技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明總體上涉及用于診斷測定的具有集成的測定對照的微量測定盒和具有光學(xué)、熱、機(jī)械和氣動液壓系統(tǒng)的緊湊型熒光檢測儀器。

相關(guān)領(lǐng)域的描述

分子診斷的作用在當(dāng)今全球醫(yī)療保健環(huán)境中至關(guān)重要。在發(fā)展中國家，95％的死亡是由于缺乏對傳染病的適當(dāng)診斷和相關(guān)后續(xù)治療造成的；例如急性呼吸道感染(ARI)、瘧疾、HIV和結(jié)核病(TB)(Yager,P等，Annu Rev Biomed Eng 10:107-144,2008)。最近的流行病(諸如2009年H1N1流感大流行)強(qiáng)調(diào)了對有效檢測和控制傳染病的工具的需要。包括快速病原體突變率、非人病原體至人病原體的轉(zhuǎn)化以及非人病原體與人病原體的重組的因素已經(jīng)加大了管理新型傳染病的挑戰(zhàn)(Kiechle,FL等，Clin Lab Med 29(3):555-560,2009)。增加的全球流動性有助于傳染病從原發(fā)地區(qū)迅速傳播到世界其他地區(qū)，如2009年H1N1大流行期間所見。檢測感染性病原體所需的當(dāng)前實驗室培養(yǎng)方法花費(fèi)一天或更多時間來提供結(jié)果。這些問題突出了在入境口岸對快速、便攜式診斷現(xiàn)場護(hù)理(point-of-care，POC)設(shè)備的需要，以防止感染的全球傳播。

在發(fā)達(dá)和發(fā)展中世界中，對某些類型的感染的診斷測試需要定期重復(fù)，以測量對治療的反應(yīng)和監(jiān)測疾病狀況。一個這樣的情況是監(jiān)測如HIV(人免疫缺陷病毒)和丙型肝炎的感染的病毒載量(每毫升血液的病毒顆粒數(shù))。撒哈拉以南非洲是受艾滋病大流行嚴(yán)重影響的地區(qū)。該地區(qū)缺乏標(biāo)準(zhǔn)實驗室設(shè)施和訓(xùn)練有素的實驗室技術(shù)人員是嚴(yán)重的瓶頸。在美國醫(yī)療服務(wù)不足的地區(qū)也存在類似的問題?？梢苑稚⒃谡麄€社區(qū)(甚至可能家中)以方便獲取的快速、低成本的診斷工具，將通過允許更快速地診斷和監(jiān)測疾病和感染提供實質(zhì)性的好處。

自從其出現(xiàn)以來，微流體已顯示出巨大的潛力成為體外診斷(IVD)的重要工具?；谖⒘黧w的IVD的“圣杯”是提供手持式或便攜式，獨(dú)立的，自校準(zhǔn)的，自動化的和廉價的裝置，其能夠使用最少量的原始樣品對多種分析物進(jìn)行快速，特異性，靈敏的和定量的測試。然而，到目前為止，只有非常有限的微流體裝置已被成功地開發(fā)并商業(yè)化用于此類應(yīng)用。獨(dú)立微流體裝置的發(fā)展面臨的一個顯著技術(shù)挑戰(zhàn)是系統(tǒng)集成，其需要將氣動、流體、機(jī)械、電子和光學(xué)單元組合至有限的空間中。將這些功能單元接口和集成至可高效地制備測試樣品以用于分析和精確檢測靶分析物的單個穩(wěn)健的微流體裝置中仍然是一個持續(xù)的挑戰(zhàn)。

其他挑戰(zhàn)涉及測定驗證和質(zhì)量控制。監(jiān)管機(jī)構(gòu)規(guī)定的當(dāng)前標(biāo)準(zhǔn)要求通過使用對照來監(jiān)測和驗證基于診斷的健康護(hù)理決策中使用的所有測定程序的準(zhǔn)確性和可靠性。這些對照包括過程對照和功能性驗證提取、擴(kuò)增和診斷過程的陽性和陰性對照。對相同樣品并在與測試測定相同的測試孔中進(jìn)行過程對照，但使用不同的引物和/或探針組來檢測總是存在于測定樣品中的對照靶。相反，陽性和陰性對照使用與測試樣品相同的引物和/或探針以及嵌入孔中的已知量的測定靶(在陰性對照的情況下為零)在分開的測定孔中來進(jìn)行。雖然幾個商購可得的微流體診斷系統(tǒng)，諸如BD Diagnostics BC MAX^TM系統(tǒng)和Cepheid系統(tǒng)運(yùn)行在卡(on-card)過程對照，但是兩個系統(tǒng)都不提供具有集成的陽性和陰性對照的測試卡。外部對照可由測試制造商作為附屬對照試劑盒(來源于如產(chǎn)品包裝插頁中指定的第三方供應(yīng)商)提供，或由采購實際樣品的客戶提供。

在運(yùn)行外部陽性和陰性測定對照的需要中存在幾個顯著的不利方面。當(dāng)陽性和陰性測定對照不是集成測試盒的一部分時，固有的批次間試劑變化和/或降解可能損害測定結(jié)果的驗證。對于終端用戶，需要額外的成本和時間來獲得另外的對照試劑和裝置并進(jìn)行分開的對照測定。此外，通常由終端用戶決定對照測試的適當(dāng)頻率，這給用戶帶來額外的負(fù)擔(dān)。當(dāng)運(yùn)行多重測定時，這些缺點(diǎn)變得越來越顯著，并且在資源貧乏的環(huán)境中受到特別關(guān)注。

另一個挑戰(zhàn)是便攜性。雖然使用熒光團(tuán)作為體外診斷測定的探針的益處是眾所周知的，但用于此類測定的最常見可用形式的裝備是大的，使用復(fù)雜的，相對緩慢的并且依賴昂貴的共聚焦光學(xué)器件。這些屬性使得許多設(shè)備不適合于偏遠(yuǎn)地區(qū)和現(xiàn)場護(hù)理的全面集成的“采樣-應(yīng)答”測試，在那里需要此類設(shè)備是堅固、快速、緊湊、便宜且易于使用的。

這些聯(lián)鎖問題的同時解決只有通過通常在這種高度不可預(yù)測的技術(shù)中通過試錯來指導(dǎo)的充分實驗和開發(fā)來實現(xiàn)。因此，本領(lǐng)域需要許多改進(jìn)，其要素是本文公開內(nèi)容的主題。

概述

本發(fā)明的實施方案通過提供若干改進(jìn)的盒特征并將過程對照以及陽性和陰性測定對照集成到盒設(shè)計中，來解決微流體盒中的熒光信號的可靠且有效的檢測的問題。本發(fā)明的微流體盒通過消除對分子測試運(yùn)行外部測定對照的需要，向終端用戶提供了幾個相當(dāng)有利的方面。本發(fā)明的集成的陽性和陰性測定對照還提供了將針對一種或多種目標(biāo)分析物的診斷測試結(jié)果作為陽性或陰性評分的更精確的方法。

本文公開的一些實施方案總體上涉及微量測定盒，其由封裝氣動回路的第一模制殼體、封裝液壓回路的第二模制殼體、連接至液壓回路的樣品入口、第一與第二模制殼體之間的含有多個氣動液壓膜的層壓層、連接到液壓回路的測定孔組件以及用于接收氣動脈沖的氣動端口陣列(其連接至第一模制殼體中的氣動回路并控制氣動液壓膜的操作)組裝而來。已經(jīng)有利地發(fā)現(xiàn)，將氣動回路分隔至第一模制殼體中并將液壓回路分隔至第二模制殼體中通過防止已被發(fā)現(xiàn)造成功能故障的氣動管線與液壓管線的交叉而增加了盒的穩(wěn)健性。

在本發(fā)明的一個方面，盒的液壓回路包括連接至樣品入口的測試測定回路和不連接至樣品入口的對照測定回路。在一些方面，對照樣品回路可被分成陽性對照測定回路和陰性對照測定回路。在一些方面，陽性對照測定回路連接至陰性對照測定回路，而在其它方面，它們不連接。每個測定和對照回路可被進(jìn)一步連接至多個測定孔，在一些方面，每個回路連接至1至3個測定孔。在優(yōu)選的方面，每個回路連接至3個測定孔。在另一方面，每個測定孔被配置來運(yùn)行附加的過程對照。在另一方面，將陽性對照核酸模板嵌入陽性對照測定孔。

在本發(fā)明的另一方面，微量測定盒包括核酸捕獲組件，其由中空殼體和支撐在殼體內(nèi)部的核酸捕獲膜組裝而成。在一些方面，核酸捕獲膜由氧化硅纖維制造。在其它方面，核酸捕獲組件還包括支持捕獲膜的上表面和下表面的兩種支持介質(zhì)。支持介質(zhì)可被稱為“玻璃料”并且由制造?；蛘?，支持介質(zhì)可以是聚丙烯墊圈型結(jié)構(gòu)。

在其它方面，微量測定卡還包括并入具有多個測定孔的PCR孔層以用于進(jìn)行靶序列的擴(kuò)增和熒光檢測的測定孔組件。在一些方面，PCR擴(kuò)增是終點(diǎn)PCR，并且在其它方面，其是實時PCR，例如，用于進(jìn)行定量PCR。

在其它方面，微量測定卡的第一模制殼體包括覆蓋測定孔組件的測定孔的光學(xué)檢測窗口。光學(xué)檢測窗口由殼體中的菱形切口形成，其中殼體的上表面中的切口大于殼體的下表面中的切口，以便形成從頂部到底部向內(nèi)傾斜的成角度的側(cè)面。已發(fā)現(xiàn)，從具有這種成角度的側(cè)面的孔發(fā)射的熒光的檢測顯著得到增強(qiáng)。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)孔的菱形幾何形狀有利地促進(jìn)孔的潤濕而不挾帶氣泡。微流體裝置中的氣泡形成是本領(lǐng)域中長期存在且相當(dāng)大的技術(shù)問題。在另一方面，光學(xué)透明蓋層放置在第一殼體中的測定孔和光學(xué)窗口之間。蓋層有利地防止材料泄漏出測定孔，而不干擾光學(xué)檢測。

在本發(fā)明的另一方面，多個試劑包被裝載到上模制殼體中。這些試劑包含有樣品制備所需的所有液體試劑，諸如細(xì)胞裂解和核酸提取、洗滌和從捕獲膜洗脫所需的那些試劑。本發(fā)明的微量測定卡被配置來保持一至六個試劑包。在一些方面，試劑包可由箔形成并且膠合至第一模制殼體中以形成氣密密封。在其它方面，尖銳物被放置在每個試劑包下方，以便在需要時通過氣動激活刺破包裝件以釋放試劑。尖銳物可由金屬(例如鋼等)形成并且具有相對于殼體的底部以大約75度的角度突出的倒鉤。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該構(gòu)造實現(xiàn)了箔材料的優(yōu)良剪切并且防止刺穿的邊緣自身重新密封，這阻礙了液體內(nèi)容物的釋放。在其它方面，可將彈簧可放置在尖銳物與箔包裝件之間以保護(hù)包裝件免于過早或不適當(dāng)?shù)钠屏?。彈簧具有僅由源自主機(jī)儀器的氣動力克服的內(nèi)部彈簧力。一旦克服了該力，彈簧就突然“啪”地下降，這易于加速箔包裝件的破裂。

在本發(fā)明的另一方面，微量測定卡的氣動端口與氣霧過濾塞配合，所述氣霧過濾塞可由液體可膨脹材料形成。這些塞捕獲液體以及霧化材料(諸如核酸)，因此大大降低了儀器-盒交叉污染的可能性。

在另一方面，用于控制氣動液壓膜和液壓回路功能的正和負(fù)壓力狀態(tài)的范圍為+150kPA至-50kPA，例如在一些實施例中，正壓狀態(tài)和負(fù)壓狀態(tài)選自+150、+100、+70、0(環(huán)境)、-35和-50kPA。

在另一方面，將微量測定卡通過固定至卡上的單個使用的密封墊密封至主機(jī)儀器。

本發(fā)明的其它實施方案總體上涉及用于進(jìn)行樣品測定的微量測定系統(tǒng)，其包括一次性微量測定盒，該盒對接至主機(jī)儀器并具有液壓回路，該液壓回路包括測試測定回路和分成陽性對照測定回路和陰性對照測定回路的對照測定回路，其中液壓回路受氣動回路控制，該氣動回路與氣動端口接口，每個氣動端口從主機(jī)儀器傳送氣動壓力狀態(tài)，主機(jī)儀器具有氣動歧管，氣動歧管連接至盒的氣動回路和連接至氣動流體源以將多個氣動壓力狀態(tài)傳送至盒以及具有1至5個檢測通道的檢測器頭，用于檢測測試樣品中的光學(xué)信號。

在其它方面，主機(jī)儀器還包括至少一個Peltier熱泵，其可向測定孔組件的孔提供熱循環(huán)能力。在其它方面，主機(jī)儀器還包括可加熱液壓回路的區(qū)域的至少一個加熱塊。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞裂解和核酸提取流程期間提供熱顯著提高效率。

在其它方面，主機(jī)儀器的檢測器頭在由參考點(diǎn)限定的離散路徑上掃描盒，所述參考點(diǎn)是在主機(jī)儀器校準(zhǔn)期間預(yù)先確定的空間坐標(biāo)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，沿著這樣的短的離散路徑掃描，與穿過盒檢測窗口的整個長度的連續(xù)路徑相反，顯著地減少了進(jìn)行盒掃描所需的時間。隨著系統(tǒng)中待掃描的測定孔的數(shù)目增加，這樣增加的效率變得越來越重要。

在其他方面，系統(tǒng)可包括單個使用的墊，以將盒的氣動接口端口連接至主機(jī)儀器的氣動歧管，并且將氣霧過濾塞設(shè)置至端口中以防止污染。

本發(fā)明的其它實施方案總體上涉及對與致病性病癥相關(guān)的靶熒光信號進(jìn)行受控測定的方法，所述方法包括用上述系統(tǒng)在測試測定回路中掃描樣品孔，其中如果存在靶熒光信號則在檢測器頭的第一光學(xué)通道中檢測靶熒光信號，并且如果存在與內(nèi)源組分相關(guān)的過程對照熒光信號則在所述檢測器頭的第二光學(xué)通道中檢測與內(nèi)源組分相關(guān)的過程對照熒光信號，在陽性對照測定回路中掃描樣品孔以利用所述系統(tǒng)檢測陽性對照熒光信號，其中如果存在陽性對照熒光信號則在所述檢測器頭的第一光學(xué)通道中檢測陽性對照熒光信號，在陰性對照測定回路中掃描樣品孔以利用所述系統(tǒng)檢測陰性對照熒光信號，其中如果存在陰性對照熒光信號則在所述檢測器頭的第一光學(xué)通道中檢測陰性對照熒光信號；以及當(dāng)且僅當(dāng)檢測到所述第二熒光過程對照信號，檢測到所述陽性對照第一熒光信號，并且未檢測到所述陰性對照第一熒光信號時，將所述第一靶對照信號報告為有效測定結(jié)果。

在本發(fā)明的一個方面，測試測定回路、陽性對照測定回路和陰性對照測定回路各自包括至多三個測定孔，每個測定孔用于分析獨(dú)特的靶。

在本發(fā)明的另一方面，所述方法包括將靶熒光信號與陽性對照熒光信號和陰性對照熒光信號進(jìn)行比較以將樣品評分為對于致病性病癥為陽性或陰性的步驟。在本發(fā)明的其他方面，比較步驟包括計算第一比率，其為靶熒光信號與陽性對照熒光信號的比率，并計算第二比率，其為靶熒光信號與陰性對照熒光信號，并將第一和第二比率與驗證比率進(jìn)行比較。在本發(fā)明的其它方面，如果第一比率大于驗證比率，則樣本被評分為陽性，如果第二比率小于驗證比率，則樣本被評分為陰性。

在本發(fā)明的另一方面，所述方法包括將靶熒光信號與陽性對照熒光信號進(jìn)行比較以定量樣品靶的相對豐度。

附圖若干視圖的簡述

圖1是本發(fā)明的儀器和微流體盒的透視圖，其示出了盒在對接倉中的動畫插入。

圖2是提供裝置的功能單元的概覽的方框圖。

圖3A和3B是與本發(fā)明的檢測系統(tǒng)一起使用的可插入微量測定盒的透視圖。

圖4是去除蓋子的微量測定盒的透視圖，其顯示了各種集成特征。

圖5是微量測定量盒的分解圖，其描繪了組件的分層結(jié)構(gòu)。

圖6A是顯示微量測定盒的第一模制殼體的下表面的細(xì)節(jié)的平面圖。

圖6B是示出微量測定盒的中間層壓層的下表面的細(xì)節(jié)的平面圖。

圖6C是顯示微量測定盒的第二模制殼體的上表面的細(xì)節(jié)的平面圖。

圖7是將微量測定盒的功能特征集成至閥和流體邏輯的系統(tǒng)中的一個實施方案的示意圖。

圖8A是描繪核酸捕獲組件的部件的分解等軸視圖。

圖8B是核酸捕獲組件的橫截面圖。

圖9是測定孔組件的透視圖。

圖10是具有對接倉、光具座和儀器底盤的浮臺的簡化圖示，其概念性地顯示了這些部件可以相對于接地平面以角度“θ”安裝。

圖11以分解圖顯示了加熱塊和Peltier熱泵組件。

圖12是顯示與儀器夾緊機(jī)構(gòu)接合的微量測定盒的分解圖。

圖13是具有雙光通道的檢測器頭的透視圖。移除殼體的一半以便觀察內(nèi)部部件。

圖14是具有雙光通道和LED強(qiáng)度控制電路的熒光檢測器的內(nèi)部光學(xué)部件的示意圖。

圖15是具有集成的測試測定回路和對照測定回路的通用微量測定裝置的一個實施方案的示意圖

圖16是具有集成的測試測定回路和對照測定回路的通用微量測定裝置的另一個實施方案的示意圖。

發(fā)明詳述

定義

測試樣品：測試樣品包括生物樣品(biological sample或“biosample”)，其可以是臨床樣本?？蓽y試代表性的生物樣品包括例如：血液、血清、血漿、血沉棕黃層、唾液、傷口滲出物、膿、肺和其它呼吸器官抽吸物、鼻抽吸物和洗液、竇引流物、支氣管灌洗液、痰、中耳和內(nèi)耳抽吸物、囊腫抽吸物、腦脊液、糞便、腹瀉液、尿、眼淚、乳腺分泌物、卵巢內(nèi)容物、腹水液、粘液、胃液、胃腸內(nèi)容物、尿道排出物、滑液、腹膜液、胎糞、陰道液或排出物、羊水、精液、陰莖排出物等。從代表粘膜分泌物和上皮的拭子或灌洗液的測定是可接受的，例如咽喉、扁桃體、牙齦、鼻道、陰道、尿道、直腸、下結(jié)腸和眼睛的粘膜拭子，對于各種組織樣本的勻漿物、裂解物和消化物也是可接受的。哺乳動物細(xì)胞是可接受的樣品。除了生理或生物流體以外，水、工業(yè)排出物、食品、牛奶、空氣濾液等的樣品也是測試樣本。在一些實施方案中，將測試樣品直接置于裝置中；在其它實施方案中，設(shè)想了預(yù)分析處理。

生物測定靶分子：或“目標(biāo)核酸”或“靶分子”或“測試分析物”包括一種或多種核酸。靶核酸包括基因、基因的部分、基因的調(diào)控序列、mRNA、rRNA、tRNA、siRNA、cDNA，并且可以是單鏈，雙鏈或三鏈的。一些核酸靶具有多態(tài)性，缺失和選擇性剪接序列。

病原體：與感染或傳染病相關(guān)的生物體。

致病性病癥：特征在于缺乏健康，即疾病、虛弱、發(fā)病或與潛在發(fā)病相關(guān)的遺傳性狀的哺乳動物宿主的病癥。

各種實施方案包括能夠分析包含一種或多種靶傳染劑的測試樣品的微流體裝置。示例性靶傳染劑包括具有基于DNA的基因組或基于RNA的基因組的微生物和/或病毒。在一些實施方案中，合適的病毒包括但不限于乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人免疫缺陷病毒(HIV)I和II、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)A和B、人偏肺病毒(MPV)和/或單純皰疹病毒(HSV)I和/或II。

在其它實施方案中，存在于測試樣品中的病毒傳染劑包括但不限于甲型流感病毒、乙型流感病毒、RSV(呼吸道合胞病毒)A和B、人免疫缺陷病毒(HIV)、人T細(xì)胞淋巴細(xì)胞營養(yǎng)型病毒、肝炎病毒(例如，乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒)、EB病毒、巨細(xì)胞病毒、人乳頭瘤病毒、正粘病毒、副粘病毒、腺病毒、冠狀病毒、彈狀病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、toga病毒、布尼亞病毒、沙狀病毒、風(fēng)疹病毒、reo病毒、諾羅病毒、人偏肺病毒(MPV)、單純皰疹病毒1和2(HSV-1和HSV-2)、西尼羅河病毒、黃熱病病毒、水痘帶狀皰疹病毒(VZV)、狂犬病病毒、鼻病毒、立夫特山谷熱病毒、馬爾堡病毒、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、EB病毒(EBV)、人乳頭瘤病毒(HPV)、埃博拉病毒、科羅拉多蜱熱病毒(CTFV)和/或鼻病毒。

在不同的實施方案中，測試樣品中的細(xì)菌傳染劑包括但不限于，大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門菌屬(Salmonella)、志賀菌屬(Shigella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、克雷伯菌屬(Klebsiella)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、單核細(xì)胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、鳥胞內(nèi)分枝桿菌(Mycobacterium avium-intracellulare)、耶爾森菌屬(Yersinia)、弗朗西絲菌屬(Francisella)、巴斯德菌屬(Pasteurella)、布魯氏菌屬(Brucella)、梭菌屬(Clostridia)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、擬桿菌屬(Bacteroides)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonia)、B溶血鏈球菌(B-Hemolytic strep.)、棒狀菌(Corynebacteria)、軍團(tuán)菌屬(Legionella)、支原體屬(Mycoplasma)、尿原體(Ureaplasma)、衣原體屬(Chlamydia)、艱難梭菌(Clostridium difficile)、加德納菌屬(Gardnerella)、陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhea)、腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)、流感嗜血桿菌(Hemophilus influenza)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、普通變形桿菌(Proteus vulgaris)、奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)、幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)、蒼白密螺旋體(Treponema palladium)、布氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)、回歸熱疏螺旋體(Borrelia recurrentis),立克次氏體屬(Rickettsial)病原體、諾卡爾菌屬(Nocardia)、放線菌(Acitnomycetes)和/或不動桿菌屬(Acinetobacter)。

在其它實施方案中，測試樣品中的真菌傳染劑包括但不限于新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、莢膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、巴西副球孢子菌(Paracoccicioides brasiliensis)、白色念珠菌(Candida albicans)、煙曲霉菌(Aspergillus fumigautus)、藻狀菌(根霉菌屬(Rhizopus))、申克孢子絲菌(Sporothrix schenckii)、色素性真菌病(Chromomycosis)和/或馬杜拉分支菌病(Maduromycosis)。

在更多的實施方案中，存在于測試樣品中的寄生蟲劑包括但不限于惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)、瘧疾瘧原蟲(Plasmodium malaria)、間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)、卵形瘧原蟲(Plasmodium ovale)、盤尾絲蟲(Onchoverva volvulus)、利什曼原蟲屬(Leishmania)、錐蟲屬的某些種(Trypanosoma spp.)、血吸蟲屬的某些種(Schistosoma spp.)、溶組織內(nèi)阿米巴(Entamoeba histolytica)、隱孢子蟲(Cryptosporidum)、賈第蟲屬的某些種(Giardia spp.)、毛滴蟲的某些種(Trichimonas spp.)、結(jié)腸小袋纖毛蟲(Balatidium coli)、班氏絲蟲(Wuchereria bancrofti)、弓形蟲屬的某些種(Toxoplasma spp.)、蟯蟲(Enterobius vermicularis)、蛔蟲(Ascaris lumbricoides)、鞭蟲(Trichuris trichiura)、麥地那龍線蟲(Dracunculus medinesis)、吸蟲類(trematodes)、闊節(jié)裂頭絳蟲(Diphyllobothrium latum)、絳蟲屬的某些種(Taenia spp.)、卡氏肺囊蟲(Pneumocystis carinii)和/或美洲板口線蟲(Necator americanis)。

測定對照或“運(yùn)行”對照或“擴(kuò)增”對照包括陽性對照和陰性對照。對照材料可以商購獲得，內(nèi)部制備或從其他來源獲得。陽性對照材料可以是純化的靶核酸，含有靶核酸的患者樣本，或通過將目標(biāo)生物體(優(yōu)選滅活的)摻入已知不含靶的樣本產(chǎn)生的對照?？蓸?gòu)建陽性對照以使得其濃度接近測定的檢測下限。濃度應(yīng)該足夠高以提供一致的陽性結(jié)果，但是足夠低以接近檢測限的方式挑戰(zhàn)檢測系統(tǒng)。對于多重系統(tǒng)，包括每種分析物的陽性對照。陽性對照PCR反應(yīng)使用與可能含有待測定的靶的測試樣品相同的引物、探針和酶。陽性對照必須在與待測樣品分開的反應(yīng)孔中進(jìn)行。

空白非模板對照諸如水或緩沖液可用作陰性對照的形式。陰性對照也可用于補(bǔ)償由試劑產(chǎn)生的背景信號。陰性對照可通過提取過程獲取并含有所有反應(yīng)試劑。陰性對照也可以是含有已知非靶核酸的樣本，諸如來自非感染個體的患者樣本或含有已知非靶生物體或核酸的樣本。陰性對照PCR反應(yīng)使用與測定靶相同的引物、探針和酶，并且必須在與待測樣品分開的反應(yīng)孔中進(jìn)行。

過程對照或“內(nèi)部對照”或“流程對照”：是指總是存在于測定樣品中或在核酸提取前加入測定樣品的對照靶。該對照驗證提取、擴(kuò)增和檢測過程的功能性。過程對照必須使用與測定靶不同的引物組。取決于系統(tǒng)，過程對照可能需要使用與測定靶不同的探針。

核酸：本文使用的術(shù)語“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”包括任何長度的核苷酸聚合形式，包括但不限于核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸。相對短的核酸聚合物通常用作“引物”或“探針”。該定義包括來自天然來源的核酸，所述核酸可被甲基化或加帽，還可以是合成形式，其可含有取代或衍生的核堿基并且可基于肽主鏈。核酸通常是腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶及其“脫氧”形式的聚合物，但也可以含有其它嘧啶，諸如尿嘧啶和黃嘌呤，或間隔子和通用堿基，諸如脫氧肌苷。取決于互補(bǔ)序列的存在或不存在，以及pH、鹽濃度、溫度的條件以及某些有機(jī)溶劑諸如甲酰胺、n,n-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜和正甲基吡咯烷酮的存在或不存在，脫氧核酸可以是單鏈或雙鏈的。

“靶核酸序列”或“模板”：如本文所用，術(shù)語“靶”是指在測定中待通過聚合酶擴(kuò)增并檢測的生物樣品中的核酸序列。“靶”分子可作為“摻入物(spike)”或作為樣品中的未表征的分析物存在，并且可由對生物體是合成或天然的DNA、cDNA、gDNA、RNA、mRNA、rRNA或miRNA組成?！吧矬w”不限于哺乳動物。靶核酸序列是用于在擴(kuò)增期間合成互補(bǔ)序列的模板?；蚪M靶序列由按照常規(guī)從5'末端至3'末端列出的堿基順序的列表表示。

報告物(Reporter)、“標(biāo)記”或“標(biāo)簽”：指可通過物理、化學(xué)、電磁和其他相關(guān)分析技術(shù)檢測的生物分子或生物分子的修飾?？蓹z測的報告物的實例包括但不限于放射性同位素、熒光團(tuán)、生色團(tuán)、質(zhì)量標(biāo)記、電子致密顆粒、磁性顆粒、染色顆粒、量子點(diǎn)(QDot)、自旋標(biāo)記、發(fā)射化學(xué)發(fā)光的分子、電化學(xué)活性分子、酶、輔因子、連接至核酸探針的酶和酶底物。報告物在生物測定中用作試劑，并且通常共價連接至另一分子，吸附在固相上，或通過特異性親和力結(jié)合。

探針：“探針”是能夠通過以足夠互補(bǔ)性進(jìn)行互補(bǔ)堿基配對而與靶核酸結(jié)合以在室溫形成穩(wěn)定雙螺旋的核酸。探針可用報告基團(tuán)標(biāo)記?？梢愿浇又撂结樀暮线m的標(biāo)記包括但不限于放射性同位素、熒光團(tuán)、生色團(tuán)、質(zhì)量標(biāo)記、電子致密顆粒、磁性顆粒、自旋標(biāo)記、發(fā)射化學(xué)發(fā)光的分子、電化學(xué)活性分子、酶、輔因子和酶底物。用于選擇探針序列，長度和雜交條件的工具通常是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。

擴(kuò)增：如本文所用，術(shù)語“擴(kuò)增”是指導(dǎo)致核酸序列的濃度相對于其初始濃度增加的“模板依賴性過程”?！澳０逡蕾囆赃^程”是涉及“引物”分子的“模板依賴性延伸”的過程。“引物”分子是指與靶序列的已知部分互補(bǔ)的核酸的序列?！澳０逡蕾囆匝由臁笔侵窻NA或DNA的核酸合成，其中新合成的核酸鏈的序列由靶核酸與引物的互補(bǔ)堿基配對的規(guī)則規(guī)定。

擴(kuò)增子是指現(xiàn)有技術(shù)擴(kuò)增工具的雙鏈DNA產(chǎn)物，并且包括從DNA和RNA模板形成的雙鏈DNA產(chǎn)物。

雙尾擴(kuò)增子是指擴(kuò)增工具的雙鏈DNA產(chǎn)物，在所述擴(kuò)增工具中加標(biāo)簽的引物對(與肽半抗原或表位綴合的第一引物，與親和報告物、標(biāo)簽或“配體”綴合的第二引物)被共價摻入。如本文所用，雙尾擴(kuò)增子用作“異雙功能”系鏈，并在固體基質(zhì)上形成分子檢測復(fù)合物。

引物：如本文所用，是在合適的聚合酶和輔因子存在下能夠作為模板指導(dǎo)的DNA合成的起始點(diǎn)的單鏈多核苷酸或多核苷酸綴合物。引物的長度通常為至少7個核苷酸，更通常地長度在10至30個核苷酸的范圍內(nèi)或更長。術(shù)語“引物對”是指一組引物，包括與待擴(kuò)增的DNA模板的5'末端的互補(bǔ)序列雜交的5'“正向”或“上游”引物和與待擴(kuò)增序列的3'端雜交的3'“反向”或“下游“引物。注意，兩個引物均具有5'和3'末端，并且引物延伸總是以5'至3'的方向發(fā)生。因此，在5'端或其附近的化學(xué)綴合不會阻斷通過合適的聚合酶進(jìn)行的引物延伸。引物可被稱為“第一引物”和“第二引物”，指示其中“正向”引物和“反向”引物的身份可以互換的引物對。其他引物可用于巢式擴(kuò)增。

聚合酶是通過其摻入核苷三磷酸或脫氧核苷三磷酸來延伸引物分子的3'羥基末端的功能定義的酶。關(guān)于聚合酶的一般討論，參見Watson,J.D.等，(1987)Molecular Biology of the Gene，第4版，W.A.Benjamin,Inc.,Menlo Park,Calif。聚合酶的實例包括但不限于大腸桿菌DNA聚合酶I、“Klenow”片段、Taq聚合酶、T7聚合酶、T4聚合酶、T5聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶。逆轉(zhuǎn)錄酶的實例包括來自人免疫缺陷病毒1型的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶、端粒酶、來自莫洛尼鼠白血病病毒的M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶和來自禽成髓細(xì)胞瘤病毒的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。

應(yīng)當(dāng)注意，逆轉(zhuǎn)錄酶通常在研究中用于將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)應(yīng)用于RNA靶。經(jīng)典PCR技術(shù)只能直接應(yīng)用于DNA，但通過使用逆轉(zhuǎn)錄酶從RNA合成cDNA，RNA靶的PCR分析是可能的。該技術(shù)統(tǒng)稱為逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)。

互補(bǔ)(針對核酸)是指可以雜交以形成雙螺旋的兩條單鏈核酸序列。兩條互補(bǔ)鏈的雙螺旋中的堿基對的匹配不一定是絕對的。雜交的選擇性是退火溫度、鹽濃度和溶劑的函數(shù)，并且當(dāng)在至少14-25個核苷酸的區(qū)段上存在少至55％同一性時，通常在低嚴(yán)格性條件下發(fā)生。嚴(yán)格性可以通過本領(lǐng)域熟知的方法增加。參見M.Kanehisa,Nucleic Acids Res.12:203(1984)。關(guān)于引物的雜交，“完全互補(bǔ)”的引物具有在引物的整個長度上完全互補(bǔ)的序列，并且沒有錯配?！板e配”是指引物中的堿基和其所比對的靶核酸中的堿基不互補(bǔ)的位點(diǎn)。

預(yù)裝載是指在裝置最終使用之前，例如在裝置制造期間將試劑添加到裝置中的術(shù)語。因此，可將固體試劑沉積在裝置上，例如通過使試劑中的溶劑蒸發(fā)來干燥試劑的溶液?；蛘撸噭┛梢砸悦撍问筋A(yù)裝載，如屬于Battrell等的美國專利申請公開號2012/0156750(其全部內(nèi)容通過引用并入本文)中所公開的。

試劑廣泛地指反應(yīng)中使用的任何化學(xué)或生物化學(xué)試劑，包括酶。試劑可以包括本身可以被監(jiān)測的單一試劑(例如，在其被加熱時被監(jiān)測的物質(zhì))或兩種或更多種試劑的混合物。試劑可以是活的(例如，細(xì)胞)或非活的。用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的示例性試劑包括但不限于緩沖液、金屬離子(例如鎂鹽)、螯合劑、聚合酶、引物、模板、核苷三磷酸、標(biāo)記、染料、核酸酶抑制劑等。用于酶反應(yīng)的試劑包括例如底物、生色體、輔因子、偶聯(lián)酶、緩沖液、金屬離子、抑制劑和活化劑。并非所有試劑都是反應(yīng)物。

特異性：指測定的可靠區(qū)分靶生物標(biāo)志物的真陽性信號與任何背景、錯誤或干擾信號的能力。

靈敏度：指其中陰性不再可靠地與陽性區(qū)分的測定的檢測下限。

穩(wěn)定性：在儲存期間，隨時間流逝在參數(shù)(例如活性、濃度、降解、粘度、pH或顆粒組成)上測量到大于10％的任何組成變化表示不穩(wěn)定性。小于或等于10％的變化意味著穩(wěn)定性。測量穩(wěn)定性所經(jīng)歷的時間段是相對的，取決于組合物的預(yù)期效用。在較高溫度下的加速穩(wěn)定性有時被認(rèn)為是在比實際測量所經(jīng)歷的更長時間段內(nèi)更快速的外推穩(wěn)定性的方式。

終點(diǎn)：“終點(diǎn)”或“數(shù)據(jù)點(diǎn)”在此處用作來自定性或定量測定的“結(jié)果”的速記，并且可指其中達(dá)到反應(yīng)物的恒定平臺或水平的穩(wěn)定終點(diǎn)，以及速率反應(yīng)，其中作為時間的函數(shù)的反應(yīng)物或產(chǎn)物出現(xiàn)或消失的速率(即，斜率)是數(shù)據(jù)點(diǎn)。

微流體盒：具有流體結(jié)構(gòu)和具有微流體尺寸的內(nèi)部通道的“裝置”、“卡”或“芯片”。這些流體結(jié)構(gòu)可以包括例如室、閥、通風(fēng)口、通孔、泵、入口、接頭(nipple)和檢測工具。通常，微流體通道是具有至少一個小于約500μm并且通常在約0.1μm與約500μm之間的內(nèi)部橫截面尺寸的流體通道。微流體通道是具有至少一個小于600μm的內(nèi)部橫截面尺寸的流體通道。微流體流動狀態(tài)的特征在于Poiseuille或“層流”流動。顆粒體積分?jǐn)?shù)和通道直徑與顆粒直徑的比率(D/d)對流動特性具有可測量的影響。(參見例如Staben M E等2005.Particle transport in Poiseuille flow in narrow channels.Intl J Multiphase Flow 31:529-47，以及其中引用的參考文獻(xiàn)，其通過引用整體并入本文)。

微流體盒可使用技術(shù)(諸如激光雕刻、壓印、沖壓、注射模制、掩模、蝕刻和三維軟光刻)由各種材料制造。層壓微流體盒進(jìn)一步用粘合劑中間層或通過熱粘合劑粘合技術(shù)(例如通過定向聚丙烯的壓力處理)來制造。層壓和模制微流體盒的微架構(gòu)可以不同。

微流體通道：也稱為“微通道”，是具有可變長度但橫截面尺寸小于500μm的流體通道。微流體通道中的微流體流動行為是高度非理想和層流的，并且可能更多地取決于壁潤濕性質(zhì)、粗糙度、液體粘度、粘附性和內(nèi)聚力，而不是端到端的壓降或橫截面面積。微流體流動狀態(tài)通常與通道中“虛擬液體壁”的存在相關(guān)。然而，在較大的通道中，10psi或更大的壓頭壓力可產(chǎn)生與湍流接界的過渡流動狀態(tài)，這在測定的漂洗步驟中可能是重要的。

由通過擠出成型形成的層構(gòu)成的微通道可具有更圓的通道輪廓和每個“通孔”上的半徑。注射模制部件的內(nèi)部通道表面也稍微更光滑。由于微流狀態(tài)的深刻的表面效應(yīng)，通道的流動特性是顯著的。表面張力和粘度復(fù)合表面粗糙度效應(yīng)。通道的最窄尺寸對流動具有最深遠(yuǎn)的影響。因此，基于矩形或圓形橫截面輪廓的通道中的流動由對角線寬度或直徑控制，并且通常改變設(shè)計以利用該行為。在流動方向上的錐度減小導(dǎo)致對于200微米以下的直徑的芯吸效應(yīng)。相反，除非施加壓力，否則可通過打開通道以形成球(bulb)來停止流動。通道中的通孔可以被設(shè)計成促進(jìn)定向流，一種固態(tài)止回閥。

如本文所用，術(shù)語“下游”是指在使用中，樣品順序通過裝置的不同部分。雖然術(shù)語“下游”在其范圍內(nèi)包括裝置的兩個部分直接流體連通，但是當(dāng)兩個部分通過例如閥或裝置的另一部分分開時，其也包括在其范圍內(nèi)。術(shù)語“集成的”是指裝置的兩個不同部分組合成單個單元，以使得例如裝置的相同部分可用于過濾樣品并用作裂解單元。當(dāng)術(shù)語“集成的”應(yīng)用于與核酸擴(kuò)增單元組合的本發(fā)明的第一和第二方面的裝置時，其意指系統(tǒng)的兩個部分彼此連接，以使得在使用中，彼此流體連通。在另一方面，術(shù)語“集成的”意指裝置的不同部分優(yōu)選地形成在公共基板上。當(dāng)應(yīng)用于裝置的兩個部分時，術(shù)語“連接的”意指兩個部分可以彼此直接流體連通(例如通過直接連接在一起或通過通道連接)，或者可以通過，例如，閥或裝置的另一部分彼此分隔。優(yōu)選地，術(shù)語“連接至”是指裝置的兩個部分彼此直接連接。

微流體泵：包括例如旨在強(qiáng)制流體移動的球、波紋管、隔膜或氣泡，其中泵的子結(jié)構(gòu)具有小于1毫米的厚度或其它尺寸。此類泵包括屬于Weigl的美國專利號6,743,399和屬于Saltsman的U.S.2005/0106066(共同轉(zhuǎn)讓給本申請人并通過引用將其全文并入本文)中描述的機(jī)械致動的再循環(huán)泵。此類泵可以是機(jī)器人操作的或手動操作的。還提供了電滲泵。此類泵可以用于代替外部驅(qū)動以在基于微流體裝置的測定中推進(jìn)溶解的試劑和樣品的流動。

波紋管(“指狀(Finger)”)泵：是形成為空腔的裝置，通常為圓柱形，通過彈性隔膜在冠部截面中對分，以形成不流體連接的第一和第二半腔。隔膜由連接至第一半腔的氣動脈沖發(fā)生器控制。隔膜上方的正壓力使隔膜膨脹，使第二半腔的內(nèi)容物移位，負(fù)表壓(抽吸)使其縮回，使第二半腔膨脹并將流體吸入。對于半腔，應(yīng)當(dāng)理解的是，隔膜的有效區(qū)域是在正壓力下的體積位移和在吸入壓力下的體積位移中的較小者，并且其因此當(dāng)?shù)谝缓偷诙胧以陔跄ど戏胶拖路降捏w積大致對稱或相等時是最佳的。第二半腔室連接至流體進(jìn)口和出口。流體進(jìn)口和出口可以是分開的端口或單個端口，但在任一情況下，都在閥控制下。如上所述，氣動脈沖發(fā)生器通常通過也是閥門控制的微通道氣動地連接至第一半腔室。在完整的設(shè)備中，氣動致動是可編程的。因此，脈沖發(fā)生器使用的可編程氣動邏輯具有兩個功能，以就信號而致動隔膜，以及就信號而打開和關(guān)閉閥門。當(dāng)脈沖發(fā)生器是盒、接頭或入口外時，提供氣動歧管和電磁閥。

在使用中，當(dāng)將負(fù)壓施加至隔膜時(或被動地，當(dāng)液體被第二波紋管泵推入時)，流體通過入口閥進(jìn)入波紋管泵的第二半腔。隨后，當(dāng)將正壓力施加至隔膜時，腔的流體內(nèi)容物通過出口閥移出。類似地，正壓力信號和負(fù)壓力信號控制閥打開和關(guān)閉。通過向隔膜提供一系列正和負(fù)壓脈沖，流體可以移入和移出波紋管泵腔。通過應(yīng)用同步閥邏輯(從而泵送動作)，該流體運(yùn)動變得定向。

微流體閥：包括一類具有至少一個尺寸小于500μm的液壓、機(jī)械、氣動、磁性和靜電致動器流動控制器。該類的代表性瓣閥描述于美國專利號6,431,212(其通過引用整體并入本文)中。還包括的是止回閥。一類閥是指其中流動通道和對照通道相交并且由彈性膜分開的構(gòu)造，所述彈性膜可響應(yīng)于對照通道中的致動力而偏轉(zhuǎn)至流動通道中或從流動通道中縮回。描述微流體閥的種類的專利包括美國專利號5,971,355、6,418,968、6,518,99、6,620,273、6,748,975、6,767,194、6,901,949以及美國專利申請2002/0195152和2005/02005816，其中的幾個專利或?qū)＠暾埍还餐D(zhuǎn)讓給本申請人，并且所有這些申請通過引用并入本文。

止回閥：是單向閥。球形彈簧閥(ball-spring valves)、瓣閥和觸發(fā)閥的微型形式是止回閥。

被動關(guān)閉閥：是微流體通道中的可潤濕插入物或涂層，當(dāng)被浸沒時其膨脹，關(guān)閉微通道以進(jìn)一步阻止在任一方向上流動。類似地，已經(jīng)公開了延遲或停止試劑的流動的由微通道壁上的疏水材料環(huán)組成的“表面張力閥”。停止流動也可通過加寬微流體通道直徑的錐度來實現(xiàn)。

自引發(fā)：意指由材料制造或經(jīng)處理，以使得通道是可潤濕的并且通常在無需引發(fā)通道的情況下開始毛細(xì)管流的微流體通道。

通孔：微流體通道中的臺階，其提供從一個基板層至上面或下面的另一基板層的流體路徑，其特征在于從層構(gòu)建的層壓裝置。

試劑包或儲存器：用于通過對隔膜加壓來遞送試劑的板上試劑包，并且可以附加諸如金屬V形元件的“尖銳物”，以使得隔膜上的壓力能破裂“枕頭(pillow)”(見枕頭)。這些可以與止回閥或可關(guān)閉的通風(fēng)口一起使用以產(chǎn)生定向流體流動和試劑遞送。用于可變形膜的合適材料包括石蠟封口膜、乳膠、箔和聚對苯二甲酸乙二醇酯。選擇可變形膜的關(guān)鍵因素包括屈服點(diǎn)和變形松弛系數(shù)(彈性模量)。

廢物室或“包”：是用作用于隔離排出的樣品、沖洗溶液和廢試劑的容器的空腔或室。通常還包括芯吸材料(參見芯)或吸收墊。廢物包也可密封在密封地附接于微流體裝置的主體的彈性隔離膜下。該內(nèi)膜隨著吸水材料膨脹而膨脹，從而包圍廢料。隔離膜外部的空腔通向大氣，以使得廢物材料被容納和隔離。廢物包可以任選地含有干燥或液體滅菌劑。

芯：是一種吸水材料，用于通過毛細(xì)管潤濕代替微流體泵或與微流體泵一起推進(jìn)流體流動。吸濕芯通常包括天然或合成纖維的纖維網(wǎng)或吸收墊，并且還通常包括通常稱為“水凝膠”，“超級吸收劑”或“水膠體”材料的某些吸收膠凝材料。材料包括紙、海綿、尿布材料、Contec-Wipe等。還可單獨(dú)地或與吸水材料組合地使用干燥劑，例如硫酸鈣、硫酸鈣、硅膠。

陷阱：具有壩的流體阱，其進(jìn)一步將廢物儲存器與通風(fēng)口隔離。

通風(fēng)口：內(nèi)腔和大氣之間相互連通的孔?！靶l(wèi)生”或“隔離通風(fēng)口”還含有可透氣體但是是疏水的并且抗?jié)竦倪^濾元件。任選地，這些過濾元件具有0.45微米或更小的孔徑。這些過濾器在正向和反向隔離中都起作用。該類型和構(gòu)造的過濾元件也可以內(nèi)部放置，例如以將閥或波紋管泵與控制其的氣動歧管隔離。

“常規(guī)的”是指明在本發(fā)明涉及的現(xiàn)有技術(shù)中已知的術(shù)語。

“約”和“總體上”是不精確的寬泛表達(dá)，其在“差不多”的意義上描述了為“或多或少”或“大致”或“幾乎”的條件，其中變化將是不顯著的，明顯的，具有等效效用或功能，并進(jìn)一步表明針對規(guī)范、規(guī)則或限制存在明顯的少數(shù)例外。例如，在各種實施方案中，前述術(shù)語是指在該術(shù)語之后的值的20％、10％、5％、1％或0.1％內(nèi)的量。

在本文中，在描述“用于功能的工具”的情況下，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的范圍不僅僅限于附圖中所示的一個或多個模式，而且還包括用于進(jìn)行行本說明書中描述的功能的所有工具，以及在本申請?zhí)峤粫r本領(lǐng)域中通常已知的所有其它工具。“現(xiàn)有技術(shù)工具”包括用于進(jìn)行在本申請?zhí)峤粫r本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的功能的所有工具，包括通過參考幾個實例在本文引用的本領(lǐng)域中的累積知識。

用于聚合的工具例如可以是指描述為聚合酶及其輔因子和底物的各種分子工具，例如逆轉(zhuǎn)錄酶和TAQ聚合酶，并且包括本文通過參考幾個實施例引用的酶學(xué)的累積知識。

用于擴(kuò)增的工具包括熱循環(huán)和等溫工具。第一熱循環(huán)技術(shù)是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(稱為PCR)，其描述于美國專利號4,683,195、4,683,202和4,800,159，Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,Md.(1989)和Innis等，("PCR Protocols",Academic Press,Inc.,San Diego Calif.,1990)(其公開內(nèi)容通過引用整體并入本文)中。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法是本領(lǐng)域眾所周知的。簡言之，在PCR中，制備與靶序列的相反互補(bǔ)鏈上的區(qū)域互補(bǔ)的兩個引物序列。將過量的脫氧核苷三磷酸與DNA聚合酶例如Taq聚合酶一起加入到反應(yīng)混合物中。如果靶序列存在于樣品中，則引物將結(jié)合靶，并且聚合酶將通過加入核苷酸而使引物沿著標(biāo)記序列延伸。通過升高和降低反應(yīng)混合物的溫度，延伸的引物將與模板解離以形成反應(yīng)產(chǎn)物，過量的引物將結(jié)合模板和反應(yīng)產(chǎn)物，并重復(fù)該過程。通過添加熒光嵌入劑，可以實時或在熱循環(huán)過程結(jié)束時檢測PCR產(chǎn)物。

一種等溫技術(shù)是LAMP(環(huán)介導(dǎo)的DNA等溫擴(kuò)增)，描述于Notomi,T.等Nucl Acid Res 2000 28中。

鏈置換擴(kuò)增(SDA)是進(jìn)行核酸等溫擴(kuò)增的另一種方法，其涉及多輪鏈置換和合成，即切口平移(Walker等Nucleic Acids Research,1992:1691-1696，通過引用并入本文)。稱為修復(fù)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RCR)的類似方法包括在整個被靶向以進(jìn)行擴(kuò)增的區(qū)域中對幾個探針進(jìn)行退火，然后進(jìn)行其中僅存在四種堿基中的兩種的修復(fù)反應(yīng)。另外兩種堿基可作為生物素化衍生物添加以便于檢測。在SDA中使用類似的方法。還可以使用循環(huán)探針反應(yīng)(CPR)來檢測靶特異性序列。在CPR中，具有非特異性DNA的3'和5'序列以及特定RNA的中間序列的探針與樣品中存在的DNA雜交。在雜交時，用核糖核酸酶H處理反應(yīng)，并且探針的產(chǎn)物被鑒定為在消化后釋放的獨(dú)特產(chǎn)物。將原始模板對另一循環(huán)探針退火，并重復(fù)反應(yīng)。

另一種核酸擴(kuò)增技術(shù)是逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)。首先，使用逆轉(zhuǎn)錄酶從RNA模板制備互補(bǔ)DNA(cDNA)，然后對所得cDNA進(jìn)行PCR。

用于擴(kuò)增的另一種方法是在EPO號320 308(其通過引用整體并入本文)中公開的連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(“LCR”)。在LCR中，制備兩個互補(bǔ)探針對，并且在靶序列存在下，每對將結(jié)合靶的相反互補(bǔ)鏈，以使得它們鄰接。在連接酶存在下，所述兩個探針對將連接形成單個單元。通過如在PCR中的溫度循環(huán)使結(jié)合的連接單元從靶解離，然后用作用于連接過量探針對的“靶序列”。美國專利號4,883,750(其公開內(nèi)容通過引用整體并入本文)描述了類似于LCR的用于將探針對結(jié)合至靶序列的方法。

Qβ復(fù)制酶，也可以用作本發(fā)明中的另一種擴(kuò)增方法。在該方法中，在RNA聚合酶存在下，將具有與靶序列互補(bǔ)的區(qū)域的RNA的復(fù)制序列添加到樣品中。聚合酶將復(fù)制隨后可被檢測的復(fù)制序列。

根據(jù)本發(fā)明，可以使用GB申請?zhí)? 202 328和PCT申請?zhí)朠CT/US89/01025(其公開內(nèi)容通過引用整體并入本文)中描述的其它擴(kuò)增方法。在前一個申請中，“經(jīng)修飾的”引物用于PCR樣模板和酶依賴性合成。可通過用捕獲部分(例如，生物素)和/或檢測劑部分(例如，酶)標(biāo)記來修飾引物。在后一個申請中，將過量的標(biāo)記探針加入樣品中。在靶序列存在下，探針結(jié)合并被催化切割。切割后，靶序列被完整釋放以被過量探針結(jié)合。標(biāo)記探針的切割信號表明靶序列的存在。

其他核酸擴(kuò)增流程包括基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增系統(tǒng)(TAS)，包括基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)和3SR(Kwoh等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：1173；Gingeras等PCT申請WO 88/10315，其公開內(nèi)容通過引用整體并入本文)。在NASBA中，可通過臨床樣品的標(biāo)準(zhǔn)苯酚/氯仿提取，熱變性，利用裂解緩沖液和用于分離DNA和RNA的minispin柱處理或者RNA的氯化胍提取來制備核酸以用于擴(kuò)增。這些擴(kuò)增技術(shù)包括使具有靶特異性序列的引物退火。聚合后，用RNA酶H消化DNA/RNA雜交體，同時再次熱變性雙鏈DNA分子。在任一情況下，通過加入第二靶特異性引物使單鏈DNA完全雙鏈化，然后聚合。然后通過RNA聚合酶諸如T7或SP6多重轉(zhuǎn)錄雙鏈DNA分子。在等溫循環(huán)反應(yīng)中，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成單鏈DNA，然后將其轉(zhuǎn)化為雙鏈DNA，然后再次用RNA聚合酶諸如T7或SP6轉(zhuǎn)錄。所得產(chǎn)物，無論是截短的還是完全的，都表示靶特異性序列。

Davey等，EPO No.329,822(通過引用整體并入本文)公開了涉及循環(huán)合成單鏈RNA(“ssRNA”)、ssDNA和雙鏈DNA(dsDNA)的核酸擴(kuò)增方法，其可以根據(jù)本發(fā)明使用。ssRNA是第一引物寡核苷酸的模板，其通過逆轉(zhuǎn)錄酶(RNA依賴性DNA聚合酶)延伸。然后通過核糖核酸酶H(RNA酶H，一種對DNA或RNA雙鏈體中的RNA特異的RNA酶)的作用從所得的DNA:RNA雙鏈體中去除RNA。所得的ssDNA是第二引物的模板，其還包括與其模板同源的5'RNA聚合酶啟動子(例如T7RNA聚合酶)的序列。然后通過DNA聚合酶(例如大腸桿菌DNA聚合酶I的大的“Klenow”片段)延伸該引物，得到雙鏈DNA(“dsDNA”)分子，其在引物之間具有與原始RNA的序列相同的序列以及額外地在一個末端具有啟動子序列。該啟動子序列可由適當(dāng)?shù)腞NA聚合酶用于制備DNA的許多RNA拷貝。然后這些拷貝可重新進(jìn)入循環(huán)，從而導(dǎo)致非常迅速的擴(kuò)增。通過適當(dāng)?shù)剡x擇酶，該擴(kuò)增可以等溫地進(jìn)行而無需在每個循環(huán)中添加酶。由于該方法的循環(huán)性質(zhì)，起始序列可被選擇為呈DNA或RNA的形式。

Miller等在PCT申請WO 89/06700(其通過引用整體并入本文)中公開了基于啟動子/引物序列與靶單鏈DNA(“ssDNA”)雜交，隨后進(jìn)行序列的許多RNA拷貝的轉(zhuǎn)錄的核酸序列擴(kuò)增方案。該方案不是循環(huán)的，即，不從所得的RNA轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生新的模板。其它擴(kuò)增方法包括“RACE”和“單側(cè)PCR”(Frohman,M.A.于"PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications",Academic Press,N.Y.,1990；Ohara等，1989,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,86:5673-567，其公開內(nèi)容通過引用整體并入本文).

在具有所得的“二寡核苷酸”的序列的核酸存在下，基于兩個(或更多個)寡核苷酸的連接，從而擴(kuò)增二寡核苷酸的方法，也可用于本發(fā)明的擴(kuò)增步驟。Wu等，(1989,Genomics 4:560，通過引用整體并入本文)。

“用于檢測的工具”：如本文所用，是指用于顯示終點(diǎn)，即測定結(jié)果的設(shè)備，并且可包括儀器光電二極管、nephlometer、光子計數(shù)器、電壓表、電流表、pH計、電容傳感器、射頻發(fā)射器、磁電阻計(magnetoresistometer)或霍爾效應(yīng)裝置。蓋板中的放大透鏡、濾波器、有色流體和標(biāo)記的探針可用于改進(jìn)檢測和測定結(jié)果的解釋?！皹?biāo)記”或“標(biāo)簽”包括但不限于染料諸如生色團(tuán)和熒光團(tuán)；和化學(xué)發(fā)光，如現(xiàn)有技術(shù)中已知的。裝飾在磁珠上的量子點(diǎn)，諸如涂覆有ZnS的CdSe，或者量子點(diǎn)和順磁性Fe3O4微粒的融合，是改善本發(fā)明的測定法的靈敏度的方便方法。還預(yù)期了熒光猝滅檢測終點(diǎn)。與酶聯(lián)免疫測定相關(guān)的多種底物和產(chǎn)物生色團(tuán)也是本領(lǐng)域眾所周知的，并且提供了擴(kuò)增檢測信號以提高測定例如“上轉(zhuǎn)換”熒光團(tuán)靈敏度的工具。熒光和光學(xué)檢測器可包括光電二極管、光伏器件、光電晶體管、雪崩光電二極管、光敏電阻器、CMOS、CCD、CID(電荷注入裝置)、光電倍增管和反向偏壓LED。檢測系統(tǒng)任選地是定性的、定量的或半定量的。

“解鏈分析”或“解鏈曲線分析”或“高分辨率解鏈曲線分析(HRM)”或“FRET解鏈分析”是加熱期間雙鏈DNA的解離特性的評估。隨著溫度升高，雙鏈開始解離。50％的DNA變性時的溫度稱為解鏈點(diǎn)。兩條DNA鏈之間的溫度依賴性解離可以使用DNA嵌入熒光團(tuán)諸如SYBR green、EvaGreen或熒光團(tuán)標(biāo)記的DNA探針來測量。在SYBR green(其在插入DNA的兩條鏈的小溝中時熒光強(qiáng)度高出1000倍)的情況下，在加熱過程中DNA的解離可通過所產(chǎn)生的熒光的大量減少來測量?；蛘撸墒褂貌⒅玫奶结?一個特征為熒光團(tuán)，另一個特征為合適的淬滅劑)來測定探針與靶序列的互補(bǔ)性。基于探針的技術(shù)可在PCR后用于檢測單核苷酸多態(tài)性(SNP)、新突變和甲基化模式，并且還可通過所產(chǎn)生的解離模式區(qū)分純合的野生型、雜合和純合突變等位基因。

“分子信標(biāo)”是設(shè)計用于報告溶液中特定核酸存在的單鏈發(fā)夾狀寡核苷酸探針。分子信標(biāo)由四個部分組成：莖、發(fā)夾環(huán)、末端標(biāo)記的熒光團(tuán)和相對末端標(biāo)記的猝滅劑。當(dāng)發(fā)夾樣信標(biāo)不與靶結(jié)合時，熒光團(tuán)和猝滅劑靠近在一起并且熒光被抑制。在互補(bǔ)靶核苷酸序列的存在下，信標(biāo)的莖打開以與靶雜交。這分離熒光團(tuán)與猝滅劑，從而允許熒光團(tuán)發(fā)熒光。或者，分子信標(biāo)還包括在末端標(biāo)記的供體附近發(fā)射的熒光團(tuán)?！安ㄩL轉(zhuǎn)移分子信標(biāo)”包含額外的收集器熒光團(tuán)，其使熒光團(tuán)發(fā)射更強(qiáng)。目前對分子信標(biāo)的綜述包括Wang K等，2009,Molecular engineering of DNA:molecular beacons.Angew Chem Int Ed Engl,48(5):856-870；Cissell KA等，2009,Resonance energy transfer methods of RNA detection,Anal Bioanal Chem 393(1):125-35以及Li Y等，2008,Molecular Beacons:an optimal multifunctional biological probe,BiochemBiophys Res Comm 373(4):457-61。最近的進(jìn)展包括Cady NC,2009,Quantum dot molecular beacons for DNA detection.Methods Mol Biol 554:367-79。

熒光核酸測定包括帶有加標(biāo)簽的引物和基于探針的檢測化學(xué)品的擴(kuò)增?？稍跍y定結(jié)束時測定或通過實時測量擴(kuò)增產(chǎn)物的量來測定熒光產(chǎn)物。

雖然是非限制性的，但依賴于3'猝滅構(gòu)建體對5'報告染料的置換和聚合酶介導(dǎo)的水解的TaqMan Probe(Applied Biosystems)、FRET雜交探針、基于雙寡核苷酸FRET的探針(Roche)、綴合有小溝結(jié)合劑的雜交探針(MGB探針，Applied Biosystems)、Eclipse探針、鎖核酸探針(Exiqon/Roche)、Amplifluor引物化學(xué)品、Scorpions引物化學(xué)品、LUX引物、Qzyme引物、RT-PCR等均適用于本發(fā)明。也可以使用嵌入染料。反轉(zhuǎn)錄用于分析RNA靶，并需要分開的步驟來形成cDNA。最近的進(jìn)展包括Krasnoperov LN等2010.Luminescent probes for ultrasensitive detection of nucleic acids.Bioconjug Chem 2010Jan 19epub。除了化學(xué)染料以外，探針還包括綠色熒光蛋白、量子點(diǎn)和納米點(diǎn)，所有這些都是熒光的。可用熒光團(tuán)加標(biāo)簽于分子諸如核酸和抗體以及對測定靶具有親和力的其他分子，以形成用于本發(fā)明的熒光測定的探針。

在一些實施方案中，“探針”是指寡核苷酸-小溝結(jié)合分子(MGB)綴合物(例如美國專利No.5,801,155(其內(nèi)容全部公開于本文中)中公開的“MGB-Eclipse”探針)。MGB部分是結(jié)合雙鏈DNA分子的小溝的合成分子。構(gòu)建探針以使得MGB和淬滅劑部分在寡核苷酸的5'-末端，而熒光團(tuán)在3'-末端。MGB的5'-定位保護(hù)MGB-Eclipse探針在PCR期間不被切割，并使探針可用于PCR后解鏈曲線分析。在與靶DNA雜交時，通過探針從隨機(jī)卷曲到線性化狀態(tài)的轉(zhuǎn)變產(chǎn)生熒光增加。在實時PCR應(yīng)用中，MGB增加雙鏈DNA復(fù)合物的穩(wěn)定性，特別是探針和擴(kuò)增的DNA靶之間的雜交。增加的DNA-DNA雜交體穩(wěn)定性允許設(shè)計具有較高特異性的較短的檢測探針。與類似的無MGB的較長的對應(yīng)探針相比，所述探針的特異性增強(qiáng)了區(qū)分完全匹配的序列與錯配的靶的能力。

“FRET”(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)-是使得能夠研究分子相互作用的熒光技術(shù)。當(dāng)兩個分子在雜交時這樣接近時，其取決于能量從一個熒光團(tuán)至另一個熒光團(tuán)(即，供體和猝滅劑)的轉(zhuǎn)移。最近的進(jìn)展包括Carmona AK等[2009，The use of fluorescence resonance energy transfer(FRET)peptides for measurement of clinically important proteolytic enzymes，An Acad Bras Cienc 81(3)：381-92]。

用于加熱和冷卻的工具：在現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)描述了用于熱循環(huán)液體填充室的許多工具。這些現(xiàn)有技術(shù)工具包括對流和導(dǎo)電加熱元件，例如電阻器、熱空氣、激光、紅外輻射、焦耳加熱、TEC或Peltier裝置、熱泵、吸熱反應(yīng)物等，通常與用于在循環(huán)的冷卻部分期間散熱的散熱器結(jié)合。加熱工具還可以包括通過由高頻磁場驅(qū)動的磁珠的運(yùn)動進(jìn)行的加熱。

用于熱循環(huán)的加熱和冷卻裝置分為兩類：斜坡(ramped)溫度和固定溫度。固定溫度裝置在反應(yīng)中保持相對恒定的溫度，并且需要至少兩個反應(yīng)室用于熱循環(huán)。斜坡加熱裝置將使至少兩個設(shè)定點(diǎn)之間溫度發(fā)生變化，因此熱循環(huán)僅需要一個反應(yīng)室。加熱元件的組合是可能的。Peltier裝置可用于固定溫度和斜坡應(yīng)用。水浴不太適用于熱循環(huán)的斜坡溫度的控制。

通常，加熱和冷卻工具與流控構(gòu)件接口，以便與液體內(nèi)容物進(jìn)行熱交換。對于PCR，形成發(fā)生熱交換的微流體通道或室的相關(guān)元件被稱為“PCR流控和熱接口”組件的一部分。

“高導(dǎo)熱聚合物”(如美國專利號7,476,702中所公開的，其內(nèi)容在本文中全部公開)是具有高熱導(dǎo)率和介電強(qiáng)度的聚合物組合物。聚合物組合物包括基礎(chǔ)聚合物基質(zhì)和導(dǎo)熱電絕緣材料?？梢韵蚪M合物中加入增強(qiáng)材料諸如玻璃。聚合物組合物包括按重量計20％至80％的聚合物基質(zhì)，按重量計20％至80％的導(dǎo)熱電絕緣陶瓷材料。聚合物組合物還可包含按重量計3％至50％的增強(qiáng)材料。聚合物基質(zhì)可以是熱塑性或熱固性聚合物。導(dǎo)熱電絕緣陶瓷材料可以是氧化鋁、氧化鈣、氧化鈦、氧化硅、氧化鋅、氮化硅、氮化鋁、氮化硼或其混合物。增強(qiáng)材料可以是玻璃、無機(jī)礦物或其它合適的材料。

除非上下文另有要求，否則在整個說明書和隨后的權(quán)利要求中，詞語“包含(comprise)”及其變型(諸如“comprises”和“comprising”)應(yīng)以開放、包含的意義來解釋，即為“包括但不限于”。

在整個說明書中對“一個實施方案”或“實施方案”的引用意味著結(jié)合實施方案描述的特定特性、結(jié)構(gòu)或特征包括在本發(fā)明的至少一個實施方案中。因此，貫穿本說明書的各個地方出現(xiàn)的短語“在一個實施方案中”或“在實施方案中”不一定都指代相同的實施方案。此外，特定特性、結(jié)構(gòu)或特征可在一個或多個實施方案中以任何合適的方式組合。

現(xiàn)在轉(zhuǎn)到附圖，圖1是主機(jī)儀器5000的透視圖，其動畫顯示了將具有光學(xué)窗口1106的微流體盒1100的前鼻部1105插入到對接倉5030中。在操作期間，盒的樣品端口1104和蓋板1103保持在主機(jī)儀器外部。顯示了觸摸屏顯示表面5080和緊湊的底盤或殼體5060。由于在微流體盒中提供了所有試劑和測定對照，所以儀器具有完全獨(dú)立的可操作性。如下面將更詳細(xì)地討論的，對接倉是懸掛安裝的并且可以相對于儀器底座成一定角度傾斜。

圖2是提供主機(jī)儀器測定設(shè)備的功能單元的概述的框圖。機(jī)械、氣動液壓、溫度控制、光學(xué)、和輸入/輸出(I/O)系統(tǒng)由兩個數(shù)字處理器協(xié)調(diào)，第一個稱為“主機(jī)控制器”，其接收用戶命令并輸出測定結(jié)果，并且還指導(dǎo)測定的機(jī)械、熱和氣動液壓過程步驟，以及第二個稱為“嵌入式微處理器”，其對光學(xué)系統(tǒng)進(jìn)行局部控制，包括在檢測器頭內(nèi)的信號采集和處理，并將數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)傳送至主機(jī)控制器。由嵌入式處理器控制的光學(xué)系統(tǒng)在檢測器頭內(nèi)與設(shè)備殼體內(nèi)的噪聲模擬電路屏蔽開來，從而允許在相對無噪聲的環(huán)境中的高增益放大。每個處理器被提供以單獨(dú)的時鐘、易失性和非易失性存儲器，并且彼此自主地進(jìn)行。

作為概述，儀器內(nèi)的浮臺(floating stage)(1000，虛線)支持用于接收和可逆地夾緊微流體盒的對接倉(此處為1001)，并且被提供有掃描檢測器頭311。在主控制器的控制下，檢測器頭在微流體盒的光學(xué)窗口上掃描。檢測器頭含有用于提供激發(fā)光的子組件和用于檢測、放大和處理熒光發(fā)射信號的傳感器。浮臺架在安裝至固定底板和儀器支架上的彈簧懸架上。

固定至固定基板并定位成與浮臺接口的是在主機(jī)控制器1003的控制下具有可單獨(dú)控制的加熱塊和Peltier熱泵的加熱器模塊，連接至安裝在基板330上的氣動伺服機(jī)構(gòu)的氣動接口，其也用作氣動分配歧管，連接步進(jìn)電機(jī)與主機(jī)控制器的線束，以及用于夾具電機(jī)和相關(guān)傳感器(包括用于測量夾具和微流體盒的位置的壓力開關(guān))的線束，條形碼讀取器和溫度監(jiān)視器。電源從安裝在儀器支架中的電池分配至所有系統(tǒng)，或通過直接連接至AC轉(zhuǎn)換器或DC源(諸如自動)來分配。

主機(jī)控制器1003安裝在還含有用于操作儀器的觸摸板面板和LCD顯示面板的主板上。儀器可經(jīng)由各種數(shù)字串行I/O鏈路(包括無線網(wǎng)卡或其他遠(yuǎn)程通信裝置)將數(shù)據(jù)發(fā)送至外部網(wǎng)絡(luò)或裝置。提供了特殊的數(shù)字中繼(Digital junction)，用于訪問RAM寄存器和編程的服務(wù)器，所述數(shù)字中繼是在固態(tài)ROM中編碼的軟件。

由與主機(jī)控制器相關(guān)聯(lián)的可編程軟件提供用于操作儀器的一般指令，諸如操作具有診斷來自液體樣品的特定疾病或病理的能力的特定微量測定卡所需的氣動脈沖和閥邏輯的序列，所述軟件被提供以用于執(zhí)行測定的易失性和非易失性存儲器。如果例如條形碼讀取器檢測特定的微量測定盒，則該裝置被編程來進(jìn)行由該條形碼識別的特定測定，并以指定的格式解釋和顯示結(jié)果。

然而，信號采集光學(xué)器件的操作，包括源強(qiáng)度的調(diào)制、信號放大和過濾，在駐留在檢測器頭311內(nèi)的傳感器PCB上的嵌入式微處理器1841中的守護(hù)進(jìn)程的控制下。因此，對噪聲高度敏感的電信號在檢測器頭中被與主機(jī)儀器中的更嘈雜的環(huán)境屏蔽開來，并且完全避免了從檢測器頭到主機(jī)A/D轉(zhuǎn)換器的模擬信號的傳輸。該非常規(guī)的功能分離已經(jīng)證實非常有利于降低儀器的噪聲敏感性，這是完全可攜帶性和現(xiàn)場操作所需要的，并且出乎意料地允許在期望是嘈雜的電子環(huán)境中使用高增益三級放大器。

圖3A和3B是與本發(fā)明的設(shè)備一起使用的一次性的、單個使用的、采樣-應(yīng)答的微流體盒的透視圖，該盒含有用于測定的所有試劑并僅需要引入測試樣品。該盒還含有進(jìn)行過程對照以及陽性和陰性測定對照所需的所有試劑。此處所示的盒由第一模制殼體1101和具有內(nèi)部工作部分和蓋板1103的第二模制殼體1102組成。端口1104用于接收測試樣品，并且前鼻部1105用于插入主機(jī)儀器的對接倉。從下面顯示的是具有測定孔組件1201的第二模制殼體。第一模制殼體中的窗口1106是在測定孔組件1201中的樣品孔上方形成的光學(xué)窗口。墊1206用于與主機(jī)儀器的氣動接口多端口密封地接口。核酸捕獲組件1208用于從測試樣品提取核酸。

圖4是顯示微量測定盒1100的內(nèi)部部件的分解圖。該特定盒被設(shè)計用于利用FRET或分子信標(biāo)檢測的PCR。優(yōu)選由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)診斷應(yīng)用和要滿足的具體要求來確定待使用的盒設(shè)計和分析反應(yīng)的細(xì)節(jié)，并且提供以下詳細(xì)描述僅用于舉例說明。

通過入口端口1104添加測試樣品。第一模制殼體1101的前鼻部上的光學(xué)窗口1106插入至主機(jī)儀器中并將其對準(zhǔn)，以使得測定孔組件1201的孔被儀器檢測器頭掃描，所述儀器檢測器頭遵循縱向橫切光學(xué)窗口的線性路徑。通過波紋管式混合器1107A和1107B以及核酸捕獲組件1208提供與測試樣品制備相關(guān)的附加處理。樣品制備所需的所有液體試劑被封閉在密封的可破裂的箔袋1205中，并且在需要時在氣動控制下分配。在該實施方案中，第一模制殼體被配置來提供六個箔袋，但本領(lǐng)域技術(shù)人員仍然可以根據(jù)特定的目標(biāo)測定的要求來確定所需的袋的數(shù)量。尖銳物1209由不銹鋼制成，具有以相對于箔袋垂直向下的角度突出的刺穿邊緣1211。通過彈簧1207防止箔袋的過早破裂或刺破，彈簧1207界于箔袋和尖銳物之間界面，保護(hù)袋不受尖銳物的刺穿邊緣的刺穿。彈簧由聚氯乙烯(PVC)制成并且是被塑形以在尖銳物上形成“帳篷”式的可變形結(jié)構(gòu)。在氣動啟動時，可變形彈簧的固有力被克服，彈簧“啪”地向下扣在尖銳物上。彈簧在頂部形成有孔，以使得尖銳物的刺穿邊緣能夠通過，這使箔袋破裂。有利地，鋼刺穿邊緣的角度有助于箔材料的剪切，同時防止剪切的材料界面重新密封。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，該機(jī)制提供了液體試劑的更可靠和有效的遞送。以干燥形式在卡上提供其它試劑(例如用于核酸擴(kuò)增和檢測)。流體廢物被隔離在膠合至凹入?yún)^(qū)域1210中的吸附劑絮墊中，并被原位密封在塑料蓋板1103下面。任何特定分子測定的細(xì)節(jié)不在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在本實施方案中，具有內(nèi)部微量測定通道和孔的測定孔組件1201提供通過熱循環(huán)擴(kuò)增核酸靶序列和任何所得擴(kuò)增子的熒光檢測。

圖5是描繪微流體盒1100的層組件的分解圖。第一模制殼體1101與第二模制殼體1102之間的接合是層壓層1301、1302和1303的層壓堆疊，其提供例如閥門控制(valving)和混合功能，并整合在第一和第二模制殼體中形成的氣動和液體回路，如下面進(jìn)一步描述的。由主機(jī)儀器提供的氣動供應(yīng)被引導(dǎo)通過第二模制殼體中的氣動端口1115。氣動供應(yīng)流體連接至第一模制殼體1101中的回路，其也可被稱為“氣動層”。如本文所使用的，術(shù)語“流體連接”是指兩個特征形成用于任何類型的物質(zhì)(例如氣體、液體、溶液、固體的水性懸浮液等)的通過和/或輸送的導(dǎo)管。液體通道由第二模制殼體1102和層壓層1301中的回路形成，其也可以被稱為“液體層”，并且與試劑包1205、核酸捕獲組件1130和PCR組件1201流體連通。氣動和液體回路平面分離，分別進(jìn)入上模制殼體和下模制殼體中的，防止空氣和流體管線的交叉，從而提供了有利地堅固的盒體系結(jié)構(gòu)。多個氣動液壓膜或隔膜被焊接入層壓層1302中以形成微流體盒的混合器、閥和分級室，如下面進(jìn)一步描述的。層壓層1301、1302和1303進(jìn)一步被切割成具有孔和通道，以連接在第一和第二模制殼體中形成的氣動和液體回路。層壓層1303和1301用本領(lǐng)域已知的粘合材料制造，以將第一和第二模制殼體固定地結(jié)合至組裝的微流體盒中。氣霧過濾塞1125被裝配至下模制殼體中的氣動端口1115中，以在微流體與主機(jī)儀器之間產(chǎn)生物理屏障。氣霧過濾塞1125可以由液體可膨脹或超可膨脹材料(諸如)制成，并且用于防止流體轉(zhuǎn)移和吸收被霧化材料(諸如核酸)。通過試錯，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，將氣霧過濾塞裝配至盒的氣動端口中有效地將主機(jī)儀器與盒中的液體和固體物質(zhì)隔離。這有利地防止污染主機(jī)儀器，主機(jī)儀器的污染可能危及后續(xù)的診斷測試結(jié)果并且引起相當(dāng)大的調(diào)節(jié)問題的。核酸捕獲組件1130被裝配至第二模制主體中的凹陷室中并且與液體通道流體連通并且與主機(jī)儀器熱接觸，如下面進(jìn)一步詳細(xì)描述的。

圖6A-C顯示微流體盒1100的第一氣動層1101、層壓閥層1302和第二液體層1102的氣動和液體回路以及焊接氣動液壓膜的進(jìn)一步細(xì)節(jié)。圖6A是第一模制外殼(即“氣動層”)1101的底表面的平面圖。第一模制外殼通過注射模制聚合物材料(諸如聚對苯二甲酸乙二醇酯乙二醇(polyethylene terephthalate glycol，PETG))制成。氣動層的一個功能是密封盒組件中的閥層1302的氣動側(cè)。第一模制殼體中的氣動管線的網(wǎng)絡(luò)控制閥(此處以管線1150A為例)、混合器(此處以管線1150B為例)和試劑包分配(此處以管線1150C為例)的操作。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在給定氣動管線的控制下最小化“特征組”(例如，閥、混合器、試劑包)的數(shù)量是必要的。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)將特征組復(fù)用至單個氣動管線促成較高水平的盒故障。通過試錯，我們已發(fā)現(xiàn)連接至20個端口1160的20個氣動管線，各自與泵、閥和通風(fēng)口以單獨(dú)的壓力相關(guān)聯(lián)，適用于大多數(shù)測定。然而，本發(fā)明不旨在限于這種構(gòu)造，并且可以設(shè)想其它合適的氣動構(gòu)造。

圖6B是層壓層(即“閥層”)1302的平面圖，其描繪了進(jìn)行微流體盒的閥門控制、混合和流體止動功能的氣動液壓隔膜或膜的構(gòu)造的說明性示例。用于微流體盒中的微型閥、微型泵和其它氣動流體元件的膜片技術(shù)及其制造和焊接的方法描述于本申請人的共同未決專利申請No.WO2014100743和WO2011/094577中，其通過引用整體并入本文?？蓪⑺械哪ず附拥絾蝹€基板材料中(例如PET膜)以形成層1302。在該示例性構(gòu)造中，閥膜1310由DURA-PET膜制成；混合膜1320由SARANEX^TM膜制造；并且分級室1330和流體止動1340膜由微孔膜(諸如膜)制成。該視圖示出了層壓層的側(cè)面，其中膜被焊接至其上并且接觸圖6A所示上模制殼體的表面。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，可以在層壓層1302中采用任何數(shù)量的替代閥門以及混合構(gòu)造和材料。

圖6C是第二模制殼體1102的上表面(即“液體層”)的平面圖。第二模制殼體的一個功能是密封盒組件中的閥層的液體側(cè)。第二模制殼體中的流體管線1107在盒中的功能特征之間輸送流體，以進(jìn)行體外診斷測試，例如，分子測定。功能特征可包括在第一模制殼體和/或?qū)訅簩雍秃怂岵东@組件1130、分級室1180、測定孔1185和流體止動器1195內(nèi)封裝或形成的試劑包、閥和混合室。通孔1190A和1190B將第二模制殼體與測定孔組件流體連接。窗口1185在下模制殼體中被切割以與測定孔組件的孔匹配，用于檢測測定信號。如上所述，空氣端口1115與儀器氣動歧管和第一模制外殼中的氣動管線氣動連接。第二模制殼體通過注射模制聚合物材料諸如聚碳酸酯(PC)或聚對苯二甲酸乙二醇酯乙二醇(PETG)來制造。

圖7是本發(fā)明的一個實施方案的示意圖，其顯示微流體盒的各種功能單元如何可由示例性的閥門控制和流體邏輯控制。顯示了樣品入口1104，填充有示例性試劑的箔包裝件1205，混合器(即波紋管泵)1107A和1107B，核酸捕獲膜1208，PCR孔1260和流體止動器1255。取決于特定目標(biāo)測定，反轉(zhuǎn)錄孔是任選的。

圖8A和8B分別是顯示核酸捕獲組件1130的細(xì)節(jié)的分解等距圖和橫截面視圖。核酸捕獲組件包括殼體1131、捕獲基質(zhì)1132、基質(zhì)支持介質(zhì)1133和粘合劑墊1134。殼體1131是大致中空的不對稱形狀的圓柱形，其將組件的其他部件保持在中空內(nèi)部中。殼體由諸如PC或PETG的聚合材料模制成不對稱形狀，該形狀鍵入下部模制體中的互補(bǔ)形狀的凹部中。捕獲組件在第二模制殼體中的適當(dāng)定向確保了液體通道的適當(dāng)流體連通。捕獲基質(zhì)或膜1132用于結(jié)合和釋放靶核酸，所述核酸可以是DNA和/或RNA。合適的基質(zhì)或膜材料是本領(lǐng)域眾所周知的，并且可包括氧化硅或玻璃纖維膜。核酸捕獲膜進(jìn)一步由兩個捕獲膜支持介質(zhì)盤或玻璃料1133A和1133B支撐。如橫截面視圖7B所示，兩個介質(zhì)支撐玻璃料在捕獲膜的頂表面和底表面上被設(shè)置為平行構(gòu)造。該平行構(gòu)造有助于維持捕獲膜中的基質(zhì)纖維的均勻分布，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，這對保持液體通過膜的均勻流動是重要的。這是對現(xiàn)有技術(shù)的過濾器或膜的明顯改進(jìn)，已知現(xiàn)有技術(shù)的過濾器或膜由于缺乏結(jié)構(gòu)支持而在液體接觸下塌陷，因此不能有效地結(jié)合靶核酸。捕獲膜支持介質(zhì)1133A和1133B可由任何合適的材料(諸如)制成。本發(fā)明也設(shè)想了替代的支持介質(zhì)實施方案。在一個實施方案中，聚丙烯墊圈可為捕獲膜提供支撐。墊圈還可被構(gòu)造來密封殼體通道的邊緣并且防止液體樣品圍繞捕獲膜的邊緣流動。在另一個實施方案中，聚合物殼體結(jié)構(gòu)本身被模制以提供側(cè)向膜支撐特征。捕獲膜粘合劑墊1134用于將捕獲組件粘附到下模制殼體，并且可由任何合適的粘合劑材料制成。

圖9顯示了適于幾種分子反應(yīng)(包括但不限于反轉(zhuǎn)錄、終點(diǎn)PCR、實時PCR和定量PCR以及解鏈曲線分析)的測定孔組件1201的透視圖。在該實施方案中，所示的組件被配置用于通過在相同測定孔中進(jìn)行熱循環(huán)和FRET檢測的終點(diǎn)PCR。PCR孔層1250用于擴(kuò)增洗脫的核酸靶分子，并且所述孔層由高導(dǎo)熱聚合物(諸如聚丙烯)制成，用于最佳的熱傳遞和減少的PCR循環(huán)時間。合適的聚合物的熱導(dǎo)率范圍優(yōu)選為1.0W/mK至10W/mK。在一個實施方案中，高導(dǎo)熱聚合物是D1201。液體樣品通過與第二模制主體中的液體通道流體連通的通孔1280進(jìn)入孔層。層1250的每個樣品通道與兩個孔流體連通：大致球形的孔1255和菱形孔1260。菱形孔1260是擴(kuò)增和檢測孔，并且含有核酸擴(kuò)增和任何所得的擴(kuò)增子的檢測二者所必需的所有試劑。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，菱形孔1260的幾何形狀有利地促進(jìn)干試劑的潤濕和再水合，而不形成氣泡。菱形孔的成角度的側(cè)面是相對于標(biāo)準(zhǔn)垂直或圓形邊緣的改進(jìn)，其增強(qiáng)了發(fā)射熒光的收集和檢測。較小的半球形孔1255用作流體止動器并且與焊接至層壓層1302中的透氣不透液體的膜1346流體連通。在該實施方案中，PCR孔組件含有九個測定孔，用于檢測至多三種個靶分析物。對于每個靶分析物，如上所述，存在用于相應(yīng)的陽性和陰性集成對照的兩個對照孔。用于靶分析物的擴(kuò)增和檢測的孔與核酸捕獲膜流體連通，并接收含有洗脫核酸的液體樣品。相反，集成的對照孔不與核酸捕獲膜流體連通，而是接收空的洗脫緩沖液作為測試樣品?？湛?299不與第二模制主體流體連通，并且在光學(xué)檢測期間可以用作熒光標(biāo)準(zhǔn)，但是本發(fā)明可以設(shè)想其它用途。覆蓋PCR孔層1250是用于將PCR孔組件固定地附著到第二模制殼體的粘合劑層1275。分析孔組件還包括在孔層1250與粘合劑層1275之間的帽蓋層。帽蓋層是光學(xué)透明的蓋，其允許檢測靶信號，同時防止液體試劑泄漏出PCR孔。

主機(jī)儀器系統(tǒng)

本發(fā)明主機(jī)儀器的機(jī)械、加熱、夾持、光學(xué)、軟件和固件、主機(jī)控制器和去耦光學(xué)功能的某些方面公開于整個申請人的共同未決的專利申請?zhí)朩O2014/100725(其通過引用整體并入本文)中。下面描述的特征代表某些替代實施方案和對現(xiàn)有技術(shù)的改進(jìn)。

具有在板(on-board)光具座和對接倉的浮臺是儀器的顯著特征。該特征在圖10中被概念性地引入，其是儀器的主要光熱機(jī)械子系統(tǒng)的概念表示。浮臺由托盤樣底盤301(虛線框)組成，所述托盤狀底盤301通過四點(diǎn)彈簧安裝的懸架懸掛在傾斜平面上并支撐用于接收微流體盒的對接倉103。浮臺300上還支撐有安裝在成對導(dǎo)軌上的檢測器頭311。盒不是儀器100的一部分，而是在插入浮動對接倉103之后與儀器接口。

在操作期間，浮臺相對于安裝板(330)被夾緊，并且接合區(qū)域加熱塊和Peltier熱泵以及相關(guān)聯(lián)的電阻加熱元件和電路的接觸表面。提供風(fēng)扇以在操作期間耗散儀器的過量熱量。傾斜安裝板還提供有用于密封地對接至微流體盒的基部的氣動接口端口350。氣動壓力通過氣動接口端口從嵌入在傾斜安裝板330中的整體氣動分配“歧管”或系統(tǒng)傳遞至盒。氣動歧管從安裝在傾斜安裝板上的源供應(yīng)負(fù)壓和正壓。主板安裝的可編程主機(jī)控制器通過底板330和氣動接口端口350中的內(nèi)部歧管將氣動驅(qū)動壓力、真空和控制脈沖引導(dǎo)至盒上的泵和閥。

檢測器頭311被電機(jī)驅(qū)動化并且在主機(jī)控制器的控制下進(jìn)行盒的掃描。為了沿著成對導(dǎo)軌掃描檢測器頭，主控制器接合由步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動的蝸輪。檢測器頭配備有具有物鏡的外部窗口，其掃描微流體盒的前鼻部中的光學(xué)窗口并收集原始光學(xué)信號。檢測器頭311具有其自己的嵌入式微處理器，其獨(dú)立于用于光學(xué)信號采集的主控制器而起作用。主控制器還調(diào)節(jié)加熱塊和Peltier熱泵中的溫度，并控制與氣動接口連接的一組電磁閥以及正壓和真空泵儲存器。儀器配有用于用戶交互的顯示面板和觸摸面板。電源輸入靈活，任選地由交流適配器、汽車適配器或安裝在儀器下面的可充電電池供電。還包括任選的無線IO和數(shù)字IO端口。

圖10概念性地顯示浮臺301、對接倉103、檢測器頭311并且微流體盒可相對于接地平面以限定的角度安裝在儀器底盤中。以與接地平面成一定角度傾斜盒改善了在流體裝載期間的排氣并且在潤濕和混合操作期間最小化了空氣夾帶。通過本文公開的這種和其他創(chuàng)新避免了干擾熱傳遞和分析結(jié)果光學(xué)探詢的氣泡聚積。傾斜安裝板330確定浮動臺301、盒以及夾持和光學(xué)掃描子組件的機(jī)械部件的角度。我們發(fā)現(xiàn)氣泡聚積干擾核酸擴(kuò)增，并受到平臺的角度底座的限制。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該角度“θ”在距離接地平面的以下角度范圍內(nèi)是有利的：10-45度，更優(yōu)選地是10-20度，最優(yōu)選地是約15度。

如圖10所示，檢測器頭311包括具有配合半殼(312,313)的蛤殼式殼體。檢測器頭在側(cè)向?qū)к?08和309上滑動，并且在具有蝸桿傳動的步進(jìn)電機(jī)的主控下。將浮臺底盤301彈簧形式地安裝在四點(diǎn)懸掛件中，并且在被夾緊之前不與傾斜安裝板330直接連接。兩個掃描導(dǎo)軌308中的一個在該視圖中是容易可見的，并且在任一端由浮臺底盤或托盤301支撐。對接倉由虛線框(103)表示，并標(biāo)記用于將微流體盒的鼻部插入檢測器頭311下方的開口，所述檢測器頭被使得能夠如圖所示(雙箭頭)從一側(cè)掃描到另一側(cè)。氣動接口端口350在此處顯示為在對接倉下方的升高平臺。功率調(diào)節(jié)、交流適配器和電池存儲功能被安裝在傾斜安裝板330下方，儀器底座329的下側(cè)上方，其被設(shè)計來擱置在平坦表面上。

圖11是儀器底部的CAD視圖，其顯示細(xì)節(jié)的內(nèi)部，包括具有Peltier熱泵341和加熱塊342的加熱器組件。加熱器組件的優(yōu)點(diǎn)在于由一個或多個加熱塊和Peltier熱泵組成，其每一個與微流體盒的下側(cè)上的限定區(qū)域形成熱界面，用于在測定期間在盒的封閉通道和室中發(fā)生的分子生物過程和/或反應(yīng)的正確操作。這些過程和/或反應(yīng)可以與細(xì)胞裂解和核酸提取一樣簡單，或者如反轉(zhuǎn)錄和核酸擴(kuò)增一樣復(fù)雜，并且通常需要相對嚴(yán)格的溫度控制以獲得最佳反應(yīng)性和特異性。Peltier熱泵和加熱塊可以是彈簧安裝的，并且與夾緊機(jī)構(gòu)的向下壓力相反地被向上推動，以建立用于熱傳遞的高熱擴(kuò)散率接觸區(qū)。還顯示了氣動接口端口350，每個獨(dú)立地端口連接至來自主機(jī)儀器的氣動分配歧管的正壓或負(fù)壓源，并且獨(dú)立地在可編程主機(jī)控制器的控制下。該實施方案描繪了20個氣動端口，但是本發(fā)明可以設(shè)想其它合適的構(gòu)造。這些出口與微流體卡的下側(cè)中的配合入口接口并密封，并且互通的氣動壓力、真空和壓力脈沖的定時模式通過氣動接口傳送以驅(qū)動和控制盒中的測定。

圖12是描繪與主機(jī)儀器的夾緊機(jī)構(gòu)500接合的微流體盒200的CAD視圖。還顯示了齒輪400、彈簧301和檢測器頭支撐件311。如上所述，在盒第二模制殼體的下側(cè)上的硅橡膠墊以彈簧力配合至主機(jī)儀器的氣動歧管，并且當(dāng)盒被加載至儀器中并施加彈簧壓力時，在壓縮下密封氣動互連。墊1206用作單個使用的密封墊，并且有利地與一次性盒一起提供，而不是如傳統(tǒng)知識那樣作為儀器的一部分。通過將墊圈包括在一次性盒中，在氣動接口處獲得更好和更清潔的密封，并且消除了定期更換墊的需要。在該構(gòu)造中，盒流體地接合在氣動控制接口多端口上并且與熱塊342和Peltier熱泵341熱接觸。儀器氣動控制歧管通過氣動接口多端口350向盒提供經(jīng)調(diào)節(jié)的氣動壓力。在完整的儀器中，安裝板330裝有用于控制卡氣動的壓力調(diào)節(jié)器、蓄壓器和螺線管。

壓力狀態(tài)通常選自一系列正壓和負(fù)壓，包括但不限于+150kPa、+100kPa、+70kPa、0kPa、-35kPa和-50kPa，其中例如較高的壓力用于破裂試劑包，負(fù)壓用于打開閥等。這些壓力可以從緩沖的壓力儲存器供應(yīng)。也可以使用撥號可變壓力供應(yīng)。氣動狀態(tài)通過在微處理器控制下的歧管子電路供應(yīng)至盒。每個測定由根據(jù)使流體移動通過液壓回路所需的氣動閥和泵邏輯執(zhí)行的一系列步驟組成。通風(fēng)孔也是回路的必要部分，并且根據(jù)每種個體測定類型的要求，加壓、反轉(zhuǎn)壓力和通風(fēng)都在儀器和相關(guān)微測定回路的能力范圍內(nèi)。

光學(xué)系統(tǒng)

圖13是具有分別用于激發(fā)和發(fā)射檢測的兩個光學(xué)通道和電子絕緣電路板(1301,1302)的雙通道檢測器頭1300的透視圖。在該視圖中，殼體1303的上半部被移除，以便顯示檢測器頭的內(nèi)部部件。雙通道由物鏡(1310,1330)以及光路A和B(空心箭頭標(biāo)記的A和B)標(biāo)記。SMD LED激發(fā)光源(1311,1331)安裝在源LED印刷電路板(1301)上，其通過邊緣型電阻引腳連接器(1304)與傳感器PCB(1302)成直角連接。光電檢測部件安裝在傳感器PCB(1302)上。法拉第籠元件(1306)用于屏蔽光電二極管(1317)和(1337)以及周圍的高增益放大電路。

通過表面安裝的LED(1331)在靶通道(箭頭A)中提供熒光激發(fā)，其被選擇為匹配靶熒光團(tuán)的激發(fā)光譜。源LED(1331)發(fā)射發(fā)散光束，然后輻射光束通過源激發(fā)透鏡(1332)準(zhǔn)直。源透鏡(1332)是其平坦表面朝向LED的平凸透鏡。然后，準(zhǔn)直光束可以通過激發(fā)帶通濾波器(1333)。檢測器頭具有在測定期間修改LED強(qiáng)度的能力，例如在測定期間隨著系統(tǒng)的熱增加或減少或當(dāng)需要多個激發(fā)強(qiáng)度時隨著時間保持恒定的LED強(qiáng)度。這通過閉環(huán)的直接LED強(qiáng)度調(diào)制電路來實現(xiàn)，其中約5％的準(zhǔn)直的經(jīng)濾波的激發(fā)光從光采樣器反射鏡通過中性密度濾波器反射至LED強(qiáng)度檢測器。然后，準(zhǔn)直的、經(jīng)濾波的激發(fā)光束的剩余部分從安裝在與入射光束成45度角的二向色鏡元件或分束器(1334)反射，并且通過平凸物鏡(1330)并通過檢測器殼體中的外部窗口(箭頭A)。在通過透鏡1330之后，激發(fā)光被聚焦通過嵌入在微量測定盒中的檢測室(未顯示，參見圖14-17)，其含有具有任何靶熒光團(tuán)的樣品液體。通過使用微量測定盒后面的后反射鏡使通過樣品液體的激發(fā)光的路徑長度加倍。靶熒光團(tuán)被入射光束激發(fā)。熒光團(tuán)的發(fā)射通常在比激發(fā)波長更長的波長處，并且偏移等于靶熒光團(tuán)的斯托克斯位移的量。

來自檢測室中的靶熒光團(tuán)的返回發(fā)射的一部分由平凸取樣透鏡1330收集并且在撞擊二向色鏡1334之前被準(zhǔn)直。任選地，菲涅爾透鏡可用于進(jìn)一步減小透鏡和樣品之間的工作距離以優(yōu)化發(fā)射光的收集，這通過安裝在檢測室后面的加熱塊上的后反射鏡進(jìn)一步增強(qiáng)。因為二向色分束器1334在激發(fā)與發(fā)射波長之間具有波長截止，所以二向色鏡1334現(xiàn)在用作發(fā)射的熒光光束的通帶分束器和用于激發(fā)光的阻帶濾波器。它透射發(fā)射的熒光，同時反射被反射的激發(fā)光和通過物鏡窗口進(jìn)入光路的任何環(huán)境光。通過二向色分束器1334的發(fā)射光然后通過發(fā)射濾波器1335，其目的在與圖20相關(guān)的描述中進(jìn)一步解釋。然后，離開發(fā)射濾波器1335的光通過平凸傳感器透鏡1336，在那里其被聚焦至表面安裝到PCB 1302的光傳感器1337的表面上，并且被法拉第籠1306保護(hù)免受電噪聲。

上述光學(xué)路徑可在多個(例如5個)通道中重復(fù)，具有檢測任何熒光發(fā)射帶的潛力。第二(對照)通道具有對照激發(fā)LED 1311、平凸激發(fā)透鏡1312、激發(fā)濾波器1313、二向色分束器1314、物鏡1310、對照發(fā)射濾波器1315、平凸傳感器透鏡1316和對照光電二極管1317。來自兩個光電二極管的輸出由三級跨阻抗放大器放大，所述放大器內(nèi)置于光電二極管旁邊的板中，并且經(jīng)由來自放大器的仔細(xì)屏蔽的引腳接地至傳感器PCB上的嵌入式微處理器。

在一個實施方案中，如通過使用熒光素和德克薩斯紅作為熒光團(tuán)所示例的，激發(fā)LED 1331是用于靶通道的具有帶通激發(fā)濾波器1333的470nm LED(用于傳遞基本上單色的485±12nm的光)，具有帶通濾波器1313的590nm LED 1311用于對照通道。使用130Hz的選通率來調(diào)制或“選通”打開和關(guān)閉激發(fā)LED以在50或60Hz以及與熒光架空照明相關(guān)聯(lián)的諧波頻率處過濾與交流電源相關(guān)的噪聲，還過濾與雜散環(huán)境光相關(guān)的幻像信號以及可能存在于30或60Hz的電噪聲。如上所述，局部反饋傳感器用于監(jiān)測和穩(wěn)定源LED輸出強(qiáng)度。熒光團(tuán)發(fā)射的檢測監(jiān)測與在由主機(jī)控制器控制的步進(jìn)電機(jī)的功率下的檢測器頭的軌道上的移動協(xié)調(diào)。檢測器頭中的嵌入式微處理器和相關(guān)電路設(shè)有RAM存儲器、ROM存儲器、A-D轉(zhuǎn)換器、三級跨阻抗放大器以及處理這些功能的信號處理和命令序列固件。

光傳感器1317和1337中的每一個安裝在普通PCB 1302上。來自這些光傳感器中的每一個的輸出信號支路直接連接至各自三級跨阻抗放大器的前置放大器或第一級(未顯示)。PCB 1302廣泛使用硬件降噪部件，特別是嵌入式接地平面和法拉第籠1306，以最小化任何RF或電磁干擾對輸入信號的不想要的影響。放大器通過法拉第籠、旁路電容器、信號調(diào)節(jié)前置放大器、單獨(dú)的接地平面、金屬化的探測器頭殼體或其組合來屏蔽電子噪聲，并且放大器緊密地電接近傳感器。光學(xué)信號采集、預(yù)調(diào)節(jié)、放大和數(shù)字化由在屏蔽環(huán)境中操作的自主守護(hù)進(jìn)程控制。這些硬件降噪元件與在檢測頭中的局部控制下的光學(xué)數(shù)據(jù)采集、數(shù)字化和處理方法的組合導(dǎo)致基本上免于不想要的噪聲影響的檢測器設(shè)計。三級放大器可被配置用于至多10¹⁴的增益，并且根據(jù)需要可選擇地被配置用于10²、10³、10⁶、10¹⁰或10¹²的增益。

我們驚奇地發(fā)現(xiàn)，在掃描頭中封裝信號處理通過最小化信號路徑長度并允許在必要時有效使用法拉第屏蔽，諸如在傳感器二極管周圍以及在激發(fā)電路板和傳感器電路板之間的接合處，實現(xiàn)具有改善的信噪比和靈敏度的隔離的低噪聲環(huán)境。任選地，檢測器殼體可由鋁制成或涂覆有導(dǎo)電聚合物并且接地以進(jìn)一步屏蔽內(nèi)部電子裝置來免受不期望的干擾。有利地，在該環(huán)境中實現(xiàn)較高的信號放大。

圖14是熒光檢測器頭1300的內(nèi)部光學(xué)部件的示意圖，顯示了在微量測定盒中具有光學(xué)窗口的外部光學(xué)接口。非常規(guī)地，在單個檢測頭中形成多個獨(dú)立的光學(xué)路徑或“通道”，并且共享電子PCB和下游信號處理電路，但是激發(fā)光學(xué)器件安裝在一個電路板上，而檢測光學(xué)器件安裝在另一個上，以減少噪聲干擾。兩個板通過角安裝的引腳結(jié)電耦合，并且使用安裝在分開的接地平面上的旁路電容器電隔離。

圖14中顯示了用于激發(fā)嵌入在微量測定盒1402內(nèi)的檢測或樣品孔(1403)中的熒光團(tuán)的光學(xué)躍遷。該頭是掃描頭并且跨過微量測定盒1402移動(雙箭頭)。來自PCB 1301上的激發(fā)LED 1331的光由透鏡1332準(zhǔn)直并且基本上由帶通濾波器1333單色化。如上所述，通過將準(zhǔn)直光從光采樣器反射鏡1338反射通過中性密度濾波器1339至LED強(qiáng)度檢測器1340，來形成LED強(qiáng)度對照回路。檢測孔1403中的任何一種或多種熒光團(tuán)(無論是對照還是靶熒光團(tuán))都被物鏡1330聚焦在樣品上的入射光1420激發(fā)。在圖X中，熒光團(tuán)的發(fā)射由物鏡1330收集，并在通過二向色分束器1334、發(fā)射濾波器1335和傳感器透鏡1336之后傳輸至傳感器1337。傳感器1337與高增益晶體管的基極直接電接觸，所述晶體管放大輸出信號并在法拉第籠中屏蔽。發(fā)射的熒光通常根據(jù)熒光團(tuán)的斯托克斯位移而處于更長的波長，使得發(fā)射的光能夠無損地通過二向色帶通鏡1334和發(fā)射帶通濾波器1335。因此，從樣品室1403a返回到物鏡1330的光是發(fā)射和反射熒光1421和反射激發(fā)光1420的混合光。提供光阱(未示出)以捕獲雜散反射。反射光1420不通過二向色鏡1334并且返回到源，并且不干擾傳感器1337處的發(fā)射強(qiáng)度的測量。單個通道的光學(xué)元件(包括激發(fā)源、源準(zhǔn)直透鏡、激發(fā)濾波器、二向色鏡、物鏡、激發(fā)濾波器、傳感器透鏡和具有放大器的檢測器)組成具有基本上單色源波長和用于檢測靶(或?qū)φ?熒光團(tuán)的特定波長特性處的熒光的高度特異性傳感器的光學(xué)模塊。一個光學(xué)模塊或通道可以用于測定靶，另一個模塊用于對照通道。串聯(lián)安裝的光學(xué)通道可用于收集多個熒光團(tuán)上的數(shù)據(jù)，其中在傳輸?shù)街鳈C(jī)儀器之前，電處理通過嵌入式微處理器在常駐守護(hù)程序的控制下多路復(fù)用。如所顯示的，兩個通道中的每一個在兩個電路板中的每一個上共享電路，但是具有分開的光學(xué)器件。任選地，可通過所示的光學(xué)元件的復(fù)制過程將附加通道加入檢測器頭中。

微量測定盒1402相對于檢測器頭1300是可移動的(雙箭頭)，并且檢測器頭或盒托盤或安裝底盤的電機(jī)驅(qū)動化允許掃描：橫跨過盒1402例如允許對樣品室1403進(jìn)行測量。通過使用并排安裝在檢測器頭中的多個檢測光學(xué)模塊，可串聯(lián)地掃描樣品室的多個熒光團(tuán)。

根據(jù)一個實施方案，激發(fā)電子器件安裝在印刷電路板(1301)上，并且檢測電子器件安裝在第二PCB(1302)上。邊緣連接器1304電連接板。法拉第籠1306保護(hù)傳感器和相關(guān)聯(lián)的高增益放大器免受雜散電磁噪聲。Peltier熱泵的溫度可在掃描期間被斜變，例如在具有在主控制器的控制下的溫度和電機(jī)驅(qū)動作用的FRET解鏈測定中，同時在自主過程中由檢測頭中的嵌入式處理器獲取光學(xué)數(shù)據(jù)。

測定驗證和質(zhì)量控制

偶然地，本發(fā)明的主機(jī)儀器的自主檢測器頭部功能可以被多路復(fù)用在含有用于檢測個體熒光團(tuán)的分開的光學(xué)通道的雙頭和多頭檢測器中，以使得每個通道包含用于照射激發(fā)光的LED，至少一個光路，所述光路具有激發(fā)濾波器、發(fā)射濾波器、調(diào)諧成能夠檢測來自限定通帶中的熒光團(tuán)的發(fā)射的二向色鏡、用于會聚所述激發(fā)光并且用于收集所述發(fā)射的物鏡、用于接收任何通帶發(fā)射的傳感器和用于放大來自傳感器的輸出的增益放大器，其中每個LED被配置來在一系列頻率范圍內(nèi)照射光，以使得通道的照射頻率不重疊，并且每個光學(xué)通道被配置來使得通道的發(fā)射通帶不重疊。此外，如上所述，每個光學(xué)通道配置有LED強(qiáng)度控制電路，以在操作期間修改LED強(qiáng)度。

對于測定驗證，提供兩個傳感器通道(或更多個)用于監(jiān)測兩個或更多個熒光團(tuán)，所述兩個傳感器通道被配置來使得來自每個熒光團(tuán)的發(fā)射通帶不重疊。在優(yōu)選實施方案中，第一檢測通道用于檢測靶信號，第二檢測通道用于檢測內(nèi)部過程對照信號，并且當(dāng)且僅當(dāng)報告有效的內(nèi)部過程對照信號時，報告測定結(jié)果。

該系統(tǒng)已證明在驗證測定操作方案時是有用的，該方案需要“雙重”或多重靶和過程對照信號的配對收集。其中，對于FDA CLIA豁免要求，靶和過程對照模板二者都被平行擴(kuò)增，在測試樣品的測定結(jié)果可以報告或記帳之前，必須存在陽性過程對照信號。在沒有可檢測的過程對照信號的情況下，檢測到的任何靶信號不是有效的結(jié)果。如果滿足這一條件，根據(jù)1988年臨床實驗室改進(jìn)修正案(CLIA)，可以免除關(guān)于簡單的低風(fēng)險試驗的規(guī)定，并且在醫(yī)生辦公室和各種其他場所進(jìn)行沒有監(jiān)督的測試。為了滿足這些CLIA豁免要求，熒光檢測器必須能夠不僅檢測例如通過PCR擴(kuò)增的靶傳染性生物體的存在，而且還檢測與靶共存的內(nèi)源人對照生物體或內(nèi)源人基因的存在，并通過相同的PCR反應(yīng)或在儀器中平行進(jìn)行的PCR反應(yīng)對其進(jìn)行擴(kuò)增。例如，過程對照可以是人線粒體基因，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，過程對照是編碼線粒體細(xì)胞色素c氧化酶亞單位2的MTOC2基因。

可以針對UV、可見光區(qū)域和近紅外光譜中的波長配置檢測系統(tǒng)。有接近單色輸出、濾波器、生色團(tuán)和熒光團(tuán)的可用光源允許調(diào)諧在300至900nm的范圍內(nèi)的激發(fā)和發(fā)射通帶。對于在為本發(fā)明的優(yōu)選操作模式之一的熒光檢測模式中的應(yīng)用，可針對在UV和可見光譜中具有激發(fā)光譜并且在UV、可見光和近紅外光譜中發(fā)射的特定熒光染料配置裝置。雖然紅移是更典型的，但也可使用上轉(zhuǎn)換熒光團(tuán)。

多路復(fù)用至嵌入式微處理器的輸入，以使得可同時測定幾種靶分析物和內(nèi)部過程對照。檢測器頭提供有至少兩個或更多個光學(xué)通道，每個光學(xué)通道具有在離散波長下操作的獨(dú)立激發(fā)光學(xué)器件和發(fā)射光學(xué)器件。白色激發(fā)光不用于在多重測定中消除不同熒光團(tuán)之間可能的串?dāng)_，諸如當(dāng)靶熒光團(tuán)和內(nèi)部對照熒光團(tuán)混合在共同的液體樣品中時。

良好的實驗室規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)還需要使用陽性和陰性測定對照來驗證診斷測試結(jié)果，所述對照通常作為外部對照進(jìn)行。在對現(xiàn)有技術(shù)的巨大改進(jìn)中，本發(fā)明的微量測定盒提供有集成的陽性和陰性對照。圖15和16舉例說明了集成至通用微流體測定回路中的本發(fā)明的陽性和陰性對照回路的某些實施方案的細(xì)節(jié)。圖15是顯示本發(fā)明的一個實施方案的裝置100的示意圖。微流體裝置100具有兩個獨(dú)立的測定回路：測試測定回路200和對照測定回路300。測試測定回路200包括與微流體通道215和樣品提取室220流體連通的樣品入口端口210。樣品提取室220與下游通道235和一個或多個測試測定孔流體連通。在該實施方案中，微流體通道235與三個測試測定孔250a、250b和250c流體連通，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，測試測定回路200可包括任何數(shù)目的測定孔。測定孔250a、250b和250c含有進(jìn)行分子測定(例如PCR)以及檢測測定信號(例如熒光信號)的存在或不存在所必需的所有試劑。每個測定孔含有酶混合物270a、270b或270c，其組成相同。酶混合物含有擴(kuò)增靶模板和過程對照模板所需的酶和其它試劑。每個測定孔還含有過程對照引物/探針混合物275a、275b或275c，其組成也相同。過程對照引物/探針混合物含有適于擴(kuò)增和檢測過程對照模板的引物和探針。每個測定孔還含有適合于擴(kuò)增和檢測獨(dú)特靶模板的獨(dú)特靶引物/探針混合物，在圖15中通過不同的顏色加以區(qū)分。在該實施方案中，測定孔250a包含靶序列1引物/探針混合物280，測定孔250b含有靶序列2引物/探針混合物285，并且測定孔250c含有靶序列3引物/探針混合物290。雖然該實施方案被配置來檢測三個測試靶序列，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)容易地理解，可通過增加或減少本發(fā)明的測定孔和靶序列引物/探針混合物的數(shù)目來測定任何數(shù)目的靶序列。

微流體裝置100的對照測定回路300包括與下游微流體通道325流體連通的對照緩沖液室320。在一個實施方案中，對照緩沖液室320含有不含任何生物材料(例如，核酸)的空緩沖溶液。微流體通道325分成兩個對照通道，陰性對照通道335和陽性對照通道345。陰性對照通道335與陰性對照測定孔350a、350b和350c流體連通。在該實施方案中，陰性對照通道與三個測定孔流體連通，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，陰性對照回路可包含任何數(shù)目的測定孔。每個陰性對照測定孔對應(yīng)于獨(dú)特的測試測定孔之一。如測試測定孔一樣，陰性對照測定孔350a、350b和350c含有用于進(jìn)行分子測定以及檢測過程對照模板和靶模板的存在或不存在的相同試劑。陰性對照測定孔350a、b和c分別含有酶混合物370a、370b和370c。這些酶混合物中的每一種的組成在每個測定孔中是相同的。酶混合物含有用于擴(kuò)增靶序列和過程對照序列所必需的酶和其它試劑。測定孔350a、b和c還含有過程對照引物/探針混合物375a、375b和375c。這些內(nèi)部對照引物/探針混合物中的每一種的組成在每個測定孔中也是相同的。過程對照引物探針混合物含有適于擴(kuò)增和檢測過程對照序列的引物和探針。每個測定孔還含有獨(dú)特的靶序列引物/探針混合物。在該實施方案中，測定孔350a含有靶序列1引物/探針混合物380a，測定孔350b含有靶序列2引物/探針混合物385a，并且測定孔350c含有靶序列3引物/探針混合物390a。靶序列引物/探針混合物380a、385a和390a中的每一個含有擴(kuò)增和檢測獨(dú)特的目標(biāo)靶序列所必需的引物和探針。混合物380a的引物/探針與混合物280的引物/探針相同，而混合物385a和390a的引物/探針分別與混合物285和290的相同。

陽性對照通道345進(jìn)而與陽性對照測定孔360a、360b和360c流體連通。在該實施方案中，陽性對照通道與三個測定孔流體連通，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，陽性對照回路可包含任何數(shù)量的測定孔。每個陽性對照測定孔對應(yīng)于獨(dú)特的測試測定孔和獨(dú)特的陰性對照測定孔。與其相應(yīng)的測試測定孔一樣，陽性對照測定孔360a、360b和360含有進(jìn)行分子測定以及檢測靶標(biāo)和過程對照序列的存在或不存在所必需的所有試劑。重要的是，用靶核酸模板的外源性樣品嵌入陽性對照孔。每個陽性對照測定孔含有酶混合物370d、370e或370f，其組成在每個測定孔中相同。酶混合物含有擴(kuò)增靶和過程對照序列所必需的酶和試劑。每個測定孔360a、b和c還含有過程對照引物/探針混合物375d、375e和375f，其組成在每個測定孔中也是相同的。過程對照引物/探針混合物含有適于擴(kuò)增和檢測過程對照靶的引物和探針。每個測定孔還含有獨(dú)特的靶序列引物/探針混合物。在該實施方案中，測定孔360a包含靶序列1引物/探針混合物380b，測定孔360b包含靶序列2引物/探針混合物385b，并且測定孔360c包含靶序列3引物/探針混合物390b。每個靶序列引物/探針混合物380b、385b和390b含有擴(kuò)增和檢測獨(dú)特的目標(biāo)靶序列所必需的引物和探針。混合物380b的引物和探針與混合物280的引物和探針相同，而混合物385b和390b的引物和探針分別與混合物285和290的引物和探針相同。每個陽性對照測定孔還含有嵌入的過程對照模板樣品，本文中稱為395a、395b和395c。嵌入的過程對照模板樣品含有已知量的過程對照模板核酸，并且在每個陽性對照測定孔中是相同的。每個陽性對照測定孔還含有嵌入的靶序列模板樣品，在本文中命名為397a、397b或397c。在該實施方案中，靶序列模板樣品397a含有已知量的靶序列1核酸模板，而靶序列模板樣品397b和397c分別含有已知量的靶序列2和靶序列3核酸模板。雖然在本發(fā)明的該實施方案中，每個靶序列由單個相應(yīng)的陽性對照測定孔表示，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，對于給定的靶序列可以考慮多個陽性對照測定孔，例如，含有不同濃度的給定靶模板的孔。這樣的陽性對照可用于例如產(chǎn)生用于定量PCR分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖16描繪了本發(fā)明的對照測定回路的替代構(gòu)造。在該實施方案中，測試回路200的構(gòu)造與圖15中描述的構(gòu)造相同，而陰性對照回路300和陽性對照電路400的構(gòu)造的不同之處在于它們不是流體連通的，而是由獨(dú)立的流體回路表示的。測試和陰性對照測定孔中含有的所有試劑與對于圖15所述的試劑相同。陽性對照樣品回路400包括與微流體通道415和下游樣品提取室420流體連通的陽性對照樣品端口410。陽性對照測定孔460a、460b和460c含有相同的酶混合樣品(470d、e和f)，過程對照引物/探針混合物(475d、475e和475f)和靶引物/探針混合物(480b、485b和490b)如圖15中所述。然而，陽性對照測定孔不含有嵌入的核酸模板樣品。在本發(fā)明的該實施方案的實踐中，用戶從外部樣品源供應(yīng)陽性對照模板，其通過樣品端口410引入陽性對照通道400。在提取室420中處理陽性對照樣品，通過本文所述的任何方法在測定孔460a、460b和460c中分析提取的核酸。在本發(fā)明的另一個實施方案中，在微流體盒的制造期間，將無活力的陽性對照模板樣品預(yù)裝載至樣品端口410中。無活力的陽性對照樣品可以包括滅活細(xì)菌、質(zhì)粒DNA等。預(yù)加載的陽性對照樣品經(jīng)歷如針對上述測試樣品所述的相同的提取和擴(kuò)增。

在實踐中，用戶將要測定其目標(biāo)靶序列的測試樣品施加于微流體裝置的樣品端口。樣品進(jìn)入下游提取室，其中通過本領(lǐng)域已知的任何方法提取核酸用于PCR。提取的核酸樣品進(jìn)入測試測定孔，用于使用上述試劑和引物/探針混合物進(jìn)行擴(kuò)增和檢測。本發(fā)明的該實施方案的裝置被配置來平行地測定三個獨(dú)特的測試序列的存在或不存在，并且每個獨(dú)特的擴(kuò)增反應(yīng)被復(fù)合以用于靶和過程對照模板的共擴(kuò)增。對于在裝置上運(yùn)行的每個獨(dú)特的靶測定，相應(yīng)的陽性和陰性對照在集成對照回路中平行運(yùn)行，排除了運(yùn)行額外的外部質(zhì)量對照的需要。

陽性和陰性對照測定的結(jié)果可用作測試測定結(jié)果驗證的進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)。例如，為了驗證陽性測試測定結(jié)果，可設(shè)置要求陰性對照測定孔中產(chǎn)生的熒光信號降至閾值以下的標(biāo)準(zhǔn)，指示陽性測試信號不是因外源模板的系統(tǒng)污染而產(chǎn)生。同樣地，為了驗證陰性測試測定結(jié)果，可設(shè)定要求陽性對照測定孔中產(chǎn)生的熒光信號超過閾值的標(biāo)準(zhǔn)，從而確認(rèn)測試試劑、引物和探針的完整性。因此，本發(fā)明的方法包括用于驗證測試測試結(jié)果的方法，其包括當(dāng)且僅當(dāng)滿足以下三個標(biāo)準(zhǔn)時才報告測試測試為有效的：1)過程對照信號為陽性，2)陰性對照信號為陰性，以及3)陽性對照信號為陽性。

本發(fā)明的其它實施方案包括通過直接比較靶和測定孔中產(chǎn)生的熒光信號來驗證測試結(jié)果和將結(jié)果評分為對于靶序列為陽性或陰性的方法。這些方法的進(jìn)一步細(xì)節(jié)參考圖15。在一個實施方案中，過程對照序列由裝置100使用第一熒光信號檢測，而測試靶序列使用第二熒光信號檢測。第一和與二熒光信號之間的直接比較可以在用于診斷測定的以下五個驗證或評分步驟中進(jìn)行，其中每個步驟基于終端用戶設(shè)置的任意有效性比率：1)為了驗證過程對照測定的完整性，將來自陽性對照孔360a、360b和360c的第一熒光信號(報告過程對照信號)與陰性對照孔350a、350b和350c的熒光信號進(jìn)行比較。在一個實施方案中，僅當(dāng)陽性對照信號約為陰性對照孔的測定信號2.5倍時才報告有效結(jié)果；2)為了驗證靶測定的完整性，將來自陽性對照孔360a，360b和360c的第二熒光信號(報告靶信號)與陰性對照孔350a，350b和350c的熒光信號進(jìn)行比較。在一個實施方案中，僅當(dāng)陽性對照信號約為陰性對照孔的測定信號5倍時才報告有效結(jié)果；3)為了驗證提取過程的完整性，將來自測試測定孔250a、250b和250c的第一熒光信號(報告過程對照信號)與陰性對照孔350a、350b和350c的熒光信號相比較。僅當(dāng)測試測定信號至少約為陰性對照孔的測定信號2倍時才報告有效結(jié)果；4)為了驗證陽性測試測定結(jié)果的完整性(即排除由于污染引起的假陽性)，將陰性對照孔350a、350b和350c的第一熒光信號和/或第二熒光信號與來自擴(kuò)增前(即背景)的相同孔的信號水平相比較，并且僅當(dāng)擴(kuò)增后的測定信號不顯著超過背景時才報告有效結(jié)果；5)為了將測試測定信號評分為對于測試分析物是陽性或陰性的，將測試測定孔250a、250b和250c中的第二熒光信號與陰性對照孔350a、350b和350c的熒光信號進(jìn)行比較。如果測試信號至少約為陰性對照孔的3倍，則測試測定被報告為陽性，如果測試信號小至陰性對照孔的約1/3，則測試測定被報告陰性。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，上面設(shè)置的有效性比率是任意的，并且許多替代值可適用于任何給定的診斷測定，這取決于特定測定所獨(dú)有的許多因素。

在本發(fā)明的另一個實施例中，掃描數(shù)據(jù)可用于確定測定孔是否已經(jīng)成功地填充有測試樣品。在擴(kuò)增之前，將測定孔掃描為“填充前”，同時干燥，和“填充后”。“填充前”和“填充后”熒光信號的比較可用于確定孔是否已經(jīng)充分地填充有測試樣品。例如，顯示較低的填充后熒光信號的孔可能未能充分填充，表明任何測定結(jié)果可能無效。

有利地，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過預(yù)先檢測盒中每個孔的位置的工廠校準(zhǔn)過程，可以大大減少掃描盒所需的時間。在工廠校準(zhǔn)期間，對盒進(jìn)行連續(xù)掃描，并且將從“原始位置”定位每個孔位置所需的步進(jìn)電機(jī)脈沖的數(shù)量作為校準(zhǔn)數(shù)據(jù)存儲在檢測器頭固件中的非易失性存儲器中。在操作中，檢測器頭通過步進(jìn)到這些校準(zhǔn)位置中的每一個來執(zhí)行“離散掃描”，僅在這些位置處獲取光學(xué)數(shù)據(jù)。通過消除檢測器頭在掃描期間定位每個個體孔的需要，對所有九個孔進(jìn)行掃描的時間減少至大約小于1秒，這是對現(xiàn)有技術(shù)的明顯改進(jìn)。

示例性實施方案包括以下實施方案：

實施方案1.用于進(jìn)行樣品測定的微量測定盒，所述盒包含：

a)具有被封閉在其中的氣動回路的第一模制殼體；

b)具有被封閉在其中的液壓回路的第二模制殼體；

c)用于接收測試樣品的樣品入口，其中所述樣品入口與所述液壓回路流體連通；

d)插入在所述第一模制殼體與所述第二模制殼體之間的層壓層，所述層壓層包含與所述氣動回路和所述液壓回路流體連通的多個氣動液壓膜；

e)與所述液壓回路流體連通的測定孔組件；

f)限定氣動接口的氣動端口陣列，每個端口用于接收施加到其上的氣動脈沖，所述端口與所述氣動回路流體連通，其中所述氣動脈沖是正壓脈沖或負(fù)壓脈沖；以及

其中所述盒能夠使得所述氣動液壓膜由所述氣動脈沖可操作地控制。

實施方案2：實施方案1的微量測定盒，其中所述液壓回路包含測試測定回路和對照測定回路。

實施方案3.實施方案2的微量測定盒，其中所述測試測定對照回路與所述樣品入口流體連通，并且所述對照測定回路不與所述樣品入口流體連通。

實施方案4.實施方案3的微量測定盒，其中所述對照測定回路包含陽性對照測定回路和陰性對照測定回路。

實施方案5.實施方案4的微量測定盒，其中所述陽性對照測定回路與所述陰性對照測定回路流體連通。

實施方案6.實施方案4的微量測定盒，其中所述陽性對照測定回路和所述陰性對照測定回路不流體連通。

實施方案7.實施方案3的微量測定盒，其中所述測試測定回路、所述陽性對照測定回路和所述陰性對照測定回路中的每一個分別與多個測定孔各自流體連通。

實施方案8.實施方案7的微量測定盒，其中所述多個測定孔的數(shù)目為至多3個。

實施方案9.實施方案7的微量測定盒，其中所述多個測定孔的數(shù)目為3個。

實施方案10.實施方案7-9的任一項的微量測定盒，其中所述多個孔中的每一個被配置來進(jìn)行過程對照。

實施方案11.實施方案7-9的任一項的微量測定盒，其中所述陽性對照測定孔包含陽性對照核酸模板。

實施方案12.實施方案1-11的任一項的微量測定卡，其還包含與所述液壓回路流體連通的核酸捕獲組件。

實施方案13.實施方案12的微量測定卡，其中所述核酸捕獲組件包含中空外殼構(gòu)件和設(shè)置在其中的核酸捕獲膜。

實施方案14.實施方案13的微量測定盒，其中所述核酸捕獲膜包含氧化硅纖維。

實施方案15.實施方案13的微量測定卡，其還包括設(shè)置在所述殼體構(gòu)件內(nèi)部的上部支持介質(zhì)和下部支持介質(zhì)，其中所述核酸捕獲膜插入在所述上部支持介質(zhì)與所述下部支持介質(zhì)之間。

實施方案16.實施方案15的微量測定盒，其中所述上部和下部支持介質(zhì)是玻璃料。

實施方案17.實施方案15的微量測定盒，其中所述上部和下部支持介質(zhì)是聚丙烯墊圈。

實施方案18：實施方案1-17的任一項的微量測定卡，其中所述測定孔組件包含配置有多個孔的PCR孔層，其中每個所述孔包含進(jìn)行PCR擴(kuò)增和任何所得擴(kuò)增子的熒光檢測所必需的所有試劑。

實施方案19.實施方案18的微量測定卡，所述PCR孔層由高導(dǎo)熱聚合物形成。

實施方案20：實施方案18的微量測定卡，其中所述PCR孔層被配置用于終點(diǎn)PCR、實時PCR或解鏈曲線分析。

實施方案21.實施方案1-20的任一項的微量測定卡，其中所述第一模制殼體包括覆蓋所述測定孔組件的光學(xué)檢測窗口，其中所述光學(xué)檢測窗口由所述第一模制殼體的上表面上的菱形開口和所述第一模制殼體的下表面上的較小菱形開口形成，并且其中光學(xué)窗口的側(cè)面從所述第一模制殼體的上表面至下表面向內(nèi)成角度。

實施方案22：實施方案21的微量測定卡，其還包括插入在所述光學(xué)窗口與所述測定孔組件之間的光學(xué)透明蓋層。

實施方案23：實施方案1-22的任一項所述的微量測定卡，其中所述第一模制殼體包含與所述氣動回路和所述液壓回路流體連通的多個試劑儲存器。

實施方案24：實施方案23的微量測定卡，其中所述試劑儲存器是雙層箔包裝件。

實施方案25.實施方案24的微量測定卡，其中所述箔包裝件通過氣密粘合劑密封件固定地粘附至所述第一模制殼體。

實施方案26.實施方案23的微量測定卡，其包含至多六個試劑儲存器。

實施方案27.實施方案24的微量測定卡，其還包括設(shè)置在所述箔包裝件之下的尖銳物，所述尖銳物用于當(dāng)通過向氣動回路施加壓力脈沖而迫使所述箔包裝件與所述尖銳物接觸時使所述箔包裝件破裂。

實施方案28.實施方案27的微量測定卡，其中所述尖銳物由金屬形成。

實施方案29：實施方案28的微量測定卡，其中所述尖銳物包括以相對于所述模制殼體低于垂直的角度突出的倒鉤。

實施方案30.實施方案29的微量測定卡，其中所述角度為約75度。

實施方案31:實施方案20的微量測定卡，其還包含插入在所述試劑包裝與所述尖銳物之間的彈簧，所述彈簧具有固有彈簧力，其中所述彈簧力防止在壓力脈沖不存在的情況下所述試劑包裝與所述尖銳物之間的接觸。

實施方案32.實施方案1-31的任一項的微量測定卡，其還包含設(shè)置在所述氣動端口中的氣霧過濾塞。

實施方案33.實施方案25的微量測定卡，其中所述氣霧過濾塞由液體可溶脹材料形成。

實施方案34：實施方案1-33的任一項的微量測定卡，其中所述正壓力狀態(tài)和負(fù)壓力狀態(tài)的范圍為+150至-50kPa，例如+150kPa、+100kPa、+70kPa、0kPa、-35kPa或-50kPa。

實施方案35.實施方案1-34的任一個的微量測定卡，其還包含被配置來將所述氣動接口連接至主機(jī)儀器的單個使用的密封墊。

實施方案36.一種用于進(jìn)行樣品測定的微量測定系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含：

a)構(gòu)造來用于與主機(jī)儀器對接的一次性微量測定盒，所述盒具有設(shè)置在其中的液壓回路，其中所述液壓回路被配置來在與其接口的氣動回路的控制下操作，并且其中所述液壓回路包含測試測定回路、陽性對照測定回路和陰性對照測定回路；

b)限定氣動接口的一個或多個氣動端口的陣列，其中每個端口使得能夠?qū)鈩訅毫顟B(tài)從所述主機(jī)儀器傳送至所述氣動回路；

c)設(shè)置在所述主機(jī)儀器中的氣動歧管，所述歧管具有流體聯(lián)接到其上的多個氣動壓力源，其中所述歧管被配置來在多個壓力狀態(tài)下被操作，并且其中所述歧管通過所述氣動接口的端口流體連接至所述氣動回路；和

d)用于檢測樣品中的至少一個光學(xué)信號的檢測器頭，所述檢測器頭包括1至5個檢測通道。

實施方案37.實施方案36的微量測定系統(tǒng)，其中所述主機(jī)儀器包括至少一個Peltier熱泵。

實施方案38.實施方案37的微量測定系統(tǒng)，其中所述微量測定盒包含與所述液壓回路流體連通并與所述Peltier熱泵熱接觸的測定孔組件。

實施方案39.實施方案38的微量測定系統(tǒng)，其中所述主機(jī)儀器包含與所述液壓回路熱接觸的至少一個熱塊。

實施方案40.實施方案38的微量測定系統(tǒng)，其中所述盒包含與所述液壓回路流體連通并與所述熱塊熱接觸的核酸捕獲組件。

實施方案41.實施方案36-40的任一項的微量測定系統(tǒng)，其中所述檢測器頭被配置來在橫跨所述測試采樣回路和所述對照采樣回路的多個離散路徑上掃描所述微量測定盒，其中每個所述離散路徑由至少一個參考點(diǎn)界定，其中所述參考點(diǎn)是在主機(jī)儀器校準(zhǔn)期間預(yù)先確定的空間坐標(biāo)。

實施方案42.實施方案36-41的任一個的微量測定系統(tǒng)，其還包括被配置來將所述氣動接口端口陣列連接至所述氣動歧管的單個使用的密封墊。

實施方案43.實施方案36-42的任一項的微量測定系統(tǒng)，其還包括設(shè)置在所述氣動端口中的氣霧過濾塞。

實施方案44.實施方案36-43的任一項所述的微量測定系統(tǒng)，其包含約20個氣動端口。

實施方案45.實施方案36-44的任一個的微量測定系統(tǒng)，其中所述檢測器頭的所述檢測通道各自包括LED強(qiáng)度調(diào)制回路，其包括激發(fā)光采樣鏡、中性密度濾波器和LED強(qiáng)度檢測器。

實施方案46.實施方案36-45的任一個的微量測定系統(tǒng)，其中所述盒相對于接地平面保持在約15度的角度。

實施方案47.一種對與致病性病癥相關(guān)的靶熒光信號進(jìn)行受控測定的方法，所述方法包括：

a)用實施方案36的系統(tǒng)掃描測試測定回路中的樣品孔，其中如果存在靶熒光信號，則在所述檢測器頭的第一光學(xué)通道中檢測所述靶熒光信號，并且如果存在與內(nèi)源組分相關(guān)的過程對照熒光信號，則在所述檢測器頭的第二光學(xué)通道中檢測與內(nèi)源組分相關(guān)的過程對照熒光信號；

b)用實施方案36的系統(tǒng)就陽性對照熒光信號掃描陽性對照測定回路中的樣品孔，其中如果存在陽性對照熒光信號，則在所述檢測器頭的所述第一光學(xué)通道中檢測所述陽性對照熒光信號；

c)用實施方案36的系統(tǒng)變陰性對照熒光信號掃描陰性對照測定回路中的樣品孔，其中如果存在陰性對照熒光信號，則在所述檢測器頭的所述第一光學(xué)通道中檢測所述陰性對照熒光信號；

d)當(dāng)且僅當(dāng)檢測到所述第二熒光過程對照信號，檢測到所述陽性對照第一熒光信號，并且未檢測到所述陰性對照第一熒光信號時，才將所述第一靶標(biāo)對照信號報告為所述測定的有效結(jié)果。

實施方案48.實施方案47的方法，其中所述測試測定回路、所述陽性對照測定回路和所述陰性對照測定回路各自包含至多3個測定孔。

實施方案49.實施方案48的方法，其中所述至多3個測定孔各自被配置來測定獨(dú)特的靶熒光信號。

實施方案50.實施方案47-49的任一項的方法，其還包括將所述靶熒光信號與所述陽性對照熒光信號和所述陰性對照熒光信號進(jìn)行比較，以將所述樣品評分為對于所述致病性病癥是陽性或陰性的的步驟。

實施方案51.實施方案50的方法，其中所述比較步驟包括計算第一比率，其中所述第一比率是所述靶熒光信號與所述陽性對照熒光信號的比率，并計算第二比率，其中所述第二比率是所述靶熒光信號與所述陰性對照熒光信號的比率，并將所述第一和第二比率與驗證比率進(jìn)行比較。

實施方案52.實施方案51的方法，其中如果所述第一比率大于所述驗證比率，則所述樣品評分為陽性，并且如果所述第二比率小于所述驗證比率，則所述樣品評分為陰性。

雖然上面是本發(fā)明的某些實施方案的描述，但是有可能使用各種替代、修改和等同物。因此，本發(fā)明的范圍不應(yīng)當(dāng)參考上述描述來確定，而是相反應(yīng)當(dāng)參考所附權(quán)利要求書以及它們的等同物的全部范圍來確定。所附權(quán)利要求書不應(yīng)被解釋為包括工具加功能的限制，除非使用短語“用于...的工具”在給定權(quán)利要求中明確地敘述了這種限制。在本說明書中引用和/或在隨附的申請數(shù)據(jù)表中引用的所有美國專利、美國專利申請公開、美國專利申請、外國專利、外國專利申請和非專利出版物，包括但不限于2014年6月11日提交的美國臨時申請?zhí)?2/010,915，通過引用整體并入本文。如果必要，可以修改實施方案的方面以采用各種專利、申請和出版物的概念，以提供另外的實施方案。