手術(shù)后疼痛評(píng)分、嗎啡劑量(mg/kg)、需要靜脈內(nèi)鎮(zhèn)痛藥干預(yù)(是/否)、疼痛造成的延長(zhǎng)的PACU停留(>90分鐘)(是/否)以及給予的總鎮(zhèn)痛藥干預(yù)數(shù)量。此外，分別使用0至10數(shù)值評(píng)定量表(NRS)(Voepel-Lewis T.等人,Anesth.Analg.,112:415-21(2011))和0至10FLACC(面部表情；腿部運(yùn)動(dòng)；活動(dòng)；哭叫；和可安慰性)量表(Merkel S.等人,Pediatr.Nurs.,23:293-7(1997))來評(píng)估主觀和客觀疼痛評(píng)分。在PACU中用拯救劑量的嗎啡(0.05毫克/千克)管理顯著的術(shù)后疼痛(NRS或FLACC≥4/10)。檢查最大NRS和FLACC評(píng)分。

通過兩組二元結(jié)果測(cè)量不良反應(yīng)：1)阿片樣物質(zhì)相關(guān)副作用，包括RD、惡心/嘔吐(PONV)和瘙癢；2)繼發(fā)于呼吸抑制或惡心/嘔吐的延長(zhǎng)的PACU停留。在我們的研究中，RD定義為<10次呼吸/分鐘的持續(xù)呼吸率或<92％的持續(xù)氧飽和度降低，其在不存在臨床明顯的上呼吸道阻塞和人為因素的情況下需要補(bǔ)充氧氣一分鐘或更久以保持SpO2>92％。

PACU停留的持續(xù)時(shí)間(達(dá)到PACU出院準(zhǔn)備的時(shí)間)定義為在實(shí)現(xiàn)下列出院標(biāo)準(zhǔn)前在PACU中的持續(xù)時(shí)間。意識(shí)水平：容易喚醒或清醒，呼吸道：患者具有足夠的空氣交換，核心體溫：≥36.3攝氏度，可接受的疼痛水平(疼痛評(píng)分<4)，血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定，沒有顯著的阿片樣物質(zhì)相關(guān)不良反應(yīng)如PONV和呼吸抑制，并且手術(shù)部位沒有任何出血或并發(fā)癥。該出院準(zhǔn)備時(shí)間不同于實(shí)際PACU出院時(shí)間，因?yàn)椴⑽窗ㄉ鐣?huì)原因造成的延遲(例如等待乘車等等)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

在分析前，檢查數(shù)據(jù)的質(zhì)量。由于僅包括44名非洲裔美國(guó)人和10名其它種族，分析對(duì)白人進(jìn)行。為了評(píng)估性別效果，首先在具有或不具有OSA分層的男孩和女孩之間比較結(jié)果測(cè)量值。使用t-檢驗(yàn)或Wilcoxon秩和檢驗(yàn)比較連續(xù)變量，使用Fisher’s精確檢驗(yàn)比較分類變量。為了分析嗎啡效果，手術(shù)中和總嗎啡劑量(毫克/千克)分類為低、中和高(對(duì)手術(shù)中嗎啡為≤0.1、>0.1-0.2、>0.2，對(duì)總嗎啡為<0.2、0.2-0.3和>0.3)。Spearman相關(guān)系數(shù)用于評(píng)估嗎啡劑量和按性別的結(jié)果之間的關(guān)系。

隨后進(jìn)行多變量統(tǒng)計(jì)建模以正式測(cè)試性別效應(yīng)和性別與嗎啡劑量的相互作用，同時(shí)考慮協(xié)變量效應(yīng)。對(duì)于鎮(zhèn)痛藥效力結(jié)果，使用手術(shù)中嗎啡作為協(xié)變量；對(duì)于副作用結(jié)果，使用總嗎啡需要量(計(jì)算為手術(shù)中和手術(shù)后嗎啡劑量之和)作為協(xié)變量。還測(cè)試了年齡、體重、BMI z評(píng)分和OSA的效應(yīng)作為所有結(jié)果的協(xié)變量。當(dāng)檢測(cè)到顯著效應(yīng)時(shí)(p<0.05)，在最終模型中包括協(xié)變量。使用邏輯回歸分析二元結(jié)果。使用線性回歸分析最大NRS。由于得分的膨脹頻率為0，通過使用零膨脹負(fù)二項(xiàng)模型分析最大FLACC評(píng)分。鎮(zhèn)痛藥干預(yù)的總數(shù)量遵循泊松分布，并使用廣義線性模型進(jìn)行分析。使用線性回歸在需要干預(yù)的患者中分析手術(shù)后嗎啡劑量。

為了檢查副作用與總嗎啡劑量之間的關(guān)系是否隨年齡而不同，將女性患者分為三個(gè)年齡組：小于8歲、8至13歲和大于13歲，以將女性分類為青春期前、青春期和青春期后以代替正式的Tanner分期。在此分析中，由于嗎啡的潛在閾值效應(yīng)，總嗎啡需要量被二分為≥0.3或<0.3毫克/千克劑量范圍。分別在三個(gè)年齡組中評(píng)估了總嗎啡量與PONV、RD、PONV和RD導(dǎo)致的延長(zhǎng)的PACU之間的線性趨勢(shì)。隨后使用多變量邏輯模型正式測(cè)試了該假設(shè)。

使用Statistical Analysis Software,版本9.3(SAS Institute Inc.,Cary,NC)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。檢查了11個(gè)相關(guān)的結(jié)果，平均Spearman相關(guān)系數(shù)為0.26。相關(guān)性調(diào)整的Bonferroni校正(http<colon slash slash>www<dot>quantitativeskills<dot>com<slash>sisa)產(chǎn)生了0.008的顯著性閾值。還報(bào)道了達(dá)到0.05的閾值的相關(guān)性，這可能有助于鑒定潛在相關(guān)性供未來研究使用，但是由于膨脹的I型錯(cuò)誤率，當(dāng)解釋這些結(jié)果時(shí)必須謹(jǐn)慎。

結(jié)果

符合關(guān)系圖描述了合格的、接洽的和入選的研究受試者(圖11)。由于非白人兒童的樣本量相對(duì)較小(44名非洲裔美國(guó)人和10名其它種族或混血)，本研究集中于219名白人兒童(114名女孩和105名男孩)。盡管平均年齡和體重相當(dāng)，女孩具有較高的OSA發(fā)病率(50％vs.36％，p＝0.04)(表10)。年齡和BMI在男孩與女孩之間是相當(dāng)?shù)摹?/p>

當(dāng)所有總嗎啡劑量在一起分組時(shí)，在單變量分析(表11)或多變量建模(數(shù)據(jù)未顯示)中在鎮(zhèn)痛和阿片樣物質(zhì)相關(guān)不良結(jié)果的任一項(xiàng)中均未檢測(cè)到顯著的差異。通過OSA進(jìn)行的分層不影響這些結(jié)果。

表10.人口統(tǒng)計(jì)特征和圍手術(shù)期的嗎啡使用

BMI z評(píng)分使用CDC生長(zhǎng)圖表來計(jì)算。

年齡、體重、BMI z評(píng)分、手術(shù)中嗎啡和總嗎啡需要量顯示為整個(gè)研究群組的中值和IQR，并使用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)進(jìn)行比較。年齡組、手術(shù)中嗎啡和總嗎啡組以及OSA顯示為數(shù)量和比例，并使用Pearson卡方檢驗(yàn)進(jìn)行比較。

OSA＝阻塞性睡眠呼吸暫停。

表11.鎮(zhèn)痛和阿片樣物質(zhì)不良反應(yīng)結(jié)果中的性別差異

手術(shù)后嗎啡顯示為平均值+SD并使用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。僅在需要手術(shù)后嗎啡的患者中對(duì)其進(jìn)行檢查。

鎮(zhèn)痛藥干預(yù)的數(shù)量、最大NRS和FLACC評(píng)分顯示為中值(IQR)，并使用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)進(jìn)行比較。

二分法變量顯示為病例數(shù)量(比例)，并使用Fisher’s精確檢驗(yàn)進(jìn)行比較。

F：女性；M：男性，PACU：麻醉后恢復(fù)室；RD：呼吸抑制；PONV：手術(shù)后惡心與嘔吐。

表12.不良反應(yīng)和總嗎啡劑量的性別特異性相關(guān)性

按體重計(jì)的總嗎啡量(毫克/千克)

*：對(duì)Spearman相關(guān)系數(shù)的精確檢驗(yàn)

F：女性；M：男性；PACU：麻醉后恢復(fù)室；RD：呼吸抑制；PONV：手術(shù)后惡心與嘔吐。

表13.鎮(zhèn)痛和總嗎啡劑量的性別特異性相關(guān)性

*：對(duì)Spearman相關(guān)系數(shù)的精確檢驗(yàn)

手術(shù)后嗎啡顯示為平均值+SD，并在需要手術(shù)后嗎啡的患者中對(duì)其進(jìn)行檢查。

鎮(zhèn)痛藥干預(yù)的數(shù)量、最大NRS和FLACC評(píng)分顯示為中值(IQR)。

二分法變量顯示為病例數(shù)量(比例)。

F：女性；M：男性；PACU：麻醉后恢復(fù)室；NRS＝數(shù)值量表

表14.通過總嗎啡組在較年輕vs.較年長(zhǎng)女孩中的阿片樣物質(zhì)相關(guān)不良反應(yīng)

PACU：麻醉后恢復(fù)室；PONV：手術(shù)后惡心與嘔吐

*：對(duì)Spearman相關(guān)系數(shù)的精確檢驗(yàn)。

通過多變量模型支持該單變量分析，所述多變量模型使用總嗎啡作為連續(xù)變量正式測(cè)試了性別造成的嗎啡效應(yīng)。在PONV(p＝0.001)和PONV導(dǎo)致的延長(zhǎng)的PACU停留(p＝0.010)方面檢測(cè)到了顯著的性別特異性嗎啡效應(yīng)。在女孩中，具有這些不良反應(yīng)的概率隨著總嗎啡劑量而提高，而在男性中，在隨提高的總嗎啡劑量具有不良反應(yīng)的概率中沒有檢測(cè)到顯著的改變(圖12A和12B)。

表12中顯示的數(shù)據(jù)表明，在女孩中，當(dāng)總嗎啡超過0.3毫克/千克時(shí)發(fā)生最多副作用。使用多變量模型測(cè)試了閾值嗎啡效應(yīng)。副作用的概率在兩個(gè)較低嗎啡組之間沒有差異。但是，當(dāng)嗎啡超過0.3毫克/千克時(shí)，除了瘙癢之外的所有阿片樣物質(zhì)不良反應(yīng)的概率顯著提高(p<0.05)。

在女孩中，具有呼吸抑制的概率隨著總嗎啡劑量的提高而提高(p＝0.001)(圖13A和13B)。在男孩中，隨著總嗎啡劑量的提高在具有RD的概率方面沒有檢測(cè)到顯著的變化(p＝0.079，表12)。在更年輕的女孩中(<8歲和8-13歲)，在RD與更高的總嗎啡劑量(≥0.3毫克/千克)之間檢測(cè)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的相關(guān)性(表13)。

接受≥0.3毫克/千克的總嗎啡的白人女孩在PACU(111±6.6分鐘)中停留得比接受<0.3毫克/千克的總嗎啡的女孩(82.2±3.3分鐘)更久(圖14)。接受≥0.3毫克/千克的總嗎啡的白人男孩在PACU中停留99.7±6.4分鐘，而接受<0.3毫克/千克的嗎啡的男孩在PACU中停留88.3±3.6分鐘(圖13)。盡管在對(duì)年齡、體重、OSA病史進(jìn)行調(diào)整后在PACU出院準(zhǔn)備的持續(xù)時(shí)間方面的差異并未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p＝0.09)，在門診扁桃體切除術(shù)后，接受更高總嗎啡劑量的白人女孩與更低劑量相比停留長(zhǎng)大約30分鐘在臨床和經(jīng)濟(jì)上是顯著的。盡管在采用高劑量的女孩中的延長(zhǎng)的PACU停留并未以統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性與在男孩中不同(p＝0.09)，在通過性別分層的分析中，采用高劑量的女孩具有比采用低劑量的女孩更長(zhǎng)的PACU停留(p＝0.0002)；在男孩中，這種差異并非統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(p＝0.11)(圖14)。

使用單變量或多變量建模，并無跡象表明對(duì)鎮(zhèn)痛藥結(jié)果存在性別特異性嗎啡效應(yīng)(表13)。在鎮(zhèn)痛藥效力方面不存在性別造成的對(duì)嗎啡的差別響應(yīng)。

總之，在女孩中，檢測(cè)到總嗎啡劑量與PONV、RD、PONV和RD造成的延長(zhǎng)的PACU的顯著相關(guān)性。為了測(cè)試這種相關(guān)性是否受年齡的影響(即在青春期后女孩中的激素效應(yīng))，比較了小于8歲、8至13歲和大于13歲的女孩(表13)。更年輕的女孩(<8歲和8-13歲)顯示出與RD、PONV和延長(zhǎng)的PACU停留的相關(guān)性。但是，當(dāng)在多變量模型中單獨(dú)測(cè)試年齡效應(yīng)時(shí)，可能由于樣本量小，并未檢測(cè)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的年齡差異(數(shù)據(jù)未顯示)。

該研究表明，雖然具有類似的鎮(zhèn)痛，當(dāng)總嗎啡劑量提高時(shí)，白人女孩對(duì)阿片樣物質(zhì)不良反應(yīng)比男孩更敏感。與男孩相比，白人女孩具有對(duì)更高總嗎啡劑量的差別響應(yīng)，導(dǎo)致阿片樣物質(zhì)相關(guān)不良反應(yīng)的更高發(fā)病率和門診手術(shù)后延長(zhǎng)的醫(yī)院停留的不平等負(fù)擔(dān)。具體而言，與男孩相比，在女孩中提高的嗎啡劑量與提高的RD、PONV和阿片樣物質(zhì)相關(guān)的呼吸抑制與PONV導(dǎo)致的在恢復(fù)室中的延長(zhǎng)的停留相關(guān)。當(dāng)不將總嗎啡分層為低、中和高劑量時(shí)，在兒童中圍手術(shù)期使用嗎啡的安全性和鎮(zhèn)痛藥結(jié)果不因性別而不同。這些發(fā)現(xiàn)與年齡、BMI和手術(shù)技術(shù)無關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)具有顯著的臨床和經(jīng)濟(jì)影響，因?yàn)榕c男孩相比，采用更高劑量的阿片類藥物時(shí)，女孩可能具有更多阿片樣物質(zhì)相關(guān)的RD和PONV，導(dǎo)致在醫(yī)院停留更長(zhǎng)時(shí)間。

發(fā)現(xiàn)提高的嗎啡劑量在女孩中而不在男孩中導(dǎo)致增加的副作用。具體而言，接受最高嗎啡劑量類別的女孩(0.3毫克/千克)與不在該高劑量類別中的那些相比具有明顯更多的RD、PONV、RD造成的延長(zhǎng)的PACU停留和PONV造成的延長(zhǎng)的PACU停留。但是，在男孩中，嗎啡劑量與副作用無關(guān)。重要的是，這些效應(yīng)不涉及OSA，盡管在該群組中在女孩中OSA的發(fā)病率相對(duì)較高。在成人人群中，文獻(xiàn)支持，與男性相比，女性經(jīng)歷更高比率的阿片樣物質(zhì)相關(guān)不良反應(yīng)，包括呼吸抑制(Fillingim R.等人,J Pain,6:116-24(2005)；Zacny J.Drug Alcohol Depend.,63:23-8(2001)；Zun L.等人,Am.J.Emerg.Med.,20:151-4(2002)；Cepeda M.等人,Clin.Pharmacol.Ther.,74:102-12(2003)；Franconi F.等人,Pharmacol.Res.,55:81-95(2007))。關(guān)注嗎啡誘導(dǎo)的呼吸抑制的性別差異的一些成人研究(Sarton E.等人,Anesthesiology,93:1245-54(2000)；Sarton E.等人,Anesthesiology,90:1329-38(1999))表明，與男性相比，女性處于更高的發(fā)展呼吸抑制的風(fēng)險(xiǎn)下。但是，幾乎不存在檢查性別對(duì)兒童中阿片樣物質(zhì)相關(guān)不良反應(yīng)的效應(yīng)的數(shù)據(jù)。

在該研究群組的延長(zhǎng)的出院后隨訪中，已經(jīng)觀察到，具有功能CYP2D6表型的女孩在手術(shù)后的頭2-3天內(nèi)在家中口服可待因(嗎啡前藥)具有明顯更高的不良反應(yīng)發(fā)病率，這與出院前在PACU中在女孩中更高的靜脈內(nèi)嗎啡劑量相關(guān)不良反應(yīng)類似和一致(Prows C.等人,The Laryngoscope,DOI:10<dot>1002<slash>lary<dot>24454(2013))。在醫(yī)院和家庭環(huán)境下在女孩中采用靜脈內(nèi)嗎啡和口服可待因的不良反應(yīng)的更高發(fā)病率的這些一致的發(fā)現(xiàn)，除了確認(rèn)該發(fā)現(xiàn)外，還表明阿片類藥物對(duì)女孩的延長(zhǎng)和不平等的臨床與潛在的經(jīng)濟(jì)的影響。顯示在呼吸抑制方面的性別相關(guān)差異繼發(fā)于外周化學(xué)反射回路介導(dǎo)的效應(yīng)，而非中樞介導(dǎo)的效應(yīng)(Sarton E.等人,Anesthesiology,93:1245-54(2000))。

本研究在性別、嗎啡劑量和鎮(zhèn)痛之間并未發(fā)現(xiàn)任何相關(guān)性。也沒有發(fā)現(xiàn)在女孩中青春期年齡類別造成的疼痛的差別相關(guān)性。這與一些人類的成人研究相反，所述成人研究表明，使用阿片類藥物，女性體驗(yàn)更好的疼痛控制(Campesi I.等人,Handb.Exp.Pharmacol.265-78(2012))。整個(gè)疼痛體驗(yàn)可以基于性別具有不同的感知(Toomey M.AANA J.,76:355-9(2008))。此外，在男性與女性之間存在顯著的藥代動(dòng)力學(xué)差異(大約40％)，并且這歸因于女性與男性相比更低的身體總水量以及更高的脂肪對(duì)肌肉百分比(Anderson G.J.Womens Health(Larchmt),14:19-29(2005))。藥物代謝所必需的酶的不同表達(dá)也可能是這些差異的原因(Anderson G.J.Womens Health(Larchmt),14:19-29(2005)；Schwartz J.Clin.Pharmacol.Ther.,82:87-96(2007)；Franconi F.等人,Curr.Pharm.Des.,17:1095-107(2011))。此前已經(jīng)報(bào)道了包括嗎啡清除率的嗎啡的藥代動(dòng)力學(xué)(Sadhasivam S.等人,J.Opioid Manag.,8:217-26(2012))。包括性別作為嗎啡清除率的協(xié)變量，但并未發(fā)現(xiàn)其是在兒童中在嗎啡藥代動(dòng)力學(xué)中變化的主要預(yù)測(cè)工具(Sadhasivam S.等人,J.Opioid Manag.,8:217-26(2012))。

在本研究中，當(dāng)施用高的總嗎啡劑量(>0.3毫克/千克)時(shí)，阿片樣物質(zhì)相關(guān)不良反應(yīng)傾向于在女孩中更頻繁地發(fā)生；而在男孩中，并未觀察到阿片樣物質(zhì)不良反應(yīng)隨總嗎啡劑量提高的此類線性趨勢(shì)(表12)。假設(shè)男孩與女孩之間的激素差異可能潛在地解釋在阿片樣物質(zhì)不良反應(yīng)中的性別差異。為了潛在地解釋阿片樣物質(zhì)不良反應(yīng)的性別差異背后的機(jī)理，女孩中常見的青春期年齡用作與青春期相關(guān)的不同激素水平的替代，并且分析了女孩的3個(gè)年齡類別：<8歲(青春期前)，8-13歲(青春期)，>13歲(青春期后青春期后)。在女孩中檢測(cè)到總嗎啡劑量與PONV、RD和PONV與RD造成的延長(zhǎng)的PACU的顯著相關(guān)性；采用更高劑量的嗎啡，更年輕的女孩具有明顯更多的RD和PONV(表14)。有趣的是，當(dāng)在多變量模型中測(cè)試年齡與OSA效應(yīng)時(shí)，年齡或OSA發(fā)病率(在更年輕的女孩和男孩中頻率更高)與女孩對(duì)嗎啡劑量的敏感度并無關(guān)聯(lián)，可能是由于各年齡和總嗎啡劑量類別中女孩的數(shù)量少。由于在所有三個(gè)年齡類別中(尤其在更年輕的女孩中)采用高嗎啡劑量(0.3毫克/千克)的阿片樣物質(zhì)不良反應(yīng)的高發(fā)病率是顯而易見的，這些數(shù)據(jù)不支持女孩中激素介導(dǎo)的差異。但是，由于并未進(jìn)行Tanner分期，這種年齡分類可能不是青春期階段的良好量度。

重要的是要注意，這些分析僅限于單一自我報(bào)告的白人人群。由于先前的研究已經(jīng)表明，在副作用風(fēng)險(xiǎn)方面存在種族造成的差異性(Sadhasivam S.等人,Pediatrics,129:832-8(2012))，通過種族分析很重要。盡管種族本身并不是研究的焦點(diǎn)，在我們的研究中，在自我報(bào)告的種族與祖先信息標(biāo)記之間存在超過95％的相關(guān)性。種族的自我報(bào)告更容易使用，因?yàn)槠渑c祖先來源的臨床標(biāo)記物相比對(duì)臨床醫(yī)生更容易獲得。由于可用于有意義的分析的少數(shù)民族兒童數(shù)量相對(duì)較少，該結(jié)果集中于白人兒童。并不清楚這些差異是否還會(huì)在非白人人群中看到?；谶@些數(shù)據(jù)，白人女孩可以受益于用于白人女孩的更積極的PONV和RD預(yù)防策略。

總之，在白人兒童中存在劑量相關(guān)的阿片樣物質(zhì)不良反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)的性別差異。與經(jīng)受手術(shù)的男孩相比，采用更高劑量的嗎啡時(shí)，白人女孩具有發(fā)生阿片樣物質(zhì)相關(guān)的呼吸抑制和PONV和阿片樣物質(zhì)不良反應(yīng)造成的在PACU中的延長(zhǎng)的停留的更高風(fēng)險(xiǎn)。這種差異不能通過青春期年齡或指示OSA的病史來解釋。當(dāng)治療兒童時(shí)，應(yīng)該記住，雖然經(jīng)歷類似于男孩的鎮(zhèn)痛，白人女孩對(duì)更高劑量的阿片類藥物相對(duì)更為敏感，具有更多的阿片樣物質(zhì)相關(guān)不良事件并在PACU中停留更長(zhǎng)時(shí)間；這種知識(shí)可能有助于預(yù)防兒童中不適宜的圍手術(shù)期臨床與經(jīng)濟(jì)結(jié)果。

實(shí)施例7：阿片樣物質(zhì)誘導(dǎo)的呼吸抑制：ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白藥物基因組學(xué)

嗎啡的效應(yīng)通過位于腦干，尤其是髓質(zhì)(其含有豐富的負(fù)責(zé)鎮(zhèn)痛以及對(duì)高碳酸血癥的通氣反應(yīng)性的mu受體)中的阿片樣物質(zhì)mu受體來介導(dǎo)(Zhang,Z.等人,Anesthesiology,107:288-297(2007)；Pattinson,K.Br.J.Anaesth.,100:747-758(2008))。此外，阿片類藥物對(duì)控制呼吸的皮質(zhì)中樞具有深遠(yuǎn)的影響，這強(qiáng)化了它們?cè)谀X干中的作用(Pattinson,K.等人,J.Neurosci.,29:8177-8186(2009))。因此，嗎啡運(yùn)輸至大腦的變化可能有助于解釋對(duì)嗎啡的個(gè)體間響應(yīng)。嗎啡在大腦中的濃度受血腦屏障處的P-糖蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCB1的影響。ABCB1的多態(tài)性，c.3435C>T，已經(jīng)與成人中嗎啡的血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)活性相關(guān)，并且純合的TT基因型與比其它基因型更高的嗎啡最大CSF濃度相關(guān)(Meineke,I.等人,British Journal of Clinical Pharmacology,54:592-603(2002))。之前，相同的ABCB1多態(tài)性，c.3435C>T與接受另一種阿片樣物質(zhì)芬太尼的韓國(guó)成年人中增加的呼吸抑制相關(guān)(Park,H.等人,Clin.Pharmacol.Ther.,81:539-546(2007))。但是，還不知道ABCB1變體是否與兒童中嗎啡誘導(dǎo)的呼吸抑制相關(guān)。

本研究假設(shè)，在ABCB1中的遺傳變異顯著影響嗎啡在兒童中的安全性和臨床效力。本研究意在確定在經(jīng)受扁桃體切除術(shù)的美國(guó)兒童的大的同類人群中常見ABCB1遺傳變體和靜脈內(nèi)嗎啡誘導(dǎo)的手術(shù)后呼吸抑制之間的特定相關(guān)性，除手術(shù)后鎮(zhèn)痛之外使用呼吸抑制的臨床措施。此實(shí)施例隨后公開為Sadhasivam等人,The Pharmacogenomics Journal(2014)1-8，其內(nèi)容經(jīng)此引用并入本文。

研究設(shè)計(jì)、參與者和步驟

采用標(biāo)準(zhǔn)圍手術(shù)期麻醉藥和手術(shù)實(shí)踐以及標(biāo)準(zhǔn)手術(shù)后護(hù)理，在273名接受扁桃體切除術(shù)的兒童中進(jìn)行前瞻性臨床觀察研究。該研究由辛辛那提兒童醫(yī)院醫(yī)療中心的機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)批準(zhǔn)，并從所有父母和參與的兒童處獲得知情同意書和同意(獲自>11歲的兒童)。雖然所有種族的兒童均參加了這項(xiàng)研究，鑒于在我們醫(yī)院對(duì)扁桃體切除術(shù)的患者人口統(tǒng)計(jì)，絕大多數(shù)兒童是白人(圖15)。

經(jīng)受選擇性門診扁桃體切除術(shù)的6-15歲兒童符合該研究的條件并在手術(shù)當(dāng)天招募。種族由父母或孩子自我報(bào)告；自我報(bào)告對(duì)鑒定種族而言是充分接受的(Boehmer,U.等人,American Journal of Public Health,92:1471-1472(2002)；Lalovic,B.等人,Drug Metab.Dispos.,32:447-454(2004))。樣本納入標(biāo)準(zhǔn)是指定具有的美國(guó)麻醉學(xué)家學(xué)會(huì)(ASA)體格狀態(tài)1或2的兒童，所述兒童由于反復(fù)扁桃體炎、扁桃體肥大或OSA而排期進(jìn)行扁桃體切除術(shù)。OSA指定的臨床標(biāo)準(zhǔn)包括具有打鼾和持續(xù)超過10秒的睡眠暫?；虬滋焓人牟∈返乃哒系K性呼吸。如果兒童或他們的父母不講英語(yǔ)的話，從研究中將其排除。排除對(duì)嗎啡過敏或具有發(fā)育遲緩、肝臟或腎臟疾病、或需要阿片樣物質(zhì)鎮(zhèn)痛藥的術(shù)前疼痛(例如慢性扁桃體炎)的兒童。

所有參與者接受標(biāo)準(zhǔn)圍手術(shù)期護(hù)理。使用七氟烷后接異丙酚(2毫克/千克)推注以促進(jìn)氣管內(nèi)插管來誘導(dǎo)麻醉。用七氟烷維持麻醉，而不使用神經(jīng)肌肉阻滯。在手術(shù)切開前，患者接受嗎啡。具有OSA病史的兒童接受0.1毫克/千克的嗎啡，而不具有OSA診斷的那些兒童接受0.2毫克/千克。如果在手術(shù)切開和燒灼后存在任何指示疼痛的跡象(心率和血壓的臨床顯著升高)，必要時(shí)臨床麻醉團(tuán)隊(duì)在手術(shù)中以0.05毫克/千克的增量提供額外的嗎啡。所有兒童在手術(shù)中接受預(yù)防性的昂丹司瓊(0.1毫克/千克)和地塞米松(0.1毫克/千克)。在PACU中用拯救劑量的嗎啡(0.05毫克/千克增量)管理FLACC疼痛評(píng)分來量度為≥4/10的顯著術(shù)后疼痛(Merkel S.等人,Pediatr.Nurs.,23:293-7(1997))。

PACU停留的持續(xù)時(shí)間(達(dá)到PACU出院準(zhǔn)備的時(shí)間)定義為在實(shí)現(xiàn)下列出院標(biāo)準(zhǔn)前在PACU中的持續(xù)時(shí)間。意識(shí)水平：容易喚醒或清醒，呼吸道：患者具有足夠的空氣交換，核心體溫：≥36.3攝氏度，可接受的疼痛水平(疼痛評(píng)分<4)，血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定，沒有顯著的阿片樣物質(zhì)相關(guān)不良反應(yīng)如PONV和呼吸抑制，并且手術(shù)部位沒有任何出血或并發(fā)癥。該出院準(zhǔn)備時(shí)間不同于實(shí)際PACU出院時(shí)間，因?yàn)椴⑽窗ㄉ鐣?huì)原因造成的延遲(例如等待乘車等等)。

在招募的273名兒童中，219名為白人兒童，44名為黑人兒童。由于ABCB1SNP的不同等位基因頻率和更小數(shù)量的來自其它種族的兒童，該分析集中于白人和黑人兒童。并未分析其它種族的兒童和混血兒童(圖15)。參與者主要是白人，女性略多于男性。與白人兒童相比，黑人兒童略微更重，并具有更高的OSA頻率(表14)。

表15.參與者的特征

年齡、體重、BMI z評(píng)分、手術(shù)中嗎啡和總嗎啡需要量顯示為中值和四分位數(shù)間距(IQR)，性別和OSA顯示為頻率和比例。BMI z評(píng)分使用CDC生長(zhǎng)圖表來計(jì)算。

結(jié)果

對(duì)各參與者記錄鎮(zhèn)痛藥效力和阿片樣物質(zhì)相關(guān)不良反應(yīng)的量度。對(duì)于阿片樣物質(zhì)相關(guān)不良反應(yīng)的量度，本研究集中于兩種臨床和經(jīng)濟(jì)上重要的結(jié)果：由研究協(xié)調(diào)員一致地評(píng)估的臨床RD和繼發(fā)于呼吸抑制的延長(zhǎng)的PACU停留(>90分鐘)。在本研究中，RD定義為持續(xù)超過1分鐘的<10次呼吸/分鐘的呼吸率或<92％的氧飽和度降低，其在不存在臨床明顯的上呼吸道阻塞的情況下需要補(bǔ)充氧氣以保持SpO2>92％。

鎮(zhèn)痛藥效力的量度包括最大術(shù)后疼痛評(píng)分、在PACU中靜脈內(nèi)鎮(zhèn)痛藥干預(yù)(是/否)和需要鎮(zhèn)痛藥干預(yù)的患者中的手術(shù)后嗎啡劑量(毫克/千克)。對(duì)各兒童的最大術(shù)后疼痛評(píng)分由術(shù)后疼痛得分生成，使用0至10FLACC疼痛量表在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)處在PACU中評(píng)估該術(shù)后疼痛得分(Merkel,S.等人,Pediatr.Nurs.,23:293-297(1997))。

基因型

在手術(shù)室中在麻醉下從各參與者收集血液，在同一天分離DNA并在-20℃下儲(chǔ)存。在對(duì)所有研究參與者登記臨床數(shù)據(jù)后進(jìn)行批量基因分型，使用TaqMan等位基因鑒別系統(tǒng)測(cè)定和Genotyper Softerware Version1.1.1(Life Technologies,Applied Biosystems,Forest City)來分析和報(bào)告以下ABCB1多態(tài)性：rs1045642、rs2032582、rs1128503、rs2229109和rs9282564。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

在分析前，檢查數(shù)據(jù)的質(zhì)量。對(duì)ABCB1變體，在白人和黑人患者中單獨(dú)地評(píng)估了等位基因和基因型頻率，并測(cè)試了哈迪-溫伯格平衡(HWE)。為了分析二元結(jié)果(RD、繼發(fā)于RD的延長(zhǎng)的PACU和鎮(zhèn)痛藥干預(yù)需要)，進(jìn)行邏輯回歸。對(duì)手術(shù)后嗎啡劑量，使用線性回歸，因?yàn)閯┝渴钦龖B(tài)分布的。最大FLACC評(píng)分表現(xiàn)出零膨脹負(fù)二項(xiàng)分布，26％的患者未經(jīng)歷疼痛。由此，使用零膨脹負(fù)二項(xiàng)模型分析最大FLACC評(píng)分以適當(dāng)?shù)夭东@該變量的分布。在評(píng)價(jià)ABCB1變體前，評(píng)估協(xié)變量(年齡、性別、BMI z評(píng)分、OSA、手術(shù)中嗎啡(用于鎮(zhèn)痛藥結(jié)果)和總嗎啡(用于不良反應(yīng)結(jié)果))的影響。為了選擇最佳擬合模型，比較對(duì)數(shù)似然值、Akaike和貝葉斯信息標(biāo)準(zhǔn)，并檢查殘差。保留顯著改進(jìn)模型擬合(p<0.05)的協(xié)變量用于隨后的遺傳分析。為了用結(jié)果評(píng)估該單一SNP相關(guān)性，使用加性模型，其中記錄基因型并作為連續(xù)變量進(jìn)行測(cè)試。對(duì)于四種雙等位基因SNP，根據(jù)次要等位基因的數(shù)量將基因型重新編碼為0、1和2。對(duì)于rs2032582，GG基因型重新編碼為0；GA和GT基因型組合并重新編碼為1，TT和TA基因型為2。單獨(dú)用白人和黑人患者進(jìn)行統(tǒng)計(jì)建模并組合。當(dāng)組合種族時(shí)，測(cè)試種族的影響和種族*SNP相互作用。

在本研究中，測(cè)試了ABCB1的5種SNP與兩種原發(fā)性副作用結(jié)果和三種繼發(fā)性鎮(zhèn)痛藥結(jié)果的相關(guān)性。在5種SNP中的平均相關(guān)系數(shù)為0.40。在原發(fā)性結(jié)果之間和繼發(fā)性結(jié)果之間的Spearman相關(guān)系數(shù)分別為0.49和0.74。為了對(duì)多次測(cè)試校正該p值，考慮結(jié)果與SNP的相關(guān)性質(zhì)。相關(guān)性調(diào)整的Bonferroni校正(http<colon slash slash>www<dot>quantitativeskills<dot>com<slash>sisa)對(duì)原發(fā)性副作用結(jié)果的測(cè)試產(chǎn)生了0.013的顯著性閾值，對(duì)繼發(fā)性結(jié)果的測(cè)試產(chǎn)生了0.014的閾值。還報(bào)告了達(dá)到0.05的閾值的相關(guān)性作為標(biāo)稱相關(guān)。使用Statistical Analysis Software(SAS),版本9.3和JMP Genomics,版本6.0(SAS Institute Inc.,Cary,NC)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

置換檢驗(yàn)：在遺傳相關(guān)性研究中，低等位基因頻率(<0.1)可以導(dǎo)致少數(shù)個(gè)體驅(qū)動(dòng)相關(guān)性。因此，對(duì)于被鑒定為與小于0.1的次要等位基因頻率顯著相關(guān)的變體，使用組合的兩個(gè)種族進(jìn)行置換檢驗(yàn)。使用R編程語(yǔ)言，通過隨機(jī)混排基因型并同時(shí)保持協(xié)變量與結(jié)果之間的相關(guān)性不發(fā)生改變，生成一千個(gè)數(shù)據(jù)復(fù)制品。隨后采用相同的方法分析各復(fù)制品，同時(shí)如上所述調(diào)節(jié)相同的協(xié)變量。

自我鑒定的種族與遺傳血統(tǒng)之間的相關(guān)性——敏感度分析：為了評(píng)估自我報(bào)告的白人與黑人種族是否與遺傳血統(tǒng)良好匹配，使用Golden Helix軟件用218種祖先信息標(biāo)記(AIM)進(jìn)行主成分分析。1397名HapMap受試者用作參考人群供分析用。

功效分析：在本研究分析之前，施用Quanto評(píng)估檢測(cè)遺傳效應(yīng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)功效。次要等位基因頻率(MAF)在0.03至0.5之間變化以捕獲我們的變體的變化，α保持為0.013以備多次測(cè)試。對(duì)于原發(fā)性結(jié)果不良反應(yīng)結(jié)果，呼吸抑制導(dǎo)致呼吸抑制(頻率11％)，使用我們263名兒童的全樣本，80％功效用于檢測(cè)等于2.6(MAF≥0.3)、2.8(MAF＝0.2)、3.6(MAF＝0.10)和7.3(MAF＝0.03)的比值比。對(duì)于原發(fā)性鎮(zhèn)痛結(jié)果，手術(shù)后嗎啡需要量，僅包括需要鎮(zhèn)痛干預(yù)的個(gè)體(n＝162)。80％的功效用于檢測(cè)僅占變化的9％的效應(yīng)(beta范圍為0.37-1.09標(biāo)準(zhǔn)偏差單位)。

結(jié)果

ABCB1SNP和等位基因頻率.在檢查的五種SNP中，一種是三等位基因(rs2032582)；一種是在白人和黑人中是低頻率的(rs2229109)；一種(rs1045642)是主要和次要等位基因所共有的，并在白人和黑人中翻轉(zhuǎn)。所有SNP處于HWE(Stern,C.Science,97:137-138(1943))并顯示高度連鎖不平衡(表15和16)。

表16.ABCB1多態(tài)性、等位基因頻率和HWE測(cè)試

測(cè)試ATP-結(jié)合盒B1(ABCB1)的五種SNP的等位基因頻率和哈迪-溫伯格平衡(HWE)。分析通過種族來分層(白人和黑人)。

表17.白人與黑人兒童中ABCB1SNP之間的連鎖(D’/R²)

ATP結(jié)合盒B1(ABCB1)的五種SNP之間的連鎖。

分析通過種族來分層(白人和黑人)并表示為D¹和R²

表18.按基因型呈現(xiàn)的RD和RD造成的延長(zhǎng)的PACU停留

阿片樣物質(zhì)相關(guān)的RD和RD造成的在恢復(fù)室中的延長(zhǎng)的停留。按基因型呈現(xiàn)頻率和比例并使用Fisher’s精確檢驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)。

表19.按ABCB1基因型的手術(shù)后鎮(zhèn)痛測(cè)量

最大FLACC得分顯示為中值(IQR)并通過精確Wilcoxon秩和檢驗(yàn)進(jìn)行測(cè)試；干預(yù)需要顯示為頻率和比例并通過Fisher’s精確檢驗(yàn)檢驗(yàn)；手術(shù)后嗎啡需要量在具有至少一次手術(shù)后干預(yù)的患者中檢查。它們顯示為平均值±SD并使用ANOVA檢驗(yàn)。

鎮(zhèn)痛藥％代表鎮(zhèn)痛藥干預(yù)％。

ABCB1和呼吸抑制.在263名患者中，51名具有RD(19％)，30名具有RD造成的延長(zhǎng)的PACU停留(11％)。為了評(píng)估ABCB1SNP的遺傳效應(yīng)，首先按基因型總結(jié)原始結(jié)果測(cè)量值。觀察幾種潛在的相關(guān)性，尤其是在白人和黑人患者中呼吸抑制造成的延長(zhǎng)的PACU停留與rs9282564之間的相關(guān)性(表17和18)。為了進(jìn)一步證實(shí)該遺傳效應(yīng)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)建模，其中調(diào)整對(duì)結(jié)果顯示顯著影響的協(xié)變量。在白人中對(duì)呼吸抑制造成的延長(zhǎng)的PACU停留檢測(cè)到rs9282564的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著效應(yīng)(p＝0.0012)(圖16A)。這一發(fā)現(xiàn)在黑人中復(fù)制(p＝0.0251)(圖16B)。當(dāng)組合并調(diào)整種族時(shí)，該ABCB1SNP，rs9282564與呼吸抑制造成的延長(zhǎng)的PACU停留強(qiáng)烈相關(guān)(p＝0.0002)(圖16C)。增加rs9282564的次要等位基因(G)的一個(gè)拷貝在白人和黑人中分別將延長(zhǎng)的PACU停留的幾率提高了4.1倍(95％CI：1.7-9.9)和13.9倍(95％CI：1.1-175.8)。當(dāng)組合種族時(shí)，增加該次要等位基因(G)的一個(gè)拷貝將延長(zhǎng)的PACU停留的幾率提高了4.7倍(95％CI：2.1-10.8)(圖17)。沒有檢測(cè)到對(duì)呼吸抑制造成的延長(zhǎng)的PACU停留的種族特異性rs9282564效應(yīng)。在種族特異性或組合分析中沒有其它變體達(dá)到與RD或RD造成的延長(zhǎng)的PACU的標(biāo)稱相關(guān)性。對(duì)于rs9282564與RD造成的延長(zhǎng)的PACU停留之間的相關(guān)性，在1000個(gè)復(fù)制中僅有1次試驗(yàn)顯示小于觀察到的p值0.0002的p值，獲得0.002的經(jīng)驗(yàn)p值，并支持這一發(fā)現(xiàn)的顯著性。

ABCB1和鎮(zhèn)痛結(jié)果：檢查了三種鎮(zhèn)痛藥結(jié)果：最大FLACC評(píng)分、干預(yù)需要和需要干預(yù)的患者的手術(shù)后嗎啡劑量，最大FLACC評(píng)分的中值為3，IQR為0.6。在263名患者中，162名(62％)需要鎮(zhèn)痛藥干預(yù)。平均而言，需要手術(shù)后嗎啡干預(yù)的患者具有0.10±0.05毫克/千克的嗎啡。在接受拯救劑量的嗎啡的患者中檢測(cè)了rs2229109與手術(shù)后嗎啡劑量之間的相關(guān)性。盡管在白人中是標(biāo)稱的(p＝0.05)，該相關(guān)性在黑人中是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(p＝0.01)。當(dāng)組合種族時(shí)，仍然檢測(cè)到rs2229109與手術(shù)后嗎啡的相關(guān)性(p＝0.02)；增加次要等位基因(A)的一個(gè)拷貝將手術(shù)后嗎啡劑量降低0.04毫克/千克(95％CI：0.01-0.07)。沒有檢測(cè)到種族特異性效應(yīng)。對(duì)于rs2229109和手術(shù)后嗎啡劑量之間的相關(guān)性，1000個(gè)復(fù)制中的13個(gè)顯示<0.02的p值，獲得經(jīng)驗(yàn)p值為0.014，因此支持這一發(fā)現(xiàn)的顯著性。

自我報(bào)告的種族和遺傳血統(tǒng)：自我報(bào)告的白人和黑人種族與由218種AIM評(píng)估的遺傳血統(tǒng)進(jìn)行比較。如圖19中所示，在250(>95％)名兒童中，自我報(bào)告的種族以CEU和非洲血統(tǒng)聚集良好。主組分(PC)1和2成功地將白人和黑人種族分開(圖19)。在本研究中，使用自我報(bào)告的種族，因?yàn)槠渑cAIM相比對(duì)臨床醫(yī)生易于獲得。但是，遺傳血統(tǒng)用于確認(rèn)用自我報(bào)告的種族和顯著的臨床結(jié)果觀察到的相關(guān)性。使用對(duì)PC 1和2調(diào)整過的模型，除了手術(shù)后嗎啡需要量和rs2229109之間的相關(guān)性(p＝0.03)之外，進(jìn)一步證實(shí)了在導(dǎo)致延長(zhǎng)的PACU停留的呼吸抑制與rs9282564之間的相關(guān)性(p<0.0001)。

本研究顯示了在全身麻醉下經(jīng)受常見手術(shù)步驟的263名美國(guó)兒童的同類組中在ABCB1多態(tài)性與臨床相關(guān)的導(dǎo)致延長(zhǎng)的恢復(fù)室停留的阿片樣物質(zhì)相關(guān)呼吸抑制之間，與手術(shù)后嗎啡需要量之間的相關(guān)性。重要的是，本研究表明，ABCB1SNP，rs9282564，在白人(p＝0.0012)中、在黑人(p＝0.0251)中和在組合的兩個(gè)種族(p＝0.0002)中與呼吸抑制造成的延長(zhǎng)的PACU停留相關(guān)。攜帶該ABCB1SNP(rs9282564)的次要等位基因(G)的每個(gè)額外拷貝的效應(yīng)將導(dǎo)致延長(zhǎng)的PACU停留的呼吸抑制的幾率提高4.7倍(95％CI：2.1-10.8)。這是與阿片樣物質(zhì)誘導(dǎo)呼吸抑制的相關(guān)性的新的報(bào)告，這種效應(yīng)的大小可與已經(jīng)用于藥物遺傳學(xué)臨床測(cè)試的已知遺傳變體中的效應(yīng)大小相當(dāng)。

在本研究中觀察到的另一種臨床相關(guān)的相關(guān)性是在PACU中在需要拯救劑量的嗎啡的兒童中在ABCB1 SNP，rs2229109和手術(shù)后嗎啡劑量之間的相關(guān)性。該ABCB1 SNP(rs2229109)的次要等位基因(A)的每個(gè)額外拷貝將手術(shù)后嗎啡劑量降低0.04毫克/千克(95％CI：0.01-0.07)，表明具有AA基因型的兒童對(duì)嗎啡敏感，需要較少的嗎啡。該ABCB1 SNP rs2229109還是一種錯(cuò)義多態(tài)性；在該核酸上在位置1692采用G至A的等位基因變化導(dǎo)致在該ABCB1蛋白質(zhì)中氨基酸殘基的變化(Ser變?yōu)锳sn)。作為與本研究中包括的其它變體相關(guān)的單倍型的一部分，近來已經(jīng)表明此變體影響美沙酮藥代動(dòng)力學(xué)(Barratt,D.等人,Pharmacogenomics and Personalized Medicine,5:53-62(2012))。

此前并未在相對(duì)較大和同類的美國(guó)人群中，尤其在兒童中調(diào)查ABCB1基因的多態(tài)性對(duì)嗎啡相關(guān)不利結(jié)果的影響。這一研究試圖建立在先前研究之上，同時(shí)盡量減少許多先前的限制(Leschziner,G.等人,The Pharmacogenomics Journal,7:154-179(2007))，并且除常見ABCB1 SNP之外包括額外的非同義SNP(圖18)。

對(duì)這一研究存在一些限制。由于受試者招募的地理位置，沒有很多非白人兒童以便將這些發(fā)現(xiàn)普及至其它種族。然而，該發(fā)現(xiàn)仍可在非洲裔美國(guó)人中復(fù)制。為了便于使用及其對(duì)臨床醫(yī)生的即時(shí)可用性，使用自我報(bào)告的種族。但是，在自我報(bào)告的種族與遺傳血統(tǒng)之間觀察到非常高的相關(guān)性(>95％)(圖19)。大型多中心試驗(yàn)，包括來自不同血統(tǒng)的兒童，將幫助研究ABCB1基因型在不同種族中的影響。雖然在該研究中與臨床結(jié)果相關(guān)的ABCB1 SNP是非同義的，并與氨基酸變化相關(guān)，但它們可能并非因果性的，而是與呼吸抑制和手術(shù)后嗎啡劑量的因果性標(biāo)記物相關(guān)聯(lián)(圖18)。ABCB1的測(cè)序或密集SNP分析可以幫助確定是否其它變體具有更好的辨別高風(fēng)險(xiǎn)vs低風(fēng)險(xiǎn)的能力。

總之，在接受扁桃體切除術(shù)的兒童中，在ABCB1多態(tài)性與手術(shù)后阿片樣物質(zhì)相關(guān)呼吸抑制和阿片樣物質(zhì)需要量之間發(fā)現(xiàn)了新的相關(guān)性。ABCB1 rs9282564 GG純合子具有增加的導(dǎo)致在醫(yī)院延長(zhǎng)的停留的呼吸抑制的風(fēng)險(xiǎn)，ABCB1 rs2229109 CC純合子在需要手術(shù)后鎮(zhèn)痛藥干預(yù)時(shí)需要更多的嗎啡。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)兒科手術(shù)患者中疼痛的手術(shù)后管理具有重要意義。在盡量減少阿片樣物質(zhì)相關(guān)呼吸抑制的負(fù)面影響方面，主動(dòng)風(fēng)險(xiǎn)識(shí)別、分層和預(yù)防措施是重要的。在將該ABCB1遺傳相關(guān)性數(shù)據(jù)應(yīng)用于臨床實(shí)踐前，另外的驗(yàn)證和潛在的基因-基因相互作用的檢查將是必要的。

上述各種方法和技術(shù)提供了實(shí)施本申請(qǐng)的多種方式。要理解的是，根據(jù)本文中描述的任何特定實(shí)施例不必能夠?qū)崿F(xiàn)所描述的所有目的或優(yōu)點(diǎn)。因此，例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，可以如本文中所教導(dǎo)的那樣以實(shí)現(xiàn)或優(yōu)化一個(gè)優(yōu)點(diǎn)或一組優(yōu)點(diǎn)的方式來實(shí)施該方法，而不必那樣實(shí)現(xiàn)如本文教導(dǎo)或建議的其它目的或優(yōu)點(diǎn)。本文提到了多種替代方案。要理解的是，一些優(yōu)選實(shí)施例具體包括一個(gè)、另一個(gè)或幾個(gè)特征，而其它實(shí)施例特定地排除一個(gè)、另一個(gè)或幾個(gè)特征，而另一些優(yōu)選實(shí)施例通過包含一個(gè)、另一個(gè)或幾個(gè)有利特征來緩和特定特征。

此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到來自不同實(shí)施方案的各種特征的適用性。類似地，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以以各種組合采用上文討論的各種要素、特征和步驟以及各個(gè)此類要素、特征或步驟的其它已知等同物來根據(jù)本文中所述原理實(shí)施該方法。在各種要素、特征和步驟中，在不同的實(shí)施例中一些將被具體包括，其它將被具體排除。

盡管已經(jīng)在某些實(shí)施方案和實(shí)施例中公開了本申請(qǐng)，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，本申請(qǐng)的實(shí)施方案延伸超出具體公開的實(shí)施方案至其它替代實(shí)施方案和/或用途及其修改與等同物。

在一些實(shí)施方案中，用于描述和要求保護(hù)本申請(qǐng)的某些實(shí)施方案的表示成分的量、性質(zhì)如分子量、反應(yīng)條件等等的數(shù)字應(yīng)理解為在某些情況下被術(shù)語(yǔ)“大約”修飾。因此，在一些實(shí)施方案中，在書面描述和所附權(quán)利要求中闡述的數(shù)值參數(shù)是可以根據(jù)想要通過特定實(shí)施例獲得的期望性質(zhì)而變化的近似值。在一些實(shí)施方案中，該數(shù)值參數(shù)應(yīng)根據(jù)所報(bào)告的有效數(shù)字的數(shù)目并通過應(yīng)用普通舍入技術(shù)來解釋。盡管描述本申請(qǐng)的一些實(shí)施方案的寬范圍的數(shù)值范圍和參數(shù)是近似值，但是在具體實(shí)施例中闡述的數(shù)值是盡可能精確地報(bào)告的。

在一些實(shí)施方案中，用于描述本申請(qǐng)的特定實(shí)施方案的上下文(特別是在下列權(quán)利要求中的某些的情況下)的術(shù)語(yǔ)“一”和“一個(gè)”和“該”和類似參考可以解釋為覆蓋單數(shù)和復(fù)數(shù)。本文中數(shù)值范圍的列舉僅僅意在用作單獨(dú)提及落在該范圍內(nèi)的每個(gè)單獨(dú)值的簡(jiǎn)化方法。除非本文另有說明，否則每個(gè)單獨(dú)的值被并入本說明書中，如同其在本文中被單獨(dú)引用一樣。本文所述的所有方法可以以任何合適的順序執(zhí)行，除非本文中另行說明或與上下文明顯矛盾。相對(duì)于本文的某些實(shí)施方案提供的任何和所有實(shí)施例、或示例性語(yǔ)言(例如，“如”)的使用僅僅意在更好地說明本申請(qǐng)，并且不對(duì)所要求保護(hù)的本申請(qǐng)的范圍構(gòu)成限制。說明書中的語(yǔ)言不應(yīng)被解釋為指示對(duì)于本申請(qǐng)的實(shí)踐必要的任何未要求保護(hù)的要素。

在本文中描述了本申請(qǐng)的優(yōu)選實(shí)施方案，包括本發(fā)明人已知的用于實(shí)施本申請(qǐng)的最佳方式。在閱讀前面的說明書之后，那些優(yōu)選實(shí)施方案的變化對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將變得顯而易見。預(yù)期技術(shù)人員可以適當(dāng)?shù)夭捎么祟愖兓?，并且本申?qǐng)可以以不同于本文中具體描述的方式實(shí)施。因此，本申請(qǐng)的許多實(shí)施方案包括如適用法律所允許的所附權(quán)利要求中所描述的主題的所有修改和等同物。此外，除非在本文中另行說明或與上下文明顯矛盾，否則本申請(qǐng)包括在其所有可能變體中上述要素的任何組合。

本文引用的所有專利、專利申請(qǐng)、專利申請(qǐng)公開以及其它材料，如文章、書籍、說明書、出版物、文獻(xiàn)、事物等等均出于所有目的經(jīng)此引用整體并入本文，除了與之相關(guān)的任何申請(qǐng)歷史文件、與本文件不一致或與本文件沖突的任何相同的任何申請(qǐng)歷史文件，或任何可以對(duì)目前或以后與本文件相關(guān)的權(quán)利要求的最寬范圍具有限制作用的文件之外。舉例而言，如果在與任何并入的材料相關(guān)聯(lián)以及與本文件相關(guān)聯(lián)的術(shù)語(yǔ)的描述、定義和/或使用之間存在任何不一致或沖突，以本文件中該術(shù)語(yǔ)的描述、定義和/或使用為準(zhǔn)。

最后，應(yīng)理解，本文公開的本申請(qǐng)的實(shí)施方案說明本申請(qǐng)的實(shí)施方案的原理。可以采用的其它修改在本申請(qǐng)的范圍內(nèi)。因此，例如而非限制，可以根據(jù)本文中的教導(dǎo)利用本申請(qǐng)的實(shí)施方案的替代配置。因此，本申請(qǐng)實(shí)施方案不限于精確地顯示和描述的實(shí)施方案。