本文提供了涉及檢測(cè)贅生物形成并且尤其，但不排他性地涉及用于檢測(cè)惡變前和惡性贅生物如結(jié)直腸癌的方法、組合物和相關(guān)用途的技術(shù)。
發(fā)明背景
美國(guó)男性和女性加在一起結(jié)直腸癌仍然是第二最常見(jiàn)的癌癥(Siegel R等人，CA Cancer J Clin 2013；63：11-30)。前期病變向癌癥進(jìn)展的基礎(chǔ)生物學(xué)本身有利于篩查(Vogelstein B等人，Science 2013；339：1546-58)。有證據(jù)支持和指導(dǎo)方針認(rèn)可了幾種試驗(yàn)和策略中的任一種(Levin B等人，Gastroenterology 2008；134：1570-95；Rex DK等人，Am J Gastroenterol 2009；104：739-50；Karl J等人，Clin Gastroenterol Hepatol 2008；6：1122-8)。從社會(huì)的角度來(lái)看，篩查被認(rèn)為是有成本效益的(Karl J等人，Clin Gastroenterol Hepatol 2008；6：1122-8；Heitman SJ等人，PLoS Med 2010；7：e1000370；Parekh M等人，Aliment Pharmacol Ther 2008；27：697-712；Sharaf RN等人，Am J Gastroenterol 2013；108：120-32)。
結(jié)直腸癌起因于積累的遺傳和表觀遺傳改變，為分析糞便的腫瘤特異性變化提供了基礎(chǔ)(Berger BM等人，Pathology 2012；44：80-8)。先前在篩查環(huán)境下基于糞便的早一代DNA試驗(yàn)的大規(guī)模研究?jī)H證明對(duì)結(jié)直腸癌的良好靈敏度和對(duì)晚期腺瘤的低靈敏度(Ahlquist DA等人，Ann Intern Med 2008；149：441-50，W81；Imperiale TF等人，N Engl J Med 2004；351：2704-14)。已經(jīng)取得了重要進(jìn)展，包括穩(wěn)定緩沖液(Boynton KA等人，Clin Chem 2003；49：1058-65；Zou H等人，Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2006；15：1115-9)，更多判別標(biāo)志物(Ahlquist DA等人，Gastroenterology 2012；142：248-56；Bardan E等人，Israel iournal of medical sciences 1997；33：777-80)，具有更高分析靈敏度的平臺(tái)(Ahlquist DA等人，Gastroenterology 2012；142：248-56；Aronchick CA等人，Gastrointestinal endoscopy 2000；52：346-52)，使用邏輯回歸分析而不是單獨(dú)的標(biāo)志物值進(jìn)行結(jié)果判斷，及自動(dòng)化。
雖然篩查減少了結(jié)直腸癌死亡率(Mandel JS等人，N Engl J Med.1993，328：1365-71；Hardcastle JD等人，Lancet.1996，348：1472-7；Kronborg O等人，Scand J Gastroenterol.2004，39：846-51；Winawer SJ等人，J Natl Cancer Inst.1993，85：1311-8；Singh H等人，JAMA.2006，295：2366-73)，但觀察到的減少是適度的(Singh H等人，JAMA.2006；295，2366-73；Heresbach D等人，Eur J Gastroenterol Hepatol.2006，18：427-33)并且在美國(guó)一半以上的成人尚未接受篩查(Meissner HI，Cancer Epidemiol Biomarkers Prev.2006，15：389-94)。
一種新興的癌癥篩查方法牽涉對(duì)來(lái)自于癌癥患者的身體樣品，如糞便、血清和尿液中腫瘤特異性DNA改變的測(cè)定(Osborn NK，Ahlquist DA.Gastroenterology 2005；128：192-206；Ahlquist DA等人，Gastroenterology 2000；119：1219-27；Ahlquist DA等人，Gastroenterology 2002；122：Suppl A40；Chen WD等人，J Natl Cancer Inst 2005；97：1124-32；Zou H等人，Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2006；15：1115-9；Zou HZ，Clin Cancer Res 2002；8：188-91；Hoque MO，J Clin Oncol 2005；23：6569-75；Belinsky SA等人，Cancer Res 2006；66：3338-44；Itzkowitz SH等人，Clin Gastroenterol Hepatol 2007；5：111-7’Kann L等人，Clin Chem 2006；52：2299-302)。如果要在癌癥篩查應(yīng)用中實(shí)現(xiàn)效率和有效性，重要的是以高精確度選擇標(biāo)志物。由于結(jié)直腸贅生物形成的分子異質(zhì)性，高檢測(cè)率往往需要一組標(biāo)志物。
已經(jīng)在來(lái)自于結(jié)直腸癌患者的糞便和血清/血漿樣品中檢測(cè)出幾個(gè)甲基化基因(Ahlquist DA，Gastroenterology 2002，；122：Suppl A40；Chen WD等人，J Natl Cancer Inst 2005；97：1124-32；Zou HZ等人，Clin Cancer Res 2002；8：188-91；Itzkowitz SH等人，Clin Gastroenterol Hepatol 2007；5：111-7；Petko Z等人，Clin Cancer Res 2005；11：1203-9；Muller HM等人，Lancet 2004；363：1283-5；Leung WK等人，Clin Chem 2004；50：2179-82；Ebert MP等人，Gastroenterology 2006；131：1418-30；Grady WM等人，Cancer Res 2001；61：900-2)。盡管在大多數(shù)結(jié)直腸癌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些甲基化基因，但基于體液的測(cè)定法的產(chǎn)率仍不是最理想的(Ahlquist DA等人，Gastroenterology 2002；122：Suppl A40；Chen WD等人，J Natl Cancer Inst 2005；97：1124-32；Zou H等人，Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2006；15：1115-9；Zou HZ，Clin Cancer Res 2002；8：188-91；Belinsky SA等人，Cancer Res 2006；66：3338-44；Itzkowitz SH等人，Clin Gastroenterol Hepatol 2007；5：111-7；Kann L等人，Clin Chem 2006；52：2299-302；Petko Z等人，Clin Cancer Res 2005，；11：1203-9；Muller HM等人，Lancet 2004；363：1283-5；Leung WK等人，Clin Chem 2004；50：2179-82；Ebert MP等人，Gastroenterology 2006；131：1418-30；Grady WM等人，Cancer Res 2001；61：900-2)。
需要更精確、用戶友好并且可廣泛經(jīng)銷(xiāo)的用于提高篩查有效性、可接受性和訪問(wèn)的工具。
發(fā)明概要
甲基化DNA已經(jīng)作為大多數(shù)腫瘤類(lèi)型的組織中的一類(lèi)潛在生物標(biāo)志物進(jìn)行研究。在許多情況下，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將甲基基團(tuán)添加到DNA的胞嘧啶-磷酸-鳥(niǎo)嘌呤(CpG)島位點(diǎn)，作為基因表達(dá)的表觀遺傳控制。在生物學(xué)上有吸引力的機(jī)制中，認(rèn)為腫瘤抑制基因的啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)的獲得甲基化事件會(huì)使表達(dá)沉默，從而有助于腫瘤發(fā)生。DNA甲基化可能是比RNA或蛋白質(zhì)表達(dá)在化學(xué)和生物學(xué)上更穩(wěn)定的診斷工具(Laird(2010)Nat Rev Genet 11：191-203)。此外，在癌癥如散發(fā)性結(jié)腸癌中，甲基化標(biāo)志物提供了優(yōu)良特異性并且比單獨(dú)的DNA突變具有更廣泛的信息并且更靈敏(Zou等人(2007)Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 16：2686-96)。
對(duì)CpG島的分析當(dāng)應(yīng)用于動(dòng)物模型和人類(lèi)細(xì)胞系時(shí)已經(jīng)取得重要發(fā)現(xiàn)。例如，Zhang和同事發(fā)現(xiàn)，來(lái)自于相同CpG島的不同部分的擴(kuò)增子可具有不同的甲基化的水平(Zhang等人(2009)PLoS Genet 5：e1000438)。進(jìn)一步地，甲基化水平在高度甲基化和未甲基化序列間雙峰分布，進(jìn)一步支持DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的二進(jìn)制轉(zhuǎn)換樣模式(Zhang等人(2009)PLoS Genet 5：e1000438)。對(duì)鼠體內(nèi)組織和體外細(xì)胞系的分析證明，僅僅約0.3％的高CpG密度啟動(dòng)子(HCP，定義為在300個(gè)堿基對(duì)的區(qū)域內(nèi)具有＞7％CpG序列)甲基化，而低CpG密度的區(qū)域(LCP，定義為在300個(gè)堿基對(duì)的區(qū)域內(nèi)具有＜5％CpG序列)趨向于呈動(dòng)態(tài)組織特異性模式頻繁甲基化(Meissner等人(2008)Nature 454：766-70)。HCP包括泛在管家基因和高度調(diào)控發(fā)育基因的啟動(dòng)子。在HCP位點(diǎn)中，幾個(gè)確定的標(biāo)志物如Wnt 2、NDRG2、SFRP2和BMP3＞50％甲基化(Meissner等人(2008)Nature 454：766-70)。
已經(jīng)在結(jié)直腸癌患者的血液和糞便中檢測(cè)出甲基化基因并且建議作為候選篩查標(biāo)志物(Ahlquist DA等人，Gastroenterology 2002；122：Suppl A40；Chen WD等人，J Natl Cancer Inst 2005；97：1124-32；Zou HZ，Clin Cancer Res 2002；8：188-91；Itzkowitz SH等人，Clin Gastroenterol Hepatol 2007；5：111-7；Kann L等人，Clin Chem 2006；52：2299-302；Petko Z等人，Clin Cancer Res 2005；11：1203-9；Muller HM等人，Lancet 2004；363：1283-5；Leung WK等人，Clin Chem 2004；50：2179-82；Ebert MP等人，Gastroenterology 2006；131：1418-30；Grady WM等人，Cancer Res 2001；61：900-2)。
Zou和同事，例如，評(píng)估了在結(jié)直腸贅生物形成中頻繁甲基化的基因以鑒定最具判別性的一個(gè)(Zou等人，2007Cancer Epidemiol Biomarkers Prev.16(12)：2686-2696)。在結(jié)直腸癌中特異性甲基化的四個(gè)基因(骨形態(tài)生成蛋白3(BMP3)、EYA2、無(wú)芒樣同源框-4(ALX4)和波形蛋白(vimentin))選自41個(gè)候選基因并且對(duì)74個(gè)癌細(xì)胞、62個(gè)腺瘤細(xì)胞和70個(gè)正常上皮細(xì)胞進(jìn)行了評(píng)估。定性和定量分析甲基化狀況并且通過(guò)亞硫酸氫鹽基因組測(cè)序來(lái)確認(rèn)。在五個(gè)結(jié)腸癌細(xì)胞系中評(píng)估了甲基化對(duì)基因表達(dá)的影響。通過(guò)測(cè)序檢測(cè)K-ras和BRAF突變。分別在66％、66％、68％和72％的癌細(xì)胞，74％、48％、89％和84％的腺瘤細(xì)胞及7％、5％、11％和11％的正常上皮細(xì)胞中檢測(cè)出BMP3、EYA2、ALX4或波形蛋白的甲基化(P＜0.01，癌癥或腺瘤對(duì)比正常細(xì)胞)。推斷BMP3、EYA2、ALX4和波形蛋白基因在大多數(shù)結(jié)直腸贅生物中甲基化，但是在正常上皮細(xì)胞中很少甲基化。
癌癥篩查需要在取自受試者的樣品(例如，糞便樣品、結(jié)直腸組織樣品)中檢查時(shí)，在組織水平上具有廣泛信息并且對(duì)結(jié)直腸癌表現(xiàn)出高特異性的結(jié)直腸癌標(biāo)志物或標(biāo)志物組。
因此，本文提供了結(jié)直腸癌篩查標(biāo)志物的技術(shù)，在從取自受試者的樣品(例如，糞便樣品、結(jié)直腸組織樣品、血清樣品、血液或血液制品)中檢測(cè)時(shí)，所述標(biāo)志物提供高信噪比和低本底水平。
在開(kāi)發(fā)本發(fā)明的實(shí)施方案的過(guò)程中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，在病例對(duì)照研究中通過(guò)比較來(lái)自于有結(jié)直腸贅生物形成、腺瘤和/或無(wú)蒂鋸齒狀息肉(SSP)的受試者的結(jié)直腸組織的DNA標(biāo)志物的甲基化狀態(tài)與來(lái)自于對(duì)照受試者(例如，正常組織如正常結(jié)腸)的相同DNA標(biāo)志物的甲基化狀態(tài)來(lái)鑒定標(biāo)志物(參見(jiàn)，實(shí)施例1、表1A和B)。
例如，在開(kāi)發(fā)本發(fā)明的實(shí)施方案的過(guò)程中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)證明NDRG4、BMP3、OPLAH、FLI1、PDGFD、SFMBT2(例如，SFMBT2_895、SFMBT2_896、SFMBT2_897)、CHST2(例如，CHST2_7889和CHST2_7890)、VAV3和DTX1為檢測(cè)糞便樣品內(nèi)的結(jié)直腸癌的有效標(biāo)志物(參見(jiàn)，實(shí)施例1及表1A和B)。
如本文所述，所述技術(shù)提供了許多對(duì)結(jié)直腸贅生物形成(例如，結(jié)直腸癌、腺瘤、SSP)有高判別力的甲基化DNA標(biāo)志物及其子集(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個(gè)或更多個(gè)標(biāo)志物的集合)。實(shí)驗(yàn)將選擇過(guò)濾器應(yīng)用于候選標(biāo)志物以鑒定提供高信噪比和低本底水平的標(biāo)志物，以例如在為了結(jié)直腸癌篩查或診斷的目的而測(cè)定遠(yuǎn)側(cè)介質(zhì)(例如，糞便、血液、尿液、轉(zhuǎn)移組織等)時(shí)，提供高特異性。這樣，所述技術(shù)提供了用于結(jié)直腸癌篩查或診斷目的的特異性標(biāo)志物和標(biāo)志物組合。
在一些實(shí)施方案中，所述技術(shù)與評(píng)估生物樣品中本文鑒定的一個(gè)或多個(gè)標(biāo)志物的存在和甲基化狀態(tài)有關(guān)。這些標(biāo)志物包括如本文所討論的一個(gè)或多個(gè)差異性甲基化區(qū)域(DMR)，例如，如表1A和B所提供的。在所述技術(shù)的實(shí)施方案中評(píng)估甲基化狀態(tài)。這樣，本文提供的技術(shù)不限于測(cè)量基因的甲基化狀態(tài)的方法。例如，在一些實(shí)施方案中通過(guò)基因組掃描方法測(cè)量甲基化狀態(tài)。例如，一種方法牽涉限制性標(biāo)記基因組掃描(Kawai等人(1994)Mol.Cell.Biol.14：7421-7427)而另一個(gè)實(shí)例牽涉甲基化敏感性任意引物PCR(Gonzalgo等人(1997)Cancer Res.57：594-599)。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)用甲基化敏感性限制酶消化基因組DNA，接著進(jìn)行對(duì)目標(biāo)區(qū)域的Southern分析(消化-Southern方法)監(jiān)測(cè)在特定CpG位點(diǎn)的甲基化模式的變化。在一些實(shí)施方案中，分析甲基化模式的變化牽涉基于PCR的過(guò)程，該過(guò)程牽涉在PCR擴(kuò)增之前用甲基化敏感性限制酶消化基因組DNA(Singer-Sam等人(1990)Nucl.Acids Res.18：687)。另外，已經(jīng)報(bào)道其它技術(shù)利用亞硫酸氫鹽處理DNA作為甲基化分析的起點(diǎn)。這些包括甲基化特異性PCR(MSP)(Herman等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：9821-9826)和限制性酶消化由經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的DNA擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物(Sadri和Hornsby(1996)Nucl.Acids Res.24：5058-5059；及Xiong和Laird(1997)Nucl.Acids Res.25：2532-2534)。已經(jīng)開(kāi)發(fā)PCR技術(shù)用于基因突變的檢測(cè)(Kuppuswamy等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：1143-1147)和等位基因特異性表達(dá)的量化(Szabo和Mann(1995)Genes Dev.9：3097-3108；及Singer-Sam等人(1992)PCR Methods Appl.1：160-163)。此類(lèi)技術(shù)使用內(nèi)部引物，其退火為PCR產(chǎn)生的模板并且在要測(cè)定的單核苷酸的5′立即終止。在一些實(shí)施方案中使用如美國(guó)專(zhuān)利第7,037,650號(hào)中所述的使用“定量Ms-SNuPE測(cè)定”的方法。
評(píng)估甲基化狀態(tài)后，常常將甲基化狀態(tài)表示為在特定位點(diǎn)(例如，在單核苷酸處，在特定區(qū)域或基因座處，在較長(zhǎng)目標(biāo)序列處，例如達(dá)～100-bp、200-bp、500-bp、1000-bp或更長(zhǎng)的DNA子序列)甲基化的單獨(dú)DNA鏈相對(duì)于樣品中包含該特定位點(diǎn)的DNA總體的分?jǐn)?shù)或百分比。傳統(tǒng)上，通過(guò)PCR使用校準(zhǔn)器確定未甲基化核酸的量。然后，亞硫酸氫鹽處理已知量的DNA并且使用實(shí)時(shí)PCR或其它指數(shù)擴(kuò)增，例如QuARTS測(cè)定(例如，如美國(guó)專(zhuān)利第8,361,720號(hào)、美國(guó)專(zhuān)利第8,916,344號(hào)；和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布第2012/0122088和2012/0122106號(hào)中所提供的)確定所得甲基化特異性序列。
例如，在一些實(shí)施方案中方法包括通過(guò)使用外標(biāo)生成未甲基化靶標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線由至少兩個(gè)點(diǎn)構(gòu)建并且將未甲基化DNA的實(shí)時(shí)Ct值與已知量化標(biāo)準(zhǔn)關(guān)聯(lián)起來(lái)。然后，由至少兩個(gè)點(diǎn)和外標(biāo)構(gòu)建甲基化靶標(biāo)的第二標(biāo)準(zhǔn)曲線。這第二標(biāo)準(zhǔn)曲線將甲基化DNA的Ct與已知量化標(biāo)準(zhǔn)關(guān)聯(lián)起來(lái)。接下來(lái)，為甲基化和未甲基化群體確定試樣Ct值并且由通過(guò)前兩個(gè)步驟產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算DNA的基因組當(dāng)量。由甲基化DNA的量，相對(duì)于群體中DNA的總量，例如(甲基化DNA的數(shù)量)/(甲基化DNA的數(shù)量+未甲基DNA的數(shù)量)×100，計(jì)算目標(biāo)位點(diǎn)處甲基化的百分比。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，當(dāng)相對(duì)于參考基因經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的DNA拷貝數(shù)的水平，一個(gè)或多個(gè)DNA甲基化標(biāo)志物的甲基化比率不同時(shí)，表明生物樣品的贅生物形成，其中所述一個(gè)或多個(gè)DNA甲基化標(biāo)志物包含如表1A和B提供的差異性甲基化區(qū)域(DMR)中的堿基。甲基化比率包括通過(guò)用于確定生物標(biāo)志物的甲基化水平的相同方式確定的DNA甲基化標(biāo)志物的甲基化水平和參考基因中區(qū)域水平的比率。通常，甲基化比率用通過(guò)用于確定DNA甲基化標(biāo)志物的甲基化水平的相同方式確定的DNA甲基化標(biāo)志物的甲基化水平和參考基因中區(qū)域水平的比率表示。
在一些實(shí)施方案中，甲基化比率是DNA甲基化標(biāo)志物的甲基化水平和參考基因的區(qū)域水平的比率，所述二者是使用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)定量測(cè)量的。例如，可以使用一對(duì)引物和寡核苷酸探針定量測(cè)量來(lái)自于受試者樣品的DNA甲基化標(biāo)志物的甲基化水平，其中一個(gè)引物、兩個(gè)引物、寡核苷酸探針，或兩個(gè)引物和寡核苷酸探針能夠區(qū)別甲基化和未甲基化核酸，例如在用修飾劑，例如將未甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)化為經(jīng)轉(zhuǎn)化核酸的亞硫酸氫鹽修飾核酸之后。
本發(fā)明的參考基因的所述區(qū)域可以是基因的具有一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的任何區(qū)域或沒(méi)有甲基化位點(diǎn)，例如無(wú)CpG二核苷酸的區(qū)域。例如，參考基因的所述區(qū)域可以是具有兩個(gè)用于擴(kuò)增如PCR的引物結(jié)合位點(diǎn)，無(wú)CpG二核苷酸的區(qū)域或具有至少一個(gè)用于實(shí)時(shí)PCR的特異性寡核苷酸探針結(jié)合位點(diǎn)，無(wú)CpG二核苷酸的區(qū)域。一方面，本發(fā)明的參考基因的所述區(qū)域是MYOD基因的區(qū)域。另一方面，本發(fā)明的參考基因的所述區(qū)域是ACTB基因的區(qū)域。再一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的參考基因的所述區(qū)域是不經(jīng)常受到拷貝數(shù)改變，如基因擴(kuò)增或缺失的區(qū)域。
一般而言，根據(jù)本發(fā)明，在亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化之后但未直接或間接判別位點(diǎn)的甲基化狀況，用特異性結(jié)合該位點(diǎn)的引物和特異性探針使用實(shí)時(shí)PCR定量測(cè)量參考基因的區(qū)域水平。
在某些實(shí)施方案中，提供了檢測(cè)受試者中的贅生物的方法。此類(lèi)方法包括，例如，從受試者獲得包含DNA的樣品；用選擇性修飾獲得的DNA中的未甲基化胞嘧啶殘基以生成經(jīng)修飾的殘基，但是不修飾甲基化胞嘧啶殘基的試劑處理獲得的DNA；確定已經(jīng)歷步驟b)的處理的DNA中的一個(gè)或多個(gè)DNA甲基化標(biāo)志物的甲基化水平，其中一個(gè)或多個(gè)DNA甲基化標(biāo)志物包含如表1A和B所提供的差異性甲基化區(qū)域(DMR)中的堿基；將確定的所述一個(gè)或多個(gè)DNA甲基化標(biāo)志物的甲基化水平與沒(méi)有贅生物的受試者的所述一個(gè)或多個(gè)DNA甲基化標(biāo)志物的甲基化水平參考做比較；并且當(dāng)所述DNA甲基化標(biāo)志物中的一個(gè)或多個(gè)的甲基化狀態(tài)不同于在沒(méi)有贅生物的受試者中測(cè)定的所述標(biāo)志物的甲基化狀態(tài)時(shí)，將所述受試者鑒定為有贅生物。
在一些實(shí)施方案中，確定所述DNA甲基化標(biāo)志物中的一個(gè)或多個(gè)的甲基化升高包括確定選自CpG島和CpG島岸的區(qū)域內(nèi)的甲基化改變。
在一些實(shí)施方案中，確定所述CpG島或CpG岸內(nèi)的甲基化升高包括所述DNA甲基化標(biāo)志物的編碼區(qū)或調(diào)控區(qū)內(nèi)的甲基化升高。
在一些實(shí)施方案中，確定已經(jīng)歷步驟b)的處理的所述DNA中一種或多種DNA甲基化標(biāo)志物的甲基化水平包括確定所述一個(gè)或多個(gè)DNA甲基化標(biāo)志物的甲基化得分和/或甲基化頻率。
在一些實(shí)施方案中，步驟b)的處理通過(guò)對(duì)獲得的DNA的亞硫酸氫鹽修飾來(lái)實(shí)現(xiàn)。
在一些實(shí)施方案中，確定已經(jīng)歷步驟b)的處理的所述DNA中一個(gè)或多個(gè)DNA甲基化標(biāo)志物的甲基化水平通過(guò)選自以下的技術(shù)實(shí)現(xiàn)：甲基化特異性PCR、定量甲基化特異性PCR、甲基化敏感性DNA限制酶分析、定量亞硫酸氫鹽焦磷酸測(cè)序和亞硫酸氫鹽基因組測(cè)序PCR。
在一些實(shí)施方案中，所述贅生物為結(jié)直腸癌、大結(jié)直腸腺瘤和/或無(wú)蒂鋸齒狀息肉。
在某些實(shí)施方案，提供了檢測(cè)受試者中的贅生物的方法。此類(lèi)方法包括，例如，確定來(lái)自于受試者的樣品的甲基化比率，其中所述甲基化比率是相對(duì)于參考基因經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的DNA拷貝數(shù)的水平，一個(gè)或多個(gè)DNA甲基化標(biāo)志物經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的區(qū)域的甲基化水平，其中所述一個(gè)或多個(gè)DNA甲基化標(biāo)志物包含如表1A和B所提供的差異性甲基化區(qū)域(DMR)中的堿基，其中參考基因?yàn)镸YOD或ACTB，當(dāng)所述DNA甲基化標(biāo)志物中的一個(gè)或多個(gè)的甲基化比率不同于在沒(méi)有贅生物的受試者中測(cè)定的相應(yīng)標(biāo)志物的甲基化比率時(shí)，將所述受試者鑒定為有贅生物。
在一些實(shí)施方案中，甲基化水平通過(guò)使用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)確定。在一些實(shí)施方案中，甲基化水平通過(guò)使用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)確定，其中PCR中使用的至少一種引物能夠區(qū)別未甲基化和甲基化核酸。在一些實(shí)施方案中，甲基化水平通過(guò)使用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)確定，其中PCR中使用的兩個(gè)引物均能夠區(qū)別未甲基化和甲基化核酸。在一些實(shí)施方案中，甲基化水平通過(guò)使用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)確定，其中PCR中使用的探針能夠區(qū)別未甲基化和甲基化核酸。在一些實(shí)施方案中，甲基化水平通過(guò)使用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)確定，其中PCR中使用的引物和探針兩者都能夠區(qū)別未甲基化和甲基化核酸。在一些實(shí)施方案中，參考基因中的所述區(qū)域的水平通過(guò)使用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)確定。在一些實(shí)施方案中，參考基因中的所述區(qū)域的水平通過(guò)使用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)確定，其中所述區(qū)域含有第一和第二引物結(jié)合位點(diǎn)和探針結(jié)合位點(diǎn)并且其中所述第一和第二引物結(jié)合位點(diǎn)和所述探針結(jié)合位點(diǎn)無(wú)CpG二核苷酸。在一些實(shí)施方案中，參考基因中的所述區(qū)域無(wú)CpG二核苷酸。
本文還提供了用于實(shí)踐所述方法的組合物和試劑盒。例如，在一些實(shí)施方案中，對(duì)一個(gè)或多個(gè)標(biāo)志物有特異性的試劑(例如，引物、探針)單獨(dú)地或呈集合(例如，用于擴(kuò)增多個(gè)標(biāo)志物的引物對(duì)集合)提供。也可提供用于進(jìn)行檢測(cè)測(cè)定的附加試劑(例如，用于進(jìn)行QuARTS、PCR、測(cè)序、亞硫酸氫鹽處理或其它測(cè)定的酶、緩沖液、陽(yáng)性和陰性對(duì)照)。在一些實(shí)施方案中，提供含有對(duì)于進(jìn)行一種方法所必需、足夠或有用的一種或多種試劑的試劑盒。還提供含有所述試劑盒的反應(yīng)混合物。進(jìn)一步提供含有多種可相互添加和/或添加到試樣中以使反應(yīng)混合物完全的試劑的主混合試劑集合。
在一些實(shí)施方案中，本文描述的技術(shù)與設(shè)計(jì)用于進(jìn)行一系列通過(guò)本文描述的方法所提供的算術(shù)或邏輯操作的可編程機(jī)器相關(guān)。例如，所述技術(shù)的一些實(shí)施方案與計(jì)算機(jī)軟件和/或計(jì)算機(jī)硬件相關(guān)(例如，在其中實(shí)現(xiàn))。一方面，所述技術(shù)涉及包括一種形式的存儲(chǔ)器、用于進(jìn)行算術(shù)和邏輯操作的元件和用于執(zhí)行一系列指令(例如，如本文所提供的方法)的處理元件(例如，微處理器)以讀取、操縱和存儲(chǔ)數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)。在一些實(shí)施方案中，微處理器是系統(tǒng)的一部分，其用于確定甲基化狀態(tài)(例如，例如表1A和B所提供的一個(gè)或多個(gè)DMR的甲基化狀態(tài))；比較甲基化狀態(tài)(例如，例如表1A和B所提供的一個(gè)或多個(gè)DMR的甲基化狀態(tài))；生成標(biāo)準(zhǔn)曲線；確定Ct值；計(jì)算甲基化的分?jǐn)?shù)、頻率或百分比(例如，例如表1A和B所提供的一個(gè)或多個(gè)DMR的甲基化)；鑒定CpG島；確定測(cè)定法或標(biāo)志物的特異性和/或靈敏度；計(jì)算ROC曲線和相關(guān)AUC；序列分析；全部如本文所述或在本領(lǐng)域中已知。
在一些實(shí)施方案中，軟件或硬件組件接收多次測(cè)定的結(jié)果并且基于多次測(cè)定的結(jié)果確定指示癌癥風(fēng)險(xiǎn)的單值結(jié)果向用戶報(bào)告(例如，確定例如表1A和B所提供的多個(gè)DMR的甲基化狀態(tài))。有關(guān)實(shí)施方案基于來(lái)自于多次測(cè)定的結(jié)果的數(shù)學(xué)組合(例如，加權(quán)組合、線性組織)，例如確定多種標(biāo)志物(例如表1A和B所提供的多個(gè)DMR)的甲基化狀態(tài)來(lái)計(jì)算危險(xiǎn)系數(shù)。在一些實(shí)施方案中，DMR的甲基化狀態(tài)限定一個(gè)維度并且可在多維空間上具有值并且由多個(gè)DMR的甲基化狀態(tài)限定的坐標(biāo)是例如要向用戶報(bào)告，例如與結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)的結(jié)果。
一些實(shí)施方案包括存儲(chǔ)介質(zhì)和存儲(chǔ)器組件。存儲(chǔ)器組件(例如，易失性和/或非易失性存儲(chǔ)器)用于存儲(chǔ)指令(例如，本文所提供的方法的實(shí)施方案)和/或數(shù)據(jù)(例如，工件如甲基化測(cè)量、序列和與之相關(guān)的統(tǒng)計(jì)學(xué)描述)。一些實(shí)施方案涉及還包括CPU、圖形卡和用戶界面(例如，包括輸出設(shè)備如顯示器和輸入設(shè)備如鍵盤(pán))中的一種或多種的系統(tǒng)。
與所述技術(shù)相關(guān)的可編程機(jī)器包括傳統(tǒng)現(xiàn)存技術(shù)和正在開(kāi)發(fā)或尚待開(kāi)發(fā)的技術(shù)(例如，量子計(jì)算機(jī)、化學(xué)計(jì)算機(jī)、DNA計(jì)算機(jī)、光學(xué)計(jì)算機(jī)、基于自旋電子學(xué)的計(jì)算機(jī)等)。
在一些實(shí)施方案中，所述技術(shù)包括用于傳輸數(shù)據(jù)的有線(例如，金屬電纜、光纖)或無(wú)線傳輸介質(zhì)。例如，一些實(shí)施方案涉及經(jīng)過(guò)網(wǎng)絡(luò)(例如，局域網(wǎng)(LAN)、廣域網(wǎng)(WAN)、ad-hoc網(wǎng)絡(luò)、互聯(lián)網(wǎng)等)的數(shù)據(jù)傳輸。在一些實(shí)施方案中，可編程機(jī)器作為同級(jí)存在于此類(lèi)網(wǎng)絡(luò)上并且在一些實(shí)施方案中可編程機(jī)器具有客戶端/服務(wù)器關(guān)系。
在一些實(shí)施方案中，數(shù)據(jù)存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)中，如硬盤(pán)、閃速存儲(chǔ)器、光學(xué)介質(zhì)、軟盤(pán)等。
在一些實(shí)施方案中，本文提供的技術(shù)與多個(gè)共同操作以進(jìn)行如本文所述的方法的可編程設(shè)備相關(guān)。例如，在一些實(shí)施方案中，多臺(tái)計(jì)算機(jī)(例如，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)連接)并行工作以收集和處理數(shù)據(jù)，例如在執(zhí)行集群計(jì)算或網(wǎng)格計(jì)算中或在依賴(lài)于通過(guò)常規(guī)網(wǎng)絡(luò)接口，如以太網(wǎng)(Ethernet)、光纖或通過(guò)無(wú)線網(wǎng)絡(luò)技術(shù)連接到網(wǎng)絡(luò)(專(zhuān)用、公用網(wǎng)絡(luò)或互聯(lián)網(wǎng))的完整計(jì)算機(jī)(具有機(jī)載CPU、存儲(chǔ)器、電源、網(wǎng)絡(luò)接口等)的一些其它分布式計(jì)算機(jī)體系結(jié)構(gòu)中。
例如，一些實(shí)施方案提供了包括計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)的計(jì)算機(jī)。該實(shí)施方案包括與處理器耦合的隨機(jī)存取存儲(chǔ)器(RAM)。處理器執(zhí)行存儲(chǔ)器中存儲(chǔ)的計(jì)算機(jī)可執(zhí)行的程序指令。此類(lèi)處理器可包括微處理器、ASIC、狀態(tài)機(jī)或其它處理器，并且可以是許多計(jì)算機(jī)處理器中的任一種，如來(lái)自于Santa Clara的Intel Corporation、Schaumburg，Illinois的California and Motorola Corporation的處理器。此類(lèi)處理器包括介質(zhì)，或可與介質(zhì)連通，例如計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其存儲(chǔ)當(dāng)由處理器執(zhí)行時(shí)，使處理器進(jìn)行本文描述的步驟的指令。
計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)的實(shí)例包括但不限于電子、光、磁或其它存儲(chǔ)器或能夠?yàn)樘幚砥魈峁┯?jì)算機(jī)可讀指令的傳輸設(shè)備。合適介質(zhì)的其它實(shí)例包括但不限于軟盤(pán)、CD-ROM、DVD、磁盤(pán)、存儲(chǔ)器芯片、ROM、RAM、ASIC、已配置的處理器、所有光學(xué)介質(zhì)、所有磁帶或其它磁性介質(zhì)或計(jì)算機(jī)處理器可以從中讀取指令的任何其它介質(zhì)。同樣，各種其它形式的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)也可向計(jì)算機(jī)傳輸或攜帶指令，包括有線和無(wú)線的路由器、專(zhuān)用或公用網(wǎng)絡(luò)，或其它傳輸設(shè)備或通道。指令可包含來(lái)自任何合適的計(jì)算機(jī)編程語(yǔ)言，包括例如C、C++、C#、Visual Basic、Java、Python、Perl和JavaScript的代碼。
在一些實(shí)施方案中計(jì)算機(jī)連接到網(wǎng)絡(luò)。計(jì)算機(jī)還可包括許多外部或內(nèi)部設(shè)備如鼠標(biāo)、CD-ROM、DVD、鍵盤(pán)、顯示器或其它輸入或輸出設(shè)備。計(jì)算機(jī)的實(shí)例為個(gè)人計(jì)算機(jī)、數(shù)字助理、個(gè)人數(shù)字助理、蜂窩式電話、移動(dòng)電話、智能電話、尋呼機(jī)、數(shù)字平板、膝上型計(jì)算機(jī)、網(wǎng)絡(luò)家電和其它基于處理器的設(shè)備。一般而言，與本文提供的技術(shù)的方方面面有關(guān)的計(jì)算機(jī)可以是在能夠支持包含本文提供的技術(shù)的一種或多種程序的任何操作系統(tǒng)，如Microsoft Windows、Linux、UNIX、Mac OS X等上操作的任何類(lèi)型的基于處理器的平臺(tái)。一些實(shí)施方案包括執(zhí)行其它應(yīng)用程序(例如，應(yīng)用軟件)的個(gè)人計(jì)算機(jī)。應(yīng)用軟件可含在存儲(chǔ)器中并且可以包括，例如文字處理應(yīng)用程序、電子表格應(yīng)用程序、電子郵件應(yīng)用程序、即時(shí)通訊應(yīng)用程序、演示應(yīng)用程序、互聯(lián)網(wǎng)瀏覽器應(yīng)用程序、日歷/管理器應(yīng)用程序和客戶端設(shè)備能夠執(zhí)行的任何其它應(yīng)用程序。
本文描述為與所述技術(shù)相關(guān)的所有此類(lèi)組件、計(jì)算機(jī)和系統(tǒng)可為邏輯性或虛擬的。
因此，本文提供了與一種在得自受試者(例如，人類(lèi)受試者)的樣品(例如，糞便樣品、結(jié)直腸組織樣品、血液樣品、血液制品樣品)中篩查結(jié)直腸贅生物的方法有關(guān)的技術(shù)，所述方法包括測(cè)定得自受試者的樣品中的標(biāo)志物的甲基化狀態(tài)；并且當(dāng)所述標(biāo)志物的甲基化狀態(tài)不同于在沒(méi)有結(jié)直腸贅生物的受試者中測(cè)定的所述標(biāo)志物的甲基化狀態(tài)時(shí)，將所述受試者鑒定為有結(jié)直腸贅生物，其中所述標(biāo)志物包含選自如表1A和B所提供的DMR的差異性甲基化區(qū)域(DMR)中的堿基。所述技術(shù)還涵蓋確定結(jié)直腸癌的狀態(tài)或階段，例如，在一些實(shí)施方案中贅生物為癌前期的。一些實(shí)施方案提供了包括測(cè)定多種標(biāo)志物，例如包括測(cè)定2至10種標(biāo)志物的方法。
所述技術(shù)不限于評(píng)估甲基化狀態(tài)。在一些實(shí)施方案中評(píng)估樣品中的標(biāo)志物的甲基化狀態(tài)包括確定一個(gè)堿基的甲基化狀態(tài)。在一些實(shí)施方案中，測(cè)定樣品中的標(biāo)志物的甲基化狀態(tài)包括確定在多個(gè)堿基處的甲基化程度。而且，在一些實(shí)施方案中標(biāo)志物的甲基化狀態(tài)包括相對(duì)于所述標(biāo)志物的正常甲基化狀態(tài)，所述標(biāo)志物的甲基化增加。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)志物的甲基化狀態(tài)包括相對(duì)于所述標(biāo)志物的正常甲基化狀態(tài)，所述標(biāo)志物的甲基化減少。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)志物的甲基化狀態(tài)包括相對(duì)于所述標(biāo)志物的正常甲基化狀態(tài)，所述標(biāo)志物的甲基化模式不同。
此外，在一些實(shí)施方案中標(biāo)志物為100個(gè)或更少堿基的區(qū)域，標(biāo)志物為500個(gè)或更少堿基的區(qū)域，標(biāo)志物為1000個(gè)或更少堿基的區(qū)域，標(biāo)志物為5000個(gè)或更少堿基的區(qū)域，或在一些實(shí)施方案中，標(biāo)志物為一個(gè)堿基。在一些實(shí)施方案中標(biāo)志物在高CpG密度啟動(dòng)子中。
所述技術(shù)不受相同類(lèi)型限制。例如，在一些實(shí)施方案中樣品為糞便樣品、組織樣品、結(jié)直腸組織樣品、血液樣品(例如，血漿、血清、全血)、排泄物或尿液樣品。
此外，所述技術(shù)不限于用于確定甲基化狀態(tài)的方法中。在一些實(shí)施方案中所述測(cè)定包括使用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)、核酸測(cè)序、質(zhì)譜法、甲基化特異性核酸酶、基于質(zhì)量的分離或靶標(biāo)捕獲。在一些實(shí)施方案中，所述測(cè)定包括使用甲基化特異性寡核苷酸。在一些實(shí)施方案中，所述技術(shù)使用用于確定甲基化狀態(tài)的大規(guī)模平行測(cè)序(例如，下一代測(cè)序)，例如通過(guò)合成測(cè)序、實(shí)時(shí)(例如，單分子)測(cè)序、微珠乳液測(cè)序、納米孔測(cè)序等。
所述技術(shù)提供了用于檢測(cè)DMR的試劑，例如在一些實(shí)施方案中提供了包含SEQ ID NO：1-57提供的序列的寡核苷酸集合。在一些實(shí)施方案中提供了包含與具有在DMR中的堿基的染色體區(qū)域互補(bǔ)的序列的寡核苷酸，例如對(duì)DMR的甲基化狀態(tài)敏感的寡核苷酸。
所述技術(shù)提供了多組標(biāo)志物，例如在一些實(shí)施方案中，所述標(biāo)志物包含具有為NDRG4、BMP3、OPLAH、FLI1、PDGFD、CHST_7889、SFMBT2_895、SFMBT2_896、SFMBT2_897、CHST2_7890、VAV3和DTX1的標(biāo)注并且包含標(biāo)志物的染色體區(qū)域(參見(jiàn)，表1A和B)。
另外，實(shí)施方案提供了分析來(lái)自于表1A和B的DMR的方法。一些實(shí)施方案提供了確定標(biāo)志物的甲基化狀態(tài)，其中具有為NDRG4、BMP3、OPLAH、FLI1、PDGFD、CHST_7889、SFMBT2_895、SFMBT2_896、SFMBT2_897、CHST2_7890、VAV3和DTX1的標(biāo)注的染色體區(qū)域包含標(biāo)志物。
提供了試劑盒實(shí)施方案，例如，一種試劑盒包含亞硫酸氫鹽試劑；和對(duì)照核酸，其包含來(lái)自于選自表1A和B中提供的任何染色體區(qū)域的DMR的序列，并且具有與未患癌癥的受試者相關(guān)的甲基化狀態(tài)。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包含亞硫酸氫鹽試劑和如本文所述的寡核苷酸。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包含亞硫酸氫鹽試劑；和對(duì)照核酸，其包含來(lái)自于選自如表1A和B中提供的任何染色體區(qū)域的DMR的序列，并且具有與患有結(jié)直腸癌、腺瘤和/或SSP的受試者相關(guān)的甲基化狀態(tài)。一些試劑盒實(shí)施方案包含用于從受試者獲得樣品(例如，糞便樣品)的取樣器；用于從所述樣品分離核酸的試劑；亞硫酸氫鹽試劑；和如本文所述的寡核苷酸。
所述試劑盒與組合物(例如，反應(yīng)混合物)的實(shí)施方案有關(guān)。在一些實(shí)施方案中提供了一種組合物，其包含含DMR的核酸和亞硫酸氫鹽試劑。一些實(shí)施方案提供了一種組合物，其包含含DMR的核酸和如本文所述的寡核苷酸。一些實(shí)施方案提供了一種組合物，其包含含DMR的核酸和甲基化敏感性限制酶。一些實(shí)施方案提供了一種組合物，其包含含DMR的核酸和聚合酶。
提供了另外的有關(guān)方法實(shí)施方案以在得自受試者的樣品中篩查結(jié)直腸贅生物，例如一種方法包括確定所述樣品中包含DMR中的堿基的標(biāo)志物的甲基化狀態(tài)，所述DMR選自如表1A和B所提供的任何染色體區(qū)域；將來(lái)自于所述受試者樣品的標(biāo)志物的甲基化狀態(tài)與來(lái)自于未患癌癥的受試者的正常對(duì)照樣品的標(biāo)志物的甲基化狀態(tài)作比較；確定所述受試者樣品和所述正常對(duì)照樣品的甲基化狀態(tài)上的差異的置信區(qū)間和/或p值。在一些實(shí)施方案中，置信區(qū)間為90％、95％、97.5％、98％、99％、99.5％、99.9％或99.99％并且p值為0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001或0.0001。方法的一些實(shí)施方案提供了以下步驟：使包含DMR的核酸與亞硫酸氫鹽試劑反應(yīng)以生成亞硫酸氫鹽反應(yīng)核酸；為所述亞硫酸氫鹽反應(yīng)核酸測(cè)序以提供所述亞硫酸氫鹽反應(yīng)核酸的核苷酸序列；將所述亞硫酸氫鹽反應(yīng)核酸的核苷酸序列與來(lái)自于未患癌癥的受試者的包含所述DMR的核酸的核苷酸序列作比較以鑒定所述兩個(gè)序列上的差異；并且當(dāng)存在差異時(shí)將所述受試者鑒定為有結(jié)直腸贅生物。
通過(guò)所述技術(shù)提供了用于在得自受試者的樣品中篩查結(jié)直腸贅生物的系統(tǒng)。系統(tǒng)的示例性實(shí)施方案包括例如，一種用于在得自受試者的樣品中篩查結(jié)直腸贅生物的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括配置用于確定樣品的甲基化狀態(tài)的分析組件，配置用于比較所述樣品的甲基化狀態(tài)與數(shù)據(jù)庫(kù)中記錄的對(duì)照樣品或參考樣品甲基化狀態(tài)的軟件組件，及配置用于警告使用者癌癥相關(guān)的甲基化狀態(tài)的警報(bào)組件。在一些實(shí)施方案中，由軟件組件接收來(lái)自于多次測(cè)定(例如，確定例如表1A和B所提供的多個(gè)標(biāo)志物例如DMR的甲基化狀態(tài))的結(jié)果并且基于多個(gè)結(jié)果計(jì)算要報(bào)告的值或結(jié)果來(lái)確定警報(bào)。一些實(shí)施方案提供了與本文提供的每個(gè)DMR相關(guān)，用于計(jì)算要向使用者(例如，醫(yī)師、護(hù)士、臨床醫(yī)生等)報(bào)告的值或結(jié)果和/或警報(bào)的加權(quán)參數(shù)的數(shù)據(jù)庫(kù)。在一些實(shí)施方案中報(bào)告來(lái)自于多次測(cè)定的所有結(jié)果并且在一些實(shí)施方案中基于來(lái)自于多次測(cè)定的表明受試者中的結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)的一個(gè)或多個(gè)結(jié)果的合成，使用一個(gè)或多個(gè)結(jié)果來(lái)提供得分、值或結(jié)果。
在系統(tǒng)的一些實(shí)施方案中，樣品包含含DMR的核酸。在一些實(shí)施方案中，所述系統(tǒng)還包含用于分離核酸的組件，用于采集樣品的組件，如用于采集糞便樣品的組件。在一些實(shí)施方案中，所述系統(tǒng)包含含DMR的核酸序列。在一些實(shí)施方案中，數(shù)據(jù)庫(kù)包含來(lái)自于未患癌癥的受試者的核酸序列。還提供了核酸，例如核酸的集合，每個(gè)核酸具有包含DMR的序列。在一些實(shí)施方案中，核酸的集合，其中每個(gè)核酸具有來(lái)自于未患癌癥的受試者的序列。有關(guān)系統(tǒng)實(shí)施方案包含所描述的核酸的集合和與核酸的集合相關(guān)的核酸序列的數(shù)據(jù)庫(kù)。一些實(shí)施方案還包含亞硫酸氫鹽試劑。并且，一些實(shí)施方案還包含核酸測(cè)序儀。
所述技術(shù)與組合物(例如，反應(yīng)混合物)的實(shí)施方案有關(guān)。在一些實(shí)施方案中提供了一種組合物，其包含含DMR(例如，表1A和B所提供的DMR)的核酸和亞硫酸氫鹽試劑。一些實(shí)施方案提供了一種組合物，其包含含DMR的核酸和如本文所述的寡核苷酸。一些實(shí)施方案提供了一種組合物，其包含含DMR的核酸和甲基化敏感性限制酶。一些實(shí)施方案提供了一種組合物，其包含含DMR的核酸和聚合酶。
基于本文所含的教導(dǎo)，對(duì)于相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員而言另外的實(shí)施方案將顯而易見(jiàn)。
發(fā)明詳述
本文提供了涉及檢測(cè)結(jié)直腸贅生物形成并且尤其，但不排他性地涉及用于檢測(cè)惡變前和惡性結(jié)直腸癌的方法、組合物和相關(guān)用途的技術(shù)。本文描述所述技術(shù)時(shí)，所用章節(jié)標(biāo)題僅僅是為了組織的目的而不得解釋為以任何方式限制主題。
在各個(gè)實(shí)施方案的這種詳細(xì)描述中，出于解釋的目的，闡述了許多具體細(xì)節(jié)以提供對(duì)公開(kāi)的實(shí)施方案的透徹理解。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，可實(shí)踐這些各個(gè)實(shí)施方案，需要或不需要這些具體細(xì)節(jié)。在其它情況下，結(jié)構(gòu)和設(shè)備以方框圖形式示出。此外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地認(rèn)識(shí)到，方法呈現(xiàn)和進(jìn)行的具體順序是說(shuō)明性的并且考慮到該順序可以改變并且仍然在本文公開(kāi)的各個(gè)實(shí)施方案的精神和范圍之內(nèi)。
本申請(qǐng)中引用的所有文獻(xiàn)和類(lèi)似材料，包括但不限于專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)、文章、書(shū)籍、論文和互聯(lián)網(wǎng)網(wǎng)頁(yè)明確地通過(guò)引用整體并入用于任何目的。除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本文所述各個(gè)實(shí)施方案所屬領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。并入的參考文獻(xiàn)中的術(shù)語(yǔ)定義出現(xiàn)與本教導(dǎo)中提供的定義不同時(shí)，應(yīng)以本教導(dǎo)中提供的定義為準(zhǔn)。
定義
為利于對(duì)本技術(shù)的理解，下面定義了許多術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)。另外的定義在發(fā)明詳述通篇有闡述。
在說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)通篇，除非上下文另外明確指出，否則以下術(shù)語(yǔ)采用本文明確相關(guān)的含義。如本文中所用的短語(yǔ)“在一個(gè)實(shí)施方案中”盡管可能，但不一定是指相同實(shí)施方案。此外，如本文中所用的短語(yǔ)“在另一個(gè)實(shí)施方案中”盡管可能，但不一定是指不同實(shí)施方案。因此，如下所述，在不背離本發(fā)明的范圍或精神的前提下，可容易地組合本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施方案。
另外，如本文中所用，除非上下文另外明確指出，否則術(shù)語(yǔ)“或”是包含性“或”運(yùn)算子并且與術(shù)語(yǔ)“和/或”等效。除非上下文另外明確指出，否則術(shù)語(yǔ)“基于”是非排他性并且允許基于未描述的另外的因素。另外，在說(shuō)明書(shū)通篇，“一”、“一種(個(gè))”和“所述(該)”的含義包括復(fù)數(shù)指示物。“在……中”的含義包括“在……中”和“在……上”。
如本文中所用，“核酸”或“核酸分子”通常是指任何核糖核酸或脫氧核糖核酸，其可為未修飾或經(jīng)修飾的DNA或RNA?！昂怂帷卑ǖ幌抻趩捂満碗p鏈核酸。如本文中所用，“核酸”還包括如以上所描述的含有一個(gè)或多個(gè)修飾堿基的DNA。因此，出于穩(wěn)定性或其它原因骨架經(jīng)修飾的DNA為“核酸”。術(shù)語(yǔ)“核酸”當(dāng)其用于本文中時(shí)包括此類(lèi)經(jīng)化學(xué)、酶或代謝修飾的核酸形式，以及病毒和細(xì)胞，包括例如單細(xì)胞和復(fù)雜細(xì)胞所特有的DNA的化學(xué)形式。
術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核苷酸”或“核酸”是指具有兩個(gè)或更多個(gè)脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，優(yōu)選三個(gè)以上并且通常十個(gè)以上的分子。確切大小將取決于許多因素，這又取決于寡核苷酸的最終功能或用途。寡核苷酸可以任何方式生成，包括化學(xué)合成、DNA復(fù)制、反轉(zhuǎn)錄或其組合。DNA的典型脫氧核糖核苷酸為胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤。RNA的典型核糖核苷酸為尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤。
如本文中所用，術(shù)語(yǔ)核酸的“基因座”或“區(qū)域”是指核酸的亞區(qū)，例如染色體上的基因、單核苷酸、CpG島等。
術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)”和“互補(bǔ)性”是指按堿基配對(duì)原則相關(guān)聯(lián)的核苷酸(例如，1個(gè)核苷酸)或多核苷酸(例如，核苷酸的序列)。例如，序列5′-A-G-T-3′與序列3′-T-C-A-5′互補(bǔ)?；パa(bǔ)性可為“部分的”，其中僅一些核酸堿基根據(jù)堿基配對(duì)原則匹配。或者，核酸之間可存在“完全”或“全部”互補(bǔ)性。核酸鏈之間的互補(bǔ)性程度影響核酸鏈之間雜交的效率和強(qiáng)度。這在擴(kuò)增反應(yīng)和依賴(lài)核酸之間的結(jié)合的檢測(cè)方法中特別重要。
術(shù)語(yǔ)“基因”是指包含生成RNA或多肽或其前體所必需的編碼序列的核酸(例如，DNA或RNA)序列。功能多肽可以由全長(zhǎng)編碼序列或該編碼序列的任一部分編碼，只要保持多肽的所需活性或功能性質(zhì)(例如，酶活性、配體結(jié)合、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等)。術(shù)語(yǔ)“部分”在關(guān)于基因使用時(shí)是指該基因的片段。片段在尺寸上范圍可從幾個(gè)核苷酸到整個(gè)基因序列減去一個(gè)核苷酸。因此，“包含基因的至少一部分的核苷酸”可包含該基因的片段或整個(gè)基因。
術(shù)語(yǔ)“基因”還涵蓋結(jié)構(gòu)基因的編碼區(qū)并且包括5′和3′末端位于編碼區(qū)附近的序列，例如任一端上約1kb的距離，使得該基因?qū)?yīng)于全長(zhǎng)mRNA(例如，包含編碼、調(diào)控、結(jié)構(gòu)和其它序列)的長(zhǎng)度。位于編碼區(qū)的5′并且存在于mRNA上的序列稱(chēng)為5′非翻譯或未翻譯序列。位于編碼區(qū)的3′或下游并且存在于mRNA上的序列稱(chēng)為3′非翻譯或3′未翻譯序列。術(shù)語(yǔ)“基因”涵蓋cDNA和基因的基因組形式兩種。在一些生物體(例如，真核生物)中，基因的基因組形式或克隆物含有被稱(chēng)為“內(nèi)含子”或“插入?yún)^(qū)”或“插入序列”的非編碼序列間斷的編碼區(qū)。內(nèi)含子是轉(zhuǎn)錄為核RNA(hnRNA)的基因片段；內(nèi)含子可含調(diào)控元件如增強(qiáng)子。從核或初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物去除或“剪掉”內(nèi)含子；因此在信使RNA(mRNA)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中不存在內(nèi)含子。mRNA在翻譯期間起到指定新生多肽中氨基酸的序列或順序的功能。
除含有內(nèi)含子以外，基因的基因組形式還可包括位于RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上存在的序列的5′和3′末端的序列。這些序列稱(chēng)為“側(cè)翼”序列或區(qū)(這些側(cè)翼序列位于mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上存在的非翻譯序列的5′或3′)。5′側(cè)翼區(qū)可含調(diào)控序列如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，其控制或影響基因的轉(zhuǎn)錄。3′側(cè)翼區(qū)可含指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的終止、轉(zhuǎn)錄后裂解和聚腺苷酸化的序列。
術(shù)語(yǔ)“野生型”關(guān)于基因使用時(shí)是指具有分離自天然存在的來(lái)源的基因的特征的基因。術(shù)語(yǔ)“野生型”關(guān)于基因產(chǎn)物使用時(shí)是指具有分離自天然存在的來(lái)源的基因產(chǎn)物的特征的基因產(chǎn)物。術(shù)語(yǔ)“天然存在的”應(yīng)用于物體時(shí)是指物體可以在天然界中找到的事實(shí)。例如，生物體(包括病毒)中存在的可以從天然界中的來(lái)源分離并且尚未在實(shí)驗(yàn)室經(jīng)人工刻意修飾的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。野生型基因常常是在群體中最頻繁觀察到的基因或等位基因并且因此被任意指定為基因的“正?！被颉耙吧汀毙问?。相反，術(shù)語(yǔ)“經(jīng)修飾”或“突變”關(guān)于基因或基因產(chǎn)物使用時(shí)分別指在與野生型基因或基因產(chǎn)物相比時(shí)，在序列和/或功能性質(zhì)上展現(xiàn)出改變(例如，特征改變)的基因或基因產(chǎn)物。值得注意的是，天然存在的突變體可以分離；這些通過(guò)它們?cè)谂c野生型基因或基因產(chǎn)物相比時(shí)具有改變的特征的事實(shí)來(lái)鑒定。
術(shù)語(yǔ)“等位基因”是指基因的變異；變異包括但不限于變異體和突變體、多態(tài)性基因座和單核苷酸多態(tài)性基因座、移碼和剪接突變。等位基因可天然出現(xiàn)在群體中或其可能在該群體的任何特定個(gè)體生存期間產(chǎn)生。
因此，術(shù)語(yǔ)“變異體”和“突變體”關(guān)于核苷酸序列使用時(shí)是指與另一個(gè)通常有關(guān)的核苷酸序列有一個(gè)或多個(gè)核苷酸不同的核酸序列?！白儺悺笔莾蓚€(gè)不同核苷酸序列之間的差異；通常，一個(gè)序列為參考序列。
“擴(kuò)增”是牽涉模板特異性的核酸復(fù)制的特例。與非特異性模板復(fù)制(例如，依賴(lài)模板，但不依賴(lài)特異性模板的復(fù)制)完全不同。此處將模板特異性與復(fù)制精確性(例如，正確多核苷酸序列的合成)和核苷酸(核糖或脫氧核糖)特異性區(qū)別開(kāi)。經(jīng)常根據(jù)“靶”特異性來(lái)描述模板特異性。靶序列在旨在將其從另一核酸中分選出來(lái)的意義上來(lái)說(shuō)是“靶”。為了這樣分選出來(lái)已主要設(shè)計(jì)了擴(kuò)增技術(shù)。
核酸的擴(kuò)增通常是指生成多個(gè)拷貝的多核苷酸或多核苷酸的一部分，該部分通常從少量的多核苷酸(例如，單個(gè)多核苷酸分子，10至100個(gè)拷貝的多核苷酸分子，其可能或可能不完全相同)，其中擴(kuò)增產(chǎn)物或擴(kuò)增子通常可檢測(cè)。多核苷酸的擴(kuò)增涵蓋多個(gè)化學(xué)和酶促過(guò)程。在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或連接酶鏈反應(yīng)(LCR；參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利第5,494,810號(hào))期間由一個(gè)或幾個(gè)拷貝的靶或模板DNA分子生成多個(gè)DNA拷貝是擴(kuò)增形式。另外的擴(kuò)增類(lèi)型包括但不限于等位基因特異性PCR(美國(guó)專(zhuān)利第5,639,611號(hào))、組裝PCR(美國(guó)專(zhuān)利第5,965,408號(hào))、解旋酶依賴(lài)性擴(kuò)增(美國(guó)專(zhuān)利第7,662,594號(hào))、熱啟動(dòng)PCR(美國(guó)專(zhuān)利第5,773,258和5,338,671號(hào))、序列間特異性PCR、反向PCR(Triglia等人(1988)Nucleic Acids Res.，16：8186)、連接介導(dǎo)的PCR(Guilfoyle，R.等人，Nucleic Acids Research，25：1854-1858(1997)；美國(guó)專(zhuān)利第5,508,169號(hào))、甲基化特異性PCR(Herman等人，(1996)PNAS 93(13)9821-9826)、微型引物PCR、多重連接依賴(lài)性探針擴(kuò)增(Schouten等人，(2002)Nucleic Acids Research 30(12)：e57)、多重PCR(Chamberlain等人，(1988)Nucleic Acids Research 16(23)11141-11156；Ballabio等人，(1990)Human Genetics 84(6)571-573；Hayden等人，(2008)BMC Genetics 9：80)、巢式PCR、重疊延伸PCR(Higuchi等人，(1988)Nucleic Acids Research 16(15)7351-7367)、實(shí)時(shí)PCR(Higuchi等人，(1992)Biotechnology 10：413-417；Higuchi等人，(1993)Biotechnology 11：1026-1030)、反轉(zhuǎn)錄PCR(Bustin，S.A.(2000)J.Molecular Endocrinology 25：169-193)、固相PCR、熱不對(duì)稱(chēng)嵌套PCR和降落PCR(Don等人，Nucleic Acids Research(1991)19(14)4008；Roux，K.(1994)Biotechniques 16(5)812-814；Hecker等人，(1996)Biotechniques 20(3)478-485)。多核苷酸擴(kuò)增也可以使用數(shù)字PCR完成(Kalinina等人，Nucleic Acids Research.25；1999-2004，(1997)；Vogelstein和Kinzler，Proc Natl Acad Sci USA.96；9236-41，(1999)；國(guó)際專(zhuān)利公布第WO05023091A2號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布第20070202525號(hào))。
如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“核酸檢測(cè)測(cè)定法”是指確定目標(biāo)核酸的核苷酸組成的任何方法。核酸檢測(cè)測(cè)定法包括但不限于DNA測(cè)序法、探針雜交法、結(jié)構(gòu)特異性裂解測(cè)定法(例如，INVADER測(cè)定法，Hologic，Inc.)并且例如在美國(guó)專(zhuān)利第5,846,717、5,985,557、5,994,069、6,001,567、6,090,543和6,872,816號(hào)；Lyamichev等人，Nat.Biotech.，17：292(1999)，Hall等人，PNAS，USA，97：8272(2000)和US 2009/0253142)中有描述；聚合酶鏈反應(yīng)；分支雜交法(例如，Chiron，美國(guó)專(zhuān)利第5,849,481、5,710,264、5,124,246和5,624,802號(hào))；滾環(huán)復(fù)制(例如，美國(guó)專(zhuān)利第6,210,884、6,183,960和6,235,502號(hào))；NASBA(例如，美國(guó)專(zhuān)利第5,409,818號(hào))；分子信標(biāo)技術(shù)(例如，美國(guó)專(zhuān)利第6,150,097號(hào))；循環(huán)探針技術(shù)(例如，美國(guó)專(zhuān)利第5,403,711、5,011,769和5,660,988號(hào))；連接酶鏈反應(yīng)(例如，Barnay Proc.Natl.Acad.Sci USA 88，189-93(1991))；QuARTS測(cè)定法(例如，如美國(guó)專(zhuān)利第8,361,720；及美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布第2012/0122088和2012/0122106號(hào)中所提供)；和夾心雜交法(例如，美國(guó)專(zhuān)利第5,288,609號(hào))。
術(shù)語(yǔ)“引物”是指如同在純化限制消耗中天然存在的或經(jīng)合成產(chǎn)生的寡核苷酸，其在處于誘導(dǎo)與核酸鏈互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物合成的條件下時(shí)，(例如，在核苷酸和誘導(dǎo)劑如DNA聚合酶的存在下并且在合適的溫度和pH)，能夠起到合成起始點(diǎn)的作用。為了擴(kuò)增的最高效率，引物優(yōu)選為單鏈，但是可選地可為雙鏈。若為雙鏈，在用于制備延伸產(chǎn)物之前首先處理引物以將其鏈分離。優(yōu)選地，因?yàn)闉楣衙撗鹾颂呛塑账?。引物必須足夠長(zhǎng)以在誘導(dǎo)劑的存在下引發(fā)延伸產(chǎn)物的合成。引物的確切長(zhǎng)度將取決于許多因素，包括溫度、引物來(lái)源和所述方法的使用。
術(shù)語(yǔ)“探針”是指如同在純化限制消耗中天然存在的或經(jīng)合成、重組或通過(guò)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的寡核苷酸，其能夠與另一目標(biāo)寡核苷雜交。探針可為單鏈或雙鏈。探針用于特定基因序列的檢測(cè)、鑒定和分離(例如，“捕獲探針”)?？紤]到，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明中使用的任何探針均可用任何“報(bào)告分子”標(biāo)記，使其在任何檢測(cè)系統(tǒng)中可檢測(cè)，包括但不限于酶(例如，ELISA以及基于酶的組織化學(xué)測(cè)定法)、熒光、放射性和發(fā)光系統(tǒng)。并非旨在將本發(fā)明限于任何特定檢測(cè)系統(tǒng)或標(biāo)記。
如本文中所用，“甲基化”是指胞嘧啶的位置C5或N4、腺嘌呤的N6位置的胞嘧啶甲基化，或其它類(lèi)型的核酸甲基化。因?yàn)榈湫腕w外DNA擴(kuò)增方法不保持?jǐn)U增模板的甲基化模式，所以體外擴(kuò)增的DNA通常未甲基化。然而，“未甲基化DNA”或“甲基化DNA”也可以指原始模板分別未甲基化或甲基化的擴(kuò)增DNA。
因此，如本文中所用，“甲基化核苷酸”或“甲基化核苷酸堿基”是指在核苷酸堿基上存在甲基部分，其中甲基部分在公認(rèn)的典型核苷酸堿基中不存在。例如，胞嘧啶在其嘧啶環(huán)上不含甲基部分，但是5-甲基胞嘧啶在其嘧啶環(huán)的位置5處含有甲基部分。因此，胞嘧啶不是甲基化核苷酸而5-甲基胞嘧啶是甲基化核苷酸。在另一個(gè)實(shí)例中，胸腺嘧啶在其嘧啶環(huán)的位置5處含有甲基部分；然而，為了本文的目的，當(dāng)存在于DNA中時(shí)不將胸腺嘧啶視為甲基化核苷酸，因?yàn)樾叵汆奏な荄NA的典型核苷酸堿基。
如本文中所用，“甲基化核酸分子”是指含有一個(gè)或多個(gè)甲基化核苷酸的核酸分子。
如本文中所用，核酸分子的“甲基化狀態(tài)”、“甲基化性質(zhì)”和“甲基化狀況”是指在核酸分子中存在或不存在一個(gè)或多個(gè)甲基化核苷酸堿基。例如，將含有甲基化胞嘧啶的核酸分子視為甲基化(例如，核酸分子的甲基化狀態(tài)為甲基化)。將不含任何甲基化核苷酸的核酸分子視為未甲基化。
特定核酸序列(例如，如本文所述的基因標(biāo)志物或DNA區(qū)域)的甲基化狀態(tài)可以指示該序列中每個(gè)甲基的甲基化狀態(tài)或可以指示該序列中堿基(例如，一個(gè)或多個(gè)胞嘧啶)子集的甲基化狀態(tài)，或可以指示關(guān)于該序列中區(qū)域甲基化密度的信息，提供或不提供該序列中發(fā)生甲基化的位置的信息。
核酸分子中核苷酸基因座的甲基化狀態(tài)是指在核酸分子內(nèi)的特定基因座存在或不存在甲基化核苷酸。例如，當(dāng)核酸分子中第7個(gè)核苷酸處存在的核苷酸為5-甲基胞嘧啶時(shí)，核酸分子中第7個(gè)核苷酸處的胞嘧啶的甲基化狀態(tài)為甲基化。類(lèi)似地，當(dāng)核酸分子中第7個(gè)核苷酸處存在的核苷酸為胞嘧啶(而非5-甲基胞嘧啶)時(shí)，核酸分子中第7個(gè)核苷酸處的胞嘧啶的甲基化狀態(tài)為未甲基化。
甲基化狀況可以任選地用“甲基化值”表示或指示(例如，表示甲基化頻率、分?jǐn)?shù)、比率、百分比等)?？梢援a(chǎn)生甲基化值，例如通過(guò)量化在用甲基化依賴(lài)性限制酶進(jìn)行限制消化之后存在的完整核酸的量或通過(guò)比較亞硫酸氫鹽反應(yīng)后的擴(kuò)增圖譜或通過(guò)比較經(jīng)亞硫酸氫鹽處理和未處理的核酸的序列。因此，值例如甲基化值，表示甲基化狀況并且因此可以用作基因座多個(gè)拷貝的甲基化狀況的量化指標(biāo)。當(dāng)期望將樣品中序列的甲基化狀況與閾值或參考值做比較時(shí)，這特別有用。
如本文中所用，“甲基化頻率”或“甲基化百分比(％)”是指相對(duì)于分子或基因座未甲基化的情況的數(shù)量，分子或基因座甲基化的情況的數(shù)量。
這樣，甲基化狀態(tài)描述核酸(例如，基因組序列)甲基化的狀態(tài)。另外，甲基化狀是指在特定基因座處的核酸片段與甲基化有關(guān)的特征。此類(lèi)特征包括但不限于，這個(gè)DNA序列內(nèi)的任何胞嘧啶(C)殘基是否甲基化，甲基化C殘基的位置，遍及核酸任何特定區(qū)域的甲基化C的頻率或百分比，及由于例如等位基因起源的差異引起的甲基化的等位差異。術(shù)語(yǔ)“甲基化狀態(tài)”、“甲基化性質(zhì)”和“甲基化狀況”還指遍及生物樣品中核酸的任何特定區(qū)域的相對(duì)濃度、絕對(duì)濃度或甲基化C或未甲基化C的模式。例如，如果核酸序列中的胞嘧啶(C)殘基甲基化，則可稱(chēng)其為“高甲基化”或具有“增加的甲基化”，而如果DNA序列內(nèi)的胞嘧啶(C)殘基未甲基化，則可稱(chēng)其為“低甲基化”或具有“減少的甲基化”。同樣，如果核酸序列內(nèi)的胞嘧啶(C)殘基與另一核酸序列(例如，來(lái)自于不同區(qū)域或來(lái)自于不同個(gè)體等)相比甲基化，則認(rèn)為該序列與另一核酸序列相比高甲基化或具有增加的甲基化?？蛇x地，如果DNA序列內(nèi)的胞嘧啶(C)殘基與另一核酸序列(例如，來(lái)自于不同區(qū)域或來(lái)自于不同個(gè)體等)相比未甲基化，則認(rèn)為該序列與另一核酸序列相比低甲基化或具有減少的甲基化。另外，如本文中所用的術(shù)語(yǔ)“甲基化模式”是指在核酸的一個(gè)區(qū)域上甲基化和未甲基化核苷酸的集中位點(diǎn)。當(dāng)整個(gè)區(qū)域上甲基化和未甲基化核苷酸的數(shù)量相同或相似，但甲基化和未甲基化核苷酸的位置不同時(shí)，兩個(gè)核酸可具有相同或相似的甲基化頻率或甲基化百分比，但是具有不同的甲基化模式。當(dāng)序列在甲基化程度(例如，一個(gè)序列相對(duì)于另一個(gè)具有增加或減少的甲基化)、頻率或模式上不同時(shí)，稱(chēng)序列為“差異性甲基化”或具有“甲基化上的差異”或具有“不同的甲基化狀態(tài)”。術(shù)語(yǔ)“差異性甲基化”是指與癌癥陰性樣品中核酸甲基化的水平或模式相比，癌癥陽(yáng)性樣品中核酸甲基化的水平或模式上的差異。也可以指在術(shù)后癌癥復(fù)發(fā)的患者與沒(méi)有復(fù)發(fā)的患者之間在水平或模式上的差異。差異性甲基化和DNA甲基化的特定水平或模式是預(yù)后和預(yù)測(cè)生物標(biāo)志，例如，曾經(jīng)已經(jīng)定義了恰當(dāng)?shù)慕刂够蝾A(yù)測(cè)特征。
甲基化狀態(tài)頻率可用于描述一群個(gè)體或來(lái)自于單個(gè)個(gè)體的樣品。例如，具有50％甲基化狀態(tài)頻率的核苷酸基因座在50％的情況下甲基化而在50％的情況下未甲基化。此類(lèi)頻率可用于，例如描述在一群個(gè)體或一堆核酸中核苷酸基因座或核酸區(qū)域甲基化的程度。因此，當(dāng)?shù)谝蝗夯蚺怂岱肿又械募谆煌诘诙夯蚺怂岱肿又械募谆瘯r(shí)，第一群或批的甲基化狀態(tài)頻率將不同于第二群或批的甲基化狀態(tài)頻率。此類(lèi)頻率也可用于，例如描述在單個(gè)個(gè)體中核苷酸基因座或核酸區(qū)域甲基化的程度。例如，此類(lèi)頻率可用于描述來(lái)自于組織樣品的一組細(xì)胞在核苷酸基因座或核酸區(qū)域處甲基化或未甲基化的程度。
如本文中所用“核苷酸基因座”是指核苷酸在核酸分子中的位置。甲基化核苷酸的核苷酸基因座是指甲基化核苷酸在核酸分子中的位置。
通常，人DNA的甲基化發(fā)生在二核苷酸序列上，包括相鄰鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶，其中胞嘧啶位于鳥(niǎo)嘌呤的5′(也稱(chēng)為CpG二核苷酸序列)。在人類(lèi)基因組中CpG二核苷酸內(nèi)的大多數(shù)胞嘧啶是甲基化的，然而在稱(chēng)為CpG島的特定CpG二核苷酸富集基因組區(qū)域中一些保持未甲基化(參見(jiàn)例如，Antequera等人(1990)Cell 62：503-514)。
如本文中所用，“CpG島”是指基因組DNA的G∶C富集區(qū)，其含有相對(duì)于全基因組DNA數(shù)量增加的CpG二核苷酸。CpG島長(zhǎng)度可為至少100、200個(gè)或更多個(gè)堿基對(duì)，其中該區(qū)域的G∶C含量為至少50％并且觀測(cè)到的CpG頻率與預(yù)期頻率的比率為0.6；在一些情況下，CpG島長(zhǎng)度可為至少500個(gè)堿基對(duì)，其中該區(qū)域的G∶C含量為至少55％)并且觀測(cè)到的CpG頻率與預(yù)期頻率的比率為0.65。觀測(cè)到的高于預(yù)期頻率的CpG頻率可以根據(jù)Gardiner-Garden等人(1987)J.Mol.Biol.196：261-281中提供的方法計(jì)算。例如，觀測(cè)到的高于預(yù)期頻率的CpG頻率可以根據(jù)公式R＝(A×B)/(C×D)計(jì)算，其中R是觀測(cè)到的CpG頻率與預(yù)期頻率的比率，A是分析序列中CpG二核苷酸的數(shù)量，B是分析序列中核苷酸的總數(shù)，C是分析序列中C核苷酸的總數(shù)，并且D是分析序列中G核苷酸的總數(shù)。通常確定在CpG島中，例如在啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)。盡管將認(rèn)識(shí)到人類(lèi)基因組中的其它序列有DNA甲基化傾向，如CpA和CpT(參見(jiàn)Ramsahoye(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：5237-5242；Salmon和Kaye(1970)Biochim.Biophys.Acta.204：340-351；Grafstrom(1985)Nucleic Acids Res.13：2827-2842；Nyce(1986)Nucleic Acids Res.14：4353-4367；Woodcock(1987)Biochem.Biophys.Res.Commun.145：888-894)。
如本文中所用，根據(jù)核酸分子的甲基化狀態(tài)修飾核酸分子的核苷酸的試劑，或甲基化特異性試劑，是指可以按影響核酸分子的甲基化狀態(tài)的方式改變核酸分子的核苷酸序列的化合物或組合物或其它藥劑。用此類(lèi)試劑處理核酸分子的方法可以包括使核酸分子與該試劑接觸，若需要，連同另外的步驟來(lái)實(shí)現(xiàn)核苷酸序列的所需變化。核酸分子的核苷酸序列上的此類(lèi)變化可以產(chǎn)生其中每個(gè)甲基化核苷酸均被修飾為不同核苷酸的核酸分子。核酸核苷酸序列上的此類(lèi)變化可以產(chǎn)生其中每個(gè)未甲基化核苷酸均被修飾為不同核苷酸的核酸分子。核酸核苷酸序列上的此類(lèi)變化可以產(chǎn)生其中選定的每個(gè)未甲基化的核苷酸(例如，每個(gè)未甲基化的胞嘧啶)均被修飾為不同核苷酸的核酸分子。使用此類(lèi)試劑改變核酸核苷酸序列可以產(chǎn)生其中為甲基化核苷酸的每個(gè)核苷酸(例如，每個(gè)甲基化胞嘧啶)均被修飾為不同核苷酸的核酸分子。如本文中所用，使用修飾選定核苷酸的試劑是指修飾核酸分子中通常存在的四種核苷酸(對(duì)于DNA而言為C、G、T和A并且對(duì)于RNA而言為C、G、U和A)中的一種核苷酸的試劑，以致該試劑修飾所述一種核苷酸，而不修飾另外三種核苷酸。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，此類(lèi)試劑修飾未甲基化的選定核苷酸以產(chǎn)生不同核苷酸。在另一個(gè)示例性實(shí)施方案中，此類(lèi)試劑可以使未甲基化的胞嘧啶核苷酸脫氨基。示例性試劑為亞硫酸氫鹽。
如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“亞硫酸氫鹽試劑”是指在一些實(shí)施方案中包含亞硫酸氫鹽、二亞硫酸鹽、氫亞硫酸鹽或其組合用于區(qū)別例如CpG二核苷酸序列中的甲基化和未甲基化胞苷的試劑。
術(shù)語(yǔ)“甲基化測(cè)定法”是指用于確定核酸序列中一個(gè)或多個(gè)CpG二核苷酸序列的甲基化狀態(tài)的任何測(cè)定法。
術(shù)語(yǔ)“MS AP-PCR”(甲基化敏感性隨機(jī)引物聚合酶鏈反應(yīng))是指允許使用CG富集引物進(jìn)行基因組全局掃描以集中在最有可能含CpG二核苷酸的區(qū)域并且經(jīng)Gonzalgo等人(1997)Cancer Research 57：594-599描述的本領(lǐng)域公認(rèn)的技術(shù)。
術(shù)語(yǔ)“MethyLightTM”是指Eads等人(1999)Cancer Res.59：2302-2306描述的本領(lǐng)域公認(rèn)的基于熒光的實(shí)時(shí)PCR技術(shù)。
術(shù)語(yǔ)“HeavyMethylTM”是指其中覆蓋介于擴(kuò)增引物之間或被其覆蓋的CpG位置的甲基化特異性阻斷探針(本文也稱(chēng)為阻斷物)使得核酸樣品的甲基化特異性選擇性擴(kuò)增成為可能的測(cè)定法。
術(shù)語(yǔ)“HeavyMethylTM MethyLightTM”測(cè)定法是指HeavyMethylTM MethyLightTM測(cè)定法，這是MethyLightTM測(cè)定法的變型，其中將MethyLightTM測(cè)定法與覆蓋介于擴(kuò)增引物之間的CpG位置的甲基化特異性阻斷探針相結(jié)合。
術(shù)語(yǔ)“Ms-SNuPE”(甲基化敏感性單核苷酸引物延伸)是指Gonzalgo和Jones(1997)Nucleic Acids Res.25：2529-2531描述的本領(lǐng)域公認(rèn)的測(cè)定法。
術(shù)語(yǔ)“MSP”(甲基化特異性PCR)是指Herman等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：9821-9826和美國(guó)專(zhuān)利第5,786,146號(hào)描述的本領(lǐng)域公認(rèn)的甲基化測(cè)定法。
術(shù)語(yǔ)“COBRA”(聯(lián)合亞硫酸氫鹽限制分析)是指Xiong和Laird(1997)Nucleic Acids Res.25：2532-2534描述的本領(lǐng)域公認(rèn)的甲基化測(cè)定法。
術(shù)語(yǔ)“MCA”(甲基化CpG島擴(kuò)增)是指Toyota等人(1999)Cancer Res.59：2307-12和WO00/26401A1描述的甲基化測(cè)定法。
如本文中所用，“選定核苷酸”是指核酸分子中通常存在的四種核苷酸(對(duì)于DNA而言為C、G、T和A并且對(duì)于RNA而言為C、G、U和A)中的一種核苷酸，并且可以包括通常存在的核苷酸的甲基化衍生物(例如，當(dāng)C為選定核苷酸時(shí)，在選定核苷酸的含義上包括甲基化和未甲基化C兩者)，而甲基化選定核苷酸特指甲基化的通常存在的核苷酸并且未甲基化選定核苷酸特指未甲基化的通常存在的核苷酸。
術(shù)語(yǔ)“甲基化特異性限制酶”或“甲基化敏感性限制酶”是指根據(jù)其識(shí)別位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)選擇性消化核酸的酶。在如果識(shí)別位點(diǎn)未甲基化或半甲基化，則特異性切割的限制酶的情況下，如果識(shí)別位點(diǎn)甲基化，則不會(huì)發(fā)生切割或?qū)⒁燥@著降低的效率發(fā)生。在如果識(shí)別位點(diǎn)甲基化，則特異性切割的限制酶的情況下，如果識(shí)別位點(diǎn)未甲基化，則不會(huì)發(fā)生切割或?qū)⒁燥@著降低的效率發(fā)生。優(yōu)選甲基化特異性限制酶，其識(shí)別序列含有CG二核苷酸(舉例來(lái)說(shuō)諸如CGCG或CCCGGG的識(shí)別序列)。對(duì)于一些實(shí)施方案而言進(jìn)一步優(yōu)選如果這種二核苷酸中的胞嘧啶在碳原子C5處甲基化，則不切割的限制酶。
如本文中所用，“不同核苷酸”是指在化學(xué)性質(zhì)上不同于選定核苷酸的核苷酸，通常使得不同核苷酸具有不同于選定核苷酸的沃森-克里克(Watson-Crick)堿基配對(duì)性質(zhì)，由此與選定核苷酸互補(bǔ)的通常存在的核苷酸和與不同核苷酸互補(bǔ)的通常存在的核苷酸不相同。例如，當(dāng)C為選定核苷酸時(shí)，U或T可為不同核苷酸，這由C與G的互補(bǔ)性和U或T與A的互補(bǔ)性為例。如本文中所用，與選定核苷酸互補(bǔ)或與不同核苷酸互補(bǔ)的核苷酸是指在高度嚴(yán)格條件下，以比互補(bǔ)核苷酸與通常存在的四種核苷酸中的三種堿基配對(duì)更高的親和力，與選定核苷酸或不同核苷酸堿基配對(duì)的核苷酸?；パa(bǔ)的實(shí)例為DNA(例如，A-T和C-G)和RNA(例如，A-U和C-G)中的沃森-克里克堿基配對(duì)。因此，例如，在高度嚴(yán)格條件下，G與C堿基配對(duì)的親和力比G與G、A或T堿基配對(duì)更高并且，因此，當(dāng)C為選定核苷酸時(shí)，G是與選定核苷酸互補(bǔ)的核苷酸。
如本文中所用，指定標(biāo)志物的“敏感性”是指報(bào)告高于區(qū)別贅生物和非贅生物樣品的閾值的DNA甲基化值的樣品百分比。在一些實(shí)施方案中，陽(yáng)性定義為組織學(xué)確認(rèn)的報(bào)告高于閾值(例如，與疾病相關(guān)的范圍)的DNA甲基化值的贅生物形成，而假陰性定義為組織學(xué)確認(rèn)的報(bào)告低于閾值(例如，與無(wú)疾病相關(guān)的范圍)的DNA甲基化值的贅生物形成。因此，敏感性值反映得自已知患病樣品的指定標(biāo)志物的DNA甲基化測(cè)量將會(huì)在疾病相關(guān)測(cè)量范圍內(nèi)的可能性。如此處所定義，計(jì)算的敏感性值的臨床相關(guān)性表示對(duì)指定標(biāo)志物在應(yīng)用于具有臨床病狀的受試者時(shí)將檢測(cè)出該病狀存在的可能性的估計(jì)。
如本文中所用，指定標(biāo)志物的“特異性”是指報(bào)告低于區(qū)別贅生物和非贅生物樣品的閾值的DNA甲基化值的贅生物樣品的百分比。在一些實(shí)施方案中，陰性定義為組織學(xué)確認(rèn)的報(bào)告低于閾值(例如，與無(wú)疾病相關(guān)的范圍)的DNA甲基化值的非贅生物樣品，而假陽(yáng)性定義為組織學(xué)確認(rèn)的報(bào)告高于閾值(例如，與疾病相關(guān)的范圍)的DNA甲基化值的非贅生物樣品。因此，特異性值反映得自已知非贅生物樣品的指定標(biāo)志物的DNA甲基化測(cè)量將會(huì)在疾病相關(guān)測(cè)量范圍內(nèi)的可能性。如此處所定義，計(jì)算的特異性值的臨床相關(guān)性表示對(duì)指定標(biāo)志物在應(yīng)用于沒(méi)有臨床病狀的受試者時(shí)將檢測(cè)出該病狀不存在的可能性的估計(jì)。
如本文中所用的術(shù)語(yǔ)“AUC”是“曲線下面積”的縮寫(xiě)。具體而言是指接受者操作特征(ROC)曲線下的面積。ROC曲線是對(duì)于診斷試驗(yàn)的不同可能分割點(diǎn)的真陽(yáng)性率相對(duì)于假陽(yáng)性率的繪圖。其根據(jù)選定分割點(diǎn)示出了敏感性和特異性之間的平衡(任何敏感性上的增加都將伴隨特異性的降低)。ROC曲線下面積(AUC)是對(duì)診斷試驗(yàn)的度量(面積越大越好；最佳為1；隨機(jī)試驗(yàn)將具有位于對(duì)角線上的面積為0.5的ROC曲線；參考：J.P.Egan.(1975)Signal Detection Theory and ROC Analysis，Academic Press，New York)。
如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“贅生物”是指“生長(zhǎng)超過(guò)正常組織的生長(zhǎng)并且與之不協(xié)調(diào)的異常組織物質(zhì)”。參見(jiàn)例如，Willis RA，“The Spread of Tumors in the Human Body”，London，Butterworth&Co，1952。
如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“腺瘤”是指腺起源的良性腫瘤。雖然這些生長(zhǎng)是良性的，但隨時(shí)間推移它們可能進(jìn)展變成惡性的。
術(shù)語(yǔ)“癌前期”或“贅生物形成前”及其等效術(shù)語(yǔ)是指正在經(jīng)歷惡性轉(zhuǎn)化的任何細(xì)胞增生性病癥。
贅生物、腺瘤、癌癥等的“部位”是受試者身體中贅生物、腺瘤、癌癥等所在的組織、器官、細(xì)胞類(lèi)型、解剖區(qū)域、身體部分等。
如本文中所用，“診斷”試驗(yàn)應(yīng)用包括檢測(cè)或鑒定受試者的疾病狀態(tài)或情況，確定受試者會(huì)患上指定疾病或病狀的可能性，確定有疾病或病狀的受試者將對(duì)治療反應(yīng)的可能性，確定對(duì)有疾病或病狀的受試者的預(yù)后(或其可能進(jìn)展或消退)，及確定治療對(duì)有疾病或病狀的受試者的作用。例如，診斷可用于檢測(cè)受試者患上贅生物的存在性或可能性或此類(lèi)受試者將順利地對(duì)化合物(例如，藥品，例如藥物)或其它治療反應(yīng)的可能性。
術(shù)語(yǔ)“標(biāo)志物”，如本文中所用，是指能夠通過(guò)區(qū)別癌細(xì)胞與正常細(xì)胞，例如基于其甲基化狀態(tài)，診斷癌癥的物質(zhì)(例如，核酸或核酸的區(qū)域)。
術(shù)語(yǔ)“分離的”關(guān)于核酸使用時(shí)，如同在“分離的寡核苷酸”中，是指核酸序列經(jīng)鑒定并且和一般在其天然來(lái)源中與之締合的至少一種污染核酸分開(kāi)。分離的核酸呈不同于其在天然界中的形式或情形存在。相反，非分離的核酸，如DNA和RNA，呈其在天然界中存在的狀態(tài)被發(fā)現(xiàn)。非分離的核酸的實(shí)例包括：在宿主細(xì)胞染色體上相鄰基因的附近發(fā)現(xiàn)的指定DNA序列(例如，基因)；RNA序列，如編碼特定蛋白質(zhì)的特定mRNA序列，在細(xì)胞中作為與編碼大量蛋白質(zhì)的許多其它mRNA的混合物被發(fā)現(xiàn)。然而，編碼特定蛋白質(zhì)的分離的核酸包括，舉例而言，一般表達(dá)該蛋白質(zhì)的細(xì)胞中的此類(lèi)核酸，其中核酸處于和天然細(xì)胞不同的染色體位置，或另外側(cè)接與在天然界中所發(fā)現(xiàn)的不同的核酸序列。分離的核酸或寡核苷酸可以呈單鏈或雙鏈形式存在。要利用分離的核酸或寡核苷酸表達(dá)蛋白質(zhì)時(shí)，寡核苷酸將在最低限度上含有有義或編碼鏈(即，寡核苷酸可為單鏈)，但可含有義鏈和反義鏈兩者(即，寡核苷酸可為雙鏈)。分離的核酸在從其天然或典型環(huán)境中分離之后，可與其它核酸或分子組合。例如，分離的核酸可存在于宿主細(xì)胞中，核酸已經(jīng)位于其中，例如用于異源表達(dá)。
術(shù)語(yǔ)“純化的”是指分子，核酸或氨基酸序列是從其天然環(huán)境中取出的、分離的或分開(kāi)的。因此“分離的核酸序列”可以是純化的核酸序列?！盎旧霞兓摹狈肿又辽?0％不含，優(yōu)選至少75％不含且更優(yōu)選至少90％不含與之天然締合的其它組分。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“純化的”或“純化”還指從樣品中去除污染物。污染蛋白的去除導(dǎo)致樣品中目標(biāo)多肽或核酸的百分比增加。在另一個(gè)實(shí)例中，重組多肽在植物、細(xì)菌、酵母或哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中表達(dá)并且通過(guò)去除宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)來(lái)純化多肽；從而樣品中重組多肽的百分比增加。
術(shù)語(yǔ)包含指定多核苷酸序列或多肽的“組合物”廣義上是指含有指定多核苷酸序列或多肽的任何組合物。所述組合物可包含含有鹽(例如NaCl)、去垢劑(例如SDS)和其它組分(例如，Denhardt溶液、奶粉、鮭魚(yú)精DNA等)的水溶液。
術(shù)語(yǔ)“樣品”在其最廣義上使用。在某種意義上它可以指動(dòng)物細(xì)胞或組織。在另一種意義上，意在包括從任何來(lái)源獲得的樣本或培養(yǎng)物，以及生物和環(huán)境樣品。生物樣品可以從植物或動(dòng)物(包括人類(lèi))中獲得并且涵蓋液體、固體、組織和氣體。環(huán)境樣品包括環(huán)境材料如地表物質(zhì)、土壤、水和工業(yè)樣品。不得將這些實(shí)例解釋為對(duì)適用于本發(fā)明的樣品類(lèi)型的限制。
如本文中所用，“遠(yuǎn)程樣品”當(dāng)在一些情況下使用時(shí)涉及從不是樣品的細(xì)胞、組織或器官來(lái)源的部位間接采集的樣品。例如，在糞便樣品(例如，不是來(lái)自于直接取自結(jié)直腸組織的樣品)中評(píng)估源自結(jié)腸或直腸的樣品材料時(shí)，該樣品為遠(yuǎn)程樣品。
如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“患者”或“受試者”是指經(jīng)受通過(guò)所述技術(shù)提供的各種試驗(yàn)的生物體。術(shù)語(yǔ)“受試者”包括動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，包括人。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，受試者為靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物。在一個(gè)甚至更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，受試者為人。
如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“試劑盒”是指用于遞送材料的任何遞送系統(tǒng)。在反應(yīng)測(cè)定法的情況下，此類(lèi)遞送系統(tǒng)包括允許儲(chǔ)存、運(yùn)輸或遞送反應(yīng)試劑(例如，適當(dāng)容器中的寡核苷酸、酶等)和/或支撐材料(例如，緩沖液、進(jìn)行該測(cè)定法的書(shū)面說(shuō)明書(shū)等)從一個(gè)位置到另一位置的系統(tǒng)。例如，試劑盒包括一個(gè)或多個(gè)含有相關(guān)反應(yīng)試劑和/或支撐材料的外殼(例如，盒子)。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“分體試劑盒”是指包含兩個(gè)或更多個(gè)獨(dú)立容器的遞送系統(tǒng)，每個(gè)容器含有總試劑盒組分的子部分?？蓪⑷萜饕黄鸹騿为?dú)遞送給預(yù)定接收者。例如，第一容器可含有用于測(cè)定的酶，而第二容器含有寡核苷酸。術(shù)語(yǔ)“分體試劑盒”旨在涵蓋含有受聯(lián)邦食品、藥物和化妝品法案(Federal Food，Drug，and Cosmetic Act)第520(e)章監(jiān)管的分析物特定試劑(ASR)的試劑盒，但不限于此。事實(shí)上，在術(shù)語(yǔ)“分體試劑盒”中包括包含兩個(gè)或更多個(gè)獨(dú)立容器的任何遞送系統(tǒng)，每個(gè)容器含有總試劑盒組分的子部分。相反，“組合試劑盒”是指在單個(gè)容器中(例如，在封裝每種所需組分的單個(gè)盒子中)含有反應(yīng)測(cè)定的所有組分的遞送系統(tǒng)。術(shù)語(yǔ)“試劑盒”包括分體和組合試劑盒兩者。
技術(shù)實(shí)施方案
總的來(lái)說(shuō)，胃腸癌占有比任何其它器官系統(tǒng)更高的癌癥死亡率。結(jié)直腸癌(CRC)是第二最致命性的癌癥，國(guó)內(nèi)每年＞600,000人死亡。雖然在美國(guó)對(duì)結(jié)直腸癌進(jìn)行篩查，但是考慮到結(jié)腸鏡檢查的成本、不適和侵入性及當(dāng)前非侵入性糞便血液試驗(yàn)項(xiàng)目的性能低下，遵從性很差。為了減輕CRC對(duì)個(gè)體和社會(huì)的負(fù)擔(dān)，需要既有效且患者友好的新試驗(yàn)策略。利用廣泛的信息生物標(biāo)志物的非侵入性、精確分子試驗(yàn)可提供合理的方法?；诩S便的測(cè)定法就是一個(gè)這樣的實(shí)例。結(jié)直腸癌和前期癌使細(xì)胞和DNA進(jìn)入消化流中并且最終在糞便中排出。高度靈敏的測(cè)定法已用于檢測(cè)患有CRC癌癥和癌前息肉的患者糞便中的遺傳和表觀遺傳標(biāo)志物兩者。在最近的多中心研究中，將這些標(biāo)志物并入糞便測(cè)定法中，糞便測(cè)定法對(duì)CRC表現(xiàn)出與結(jié)腸鏡檢查基本上等同的靈敏度。新標(biāo)志物如果經(jīng)證實(shí)比現(xiàn)有標(biāo)志物更靈敏、更具特異性或更能預(yù)測(cè)病變部位，則其價(jià)值將增加。此外，當(dāng)適用于篩查應(yīng)用時(shí)除CRC外，標(biāo)志物將理想地檢測(cè)出關(guān)鍵的癌前病變-腺瘤性息肉和鋸齒狀息肉。
結(jié)直腸癌根本的基因組基質(zhì)牽涉基因和染色體異常，包括單堿基突變、異倍性、缺失、易位、拷貝數(shù)改變和表達(dá)變化。所有這些事件正使用更新的基因組技術(shù)，包括大規(guī)模平行測(cè)序進(jìn)行深入研究。然而，證明遺傳改變是非常不均勻的，并且在一些方面是隨機(jī)的，而不是復(fù)發(fā)性的。例如，APC基因是CRC病變中突變最多的基因(～90％)，但是突變位點(diǎn)遍布15個(gè)編碼外顯子，使全基因分析成為必要。這增加了開(kāi)發(fā)具有所需性能水平的測(cè)定法的復(fù)雜性。
DNA在胞嘧啶-磷酸-鳥(niǎo)嘌呤(CpG)島位點(diǎn)通過(guò)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的表觀遺傳甲基化已經(jīng)作為大多數(shù)腫瘤類(lèi)型的組織中一類(lèi)潛在的生物標(biāo)志物進(jìn)行研究。在生物學(xué)上有吸引力的機(jī)制中，認(rèn)為腫瘤抑制基因的啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)的獲得甲基化事件會(huì)使表達(dá)沉默，從而有助于腫瘤發(fā)生。DNA甲基化可能是比RNA或蛋白質(zhì)表達(dá)在化學(xué)和生物學(xué)上更穩(wěn)定的診斷工具。此外，異常甲基化標(biāo)志物比單獨(dú)的DNA突變具有更廣泛的信息并且更靈敏并且提供了優(yōu)良特異性。
臨床應(yīng)用有高度判別力的標(biāo)志物可具有很大影響。例如，對(duì)遠(yuǎn)側(cè)介質(zhì)如糞便或血液中的此類(lèi)標(biāo)志物的測(cè)定可用于精確篩查或診斷測(cè)定中以檢測(cè)結(jié)直腸贅生物形成。
在開(kāi)發(fā)本發(fā)明的實(shí)施方案的過(guò)程中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，在病例對(duì)照研究中通過(guò)比較來(lái)自于有結(jié)直腸贅生物形成、腺瘤和/或無(wú)蒂鋸齒狀息肉(SSP)的受試者的結(jié)直腸組織的DNA標(biāo)志物的甲基化狀態(tài)與來(lái)自于對(duì)照受試者(例如，正常組織如正常結(jié)腸)的相同DNA標(biāo)志物的甲基化狀態(tài)來(lái)鑒定標(biāo)志物(參見(jiàn)，實(shí)施例3、表1A和B)。
在開(kāi)發(fā)本發(fā)明的實(shí)施方案的過(guò)程中進(jìn)行的另外的實(shí)驗(yàn)證明NDRG4、BMP3、OPLAH、FLI1、PDGFD、CHST_7889、SFMBT2_895、SFMBT2_896、SFMBT2_897、CHST2_7890、VAV3和DTX1為用于檢測(cè)糞便樣品中的結(jié)直腸癌的有效標(biāo)志物(參見(jiàn)，實(shí)施例1及表1A和B)。
因此，本文提供了結(jié)直腸癌篩查標(biāo)志物的技術(shù)，在從取自受試者的樣品(例如，糞便樣品、結(jié)直腸組織樣品)中檢測(cè)時(shí)，所述標(biāo)志物提供高信噪比和低本底水平。在病例對(duì)照研究中通過(guò)比較來(lái)自于有結(jié)直腸贅生物形成和/或腺瘤的受試者的結(jié)直腸組織的DNA標(biāo)志物的甲基化狀態(tài)與來(lái)自于對(duì)照受試者(例如，正常組織如正常結(jié)腸)的相同DNA標(biāo)志物的甲基化狀態(tài)來(lái)鑒定標(biāo)志物(參見(jiàn)，實(shí)施例1及表1A和B)。
雖然本文的公開(kāi)提到某些說(shuō)明的實(shí)施方案，但應(yīng)理解這些實(shí)施方案是以舉例的方式而不是以限制的方式提出。
在特定方面中，本技術(shù)提供了用于鑒定、確定結(jié)直腸癌和/或?yàn)榻Y(jié)直腸癌分類(lèi)的組合物和方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括確定分離自受試者的生物樣品(例如，糞便樣品或結(jié)直腸組織樣品)中至少一種甲基化標(biāo)志物的甲基化狀況，其中所述標(biāo)志物的甲基化狀態(tài)變化表明結(jié)直腸癌的存在、類(lèi)別或部位。特定實(shí)施方案涉及包含差異性甲基化區(qū)域(DMR，例如表1A和B中提供的DMR)的標(biāo)志物，其用于診斷或篩查新生細(xì)胞增生性疾病(例如，結(jié)直腸癌)，包括在疾病的癌前期階段早期檢測(cè)。此外，所述標(biāo)志物用于區(qū)分新生與良性細(xì)胞增生性疾病。在特定方面中，本技術(shù)提供了一種方法，其中將新生細(xì)胞增生性疾病與良性細(xì)胞增生性疾病區(qū)分開(kāi)。
本技術(shù)的標(biāo)志物在檢測(cè)和區(qū)分結(jié)直腸增生性疾病中特別有效，從而提供了結(jié)直腸癌早期檢測(cè)、分類(lèi)和治療的改進(jìn)手段。
除其中分析本文提供的至少一個(gè)標(biāo)志物、標(biāo)志物的區(qū)域或包含DMR(例如表1A和B中提供的DMR)的標(biāo)志物的堿基的甲基化分析的實(shí)施方案外，所述技術(shù)還提供了多組對(duì)結(jié)直腸癌檢測(cè)有實(shí)用性的標(biāo)志物，其包含至少一個(gè)標(biāo)志物、標(biāo)志物的區(qū)域或包含DMR的標(biāo)志物的堿基。除其中分析本文提供的至少一個(gè)標(biāo)志物、標(biāo)志物的區(qū)域或包含DMR(例如表1A和B中提供的DMR)的標(biāo)志物的堿基的甲基化分析的實(shí)施方案外，所述技術(shù)還提供了多組對(duì)結(jié)直腸癌檢測(cè)(例如，表達(dá)標(biāo)志物、DNA的量、肽、血紅蛋白等)有實(shí)用性的標(biāo)志物，其包含任何類(lèi)型或類(lèi)別的標(biāo)志物(例如，完整標(biāo)志物、標(biāo)志物的區(qū)域、標(biāo)志物的堿基等)。
所述技術(shù)的一些實(shí)施方案基于對(duì)至少一個(gè)標(biāo)志物、標(biāo)志物的區(qū)域或包含DMR的標(biāo)志物的堿基的CpG甲基化狀況的分析。
在一些實(shí)施方案中，本技術(shù)提供亞硫酸氫鹽技術(shù)連同一種或多種甲基化測(cè)定法用于確定包含DMR(例如表1A和B中提供的DMR)的至少一個(gè)標(biāo)志物中CpG二核苷酸的甲基化狀況的用途?；蚪MCpG二核苷酸可甲基化或未甲基化(可選地分別稱(chēng)為高和低甲基化)。然而，在遠(yuǎn)程樣品(例如，血液、器官排放物或糞便)的背景下，本發(fā)明的方法適于分析異源性的生物樣品，例如低濃度的腫瘤細(xì)胞，或來(lái)自其中的生物材料。因此，當(dāng)分析此類(lèi)樣品內(nèi)的CpG位置的甲基化狀況時(shí)，可以使用定量測(cè)定法確定在特定CpG位置的甲基化水平(例如，百分比、分散、比率、比例或程度)。
對(duì)包含DMR的標(biāo)志物中CpG二核苷酸序列的甲基化狀況的確定在結(jié)直腸癌的診斷和表征中具有實(shí)用性。
標(biāo)志物的組合
在一些實(shí)施方案中，所述技術(shù)涉及評(píng)估包含來(lái)自表1A和B的DMR的標(biāo)志物(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10個(gè))的組合或包含DMR的標(biāo)志物的甲基化狀態(tài)。在一些實(shí)施方案中，評(píng)估一個(gè)以上標(biāo)志物的甲基化狀態(tài)增加了篩查或診斷以鑒定受試者中的結(jié)直腸贅生物的特異性和/或敏感性。除其中分析本文提供的至少一個(gè)標(biāo)志物、標(biāo)志物的區(qū)域或包含DMR(例如表1A和B中提供的DMR)的標(biāo)志物的堿基的甲基化分析的實(shí)施方案外，所述技術(shù)還提供了多組對(duì)結(jié)直腸癌檢測(cè)(例如，表達(dá)標(biāo)志物、DNA的量、肽、血紅蛋白等)有實(shí)用性的標(biāo)志物，其包含任何類(lèi)型或類(lèi)別的標(biāo)志物(例如，完整標(biāo)志物、標(biāo)志物的區(qū)域、標(biāo)志物的堿基等)。
通過(guò)各種標(biāo)志物的組合預(yù)測(cè)各種癌癥，例如，如同通過(guò)與預(yù)測(cè)特異性和靈敏度有關(guān)的統(tǒng)計(jì)技術(shù)鑒定那樣。所述技術(shù)提供了鑒定一些癌癥的預(yù)測(cè)性組合和經(jīng)驗(yàn)證的預(yù)測(cè)性組合的方法。
測(cè)定甲基化狀態(tài)的方法
分析核酸中5-甲基胞嘧啶的存在的方法基于Frommer等人描述的用于檢測(cè)DNA或其各種變型中的5-甲基胞嘧啶的亞硫酸氫鹽方法(Frommer等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：1827-31)。為5-甲基胞嘧啶繪圖的亞硫酸氫鹽方法基于以下觀測(cè)結(jié)果，胞嘧啶，而非5-甲基胞嘧啶與氫亞硫酸根離子(也稱(chēng)為亞硫酸氫鹽)反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)根據(jù)以下步驟進(jìn)行：首先，胞嘧啶與氫亞硫酸鹽反應(yīng)形成磺化胞嘧啶。接著，磺化反應(yīng)中間產(chǎn)物自發(fā)脫氨產(chǎn)生磺化尿嘧啶。最后，磺化尿嘧啶在堿性條件下去磺化形成尿嘧啶。因?yàn)槟蜞奏づc腺嘌呤形成堿基對(duì)(因此表現(xiàn)類(lèi)似胸腺嘧啶)，而5-甲基胞嘧啶與鳥(niǎo)嘌呤形成堿基對(duì)(因此表現(xiàn)類(lèi)似胞嘧啶)，所以檢測(cè)是可能的。這使得判別甲基化胞嘧啶與非甲基化胞嘧啶成為可能，例如通過(guò)亞硫酸氫鹽基因組測(cè)序(Grigg G和Clark S，Bioessays(1994)16：431-36；Grigg G，DNA Seq.(1996)6：189-98)或例如美國(guó)專(zhuān)利第5,786,146號(hào)中公開(kāi)的甲基化特異性PCR(MSP)。
一些常規(guī)技術(shù)與包括將待分析的DNA封入瓊脂糖基質(zhì)中，從而防止DNA擴(kuò)散和復(fù)性(亞硫酸氫鹽僅與單鏈DNA反應(yīng))，并且用快速透析代替沉淀和純化步驟(Olek A等人(1996)“A modified and improved method for bisulfite based cytosine methylation analysis”Nucleic Acids Res.24：5064-6)的方法有關(guān)。因此可能分析單個(gè)細(xì)胞的甲基化狀況，說(shuō)明了所述方法的實(shí)用性和敏感性。Rein，T.等人(1998)Nucleic Acids Res.26：2255提供了對(duì)檢測(cè)5-甲基胞嘧啶的傳統(tǒng)方法的綜述。
亞硫酸氫鹽技術(shù)通常牽涉繼亞硫酸氫鹽處理之后擴(kuò)增已知核酸的短特定片段，然后通過(guò)測(cè)序來(lái)測(cè)定產(chǎn)物(Olek和Walter(1997)Nat.Genet.17：275-6)或進(jìn)行引物延伸反應(yīng)(Gonzalgo和Jones(1997)Nucleic Acids Res.25：2529-31；WO 95/00669；美國(guó)專(zhuān)利第6,251,594號(hào))以分析單個(gè)胞嘧啶位置。一些方法使用酶消化法(Xiong和Laird(1997)Nucleic Acids Res.25：2532-4)。在本領(lǐng)域中還已描述了通過(guò)雜交檢測(cè)(Olek等人，WO 99/28498)。另外，已描述了亞硫酸氫鹽技術(shù)對(duì)于單個(gè)基因的甲基化檢測(cè)的用途(Grigg和Clark(1994)Bioessays 16：431-6；Zeschnigk等人(1997)Hum Mol Genet.6：387-95；Feil等人(1994)Nucleic Acids Res.22：695；Martin等人(1995)Gene 157：261-4；WO 9746705；WO 9515373)。
各種甲基化測(cè)定程序是本領(lǐng)域已知的并且根據(jù)本技術(shù)可連同亞硫酸氫鹽處理一起使用。這些測(cè)定法允許確定核酸序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)CpG二核苷酸(例如，CpG島)的甲基化狀態(tài)。除其它技術(shù)以外，此類(lèi)測(cè)定法牽涉經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的核酸的測(cè)序，PCR(對(duì)于序列特異性擴(kuò)增而言)、Southern印跡分析和使用甲基化敏感性限制酶。
例如，已經(jīng)通過(guò)使用亞硫酸氫鹽處理簡(jiǎn)化基因組測(cè)序用于分析甲基化模式和5-甲基胞嘧啶分布(Frommer等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：1827-1831)。另外，限制酶消化由亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的DNA擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物可用于評(píng)估甲基化狀態(tài)，例如如Sadri和Hornsby(1997)Nucl.Acids Res.24：5058-5059所述或如稱(chēng)為COBRA(聯(lián)合亞硫酸氫鹽限制分析)的方法中所體現(xiàn)那樣(Xiong和Laird(1997)Nucleic Acids Res.25：2532-2534)。
COBRATM分析是用于確定少量基因組DNA中特定基因座處的DNA甲基化水平的定量甲基化測(cè)定法(Xiong和Laird，Nucleic Acids Res.25：2532-2534，1997)。簡(jiǎn)言之，使用限制酶消化揭示經(jīng)亞硫酸氫鈉處理的DNA的PCR產(chǎn)物中的甲基化依賴(lài)性序列差異。首先根據(jù)Frommer等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：1827-1831，1992)描述的程序通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的亞硫酸氫鹽處理向基因組DNA中引入甲基化依賴(lài)性序列差異。然后使用對(duì)目標(biāo)CpG島有特異性的引物進(jìn)行經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的DNA的PCR擴(kuò)增，接著進(jìn)行限制性核酸內(nèi)切酶消化、凝膠電泳并使用特異性標(biāo)記雜交探針檢測(cè)。原DNA樣品中的甲基化水平用在廣泛的DNA甲基化水平范圍呈線性定量方式，消化和未消化PCR產(chǎn)物的相對(duì)量表示。另外，這種技術(shù)可容易地適用于從顯微切割的石蠟包埋組織樣品獲得的DNA。
用于COBRATM分析的典型試劑(例如，可能在基于COBRATM的典型試劑盒中找到)可包括但不限于：特定基因座(例如，特定基因、標(biāo)志物、DMR、基因區(qū)域、標(biāo)志物區(qū)域、經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的DNA序列、CpG島等)的PCR引物；限制酶和適當(dāng)緩沖液；基因雜交寡核苷酸；對(duì)照雜交寡核苷酸；寡核苷酸探針的激酶標(biāo)記試劑盒；和經(jīng)標(biāo)記的核苷酸。另外，亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化試劑可包括：DNA變性緩沖液、磺化緩沖液、DNA回收試劑或試劑盒(例如，沉淀、超濾、親和柱)、去磺化緩沖液和DNA回收組分。
優(yōu)選地，測(cè)定法如“MethyLightTM”(一種基于熒光的實(shí)時(shí)PCR技術(shù))(Eads等人，Cancer Res.59：2302-2306，1999)、Ms-SNuPETM(甲基化敏感性單核苷酸引物延伸)反應(yīng)(Gonzalgo和Jones，Nucleic Acids Res.25：2529-2531，1997)、甲基化特異性PCR(“MSP”；Herman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：9821-9826，1996；美國(guó)專(zhuān)利第5,786,146號(hào))和甲基化CpG島擴(kuò)增(“MCA”；Toyota等人，Cancer Res.59：2307-12，1999)單獨(dú)或結(jié)合這些方法中的一種或多種使用。
“HeavyMethylTM”測(cè)定技術(shù)是基于經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的DNA的甲基化特異性擴(kuò)增，評(píng)估甲基化差異的定量方法。覆蓋介于擴(kuò)增引物之間或被其覆蓋的CpG位置的甲基化特異性阻斷探針(“阻斷物”)使得核酸樣品的甲基化特異性選擇性擴(kuò)增成為可能。
術(shù)語(yǔ)“HeavyMethylTM MethyLightTM”測(cè)定法是指HeavyMethylTM MethyLightTM測(cè)定法，這是MethyLightTM測(cè)定法的變型，其中將MethyLightTM測(cè)定法與覆蓋介于擴(kuò)增引物之間的CpG位置的甲基化特異性阻斷探針相結(jié)合。HeavyMethylTM測(cè)定法也可結(jié)合甲基化特異性擴(kuò)增引物使用。
用于HeavyMethylTM分析的典型試劑(例如，可能在基于MethyLightTM的典型試劑盒中找到)可包括但不限于：特定基因座(例如，特定基因、標(biāo)志物、DMR、基因區(qū)域、標(biāo)志物區(qū)域、經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的DNA序列、CpG島或經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的DNA序列或CpG島等)的PCR引物；阻斷寡核苷酸；優(yōu)化PCR緩沖液和脫氧核苷酸；及Taq聚合酶。
MSP(甲基化特異性PCR)允許評(píng)估CpG島內(nèi)幾乎任一組CpG位點(diǎn)的甲基化狀況，不依賴(lài)于使用甲基化敏感性限制酶(Herman等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：9821-9826，1996；美國(guó)專(zhuān)利第5,786,146號(hào))。簡(jiǎn)言之，DNA經(jīng)亞硫酸氫鈉修飾，亞硫酸氫鈉將未甲基化而非甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，并且隨后用相對(duì)于未甲基化DNA而言對(duì)甲基化DNA有特異性的引物擴(kuò)增產(chǎn)物。MSP僅需要少量的DNA，對(duì)指定CpG島基因座的0.1％甲基化等位基因靈敏，并且可以對(duì)從石蠟包埋樣品提取的DNA進(jìn)行。用于MSP分析的典型試劑(例如，可能在基于MSP的典型試劑盒中找到)可包括但不限于：特定基因座(例如，特定基因、標(biāo)志物、DMR、基因區(qū)域、標(biāo)志物區(qū)域、經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的DNA序列、CpG島等)的甲基化和未甲基化PCR引物；優(yōu)化PCR緩沖液和脫氧核苷酸；及特異性探針。
MethyLightTM測(cè)定法是一種高通量定量甲基化測(cè)定法，其利用基于熒光的實(shí)時(shí)PCR(例如，)，在PCR步驟之后不需要進(jìn)一步操縱(Eads等人，Cancer Res.59：2302-2306，1999)。簡(jiǎn)言之，MethyLightTM方法以基因組DNA混合樣品開(kāi)始，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序在亞硫酸氫鈉反應(yīng)中所述混合樣品轉(zhuǎn)化為甲基化依賴(lài)性序列差異的混合物(亞硫酸氫鹽方法將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶)。然后在“偏向”反應(yīng)中，例如用重疊已知CpG二核苷酸的PCR引物進(jìn)行基于熒光的PCR。在擴(kuò)增過(guò)程的水平上和在熒光檢測(cè)過(guò)程的水平上進(jìn)行序列判別。
MethyLightTM測(cè)定法用作核酸，例如基因組DNA樣品中甲基化模式的定量試驗(yàn)，其中在探針雜交的水平上進(jìn)行序列判別。在定量形式中，在重疊特定假定甲基化位點(diǎn)的熒光探針的存在下PCR反應(yīng)提供甲基化特異性擴(kuò)增。通過(guò)引物和探針都不在任何CpG二核苷酸上的反應(yīng)提供輸入DNA的量的無(wú)偏對(duì)照。可選地，基因組甲基化的定量試驗(yàn)通過(guò)探測(cè)具有未覆蓋已知甲基化位點(diǎn)的對(duì)照寡核苷酸(例如，HeavyMethylTM和MSP技術(shù)基于熒光的形式)或具有覆蓋潛在甲基化位點(diǎn)的寡核苷酸的偏向PCR混合物實(shí)現(xiàn)。
MethyLightTM方法連同任何合適的探針(例如，探針、探針等)使用。例如，在一些應(yīng)用中雙鏈基因組DNA經(jīng)亞硫酸氫鈉處理并且使用探針(例如)和MSP引物和/或HeavyMethyl阻斷物寡核苷酸和探針進(jìn)行兩組PCR反應(yīng)之一。探針經(jīng)熒光“報(bào)告物”和“猝滅劑”分子雙重標(biāo)記并且設(shè)計(jì)為對(duì)GC含量相對(duì)高的區(qū)域有特異性，使其在PCR循環(huán)中在比正向和反向引物高約10℃的溫度下解鏈。這允許探針在PCR退火/延伸步驟期間保持完全雜交。當(dāng)Taq聚合酶在PCR期間酶促合成新鏈時(shí)，將最終到達(dá)退火的探針。然后Taq聚合酶5′至3′內(nèi)切核酸酶活性將通過(guò)使其消化而置換探針以釋放熒光報(bào)告物分子以使用實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)系統(tǒng)定量檢測(cè)此刻其未猝滅的信號(hào)。
用于MethyLightTM分析的典型試劑(例如，可能在基于MethyLightTM的典型試劑盒中找到)可包括但不限于：特定基因座(例如，特定基因、標(biāo)志物、DMR、基因區(qū)域、標(biāo)志物區(qū)域、經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的DNA序列、CpG島等)的PCR引物；或探針；優(yōu)化PCR緩沖液和脫氧核苷酸；及Taq聚合酶。
QMTM(定量甲基化)測(cè)定法是基因組DNA樣品中甲基化模式的一種備選定量試驗(yàn)，其中在探針雜交的水平上進(jìn)行序列判別。在這種定量形式中，在重疊特定假定甲基化位點(diǎn)的熒光探針的存在下PCR反應(yīng)提供無(wú)偏擴(kuò)增。通過(guò)引物和探針都不在任何CpG二核苷酸上的反應(yīng)提供輸入DNA的量的無(wú)偏對(duì)照。可選地，基因組甲基化的定量試驗(yàn)通過(guò)探測(cè)具有未覆蓋已知甲基化位點(diǎn)的對(duì)照寡核苷酸(HeavyMethylTM和MSP技術(shù)基于熒光的形式)或具有覆蓋潛在甲基化位點(diǎn)的寡核苷酸的偏向PCR混合物實(shí)現(xiàn)。
QMTM方法可在擴(kuò)增過(guò)程中連同任何合適的探針，例如探針、探針使用。例如，雙鏈基因組DNA經(jīng)亞硫酸氫鈉處理并且經(jīng)受無(wú)偏引物和探針。探針經(jīng)熒光“報(bào)告物”和“猝滅劑”分子雙重標(biāo)記，并且設(shè)計(jì)為對(duì)GC含量相對(duì)高的區(qū)域有特異性，使其在PCR循環(huán)中在比正向和反向引物高約10℃的溫度下解鏈。這允許探針在PCR退火/延伸步驟期間保持完全雜交。當(dāng)Taq聚合酶在PCR期間酶促合成新鏈時(shí)，將最終到達(dá)退火的探針。然后Taq聚合酶5′至3′內(nèi)切核酸酶活性將通過(guò)使其消化而置換探針以釋放熒光報(bào)告物分子以使用實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)系統(tǒng)定量檢測(cè)此刻其未猝滅的信號(hào)。用于QMTM分析的典型試劑(例如，可能在基于QMTM的典型試劑盒中找到)可包括但不限于：特定基因座(例如，特定基因、標(biāo)志物、DMR、基因區(qū)域、標(biāo)志物區(qū)域、經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的DNA序列、CpG島等)的PCR引物；或探針；優(yōu)化PCR緩沖液和脫氧核苷酸；及Taq聚合酶。
Ms-SNuPETM技術(shù)是一種用于評(píng)估特定CpG位點(diǎn)的甲基化差異的定量方法，其基于對(duì)DNA的亞硫酸氫鹽處理，接著是單核苷酸引物延伸(Gonzalgo&Jones，Nucleic Acids Res.25：2529-2531，1997)。簡(jiǎn)言之，基因組DNA與亞硫酸氫鈉反應(yīng)以將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，同時(shí)讓5-甲基胞嘧啶不變。然后使用對(duì)經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的DNA有特異性的PCR引物進(jìn)行所需靶序列的擴(kuò)增，并且分離所得產(chǎn)物并用作目標(biāo)CpG位點(diǎn)甲基化分析的模板。可分析少量DNA(例如，顯微切割病理切片)并且避免利用限制酶用于確定CpG位點(diǎn)的甲基化狀況。
用于Ms-SNuPETM分析的典型試劑(例如，可能在基于Ms-SNuPETM的典型試劑盒中找到)可包括但不限于：特定基因座(例如，特定基因、標(biāo)志物、DMR、基因區(qū)域、標(biāo)志物區(qū)域、經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的DNA序列、CpG島等)的PCR引物；優(yōu)化PCR緩沖液和脫氧核苷酸；凝膠提取試劑盒；陽(yáng)性對(duì)照引物；特定基因座的Ms-SNuPETM引物；反應(yīng)緩沖液(對(duì)于Ms-SNuPE反應(yīng)而言)；和經(jīng)標(biāo)記的核苷酸。另外，亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化試劑可包括：DNA變性緩沖液、磺化緩沖液、DNA回收試劑或試劑盒(例如，沉淀、超濾、親和柱)、去磺化緩沖液和DNA回收組分。
簡(jiǎn)化代表性亞硫酸氫鹽測(cè)序(RRBS)從亞硫酸氫鹽處理核酸開(kāi)始以將所有未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，接著進(jìn)行限制酶消化(例如，用識(shí)別包括CG序列的位點(diǎn)的酶如MspI)并且在與適體配體偶合后進(jìn)行片段的完全測(cè)序。限制酶的選擇使片段富含CpG密集區(qū)，減少了分析期間可以繪圖到多個(gè)基因位置的冗余序列的數(shù)量。這樣，RRBS通過(guò)選擇用于測(cè)序的限制片段的子集(例如，使用制備凝膠電泳通過(guò)尺寸選擇)而降低了核酸樣品的復(fù)雜性。與全基因組亞硫酸氫鹽測(cè)序相反，通過(guò)限制酶消化產(chǎn)生的每個(gè)片段均含有至少一個(gè)CpG二核苷酸的DNA甲基化信息。這樣，RRBS使樣品富含啟動(dòng)子、CpG島和其它基因組特征，這些區(qū)域中限制酶切割位點(diǎn)的頻率較高，并且因此提供了評(píng)估一個(gè)或多個(gè)基因組基因座的甲基化狀態(tài)的測(cè)定法。
RRBS的典型方案包括用限制酶如MspI消化核酸樣品，補(bǔ)平突出端和A-尾部，連接適體，亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化和PCR的步驟。參見(jiàn)例如，等人(2005)Nat Methods 7：133-6；Meissner等人(2005)Nucleic Acids Res.33：5868-77。
在一些實(shí)施方案中，使用定量等位基因特異性實(shí)時(shí)靶標(biāo)和信號(hào)擴(kuò)增(QuARTS)測(cè)定法估計(jì)甲基化狀態(tài)。在每種QuARTS測(cè)定法中這些反應(yīng)按序發(fā)生，包括主反應(yīng)中的擴(kuò)增(反應(yīng)1)和靶探針裂解(反應(yīng)2)；和副反應(yīng)中的FRET裂解和熒光信號(hào)產(chǎn)生(反應(yīng)3)。用特異性引物擴(kuò)增靶核酸時(shí)，具有翼序列的特異性檢測(cè)探針與擴(kuò)增子松散結(jié)合。靶結(jié)合位點(diǎn)處特異性侵入性寡核苷酸的存在使裂解酶通過(guò)在檢測(cè)探針和翼序列之間切割而釋放翼序列。翼序列與相應(yīng)FRET盒的非發(fā)夾部分互補(bǔ)。因此，翼序列在FRET盒上起到侵入性寡核苷酸的作用并且影響FRET盒熒光團(tuán)和猝滅劑之間的裂解，這樣產(chǎn)生熒光信號(hào)。裂解反應(yīng)可以切割每個(gè)靶標(biāo)的多個(gè)探針并且因此釋放每個(gè)翼的多個(gè)熒光團(tuán)，提供指數(shù)信號(hào)擴(kuò)增。QuARTS可以通過(guò)使用具有不同染料的FRET盒在單一反應(yīng)中很好地檢測(cè)多個(gè)靶標(biāo)。參見(jiàn)例如，在Zou等人(2010)“Sensitive quantification of methylated markers with a novel methylation specific technology”Clin Chem 56：A199；美國(guó)專(zhuān)利第8,361,720號(hào)和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)13/594,674、12/946,745和12/946,752號(hào)中。
在一些實(shí)施方案中，通過(guò)例如直接基因捕獲，從樣品中分離靶核酸。例如，在一些實(shí)施方案中，通過(guò)以下從樣品中分離靶核酸，例如去除測(cè)定抑制劑以產(chǎn)生澄清樣品(例如，用PVP、PVPP和/或使用旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器)，用捕獲試劑從澄清樣品捕獲靶核酸(若存在)以形成捕獲復(fù)合物，從澄清樣品中分離捕獲復(fù)合物，從核酸溶液中的捕獲復(fù)合物回收靶核酸(若存在)，并且任選地重復(fù)以分離不同靶標(biāo)(參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)14/145,082、14/145,087、14/145,070、14/145,056、13/470,251、13/470,018、13/469,999和13/469,989)。
在一些實(shí)施方案中，使用根據(jù)本發(fā)明的引物寡核苷酸集合(例如，參見(jiàn)表1A和B)和擴(kuò)增酶擴(kuò)增經(jīng)處理DNA的片段。幾個(gè)DNA片段的擴(kuò)增可以在同一個(gè)反應(yīng)釜中同時(shí)進(jìn)行。通常，使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增子通常長(zhǎng)度為100至2000個(gè)堿基對(duì)。
在所述方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，可通過(guò)使用甲基化特異性引物寡核苷酸檢測(cè)包含DMR(例如，表1A和B中提供的DMR)內(nèi)或附近的CpG位置的甲基化狀況。這種技術(shù)(MSP)在Herman的美國(guó)專(zhuān)利第6,265,171號(hào)中有描述。使用甲基化狀況特異性引物擴(kuò)增經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的DNA允許區(qū)分甲基化和未甲基化核酸。MSP引物對(duì)含有至少一個(gè)與經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的CpG二核苷酸雜交的引物。因此，所述引物的序列包含至少一個(gè)CpG二核苷酸。對(duì)非甲基化DNA有特異性的MSP引物在CpG的C位置處含有“T”。
通過(guò)擴(kuò)增的方式獲得的片段可以攜帶直接或間接可檢測(cè)標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)記為熒光標(biāo)記、放射性核素或具有可以在質(zhì)譜儀中檢測(cè)的典型質(zhì)量的可檢測(cè)分子片段。所述標(biāo)記為質(zhì)量標(biāo)記時(shí)，一些實(shí)施方案提供經(jīng)標(biāo)記擴(kuò)增子具有單個(gè)正或負(fù)凈電荷，在質(zhì)譜儀中允許更佳的可檢測(cè)性?？赏ㄟ^(guò)例如基質(zhì)輔助激光解吸/電離質(zhì)譜法(MALDI)的方式或使用電噴霧質(zhì)譜法(ESI)進(jìn)行檢測(cè)并且可視化。
在一些實(shí)施方案中，分離DNA的方法包括如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)13/470,251(“Isolation of Nucleic Acids”)中所述的核酸的分離。
方法
在所述技術(shù)的一些實(shí)施方案中，提供了包括以下步驟的方法：
1)使得自受試者的核酸(例如，基因組DNA，例如分離自體液如糞便樣品或結(jié)直腸組織)與區(qū)別至少一個(gè)標(biāo)志物DMR(例如，表1A和B中提供的DMR)內(nèi)的甲基化和非甲基化CpG二核苷酸的至少一種試劑或一系列試劑接觸，并且
2)檢測(cè)結(jié)直腸贅生物或增生性疾病(例如，結(jié)直腸癌、大腺瘤、SSP)(例如，提供高于或等于80％的敏感性和高于或等于80％的特異性)。
在所述技術(shù)的一些實(shí)施方案中，提供了包括以下步驟的方法：
1)使得自受試者的核酸(例如，基因組DNA，例如分離自體液如糞便樣品或結(jié)直腸組織)與區(qū)別至少一個(gè)標(biāo)志物內(nèi)的甲基化和非甲基化CpG二核苷酸的至少一種試劑或一系列試劑接觸，所述標(biāo)志物選自具有選自以下標(biāo)注的染色體區(qū)域：NDRG4、BMP3、OPLAH、FLI1、PDGFD、SFMBT2(例如，SFMBT2_895、SFMBT2_896、SFMBT2_897)、CHST2(例如，CHST2_7889和CHST2_7890)、VAV3和DTX1，并且
2)檢測(cè)結(jié)直腸癌(例如，提供高于或等于80％的敏感性和高于或等于80％的特異性)。
優(yōu)選地，敏感性為約70％至約100％，或約80％至約90％，或約80％至約85％。在一些實(shí)施方案中，特異性為約70％至約100％，或約80％至約90％，或約80％至約85％。在一些實(shí)施方案中，特異性為約90％至100％、91％至99％、93％至97％、94％至96％、95％至99％、96％至99.5％、97％至99.9％等。)
可通過(guò)任何方式分離基因組DNA，包括使用可商購(gòu)試劑盒。簡(jiǎn)言之，其中目標(biāo)DNA被細(xì)胞膜封裝，應(yīng)通過(guò)酶、化學(xué)或機(jī)械方式破壞和溶解生物樣品。然后例如通過(guò)用蛋白酶K消化，為DNA溶液清除蛋白質(zhì)和其它污染物。然后從溶液中回收基因組DNA。這可借助于多種方法實(shí)現(xiàn)，包括鹽析、有機(jī)提取或DNA與固相支持物結(jié)合。方法的選擇將受幾種因素影響，包括時(shí)間、費(fèi)用和所需DNA的量。包含贅生物質(zhì)或新生前物質(zhì)的所有樣品類(lèi)型適合用于本方法中，例如細(xì)胞系、組織學(xué)載玻片、活檢、石蠟包埋組織、體液、糞便、結(jié)腸排放物、尿液、血漿、血清、全血、分離的血細(xì)胞、從血液中分離的細(xì)胞及其組合。
所述技術(shù)不限于用于制備樣品和提供用于試驗(yàn)的核酸的方法。例如，在一些實(shí)施方案中，使用直接基因捕獲從糞便樣品或血液或血漿樣品中分離DNA，例如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)14/145,082、14/145,087、14/145,070、14/145,056、13/470,251、13/470,018、13/469,999和13/469,989中所詳述。
然后用區(qū)別至少一個(gè)包含DMR(例如，表1A和B中提供的DMR)的標(biāo)志物內(nèi)的甲基化和非甲基化CpG二核苷酸的至少一種試劑或一系列試劑處理基因組DNA樣品。
在一些實(shí)施方案中，所述試劑按照雜交行為將5′-位置處未甲基化的胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶、胸腺嘧啶或不同于胞嘧啶的另一堿基。然而，在一些實(shí)施方案中，所述試劑可為甲基化敏感性限制酶。
在一些實(shí)施方案中，以使得按照雜交行為將5′-位置處未甲基化的胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶、胸腺嘧啶或不同于胞嘧啶的另一堿基的方式處理基因組DNA樣品。在一些實(shí)施方案中，這種處理用硫酸氫鹽(氫亞硫酸鹽、二亞硫酸鹽)實(shí)現(xiàn)，接著進(jìn)行堿水解。
然后分析經(jīng)處理的核酸以確定靶基因序列(來(lái)自于包含DMR，例如表1A和B提供的DMR的標(biāo)志物的至少一個(gè)基因、基因組序列或核苷酸)的甲基化狀態(tài)。在一些實(shí)施方案中，分析方法是如本文所描述的QuARTS和/或MSP。
異常甲基化，更具體地說(shuō)包含DMR(例如表1A和B提供的DMR)的標(biāo)志物的高甲基化與結(jié)直腸癌相關(guān)。
所述技術(shù)涉及對(duì)與結(jié)直腸癌相關(guān)的任何樣品的分析。例如，在一些實(shí)施方案中樣品包含得自患者的組織和/或生物體液。在一些實(shí)施方案中，樣品包含分泌物。在一些實(shí)施方案中，樣品包含血液、血清、血漿、胃分泌物、結(jié)直腸組織、結(jié)直腸腫瘤組織、結(jié)直腸活檢樣品、胰液、胃腸道活檢樣品、來(lái)自于胃腸道活檢的顯微切割細(xì)胞、脫落至胃腸腔的胃腸道細(xì)胞和/或回收自糞便的胃腸道細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，受試者為人。這些樣品可源于上消化道、下消化道，或包含來(lái)自于上消化道和下消化道的細(xì)胞、組織和/或分泌物。樣品可包括來(lái)自于肝臟、膽管、胰腺、胃部、結(jié)腸、直腸、食道、小腸、闌尾、十二指腸、息肉、膽囊、肛門(mén)和/或腹膜的細(xì)胞、分泌物或組織。在一些實(shí)施方案中，樣品包含細(xì)胞液、腹水、尿液、糞便、胰液、內(nèi)窺鏡檢查期間獲得的體液、血液、粘液或唾液。在一些實(shí)施方案中，樣品為糞便樣品。
此類(lèi)樣品可以通過(guò)任何類(lèi)型的技術(shù)獲得。例如，尿液和糞便樣品可容易得到，全血、腹水、血清、結(jié)直腸或胰液樣品例如可在腸胃外通過(guò)使用針和注射器獲得。不含或基本上不含細(xì)胞的樣品可以通過(guò)使樣品經(jīng)受各種技術(shù)獲得，包括但不限于離心和過(guò)濾。雖然通常優(yōu)選使用非侵入性技術(shù)獲得樣品，但是仍然可優(yōu)選獲得諸如組織勻漿、組織切片和活檢樣本的樣品。
在一些實(shí)施方案中，所述技術(shù)提供了一種治療患者(例如，有結(jié)直腸癌、早期結(jié)直腸癌或可發(fā)展結(jié)直腸癌的患者)的方法，所述方法包括確定如本文所提供的一個(gè)或多個(gè)DMR的甲基化狀態(tài)并且基于確定甲基化狀態(tài)的結(jié)果向患者施用治療。所述治療可是進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查，施用藥物化合物、疫苗，進(jìn)行手術(shù)，為患者成像，進(jìn)行另一試驗(yàn)。優(yōu)選地，所述用途是在臨床篩查的方法，預(yù)后評(píng)估的方法，監(jiān)測(cè)治療結(jié)果的方法，鑒定最有可能對(duì)特定治療性治療反應(yīng)的患者的方法，為患者或受試者成像的方法及藥物篩選和開(kāi)發(fā)的方法中。
在一些實(shí)施方案中，臨床癌癥預(yù)后包括確定癌癥的侵蝕性及腫瘤復(fù)發(fā)的可能性以計(jì)劃最有效的療法。如果可以做更準(zhǔn)確的預(yù)后或甚至可以評(píng)估發(fā)展癌癥的潛在風(fēng)險(xiǎn)，則可以選擇適當(dāng)療法，并且在一些情況下可以為患者選擇不太嚴(yán)重的療法。癌癥生物標(biāo)志物的評(píng)估(例如，確定甲基化狀態(tài))對(duì)于將預(yù)后良好和/或發(fā)展癌癥的風(fēng)險(xiǎn)低，將不需要治療或需要有限治療的受試者與很可能發(fā)展癌癥或遭受癌癥復(fù)發(fā)，可能受益于更強(qiáng)治療或監(jiān)測(cè)的受試者分開(kāi)有用。
在當(dāng)前公開(kāi)的主題的一些實(shí)施方案中，隨時(shí)間推移可做生物標(biāo)志物的多次確定以利于診斷和/或預(yù)后。使用生物標(biāo)志物的時(shí)間變化預(yù)測(cè)臨床結(jié)果，監(jiān)測(cè)胃腸癌的進(jìn)展，和/或監(jiān)測(cè)針對(duì)癌癥的適當(dāng)療法的功效。例如在此類(lèi)實(shí)施方案中，可能會(huì)期望了解在有效治療的過(guò)程中隨時(shí)間推移生物樣品中本文公開(kāi)的一個(gè)或多個(gè)生物標(biāo)志物(例如，DMR)(若監(jiān)測(cè)，和潛在地一個(gè)或多個(gè)附加生物標(biāo)志物)的甲基化狀態(tài)的變化。
在一些實(shí)施方案中，在早期，例如在疾病的癥狀出現(xiàn)之前采用本發(fā)明的方法和組合物治療或診斷疾病。
在一些實(shí)施方案中，統(tǒng)計(jì)分析將預(yù)后指標(biāo)與不良結(jié)果的傾向聯(lián)系在一起。例如，在一些實(shí)施方案中，通過(guò)統(tǒng)計(jì)顯著性水平確定，與得自未患癌癥的患者的正常對(duì)照樣品中的甲基化狀態(tài)不同的甲基化狀態(tài)可以表示受試者比具有更類(lèi)似于對(duì)照樣品中的甲基化狀態(tài)的水平的受試者更有可能患癌癥。另外，甲基化狀態(tài)從基線(例如，“正?！?水平的變化可以反映受試者預(yù)后，并且甲基化狀態(tài)的變化程度可與不良事件的嚴(yán)重程度相關(guān)。常常通過(guò)比較兩個(gè)或更多個(gè)群體并且確定置信區(qū)間和/或p值來(lái)確定統(tǒng)計(jì)顯著性。參見(jiàn)，例如，Dowdy和Wearden，Statistics for Research，John Wiley&Sons，New York，1983。當(dāng)前主題的示例性置信區(qū)間為90％、95％、97.5％、98％、99％、99.5％、99.9％和99.99％，而示例性p值為0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001和0.0001。
在其它實(shí)施方案中，可以確定本文公開(kāi)的預(yù)后或診斷生物標(biāo)志物(例如，DMR)的甲基化狀態(tài)變化的閾值程度，并且僅僅將生物樣品中生物標(biāo)志物的甲基化狀態(tài)變化程度與甲基化狀態(tài)變化的閾值程度做比較。本文提供的生物標(biāo)志物的甲基化狀態(tài)的優(yōu)選閾值變化為約5％、約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、約50％、約75％、約100％和約150％。在其它實(shí)施方案中，可以確定“列線圖”，通過(guò)列線圖將預(yù)后或診斷指示物(生物標(biāo)志物或生物標(biāo)志物的組合)的甲基化狀態(tài)直接與針對(duì)指定結(jié)果的相關(guān)傾向直接相關(guān)。技術(shù)人員熟悉此類(lèi)列線圖用于將兩個(gè)數(shù)值相關(guān)聯(lián)的用途，理解這種測(cè)量中的不確定性與標(biāo)志物濃度上的不確定性相同，因?yàn)閰⒖嫉氖菃为?dú)樣品處理，而非群體平均值。
在一些實(shí)施方案中，與生物樣品同時(shí)分析對(duì)照樣品，使得可以將從生物樣品獲得的結(jié)果與從對(duì)照樣品獲得的結(jié)果做比較。另外，考慮到可以提供標(biāo)準(zhǔn)曲線，可將其與生物樣品的測(cè)定結(jié)果做比較。此類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)測(cè)定單位，例如熒光信號(hào)強(qiáng)度(若使用熒光標(biāo)記)呈現(xiàn)生物標(biāo)志物的甲基化狀態(tài)。使用取自多個(gè)供體的樣品，可以為正常組織中所述一個(gè)或多個(gè)生物標(biāo)志物的對(duì)照甲基化狀態(tài)，以及取自有化生的供體或有胃腸癌的供體的組織中所述一個(gè)或多個(gè)生物標(biāo)志物的“風(fēng)險(xiǎn)”水平提供標(biāo)準(zhǔn)曲線。在所述方法的某些實(shí)施方案中，在鑒定得自受試者的生物樣品中本文提供的一個(gè)或多個(gè)DMR的異常甲基化狀態(tài)之后，將受試者鑒定為有化生。在所述方法的其它實(shí)施方案中，檢測(cè)到得自受試者的生物樣品中一個(gè)或多個(gè)此類(lèi)生物標(biāo)志物的異常甲基化狀態(tài)導(dǎo)致受試者被鑒定為患有癌癥。
標(biāo)志物的分析可以與一個(gè)試樣中另外的標(biāo)志物分開(kāi)或同時(shí)進(jìn)行。例如，可以將幾個(gè)標(biāo)志物組合到一次試驗(yàn)中以有效處理多個(gè)樣品并且潛在地提供更高的診斷和/或預(yù)后精確性。另外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到試驗(yàn)來(lái)自于相同受試者的多個(gè)樣品(例如，在連續(xù)時(shí)間點(diǎn))的價(jià)值。連續(xù)樣品的此類(lèi)試驗(yàn)可以允許鑒定隨時(shí)間推移標(biāo)志物甲基化狀態(tài)的變化。甲基化狀態(tài)的變化以及甲基化狀態(tài)變化的不存在可以提供關(guān)于疾病狀況的有用信息，包括但不限于鑒定事件發(fā)生開(kāi)始的大致時(shí)間，可挽救組織的存在和量，藥物療法的適合程度，各種療法的有效性，及對(duì)受試者結(jié)果，包括未來(lái)事件風(fēng)險(xiǎn)的鑒定。
標(biāo)志物的分析可以呈各種物理形式進(jìn)行。例如，微量滴定板或自動(dòng)化可用于促進(jìn)對(duì)大量試樣的處理?？蛇x地，單樣品形式可用于促進(jìn)及時(shí)地，例如在移動(dòng)運(yùn)輸或急診室情況下的即時(shí)治療和診斷。
在一些實(shí)施方案中，如果與對(duì)照甲基化狀態(tài)比較時(shí)，樣品中至少一個(gè)生物標(biāo)志物的甲基化狀態(tài)存在可測(cè)量的差異，將受試者診斷為患有結(jié)直腸癌。相反，在生物樣品中未鑒定出甲基化狀態(tài)的變化時(shí)，可以將受試者診斷為未患結(jié)直腸癌，未處于癌癥風(fēng)險(xiǎn)中，或診斷為具有低癌癥風(fēng)險(xiǎn)。就這一點(diǎn)而言，因此可以將有癌癥或癌癥風(fēng)險(xiǎn)的受試者與具有低風(fēng)險(xiǎn)至基本上無(wú)癌癥或癌癥風(fēng)險(xiǎn)的受試者區(qū)分開(kāi)。具有發(fā)展結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)的那些受試者可以采用更強(qiáng)和/或更規(guī)律的篩查方案，包括內(nèi)窺鏡檢查監(jiān)測(cè)。另一方面，具有低風(fēng)險(xiǎn)至基本上無(wú)風(fēng)險(xiǎn)的那些受試者可以避免進(jìn)行內(nèi)窺鏡檢查，直至諸如進(jìn)一步篩查，例如根據(jù)本技術(shù)進(jìn)行篩查，表明在那些受試者中已經(jīng)出現(xiàn)結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)時(shí)為止。
如以上所提到的，根據(jù)本技術(shù)的所述方法的實(shí)施方案，檢測(cè)所述一個(gè)或多個(gè)生物標(biāo)志物的甲基化狀態(tài)的變化可以是定性確定或者可以是定量確定。這樣，將受試者診斷為患有胃腸癌或處于發(fā)展胃腸癌風(fēng)險(xiǎn)的步驟表明，進(jìn)行了某些閾值測(cè)量，例如生物樣品中所述一個(gè)或多個(gè)生物標(biāo)志物的甲基化狀態(tài)不同于預(yù)定對(duì)照甲基化狀態(tài)。在所述方法的一些實(shí)施方案中，對(duì)照甲基化狀態(tài)是生物標(biāo)志物的任何可檢測(cè)甲基化狀態(tài)。在所述方法的其它實(shí)施方案中，其中對(duì)照樣品與生物樣品同時(shí)試驗(yàn)，預(yù)定甲基化狀態(tài)是對(duì)照樣品中的甲基化狀態(tài)。在所述方法的其它實(shí)施方案中，預(yù)定甲基化狀態(tài)基于和/或通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線鑒定。在所述方法的其它實(shí)施方案中，預(yù)定甲基化狀態(tài)是具體狀態(tài)或狀態(tài)范圍。這樣，可以在本領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易見(jiàn)的可接受限制范圍內(nèi)，部分基于實(shí)踐的所述方法的實(shí)施方案和所需特異性等，選擇預(yù)定甲基化狀態(tài)。
實(shí)施例
實(shí)施例1.
該實(shí)施例證明NDRG4、BMP3、OPLAH、FLI1、PDGFD、CHST_7889、SFMBT2_895、SFMBT2_896、SFMBT2_897、CHST2_7890、VAV3和DTX1為糞便樣品內(nèi)用于檢測(cè)結(jié)直腸癌的有效標(biāo)志物。
表1A中提供了NDRG4、BMP3、OPLAH、FLI1、PDGFD、CHST_7889、SFMBT2_895、SFMBT2_896、SFMBT2_897、CHST2_7890、VAV3和DTX1的正向和反向引物及探針序列。表1B提供了關(guān)于表1A中提供的甲基化標(biāo)志物、染色體和DMR基因組坐標(biāo)的信息。
將每個(gè)標(biāo)志物的捕獲探針設(shè)計(jì)為具有75-80℃的解鏈溫度和介于25-35個(gè)堿基之間的長(zhǎng)度(參見(jiàn)表1C)。另外，可以將捕獲探針雜交區(qū)選擇為在亞硫酸氫鹽后QuARTS足跡內(nèi)。表1C提供了甲基化標(biāo)志物和各自的捕獲探針序列。
表1A：實(shí)施例1中利用的標(biāo)志物的正向引物、探針、反向引物序列
表1B.甲基化標(biāo)志物、染色體和DMR基因組坐標(biāo)。
表1C.甲基化標(biāo)志物和相應(yīng)的捕獲探針序列。
每個(gè)捕獲探針經(jīng)5’-NH2修飾合成以允許通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)碳二亞胺偶合化學(xué)法偶合至經(jīng)-COOH修飾的磁性顆粒上。同樣，捕獲探針的互補(bǔ)寡核苷酸合成為含有5’-Cy3標(biāo)記。這種互補(bǔ)探針用于確認(rèn)捕獲探針偶合至磁性顆粒上。
為試驗(yàn)每個(gè)探針的捕獲效率以及評(píng)估標(biāo)志物性能，制備正常和癌癥患者的兩份糞便混合物。癌癥糞便混合物來(lái)自于6名患者(3名為CRC，1名為AA而2名未知)。類(lèi)似地，正常糞便來(lái)自于6名非CRC正?；颊?。在勻漿離心之后通過(guò)混合上清液制備糞便。然后將混合上清液等分為含有14mL上清液的單一捕獲樣品。
將捕獲探針設(shè)計(jì)為具有75-80℃的解鏈溫度和介于25-35個(gè)堿基之間的長(zhǎng)度。另外，可以將捕獲探針雜交區(qū)選擇為在亞硫酸氫鹽后QuARTS足跡內(nèi)。
為進(jìn)行捕獲，混合兩種標(biāo)志物的捕獲珠粒(具有共價(jià)連接的捕獲探針的磁性顆粒)加上ACTB捕獲珠粒以形成三捕獲珠?；旌衔?。
對(duì)14mL的陽(yáng)性和正常糞便上清液進(jìn)行捕獲，一式三份(因?yàn)榛旌衔锊蛔悖訴AV3和DTX1除外，進(jìn)行一式兩份)。
捕獲完成之后，在42℃下用0.1N NaOH從捕獲珠粒將糞便DNA洗脫20分鐘，接著在56℃下使用亞硫酸氫銨進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化1小時(shí)。然后為糞便DNA去磺化并且使用涂硅磁珠純化并且在70uL的10mM Tris-HCl(pH 8)、0.1mM EDTA中洗脫。然后試驗(yàn)10uL洗脫液并且在QuARTS測(cè)定法中量化。
為能夠量化樣品，使用具有對(duì)應(yīng)于QuARTS足跡的DNA插入物的pUC57質(zhì)粒。DNA插入物側(cè)接EcoRI位點(diǎn)以允許使用260nm下的吸光度線性化和量化。
為允許反算洗脫樣品中的鏈，對(duì)10uL洗脫液和消化質(zhì)粒的稀釋液進(jìn)行QuARTS測(cè)定法。
表1D示出了每個(gè)試驗(yàn)標(biāo)志物獲得的結(jié)果。這些結(jié)果顯示在陽(yáng)性和正常糞便混合物間甲基化標(biāo)志物具有高鏈差異，表明這些標(biāo)志物是糞便中用于CRC檢測(cè)的候選物。
表1D.
實(shí)施例2.
在人類(lèi)受試者內(nèi)篩查結(jié)直腸癌的示例性程序。
使得自人類(lèi)受試者的核酸(例如，基因組DNA，例如分離自體液如糞便樣品或結(jié)直腸組織)與區(qū)別至少一個(gè)標(biāo)志物DMR內(nèi)的甲基化和非甲基化CpG二核苷酸的至少一種試劑或一系列試劑接觸，所述標(biāo)志物DMR選自：
·NDRG4、BMP3、OPLAH、FLI1、PDGFD、SFMBT2(例如，SFMBT2_895、SFMBT2_896、SFMBT2_897)、CHST2(例如，CHST2_7889和CHST2_7890)、VAV3和DTX1(如表1A和B中所述)。
當(dāng)所述標(biāo)志物的甲基化狀態(tài)不同于在沒(méi)有贅生物的受試者中測(cè)定的所述標(biāo)志物的甲基化狀態(tài)時(shí)，將所述受試者鑒定為有結(jié)直腸癌。
以上說(shuō)明書(shū)中提到的所有出版物和專(zhuān)利通過(guò)引用整體并入本文用于所有目的。在不背離所述技術(shù)的范圍和精神的前提下，描述的所述技術(shù)的組合物、方法和用途的各種修改和變型對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易見(jiàn)。雖然已經(jīng)連同具體示例性實(shí)施方案描述了所述技術(shù)，但是應(yīng)理解要求保護(hù)的本發(fā)明不應(yīng)過(guò)度限于此類(lèi)具體實(shí)施方案。事實(shí)上，對(duì)于藥理學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)科學(xué)或有關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員明顯的，對(duì)描述的用于實(shí)施本發(fā)明的模式的各種修改旨在屬于以下權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。