發(fā)明背景

蛋白質(zhì)的表達(dá)是活細(xì)胞中的基本過程。用于蛋白質(zhì)表達(dá)所需的所有信息都由單一核酸提供。該核酸不僅包含蛋白質(zhì)的氨基酸序列信息，還提供所需的調(diào)控信息(例如，核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄的開始和結(jié)束信號(hào)、剪接信號(hào)、增強(qiáng)子元件等)，包括啟動(dòng)子/啟動(dòng)子序列。

啟動(dòng)子是一種核酸，其調(diào)控與其有效連接的核酸(例如編碼多肽)轉(zhuǎn)錄成前mRNA的量。它是轉(zhuǎn)錄控制元件，其定位于有效連接的編碼序列的5'末端的RNA聚合酶起始位點(diǎn)附近。從SV40早期啟動(dòng)子的分析可知，用于轉(zhuǎn)錄激活子的識(shí)別/結(jié)合位點(diǎn)包含在啟動(dòng)子中的由7-20個(gè)堿基對(duì)組成的區(qū)段中。一個(gè)區(qū)段是用于RNA合成的起始位點(diǎn)，例如已知的TATA盒。其他區(qū)段，位于用于RNA合成的起始位點(diǎn)的5'(即，上游)約30-110個(gè)堿基對(duì)，限定轉(zhuǎn)錄起始的頻率。啟動(dòng)子至少需要一個(gè)區(qū)段，其在特定位點(diǎn)和在限定的方向(即，在5'到3'的方向上)啟動(dòng)RNA合成。

在長期培養(yǎng)中的生產(chǎn)力的逐漸損失是開發(fā)生產(chǎn)細(xì)胞系的普遍問題(Barnes,L.M.等人，Biotechnol.Bioeng.81(2003)631-639)。重組蛋白表達(dá)的減少可能是由于轉(zhuǎn)基因拷貝的丟失和/或轉(zhuǎn)基因啟動(dòng)子的沉默(參見例如Escher,G.等人，J.Lipid Res.46(2005)356-365；Krishnan,M.等人，F(xiàn)ASEB J.20(2006)106-108；Yang,Y.等人，J.Biotechnol.147(2010)180-185)。啟動(dòng)子的沉默是通過染色質(zhì)的外遺傳修飾如組蛋白的翻譯后修飾，以及啟動(dòng)子DNA在CpG位點(diǎn)的的直接甲基化引起的(參見例如Cedar,H.和Bergman,Y.,Nat.Rev.Genet.10(2009)295-304；De Carvalho,D.D.等人，Trends Cell Biol 20(2010):609-617；Klose；R.J.和Bird,A.P.,Trends Biochem Sci 31(2006):89-97)。甲基化的啟動(dòng)子一般是失活的。

人巨細(xì)胞病毒(hCMV-MIE)的主要立即早期基因的極強(qiáng)啟動(dòng)子和增強(qiáng)子被用于多肽在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的重組表達(dá)。已經(jīng)表明該啟動(dòng)子容易在瞬時(shí)以及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞通過甲基化沉默(參見例如Escher,G.等人，J.Lipid Res.46(2005)356-365；Krishnan,M.等人，F(xiàn)ASEB J.20(2006)106-108；Proesch,S.等人，Biol Chem Heppe Seyler 377(1996):195-201；Yang,Y.等人，J.Biotechnol.147(2010)180-185)。

已經(jīng)在WO2011/128377中證明hCMV-MIE啟動(dòng)子的直接甲基化可以作為預(yù)測(cè)重組CHO細(xì)胞系的生產(chǎn)不穩(wěn)定性的早期標(biāo)記。

Osterlehner,A.等人報(bào)道了啟動(dòng)子甲基化和轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)預(yù)測(cè)在重組中國倉鼠卵巢細(xì)胞系中的不穩(wěn)定蛋白生產(chǎn)并描述了不同的CpG位點(diǎn)是以不同的頻率甲基化(Biotechnol.Bioeng.108(2011)2670-2681)。

發(fā)明概述

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在hCMV-MIE啟動(dòng)子的特定位點(diǎn)的C到G點(diǎn)突變，即，單個(gè)C到G的突變，造成降低的啟動(dòng)子沉默以及同樣造成提高的生產(chǎn)穩(wěn)定性。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，可以實(shí)現(xiàn)所產(chǎn)生多肽的更高效價(jià)。相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，在位置-41和/或位置-179的C到G的突變已證明是特別有效的。

如本文所報(bào)道的一個(gè)方面是人CMV啟動(dòng)子(基于SEQ ID NO:01的啟動(dòng)子)，其相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，具有在核苷酸位置-41(和/)或-179的核苷酸G。

在此方面的一個(gè)實(shí)施方式中，(在與相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)在位置-41和/或-179無C到G點(diǎn)突變的人CMV啟動(dòng)子進(jìn)行比較時(shí))人CMV啟動(dòng)子具有提高的生產(chǎn)穩(wěn)定性和/或改善的產(chǎn)品效價(jià)。

在此方面的一個(gè)實(shí)施方式中，人CMV啟動(dòng)子具有SEQ ID NO:02或SEQ ID NO:03的核酸序列。

如本文所報(bào)道的一個(gè)方面是具有SEQ ID NO:02的核酸序列的啟動(dòng)子。

如本文所報(bào)道的一個(gè)方面是一種核酸，其特征在于它是由SEQ ID NO:02的核酸組成，并且當(dāng)有效連接至編碼增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)的SEQ ID NO:04的核酸時(shí)具有SEQ ID NO:01的人CMV主要立即早期啟動(dòng)子的至少80％的啟動(dòng)子強(qiáng)度。

如本文所報(bào)道的一個(gè)方面是用于生產(chǎn)多肽的方法，其特征在于它包括以下步驟：

a)用包括表達(dá)盒的核酸轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，該表達(dá)盒包含SEQ ID NO:02的第一核酸，該第一核酸有效連接到編碼所述多肽的第二核酸，

b)選擇在步驟a)中轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，

c)(在適合于多肽表達(dá)的條件下)培養(yǎng)步驟b)的經(jīng)選擇的細(xì)胞，

d)從細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收多肽，

和由此生產(chǎn)多肽。

在此方面的一個(gè)實(shí)施方式中，生產(chǎn)是大規(guī)模生產(chǎn)。在一個(gè)實(shí)施方式中，生產(chǎn)是以500l或更大的最終培養(yǎng)體積，在一個(gè)實(shí)施方式中為500l至10,000l。

在此方面的一個(gè)實(shí)施方式中，所述多肽是免疫球蛋白、或免疫球蛋白片段或免疫球蛋白綴合物。

在此方面的一個(gè)實(shí)施方式中，多肽是免疫球蛋白輕鏈或免疫球蛋白重鏈或其變體或其片段或其融合物。

在此方面的一個(gè)實(shí)施方式中，核酸包含編碼選擇標(biāo)記的另一表達(dá)盒。在此方面的一個(gè)實(shí)施方式中，核酸包含編碼免疫球蛋白輕鏈或免疫球蛋白重鏈的另一表達(dá)盒。

在此方面的一個(gè)實(shí)施方式中，所述真核細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。

在此方面的一個(gè)實(shí)施方式中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是CHO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、HEK細(xì)胞、Sp2/0細(xì)胞或細(xì)胞。

在此方面的一個(gè)實(shí)施方式中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是CHO細(xì)胞或HEK細(xì)胞。

在此方面的一個(gè)實(shí)施方式中，所述選擇標(biāo)記是二氫葉酸還原酶、氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶或潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶。

如本文所報(bào)道的一個(gè)方面是使用SEQ ID NO:02的啟動(dòng)子用于生產(chǎn)多肽。

如本文所報(bào)道的一個(gè)方面是包含如本文所報(bào)道的啟動(dòng)子或如本文所報(bào)道的核酸的細(xì)胞。

如本文所報(bào)道的一個(gè)方面是具有SEQ ID NO:03的核酸序列的啟動(dòng)子。

如本文所報(bào)道的一個(gè)方面是一種核酸，其特征在于它是由SEQ ID NO:03的核酸組成，并且當(dāng)有效連接至編碼增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)的SEQ ID NO:04的核酸時(shí)具有SEQ ID NO:01的人CMV主要立即早期啟動(dòng)子的至少80％的啟動(dòng)子強(qiáng)度。

如本文所報(bào)道的一個(gè)方面是一種生產(chǎn)多肽的方法，其特征在于它包括以下步驟：

a)用包括表達(dá)盒的核酸轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，該表達(dá)盒包含SEQ ID NO:03的第一核酸，該第一核酸有效連接到編碼該多肽的第二核酸，

b)選擇在步驟a)中轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，

c)(在適合于多肽表達(dá)的條件下)培養(yǎng)步驟b)的經(jīng)選擇的細(xì)胞，

d)從細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收多肽，

和由此生產(chǎn)多肽。

在此方面的一個(gè)實(shí)施方式中，生產(chǎn)是大規(guī)模生產(chǎn)。在一個(gè)實(shí)施方式中，生產(chǎn)是以500l或更大的最終培養(yǎng)體積，在一個(gè)實(shí)施方式中為500l至10,000l。

在此方面的一個(gè)實(shí)施方式中，所述多肽是免疫球蛋白，或免疫球蛋白片段，或免疫球蛋白綴合物。

在此方面的一個(gè)實(shí)施方式中，多肽是免疫球蛋白輕鏈或免疫球蛋白重鏈或其變體或其片段或其融合物。

在此方面的一個(gè)實(shí)施方式中，核酸包含編碼選擇標(biāo)記的另一表達(dá)盒。在此方面的一個(gè)實(shí)施方式中，核酸包含編碼免疫球蛋白輕鏈或免疫球蛋白重鏈的另一表達(dá)盒。

在此方面的一個(gè)實(shí)施方式中，所述真核細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。

在此方面的一個(gè)實(shí)施方式中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是CHO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、HEK細(xì)胞、Sp2/0細(xì)胞或細(xì)胞。

在此方面的一個(gè)實(shí)施方式中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是CHO細(xì)胞或HEK細(xì)胞。

在此方面的一個(gè)實(shí)施方式中，所述選擇標(biāo)記是二氫葉酸還原酶、氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶或潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶。

如本文所報(bào)道的一個(gè)方面是使用SEQ ID NO:03的啟動(dòng)子用于生產(chǎn)多肽。

如本文所報(bào)道的一個(gè)方面是包含如本文所報(bào)道的啟動(dòng)子或如本文所報(bào)道的核酸的細(xì)胞。

如本文所報(bào)道的一個(gè)方面是一種人CMV啟動(dòng)子，其相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)在核苷酸位置-41處具有核苷酸G。

在此方面的一個(gè)實(shí)施方式中，人CMV啟動(dòng)子是人CMV主要立即早期啟動(dòng)子。

如本文所報(bào)道的一個(gè)方面是一種人CMV啟動(dòng)子，其相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)在核苷酸位置-179處具有核苷酸G。

在此方面的一個(gè)實(shí)施方式中，人CMV啟動(dòng)子是人CMV主要立即早期啟動(dòng)子。

發(fā)明詳述

當(dāng)使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞系用于重組多肽(如分泌的蛋白質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)報(bào)告蛋白或細(xì)胞表面標(biāo)記)的生產(chǎn)/表達(dá)時(shí)，在長期培養(yǎng)中生產(chǎn)力的逐漸損失是開發(fā)生產(chǎn)細(xì)胞系的普遍問題(Barnes,L.M.等人，Biotechnol.Bioeng.81(2003)631-639)。對(duì)于細(xì)胞系/細(xì)胞克隆的生產(chǎn)，即用于多肽(如例如抗體)的大規(guī)模重組生產(chǎn)的細(xì)胞克隆/細(xì)胞系，該細(xì)胞克隆/細(xì)胞系的生產(chǎn)穩(wěn)定性，即，一代代的生產(chǎn)力損失，是非常重要的。因此，用于重組蛋白生產(chǎn)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系需要在延長的培養(yǎng)時(shí)間期間保持生產(chǎn)率。通常細(xì)胞克隆/細(xì)胞系的生產(chǎn)穩(wěn)定性是通過培育該細(xì)胞克隆/細(xì)胞系很長一段時(shí)間來確定的。以規(guī)則的時(shí)間間隔，將培養(yǎng)基用新鮮的培養(yǎng)基稀釋，并基于產(chǎn)物效價(jià)和活細(xì)胞密度來測(cè)定每個(gè)細(xì)胞的比生產(chǎn)力。比生產(chǎn)力的變化(通常是減小)指示細(xì)胞克隆/細(xì)胞系的長期生產(chǎn)穩(wěn)定性。

重組蛋白表達(dá)的減少可能是由于轉(zhuǎn)基因拷貝的丟失和/或轉(zhuǎn)基因啟動(dòng)子的沉默(參見例如Escher,G.等人，J.Lipid Res.46(2005)356-365；Krishnan,M.等人，F(xiàn)ASEB J.20(2006)106-108；Yang,Y.等人，J.Biotechnol.147(2010)180-185)。啟動(dòng)子的沉默是由染色質(zhì)的外遺傳修飾如組蛋白的翻譯后修飾，以及啟動(dòng)子DNA在CpG位點(diǎn)的直接甲基化造成的(參見例如Cedar,H.和Bergman,Y.，Nat.Rev.Genet.10(2009)295-304；De Carvalho,D.D.等人，Trends Cell Biol 20(2010):609-617；Klose；R.J.and Bird,A.P.,Trends Biochem Sci 31(2006):89-97)。甲基化的啟動(dòng)子通常是處于失活狀態(tài)。

Osterlehner，A等人早先已經(jīng)表明，啟動(dòng)子甲基化和轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)預(yù)測(cè)在重組中國倉鼠卵巢細(xì)胞系中的不穩(wěn)定蛋白生產(chǎn)并描述了不同的CpG位點(diǎn)是以不同的頻率甲基化(Biotechnol.Bioeng.108(2011)2670-2681)。

本文調(diào)查了不同的CpG位點(diǎn)單獨(dú)或組合。產(chǎn)生了在人CMV主要立即早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)內(nèi)含有CpG點(diǎn)突變的各種細(xì)胞系并測(cè)試了長期生產(chǎn)力。

很重要的是啟動(dòng)子突變不顯著影響其基因表達(dá)的效力，即，不應(yīng)影響啟動(dòng)子強(qiáng)度。

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)在具有如本文所報(bào)道的點(diǎn)突變的hCMV-MIE啟動(dòng)子中，啟動(dòng)子強(qiáng)度未受到影響。在人CMV主要立即早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子片段中具有點(diǎn)突變的質(zhì)粒和未突變對(duì)照質(zhì)粒之間，沒有檢測(cè)到顯著差異。

本發(fā)明至少部分是基于以下發(fā)現(xiàn)：可以通過在人CMV主要立即早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)的特定CpG位點(diǎn)處從C到G的點(diǎn)突變來降低啟動(dòng)子的沉默。由此可以提高細(xì)胞系的長期生產(chǎn)穩(wěn)定性，并且可以在很長一段時(shí)間以高/更高的產(chǎn)率來生產(chǎn)重組多肽。

示例性的CHO細(xì)胞用質(zhì)粒16107(含點(diǎn)突變C-179到G)或質(zhì)粒16109(含點(diǎn)突變C-41到G)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并培養(yǎng)。測(cè)定在延長的培養(yǎng)時(shí)間中每個(gè)質(zhì)粒中8-10個(gè)獨(dú)立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞池的eGFP強(qiáng)度。

在已被質(zhì)粒16109或?qū)φ召|(zhì)粒16111轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，檢測(cè)了轉(zhuǎn)染細(xì)胞的長期生產(chǎn)力的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(p值<0.05；見下表)。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)在位置-41引入C到G的點(diǎn)突變(即，消除甲基化位點(diǎn))時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)報(bào)告基因表達(dá)的穩(wěn)定性的積極影響。

表：用質(zhì)粒16107、16109或16111轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞池的熒光幾何平均數(shù)的最小顯著差異(LSD)的p值

因此，如本文中報(bào)道的一個(gè)方面是具有SEQ ID NO:02的核酸序列的啟動(dòng)子，即具有C-41到G點(diǎn)突變的hCMV-MIE啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方式中，啟動(dòng)子具有至少一個(gè)C到G的點(diǎn)突變。在一個(gè)實(shí)施方式中，啟動(dòng)子具有兩個(gè)C到G的點(diǎn)突變。在一個(gè)實(shí)施方式中，啟動(dòng)子具有三個(gè)C到G的點(diǎn)突變。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，啟動(dòng)子具有C到G的單點(diǎn)突變。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，啟動(dòng)子相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)在位置-41具有C到G的單點(diǎn)突變。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，啟動(dòng)子相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)在-179位置具有C到G的單個(gè)點(diǎn)突變。

如本文所報(bào)道的另一個(gè)方面是一種核酸，其特征在于它是由SEQ ID NO:02的核酸組成，并且當(dāng)有效連接至編碼增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)的SEQ ID NO:04的核酸時(shí)具有SEQ ID NO:01的人CMV主要立即早期啟動(dòng)子的至少80％的啟動(dòng)子強(qiáng)度。

如本文所報(bào)道的一個(gè)方面是一種用于生產(chǎn)多肽的方法，其特征在于它包括以下步驟：

a)用包括表達(dá)盒的核酸轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，該表達(dá)盒包含SEQ ID NO:02的第一核酸(即具有C-41至G點(diǎn)突變的hCMV-MIE啟動(dòng)子)，該第一核酸有效連接到編碼該多肽的第二核酸，

b)選擇在步驟a)中轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，

c)(在適合于多肽表達(dá)的條件下)培養(yǎng)步驟b)的經(jīng)選擇的細(xì)胞，

d)從細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收所述多肽，

和由此生產(chǎn)多肽。

在此方面的一個(gè)實(shí)施方式中，生產(chǎn)是大規(guī)模生產(chǎn)。在一個(gè)實(shí)施方式中，生產(chǎn)是以500l或更大的最終培養(yǎng)體積，在一個(gè)實(shí)施方式中為500l至10,000l。

在此方面的一個(gè)實(shí)施方式中，所述多肽是免疫球蛋白、或免疫球蛋白片段或免疫球蛋白綴合物。

在此方面的一個(gè)實(shí)施方式中，多肽是免疫球蛋白輕鏈或免疫球蛋白重鏈或其變體或其片段或其融合物。應(yīng)理解的是，如果要生產(chǎn)完整的免疫球蛋白分子，有必要包含具有編碼各種的其它免疫球蛋白鏈的核酸的另一表達(dá)盒。例如，如果多肽是免疫球蛋白輕鏈，導(dǎo)入具有編碼免疫球蛋白重鏈的核酸的另一表達(dá)盒。在此方面的一個(gè)實(shí)施方式中，核酸包含編碼免疫球蛋白輕鏈或免疫球蛋白重鏈的另一表達(dá)盒。

在此方面的一個(gè)實(shí)施方式中，核酸包含編碼選擇標(biāo)記的另一表達(dá)盒。在此方面的一個(gè)實(shí)施方式中，所述選擇標(biāo)記是二氫葉酸還原酶、氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶或潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶。如本文所報(bào)道的另一個(gè)方面是使用SEQ ID NO:02的啟動(dòng)子生產(chǎn)多肽的用途。

在此方面的一個(gè)實(shí)施方式，所述真核細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在此方面的一個(gè)實(shí)施方式中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是CHO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、HEK細(xì)胞、Sp2/0細(xì)胞或細(xì)胞。在此方面的一個(gè)實(shí)施方式中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是CHO細(xì)胞或HEK細(xì)胞。

將另外的細(xì)胞系16107和16111進(jìn)行直接比較。細(xì)胞系16107與對(duì)照細(xì)胞系16111相比更高的eGFP表達(dá)趨勢(shì)顯示出相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)在位置C-179的C到G點(diǎn)突變對(duì)于eGFP表達(dá)基因的穩(wěn)定性的積極影響。

相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的位置-41對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:01的位置561。相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的位置-179對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:01的423。

因此，如本文中報(bào)道的一個(gè)方面是具有SEQ ID NO:03的核酸序列的啟動(dòng)子，即具有C-179到G點(diǎn)突變的hCMV-MIE啟動(dòng)子。

如本文所報(bào)道的另一個(gè)方面是一種核酸，其特征在于它是由SEQ ID NO:03的核酸組成，并且當(dāng)有效連接至編碼增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)的SEQ ID NO:04的核酸時(shí)具有SEQ ID NO:01的人CMV主要立即早期啟動(dòng)子的至少80％的啟動(dòng)子強(qiáng)度。

如本文所報(bào)道的另一個(gè)方面是一種用于生產(chǎn)多肽的方法，其特征在于它包括以下步驟：

a)用包括表達(dá)盒的核酸轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，所述表達(dá)盒包含SEQ ID NO:03的第一核酸，該第一核酸有效連接到編碼所述多肽的第二核酸，

b)選擇在步驟a)中轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，

c)(在適合于多肽表達(dá)的條件下)培養(yǎng)步驟b)的經(jīng)選擇的細(xì)胞，

d)從細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收多肽，

和由此生產(chǎn)多肽。

在此方面的一個(gè)實(shí)施方式中，生產(chǎn)是大規(guī)模生產(chǎn)。在一個(gè)實(shí)施方式中，生產(chǎn)是以500l或更大的最終培養(yǎng)體積，在一個(gè)實(shí)施方式中為500l至10,000l。

在此方面的一個(gè)實(shí)施方式中，所述多肽是免疫球蛋白，或免疫球蛋白片段，或免疫球蛋白綴合物。

在此方面的一個(gè)實(shí)施方式中，多肽是免疫球蛋白輕鏈或免疫球蛋白重鏈或其變體或其片段或其融合物。

在此方面的一個(gè)實(shí)施方式中，核酸包含編碼選擇標(biāo)記的另一表達(dá)盒。

在此方面的一個(gè)實(shí)施方式中，所述真核細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。

在此方面的一個(gè)實(shí)施方式中，所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞是CHO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、HEK細(xì)胞、Sp2/0細(xì)胞或細(xì)胞。

在此方面的一個(gè)實(shí)施方式中，所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞是CHO細(xì)胞或HEK細(xì)胞。

在此方面的一個(gè)實(shí)施方式中，所述選擇標(biāo)記是二氫葉酸還原酶、氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶或潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶。

如本文所報(bào)道的另一個(gè)方面是SEQ ID NO:03的啟動(dòng)子用于生產(chǎn)多肽的用途。

定義

“啟動(dòng)子”是指一種核酸，即多核苷酸序列，它控制與其有效連接的核酸的轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子可以包括用于RNA聚合酶結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始的信號(hào)。所使用的啟動(dòng)子將在(其中考慮了有效連接的核酸的表達(dá)的)宿主細(xì)胞的細(xì)胞類型中是有功能的。在本領(lǐng)域中公知大量的啟動(dòng)子，包括來自各種不同來源的組成型、誘導(dǎo)型和阻抑型啟動(dòng)子(并且在諸如GenBank的數(shù)據(jù)庫中被鑒定)。它們可作為克隆的多核苷酸獲得或在克隆的多核苷酸內(nèi)(來自，例如，保藏機(jī)構(gòu)例如ATCC以及其它商業(yè)或個(gè)體來源)?！皢?dòng)子”包括指導(dǎo)例如有效連接的結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。通常，啟動(dòng)子位于基因的5'非編碼區(qū)或5'-非翻譯區(qū)(5'UTR)，接近結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。在轉(zhuǎn)錄起始中起作用的啟動(dòng)子內(nèi)的序列元件通常以共有核苷酸序列來表征。這些序列元件包括RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)，TATA序列，CAAT序列，分化特異性元件(DSEs；McGehee，R.E.等人，Mol.Endocrinol.7(1993)551)，環(huán)AMP應(yīng)答元件(CRE)，血清應(yīng)答元件(SREs；Treisman,R.,Seminars in Cancer Biol.1(1990)47)，糖皮質(zhì)激素應(yīng)答元件(GRE)和其他轉(zhuǎn)錄因子，如CRE/ATF的結(jié)合位點(diǎn)(O'Reilly,M.A.等人，J.Biol.Chem.267(1992)19938)，AP2(Ye,J.等人，J.Biol.Chem.269(1994)25728)，SP1，cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(CREB；Loeken,M.R.,Gene Expr.3(1993)253-264)和八聚體因子(通常參見，Watson等人編，Molecular Biology of the Gene，第4版，The Benjamin/Cummings Publishing Company,Inc.1987，和Lemaigre,F.P.and Rousseau,G.G.,Biochem.J.303(1994)1-14)。如果啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，那么響應(yīng)于誘導(dǎo)劑，轉(zhuǎn)錄速率增加。與此相反，如果啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄速率不受誘導(dǎo)劑調(diào)控。阻抑型啟動(dòng)子也是已知的。例如，c-fos啟動(dòng)子在生長激素結(jié)合到其在細(xì)胞表面上的受體被特異活化。四環(huán)素(tet)調(diào)節(jié)的表達(dá)可以通過人工雜交啟動(dòng)子來實(shí)現(xiàn)，所述雜交啟動(dòng)子由例如CMV啟動(dòng)子后面是兩個(gè)Tet操縱基因位點(diǎn)組成。Tet-阻遏物結(jié)合至兩個(gè)Tet操縱基因位點(diǎn)并阻斷轉(zhuǎn)錄。在加入誘導(dǎo)物四環(huán)素時(shí)，tet-阻遏物從Tet操縱基因位點(diǎn)釋放并且轉(zhuǎn)錄繼續(xù)(Gossen,M.and Bujard,H.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)5547-5551)。對(duì)于其他誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，包括金屬硫蛋白和熱休克啟動(dòng)子，參見，例如，Sambrook等人(同上)，和Gossen,M.等人，Curr.Opin.Biotech.5(1994)516-520。已經(jīng)被鑒定為用于高水平表達(dá)的強(qiáng)啟動(dòng)子的真核啟動(dòng)子包括SV40早期啟動(dòng)子、腺病毒主要晚期啟動(dòng)子、小鼠金屬硫蛋白-I啟動(dòng)子，勞斯肉瘤病毒長末端重復(fù)，中國倉鼠延伸因子1α(CHEF-1，參見如US 5,888,809)，人EF-1α，泛素和人類巨細(xì)胞病毒主要立即早期啟動(dòng)子(CMV-MIE)?！霸鰪?qiáng)子”(即，作用于啟動(dòng)子以增加轉(zhuǎn)錄的順式作用DNA元件)可能必需與啟動(dòng)子結(jié)合來發(fā)揮功能以增加單獨(dú)通過啟動(dòng)子得到的表達(dá)水平，并可以被包括作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。通常，含有啟動(dòng)子的多核苷酸片段也將包括增強(qiáng)子序列(例如，CMV或SV40)。

術(shù)語“CpG位點(diǎn)”表示核酸內(nèi)可以被細(xì)胞的甲基化酶所識(shí)別的二核苷酸CG，并且其中胞嘧啶可以被轉(zhuǎn)化為5-甲基胞嘧啶。在一個(gè)實(shí)施方式中，CpG位點(diǎn)是在啟動(dòng)子核酸內(nèi)。

如本文所用的術(shù)語“核酸”是由單個(gè)核苷酸組成的聚合物，即多核苷酸。它指的是天然存在的，或者部分或完全非天然存在的核酸，這是例如編碼可以重組產(chǎn)生的多肽。該核酸可以由DNA片段構(gòu)成，該DNA是分離的或者是通過化學(xué)方法合成的。核酸可以被整合到另一個(gè)核酸，例如在表達(dá)質(zhì)?；蛩拗骷?xì)胞的基因組/染色體中。質(zhì)粒包括穿梭和表達(dá)載體。典型地，該質(zhì)粒還包含原核繁殖單元，其包括分別用于在細(xì)菌中復(fù)制和選擇載體的復(fù)制起點(diǎn)(例如，ColE1復(fù)制起點(diǎn))和篩選標(biāo)記(例如，氨芐青霉素或四環(huán)素抗性基因)。

在本發(fā)明中所用的術(shù)語“啟動(dòng)子強(qiáng)度”及其語法等同物是指啟動(dòng)子在有效連接的核酸的轉(zhuǎn)錄中的效力。如果與SEQ ID NO:01的野生型hCMV-MIE啟動(dòng)子的啟動(dòng)子強(qiáng)度相比，啟動(dòng)子的啟動(dòng)子強(qiáng)度可以是高的，也就是說，它可以從75％至超過100％，中度的，也就是說，它可以從40％至小于75％，或是低的，也就是說，它可以高達(dá)小于40％。該值可以通過比較有效連接到目的啟動(dòng)子的異源多肽的表達(dá)量與有效連接到相同細(xì)胞類型的野生型SV40啟動(dòng)子的異源多肽的表達(dá)量來確定。這可以例如通過ELISA測(cè)定法測(cè)定轉(zhuǎn)染了表達(dá)盒的CHO-或HEK細(xì)胞中的異源多肽的表達(dá)量來完成，該表達(dá)盒由有效連接到編碼異源多肽的核酸的目的啟動(dòng)子組成。通過將該量與在相同細(xì)胞系中的相同異源多肽的表達(dá)量(由相同的ELISA測(cè)定法測(cè)定)進(jìn)行比較，即，將相同細(xì)胞中的異源多肽的量與其中僅啟動(dòng)子改變的相同的表達(dá)質(zhì)粒相比，可以測(cè)定相對(duì)啟動(dòng)子強(qiáng)度，所述細(xì)胞系轉(zhuǎn)染了由有效連接到編碼異源多肽的核酸的野生型SV40啟動(dòng)子的表達(dá)盒組成。

“有效連接的”是指兩個(gè)或更多個(gè)組分的并列，其中如此描述的組分處于一種允許它們以其預(yù)期方式發(fā)揮功能的關(guān)系。例如，啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子有效連接到編碼序列，如果它順式控制或調(diào)節(jié)所連接的編碼序列的轉(zhuǎn)錄的話。通常，但不一定，被“有效連接”的DNA序列是鄰接的，并在需要連接兩個(gè)蛋白編碼區(qū)域(例如分泌前導(dǎo)/信號(hào)序列和多肽)時(shí)，是鄰接的且在讀碼框內(nèi)。然而，雖然有效連接的啟動(dòng)子通常位于編碼序列的上游，它不一定是與之鄰接。增強(qiáng)子不必是鄰接的。如果增強(qiáng)子增加了編碼序列的轉(zhuǎn)錄，那么增強(qiáng)子有效連接到編碼序列。有效連接的增強(qiáng)子可以位于編碼序列的上游，之內(nèi)或下游，并距啟動(dòng)子相當(dāng)?shù)木嚯x。如果多聚腺苷酸化位點(diǎn)以轉(zhuǎn)錄進(jìn)行通過編碼序列到聚腺苷酸化序列這樣一種方式位于編碼序列的下游，那么多聚腺苷酸化位點(diǎn)有效連接到編碼序列。連接是通過本領(lǐng)域中已知的重組方法，例如，使用PCR方法和/或通過在方便的限制性位點(diǎn)連接而完成的。如果不存在方便的限制性位點(diǎn)，那么根據(jù)常規(guī)實(shí)踐使用合成的寡核苷酸銜接頭或接頭。

在本發(fā)明的范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以用本領(lǐng)域已知的基本上任何類型的轉(zhuǎn)染方法來獲得。例如，核酸可以通過電穿孔或顯微注射的方法被引入細(xì)胞中。備選地，可使用脂轉(zhuǎn)染試劑如FuGENE 6(Roche Diagnostics GmbH，德國)，X-tremeGENE(Roche Diagnostics GmbH，德國)和LipofectAmine(Invitrogen Corp.，美國)。還備選地，核酸可以通過基于逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒或腺伴隨病毒的適當(dāng)病毒載體系統(tǒng)(Singer,O.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(2004)5313-5314)被引入到細(xì)胞中。

術(shù)語“細(xì)胞”或“宿主細(xì)胞”指可以或是在其中引入/轉(zhuǎn)染例如編碼異源多肽或組成性shRNA的核酸的細(xì)胞。宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞，其被用于載體/質(zhì)粒的繁殖，和真核細(xì)胞，其被用于核酸的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方式中，真核細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞是選自包含CHO細(xì)胞(如CHO K1或CHO DG44)、BHK細(xì)胞、NS0細(xì)胞、Sp2/0細(xì)胞、HEK 293細(xì)胞、HEK 293EBNA細(xì)胞、PER.C6細(xì)胞和COS細(xì)胞的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞選自雜交瘤、骨髓瘤和嚙齒動(dòng)物細(xì)胞。骨髓瘤細(xì)胞包括大鼠骨髓瘤細(xì)胞(例如YB2)和小鼠骨髓瘤細(xì)胞(例如NS0、Sp2/0)。在一個(gè)實(shí)施方式中，用于藥物應(yīng)用的多肽在哺乳動(dòng)物細(xì)胞如CHO細(xì)胞、NS0細(xì)胞、Sp2/0細(xì)胞、COS細(xì)胞、HEK細(xì)胞、BHK細(xì)胞、細(xì)胞等中產(chǎn)生。對(duì)于宿主細(xì)胞的發(fā)酵以及因此對(duì)于目的多肽的表達(dá)，使用了培養(yǎng)基。今天CHO細(xì)胞被廣泛地用于藥物多肽的表達(dá)，無論是實(shí)驗(yàn)室小規(guī)?；蛟谏a(chǎn)過程中的大規(guī)模。由于它們的廣泛分布和使用，CHO細(xì)胞的特性和遺傳背景是眾所周知的。因此，CHO細(xì)胞被監(jiān)管部門批準(zhǔn)用于生產(chǎn)應(yīng)用于人類的治療性蛋白。在一個(gè)實(shí)施方式中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞是CHO細(xì)胞。

“表達(dá)盒”是指一種核酸，其包含在宿主細(xì)胞中表達(dá)和分泌至少所含有的結(jié)構(gòu)基因所必需的元件。核酸同樣通過由其單個(gè)核苷酸的序列或由核酸分子編碼的氨基酸序列表征。

“基因”表示核酸，其是例如染色體上或質(zhì)粒上可實(shí)現(xiàn)肽、多肽或蛋白質(zhì)表達(dá)的區(qū)段。在編碼區(qū)旁邊，即結(jié)構(gòu)基因，基因包括其它功能元件例如信號(hào)序列、啟動(dòng)子、內(nèi)含子和/或終止子。

“結(jié)構(gòu)基因”表示基因沒有信號(hào)序列的區(qū)域，即編碼區(qū)。

如本文所用的術(shù)語“表達(dá)”指的是發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。在宿主細(xì)胞中的所需產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄水平可以基于存在于細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)mRNA的量來確定。例如，從所選核酸轉(zhuǎn)錄的mRNA可以通過PCR或通過Northern雜交來定量(參見Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))。由所選核酸編碼的蛋白質(zhì)可以通過各種方法來定量，例如，通過ELISA，通過用于蛋白質(zhì)的生物活性測(cè)定法，或通過采用測(cè)定獨(dú)立于這種活動(dòng)的測(cè)定法，例如Western印跡或放射性免疫測(cè)定法，通過使用識(shí)別并結(jié)合所述蛋白質(zhì)的抗體(參見Sambrook等人，1989，上文)。

無論是天然或合成產(chǎn)生的，“多肽”是通過肽鍵連接的氨基酸殘基的聚合物。少于約20個(gè)氨基酸殘基的多肽可被稱為“肽”。包含兩個(gè)或多個(gè)氨基酸鏈或包含100個(gè)氨基酸或以上長度的氨基酸鏈的多肽可被稱為“蛋白質(zhì)”。多肽或蛋白質(zhì)也可包含非肽組分，例如碳水化合物基團(tuán)或金屬離子。碳水化合物和其他非肽類取代基可以通過產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)的細(xì)胞被添加到蛋白質(zhì)中，并且可以隨著細(xì)胞的類型而變化。蛋白質(zhì)和多肽在本文中是針對(duì)它們的氨基酸主鏈結(jié)構(gòu)定義的；添加如碳水化合物基團(tuán)通常并無規(guī)定，但仍然可以存在。在一個(gè)實(shí)施方式中，多肽是免疫球蛋白，或免疫球蛋白片段，或免疫球蛋白綴合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，多肽是免疫球蛋白重鏈或免疫球蛋白輕鏈或其片段、融合物或其綴合物。

術(shù)語“選擇標(biāo)記”表示一種核酸，它允許攜帶該核酸的細(xì)胞在相應(yīng)的“篩選劑”的存在下被特異性選擇出來或選擇除去。有用的陽性選擇標(biāo)記是例如抗生素抗性基因。選擇標(biāo)記允許以其所轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在相應(yīng)的選擇劑的存在下進(jìn)行選擇；未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞不能夠在選擇性培養(yǎng)條件下(即在選擇劑存在下)生長或存活。選擇標(biāo)記可以是陽性、陰性或雙功能的。陽性選擇標(biāo)記允許對(duì)攜帶該標(biāo)記的細(xì)胞的篩選，而陰性選擇標(biāo)記允許選擇性地消除攜帶該標(biāo)記的細(xì)胞。典型地，選擇標(biāo)記將賦予藥物抗性或補(bǔ)償細(xì)胞中的代謝或分解缺陷。真核細(xì)胞中有用的選擇標(biāo)記包括，例如，氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)，如潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HYG)、新霉素和G418APH、二氫葉酸還原酶(DHFR)、胸苷激酶(TK)、谷氨酰胺合成酶(GS)、天冬酰胺合成酶、色氨酸合成酶(選擇劑吲哚)、組氨醇脫氫酶(選擇劑組氨醇D)的基因和提供對(duì)嘌呤霉素、博來霉素、腐草霉素、氯霉素、Zeocin和霉酚酸抗性的基因。進(jìn)一步的選擇標(biāo)記在WO 92/08796和WO 94/28143中報(bào)道。

術(shù)語“在適合于所述多肽表達(dá)的條件下”表示被用于表達(dá)異源多肽的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的或可以容易地確定的條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員還已知，這些條件可根據(jù)培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的類型和表達(dá)的蛋白質(zhì)的類型而變化。通常，哺乳動(dòng)物細(xì)胞是在例如20℃和40℃之間的溫度培養(yǎng)，并在從0.1升至10⁷升的體積中培養(yǎng)足以允許有效生產(chǎn)蛋白質(zhì)的一段時(shí)間，例如4至28天。

在本申請(qǐng)中使用的術(shù)語“多肽的回收”是指沉淀、鹽析、超濾、滲濾、凍干、溶劑體積減少得到濃縮液，或?qū)游龇?。通常，層析方法被用于多肽的分離和純化。不同的方法已經(jīng)確立并廣泛用于蛋白質(zhì)的回收和純化，如用微生物蛋白質(zhì)的親和層析(例如蛋白A或蛋白G親和層析)，離子交換層析(例如陽離子交換(羧甲基樹脂)，陰離子交換(氨基乙基樹脂)和混合模式交換)，親硫吸附(例如，用β-巰基乙醇和其它SH配體)，疏水相互作用或芳香族吸附層析(例如，使用苯基-瓊脂糖，氮雜－arenophilic樹脂，或間氨基苯基硼酸)，金屬螯合物親和層析(例如使用Ni(II)-和Cu(II)-親和性材料)，尺寸排阻層析，和電泳方法(如凝膠電泳，毛細(xì)管電泳)(Vijayalakshmi,M.A.,Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。

術(shù)語“免疫球蛋白”是指包括至少兩個(gè)所謂的輕鏈多肽(輕鏈)和兩個(gè)所謂的重鏈多肽(重鏈)的分子。每個(gè)重鏈和輕鏈多肽包含可變結(jié)構(gòu)域(可變區(qū))(一般為多肽鏈的氨基末端部分)，其包含能夠與抗原相互作用的結(jié)合區(qū)。每個(gè)重鏈和輕鏈多肽還包含恒定區(qū)(通常是羧基端部分)。重鏈的恒定區(qū)介導(dǎo)免疫球蛋白ⅰ)與帶有Fcγ受體(FcγR)的細(xì)胞，如吞噬細(xì)胞或ii)或與帶有新生Fc受體(FcRn，也被稱為Brambell受體)的細(xì)胞的結(jié)合。它也介導(dǎo)與一些因子的結(jié)合，包括諸如組分(C1q)的經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的因子。

術(shù)語“免疫球蛋白”在本文中以最廣義使用，并且包括各種免疫球蛋白結(jié)構(gòu)，包括但不限于單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)和免疫球蛋白片段，只要它們展現(xiàn)出期望的抗原結(jié)合活性。

根據(jù)重鏈的恒定區(qū)的氨基酸序列，免疫球蛋白分為不同類：IgA類、IgD類、IgE類、IgG類和IgM類。這些類中的一些被進(jìn)一步分成亞類(同種型)，即在IgG中的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，或在IgA中的IgA1和IgA2。根據(jù)免疫球蛋白所屬的類，重鏈恒定區(qū)分別被稱為δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)和μ(IgM)。在一個(gè)實(shí)施方式中，免疫球蛋白是IgG類的免疫球蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方式中，免疫球蛋白具有人恒定區(qū)或源自于人源的恒定區(qū)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，免疫球蛋白是IgG4亞類或IgG1或IgG2或IgG3亞類，它們以下述的方式被修飾，即沒有Fcγ受體(例如FcγRIIIa)結(jié)合和/或沒有Clq結(jié)合可以被檢測(cè)到。在一個(gè)實(shí)施方式中，免疫球蛋白是人IgG4亞類或突變的人IgG1亞類。在一個(gè)實(shí)施方式中，免疫球蛋白是具有突變L234A和L235A的人IgG1亞類。在另一個(gè)實(shí)施方式中，免疫球蛋白是關(guān)于IgG4亞類的或IgG1的或IgG2亞類的Fcγ受體結(jié)合(在L234、L235和/或D265中有突變)，和/或包含PVA236突變。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，免疫球蛋白具有選自S228P，L234A，L235A，L235E，SPLE(S228P和L235E)，和/或PVA236(PVA236意指來自IgG1的氨基酸位置233至236的氨基酸序列ELLG(以單字母氨基酸代碼給出)或IgG4的EFLG被PVA取代)的突變。在一個(gè)實(shí)施方式中，免疫球蛋白是IgG4亞類的，并具有IgG4的突變S228P，或者免疫球蛋白是IgG1亞類的，并具有突變L234A和L235A。

免疫球蛋白的輕鏈或重鏈的可變結(jié)構(gòu)域相應(yīng)地包含不同的區(qū)段，即，四個(gè)構(gòu)架區(qū)(FR)和三個(gè)高變區(qū)(CDR)。

“免疫球蛋白片段”表示在包含下組結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的多肽，所述組包括免疫球蛋白的重鏈的可變結(jié)構(gòu)域、C_H1結(jié)構(gòu)域、鉸鏈區(qū)、C_H2結(jié)構(gòu)域、C_H3結(jié)構(gòu)域、C_H4結(jié)構(gòu)域或免疫球蛋白輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域或C_L結(jié)構(gòu)域。也包括衍生物及其變體?？梢源嬖诹硗獾目勺兘Y(jié)構(gòu)域，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸或氨基酸的區(qū)域被缺失。

“免疫球蛋白綴合物”表示包含通過肽鍵綴合到另一多肽的免疫球蛋白重鏈或輕鏈的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的多肽。另一多肽是非免疫球蛋白肽，例如激素、生長受體、抗融合肽等。

提供以下實(shí)施例、附圖和序列表，以幫助理解本發(fā)明，本發(fā)明的真正范圍在所附的權(quán)利要求中給出。可以理解的是可以在所提出的步驟中進(jìn)行修改而不脫離本發(fā)明的精神。

序列表的說明

SEQ ID NO:01人CMV主要立即早期(hCMV-MIE)啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的核苷酸序列

SEQ ID NO:02相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，在位置-41具有C到G點(diǎn)突變的hCMV-MIE啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的核苷酸序列

SEQ ID NO:03相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，在位置-179具有C到G點(diǎn)突變的hCMV-MIE啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的核苷酸序列

SEQ ID NO:04包括去穩(wěn)定化PEST序列的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)的核苷酸序列

SEQ ID NO:05包括信號(hào)肽的分泌型堿性磷酸酶(SEAP)的核苷酸序列。

SEQ ID NO:06相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，在位置-41和-179具有C到G點(diǎn)突變的hCMV-MIE啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的核苷酸序列

附圖說明

圖1：分泌型堿性磷酸酶(SEAP)表達(dá)質(zhì)粒p5532的質(zhì)粒圖譜

圖2：增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)表達(dá)質(zhì)粒p16111的質(zhì)粒圖譜

圖3：細(xì)胞培養(yǎng)物上清液的稀釋過程

圖4：無(斜線柱)或用DAC處理(垂直陰影柱)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞懸浮液的歸一化的SEAP表達(dá)水平。表示出被用于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒。誤差線代表八(無DAC)或4(有DAC)個(gè)生物學(xué)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差。也示出了模擬物轉(zhuǎn)染的CHO-K1細(xì)胞(兩個(gè)生物學(xué)重復(fù))的背景信號(hào)。

圖5：在正向散射(FSC)/側(cè)向散射(SSC)點(diǎn)圖中未轉(zhuǎn)染的CHO-K1細(xì)胞的存活柵。相同的柵被施用于相同的FACS測(cè)定法的所有樣本。

圖6：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的培養(yǎng)物的eGFP熒光的存活柵直方圖。熒光用Alexa Fluor 488通道在激發(fā)波長488nm下測(cè)量。兩個(gè)峰能夠被辨別為代表非eGFP表達(dá)者(左峰)和高eGFP表達(dá)者(右峰)的兩個(gè)主要亞群。

圖7：使用質(zhì)粒16107、16109或16111穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后六周CHO細(xì)胞的獨(dú)立池的eGFP表達(dá)水平。點(diǎn)代表單個(gè)CHO池的熒光強(qiáng)度的幾何平均數(shù)。

圖8：使用質(zhì)粒16107或16111穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后六周CHO細(xì)胞的獨(dú)立池的eGFP表達(dá)水平。點(diǎn)代表單個(gè)CHO池的熒光強(qiáng)度的幾何平均數(shù)。

圖9：IgG類抗體表達(dá)質(zhì)粒p21504的質(zhì)粒圖譜

圖10：用質(zhì)粒16134(CGG)、16135(CGC)或16136(CCG)或21504(CCC)轉(zhuǎn)染后68天(A)或134天(B)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞池的抗體效價(jià)(μg/ml)。點(diǎn)代表單個(gè)CHO池的抗體效價(jià)的幾何平均數(shù)。

圖11：用質(zhì)粒16134(CGG)、16135(CGC)或16136(CCG)或21504(CCC)轉(zhuǎn)染后68天(A)或131天(B)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞池的比生產(chǎn)力(qP)。點(diǎn)代表單個(gè)CHO池的比生產(chǎn)力的幾何平均數(shù)。

圖12：突變體與對(duì)照用Tukey HSD檢驗(yàn)(ΔqP平均值)的平均值比較。

實(shí)施例1

通用技術(shù)

重組DNA技術(shù)

按照在Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y,(1989)所述，使用標(biāo)準(zhǔn)方法操作DNA。根據(jù)制造商的說明使用分子生物學(xué)試劑。

DNA序列測(cè)定

DNA測(cè)序是在SequiServe GmbH(瓦特斯蒂恩，德國)進(jìn)行。

DNA和蛋白質(zhì)序列分析和序列數(shù)據(jù)管理

EMBOSS(歐洲分子生物學(xué)開放軟件套裝)軟件包和Invitrogen的Vector NTI 9.1版本用于序列創(chuàng)建、繪圖、分析、注釋和說明。

用于抗體分析的樣品制備：

計(jì)算細(xì)胞濃度并且每樣品取2ml進(jìn)行離心(500g，在20-30℃下5分鐘)。將上清液轉(zhuǎn)移至新的96深孔板并在使用前儲(chǔ)存在-20℃。將冷凍的上清液在4℃解凍過夜，6×倒置離心(4000rpm，在20-30℃下30分鐘)。將310μl通過離心(1200rpm，在20-30℃下3分鐘)過濾，將多孔Millipore板放在帶條碼的96圓孔板頂上。

實(shí)施例2

重組CHO細(xì)胞系的產(chǎn)生

用攜帶報(bào)告基因的載體，或瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞懸浮液，所述報(bào)告基因在人CMV主要立即早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子片段(野生型(SEQ ID NO:01)，或含有C到G點(diǎn)突變)的控制下，所述報(bào)告基因是分泌型堿性磷酸酶(SEAP：圖1；SEQ ID NO:05)或者是增強(qiáng)的綠色熒光蛋白(eGFP：圖2)或IgG類的人抗體構(gòu)建體(在WO 2014023752報(bào)道的IgG細(xì)胞因子(IL2)融合蛋白；圖9)。在hCMV-MIE片段內(nèi)的CpG二核苷酸的C到G突變C-508、C-179和C-41被單獨(dú)或以各種組合插入來提高長期穩(wěn)定性(表1)。C到G的突變是通過它們距轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)的距離來鑒定的。突變是使用QuikChange Multi－Site－Directed Mutagnesis試劑盒(Agilent Technologies，Waldbronn，德國)插入的。載體進(jìn)一步包括編碼鼠二氫葉酸還原酶(DHFR)的核酸序列(圖1、2和9)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染用Amaxa核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)進(jìn)行(Lonza Cologne GmbH，科隆，德國)。

表1：在人CMV主要立即早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子片段內(nèi)的CpG二核苷酸的C到G點(diǎn)突變的組合

例如，根據(jù)制造商的方案，使用Nucleofector設(shè)備組合Nucleofector試劑盒V(Lonza Cologne GmbH，科隆，德國)，將用于SEAP瞬時(shí)表達(dá)的環(huán)形質(zhì)粒DNA或?qū)⒂糜趀GFP穩(wěn)定表達(dá)的線性化質(zhì)粒DNA或用于IgG類抗體融合蛋白的穩(wěn)定表達(dá)的適當(dāng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞。將瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞懸浮液接種在96孔板中并培養(yǎng)5天。通過化學(xué)反應(yīng)的顏色變化，在Tecan-Reader SECTRAFluor Plus(Tecan Deutschland GmbH,Crailsheim,Germany)中檢查SEAP濃度。

將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞懸浮液接種到含有游離胸苷培養(yǎng)基的384或6孔板中(以250至1600nM甲氨蝶呤(MTX)作為選擇劑)。三至四周后，檢查表達(dá)eGFP的細(xì)胞庫或表達(dá)抗體的細(xì)胞庫在1-3個(gè)月的長期穩(wěn)定性。通過流式細(xì)胞術(shù)檢查eGFP的表達(dá)強(qiáng)度。在384和96孔板中接種表達(dá)抗體的單細(xì)胞克隆。三周后，通過ELISA測(cè)量培養(yǎng)基中的抗體效價(jià)來鑒定表達(dá)抗體的細(xì)胞系。隨機(jī)挑選生長細(xì)胞，并且為了長期穩(wěn)定性測(cè)定，以更高體積(在6孔板中每孔3ml)擴(kuò)增細(xì)胞克隆并在每次傳代結(jié)束時(shí)，用蛋白AHPLC和ELISA測(cè)定抗體濃度。

在標(biāo)準(zhǔn)加濕條件下(95％rH，37℃和5％至8％CO₂)，將細(xì)胞以120rpm/min至150rpm/min的恒定攪拌速率在一次性125ml通氣搖瓶中繁殖。每3-4天將細(xì)胞分傳到新鮮培養(yǎng)基中。采用Cedex HiRes細(xì)胞計(jì)數(shù)器(Roche Innovates AG,Bielefeld,德國)測(cè)定培養(yǎng)物的密度和活力。此外，按照例如Current Protocols in Cell Biology,Binifacino,J.S.et al.(編),John Wiley&Sons,Inc.,New York(2000)所描述的應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。

實(shí)施例3

長期培養(yǎng)和生產(chǎn)

調(diào)查根據(jù)實(shí)施例2得到的、在人CMV主要立即早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子片段內(nèi)含有CpG點(diǎn)突變的各種CHO細(xì)胞池(表1)的長期生產(chǎn)力。

將細(xì)胞在選擇劑的MTX的存在下轉(zhuǎn)染后，測(cè)試生產(chǎn)穩(wěn)定性2至3個(gè)月。細(xì)胞在125ml含帶有選擇劑的20-40ml培養(yǎng)基的搖瓶中通風(fēng)連續(xù)培養(yǎng)，用新鮮培養(yǎng)基一周稀釋兩次。接種密度為2至3×10⁵細(xì)胞/ml。傳代之前測(cè)定活細(xì)胞的密度和生存力。

在每次傳代結(jié)束，用蛋白A HPLC和ELISA測(cè)定上清液的抗體濃度(抗體效價(jià))。從這些數(shù)據(jù)中，用下列公式計(jì)算每次傳代的細(xì)胞比生產(chǎn)力(qP)：

$qP=\frac{P2-P1}{(D2-D1)/2*\mathrm{\&Delta;}t}$

qP[pg/細(xì)胞/d]：細(xì)胞比生產(chǎn)力，

P₁[μg/ml]：在傳代開始時(shí)的抗體效價(jià)，

P₂[μg/ml]：在傳代結(jié)束時(shí)的抗體效價(jià)，

D₁[細(xì)胞/ml]：在傳代開始時(shí)的活細(xì)胞密度，

D₂[細(xì)胞/ml]：在傳代結(jié)束時(shí)的活細(xì)胞密度，

Δt[d]：傳代的持續(xù)時(shí)間。

該qP值是針對(duì)在世代中各傳代結(jié)束時(shí)的培養(yǎng)物年齡繪制的。在全部qP數(shù)據(jù)點(diǎn)上計(jì)算線性趨勢(shì)線，并且根據(jù)下面的等式內(nèi)部計(jì)算在此期間的qP的相對(duì)改變(百分比)：

$\mathrm{\&Delta;}qP-\frac{m*a}{{\mathrm{qP}}_0*100}$

ΔqP[％]：QP的改變百分比，

M[pg/細(xì)胞/d/世代]：線性趨勢(shì)線的斜率，

a[世代數(shù)]：培養(yǎng)物的年齡，

qP₀：線性趨勢(shì)線的y軸截距。

考慮到在hCMV-MIE啟動(dòng)子變體的穩(wěn)定性試驗(yàn)中得到的數(shù)據(jù)點(diǎn)數(shù)目較少，對(duì)每個(gè)樣品，將最后三個(gè)qP值的平均值除以前兩個(gè)Qp值的平均值并且以百分?jǐn)?shù)顯示以得到ΔqP。

平均qP EOS：最后三個(gè)qP值的平均值

平均qP PSB：前兩個(gè)qP值的平均值

實(shí)施例4

在不同的人CMV主要立即早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子片段的控制下，報(bào)告基因表達(dá)的定量。

a)在不同的人CMV主要立即早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子片段控制下的SEAP表達(dá)的定量

按照制造商的方案，使用Nucleofector設(shè)備結(jié)合Nucleofector Kit V(Lonza Cologne GmbH，科隆，德國)在Amaxa Shuttle 96孔板中，用環(huán)形質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞用于SEAP的瞬時(shí)表達(dá)。將每質(zhì)粒12瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞懸浮液在96孔板中接種并培養(yǎng)5天。在第2天，每質(zhì)粒一式四份加入5'-氮雜-2'-脫氧胞苷(DAC)到最終濃度1μM以使DNA脫甲基化。在Tecan Reader SECTRAFluor Plus(Tecan Deutschland GmbH,Crailsheim，德國)上檢查SEAP濃度。

按以下方案通過pNPP(對(duì)硝基苯基磷酸)向pNP(對(duì)硝基苯酚)的代謝率來檢查SEAP的相對(duì)濃度：

表2：用于SEAP測(cè)定法的溶液：

在多個(gè)步驟中將150μl的經(jīng)離心的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液以1：3稀釋(圖3)。

在新的96孔板中添加50μl稀釋液并與50μl底物溶液混合。5分鐘后，使用SECTRAFluor Plus光度計(jì)(Tecan Deutschland GmbH，Crailsheim，德國)，以405nm波長測(cè)量光密度。

將未經(jīng)DAC處理的每質(zhì)粒8個(gè)重復(fù)的平均數(shù)與經(jīng)DAC處理的每質(zhì)粒4個(gè)重復(fù)的平均數(shù)(表1)進(jìn)行歸一化來控制沒有點(diǎn)突變的質(zhì)粒(p5532)(圖4)。

沒有檢測(cè)到在人CMV主要立即早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子片段中具有點(diǎn)突變的質(zhì)粒和未突變的對(duì)照質(zhì)粒5532之間的顯著差異。此外，在具有和沒有DAC處理的樣品之間沒有觀察到顯著差異，表明轉(zhuǎn)染后5天之內(nèi)沒有發(fā)生顯著的啟動(dòng)子沉默。因此可以得出結(jié)論，被引入到人CMV主要立即早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子片段的點(diǎn)突變不影響啟動(dòng)子強(qiáng)度(點(diǎn)突變對(duì)人CMV立即早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子片段的直接效力沒有影響)。

b)通過FACS對(duì)在不同的人CMV主要立即早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子片段的控制下的eGFP表達(dá)的量化

將表達(dá)eGFP的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞懸浮液培養(yǎng)1-3個(gè)月的時(shí)間。使用BD FACS Canto II或BD FACS Calibur(BD,Heidelberg，德國)測(cè)量eGFP的表達(dá)強(qiáng)度。使用BD FACS Diva軟件v6.12或Cell Quest Pro Software(BD,Heidelberg，德國)進(jìn)行數(shù)據(jù)收集。用FlowJo 7.6.5EN軟件(TreeStar，Olten，瑞士)進(jìn)行主要的數(shù)據(jù)分析。

對(duì)于實(shí)施例，用BD FACS Calibur在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢查CHO細(xì)胞懸液16105、16106、16107、16108、16109、16110和16111以檢測(cè)eGFP的表達(dá)。所有樣品以3-4個(gè)生物學(xué)重復(fù)進(jìn)行檢查。測(cè)量每個(gè)樣品10000個(gè)事件?；罴?xì)胞的柵極用未轉(zhuǎn)染的CHO-K1細(xì)胞定義并且施用到相同的FACS實(shí)驗(yàn)中的所有樣品(圖8)。

活細(xì)胞的eGFP熒光以488nm(Alexa Fluor 488通道)的激發(fā)波長和大約516nm的發(fā)射波長進(jìn)行測(cè)量。圖6示出了活柵極事件的熒光強(qiáng)度的直方圖。

熒光數(shù)據(jù)用FlowJo 7.6.5EN軟件進(jìn)行分析。用FlowJo計(jì)算在活柵極中eGFP表達(dá)的幾何平均數(shù)、平均值和中值。進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)分析用JMP軟件版本10(SAS，德國)完成。

實(shí)施例5

eGFP表達(dá)和人CMV主要立即早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子片段的C到G的點(diǎn)突變的相關(guān)性。

如實(shí)施例2所述產(chǎn)生8個(gè)(質(zhì)粒16107)或10個(gè)(質(zhì)粒16109或16111)個(gè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的池并且培養(yǎng)。如實(shí)施例4所述測(cè)量eGFP強(qiáng)度。

將eGFP強(qiáng)度的幾何平均數(shù)用于相關(guān)性研究并以圖表顯示(圖7&8)。為確定質(zhì)粒16107和16109相比于對(duì)照質(zhì)粒16111之間的顯著差異，使用Dunnett's檢驗(yàn)。

計(jì)算在長期培養(yǎng)期間的不同時(shí)間點(diǎn)的eGFP的強(qiáng)度的幾何平均數(shù)的P值(表3)。將顯著差異的限制設(shè)置為p<0.005。

表3：轉(zhuǎn)染了質(zhì)粒16107、16109或16111的CHO池的幾何平均數(shù)的p值

例如，檢測(cè)在轉(zhuǎn)染6-周和8周(取樣日期03-14至03-25)之間的質(zhì)粒16109和對(duì)照質(zhì)粒16111之間的顯著差異(參見表3)。長期穩(wěn)定性測(cè)定法的結(jié)果與SEAP測(cè)定法的結(jié)果相結(jié)合顯示出C到G點(diǎn)突變C-41對(duì)報(bào)告基因表達(dá)的穩(wěn)定性有積極影響，而不會(huì)影響啟動(dòng)子強(qiáng)度。

質(zhì)粒16107和16111在第二次計(jì)算中成對(duì)比較。對(duì)熒光強(qiáng)度的幾何平均值作圖并使用Dunnett's檢驗(yàn)計(jì)算p值(見表4)。

表4：CHO細(xì)胞系16107和16111的幾何平均數(shù)的p值

質(zhì)粒16107顯示出相對(duì)于對(duì)照質(zhì)粒提高的生產(chǎn)穩(wěn)定性，即C到G點(diǎn)突變C-179增加了報(bào)告基因表達(dá)的穩(wěn)定性，而不會(huì)影響啟動(dòng)子強(qiáng)度。

實(shí)施例6

在不同的人CMV主要立即早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子片段的控制下抗體生產(chǎn)的量化

a)用HPLC量化抗體產(chǎn)生：

使用層析方法來量化樣品中存在的抗體量。使用結(jié)合抗體的Fc區(qū)的PorosA柱?？贵w結(jié)合到柱上，隨后通過低pH條件洗脫。通過測(cè)定280nm處的光密度(OD)，用320nm為參照波長，使用基于氨基酸序列計(jì)算出的摩爾消光系數(shù)來建立蛋白質(zhì)濃度。

b)用ELISA量化抗體產(chǎn)生：

ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)技術(shù)是基于抗體夾層原理。對(duì)目標(biāo)分析物特異的捕獲抗體例如IgG的Fc部分結(jié)合至微量滴定板(Maxisorp，Inhouse，Roche)以創(chuàng)建固相。在封閉和洗滌步驟后，將樣品、標(biāo)準(zhǔn)品(參照Ab的稀釋系列)和對(duì)照隨后用固相抗體孵育，其捕獲分析物。洗去未結(jié)合的分析物后，加入綴合的檢測(cè)抗體(例如，POD綴合的)。該檢測(cè)抗體結(jié)合到被測(cè)量的分子的不同的表位，完成夾層。BM Chemiluminescence ELISA Substrate POD(Roche,Penzberg,德國)提供了基于過氧化物酶(POD，HRP)的二級(jí)檢測(cè)系統(tǒng)的底物溶液。在免疫測(cè)定中的信號(hào)產(chǎn)生的速率與結(jié)合于固相的標(biāo)記酶的量成正比。

實(shí)施例7

抗體生產(chǎn)/效價(jià)和人CMV主要立即早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子片段的C到G點(diǎn)突變的相關(guān)性。

通過使用ELISA技術(shù)來檢查抗體(IgG-IL2融合蛋白)濃度并計(jì)算出抗體效價(jià)(ug/ml)，以及每個(gè)細(xì)胞和天(qP)的比生產(chǎn)力。顯示出培養(yǎng)階段開始和結(jié)束時(shí)的測(cè)量以可視化突變體與對(duì)照的差異和培養(yǎng)過程中表達(dá)的變化。由此，培養(yǎng)階段開始和結(jié)束效價(jià)表明在所有突變體中抗體生產(chǎn)相比于對(duì)照的改進(jìn)(圖10A和B)。

通過Tukey HSD檢驗(yàn)來比較克隆細(xì)胞系的效價(jià)(表5)。計(jì)算突變與未突變啟動(dòng)子變體的效價(jià)差異的P值。比較在培養(yǎng)階段的效價(jià)。顯著性水平設(shè)定為0.05(5％)。

表5

例如，在除了轉(zhuǎn)染后第127天的整個(gè)培養(yǎng)階段，CGC突變體與對(duì)照顯著不同。

效價(jià)的比較表明，所有突變細(xì)胞懸液具有每體積高于對(duì)照的抗體生產(chǎn)力。

需要澄清的是表達(dá)強(qiáng)度或細(xì)胞濃度是否是效價(jià)差異的主要效應(yīng)子。

為此目的，比較了整個(gè)培養(yǎng)階段突變體與對(duì)照的每個(gè)細(xì)胞和天數(shù)(qP)的抗體表達(dá)。從培養(yǎng)階段開始(圖11A)到結(jié)束(圖11B)的qP值表現(xiàn)與效價(jià)值相當(dāng)，與對(duì)照的明顯差異較少。

獲得培養(yǎng)開始時(shí)的CGC和CGG突變體的較高效價(jià)。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，CCG和CGG突變體獲得了比對(duì)照稍高的qPs。CGC突變細(xì)胞在培養(yǎng)階段結(jié)束時(shí)具有較高的qP值。

將突變和未突變的細(xì)胞系的比生產(chǎn)力與Tukey HSD檢驗(yàn)進(jìn)行比較(表6)。從而，CGC突變體與未突變的對(duì)照的差異隨時(shí)間增加。對(duì)于CCG突變，也得到qP值的增加。

表6Tukey HSD檢驗(yàn)計(jì)算hCMV MIE啟動(dòng)子突變體qPs相比未突變對(duì)照的P值

顯著性水平設(shè)定為0.05(5％)。

考慮到單突變的細(xì)胞系與未突變的細(xì)胞系的qP值的時(shí)間依賴性增加差異，提出了更高的穩(wěn)定性。為了檢驗(yàn)這一假設(shè)，計(jì)算比生產(chǎn)力的相對(duì)改變。

通過對(duì)前兩個(gè)(PSB＝68&83天)和最后三個(gè)(EOS＝124、127及131天)qP值取平均數(shù)，比生產(chǎn)力在第一天和分裂依賴性變化穩(wěn)定化。在第二步驟中，將qP的改變被定義為穩(wěn)定的結(jié)束到穩(wěn)定的開始點(diǎn)的百分比比率。

平均的qP EOS：最后三個(gè)qP的平均數(shù)

平均的qP PSB：前兩個(gè)qP的平均數(shù)

相比于未突變的對(duì)照，包括CGC和CCG啟動(dòng)子突變體的單克隆細(xì)胞系的長期穩(wěn)定性較高(圖12)。G-41啟動(dòng)子突變體在整個(gè)培養(yǎng)階段是穩(wěn)定的，而G-179點(diǎn)突變?cè)斐蒊gG表達(dá)隨時(shí)間增加(平均％ΔqP)。雙突變CGG在開始時(shí)具有高表達(dá)值，但隨著時(shí)間的推移而降低。

表7

以0.05(5％)的顯著性水平比較克隆細(xì)胞系的％ΔqPs。

包括hCMV-MIE啟動(dòng)子變體CGC(16135)及CCG(16136)的單克隆細(xì)胞系比未突變的對(duì)照(21504)顯著更穩(wěn)定。