在克隆擴增方案中的第一次延伸期間，可能將錯誤引入DNA。圖1示出了第一延伸期間的誤摻入(misincorporation)錯誤的示意圖100。在該實例中，首先將DNA分子與表面結(jié)合的寡核苷酸雜交。雜交的寡核苷酸然后在稱為“第一延伸”的步驟中通過DNA聚合酶延伸。在該實例中，聚合酶在第一延伸步驟期間在特定位置處摻入不正確的核苷酸(誤摻入的堿基顯示為交叉/星)。在第一次延伸后，進行擴增步驟，其產(chǎn)生在第一次延伸期間生成的DNA分子的多個拷貝。在擴增期間，在第一延伸步驟期間引入的錯誤在作為克隆群體的部分的所有分子中傳播(propagate)。誤摻入的堿基將被測序為“高質(zhì)量錯誤”，其可能難以與樣品中的真實突變區(qū)分開。

在克隆擴增過程的第一或第二循環(huán)中產(chǎn)生的摻入錯誤在該特定位置被測序時產(chǎn)生混合信號。圖2示出了在第一擴增循環(huán)期間的誤摻入錯誤的示意圖200(誤摻入的堿基顯示為交叉/星)。在此早期階段時，克隆群體由兩種分子組成；一種分子具有正確的堿基，而另一種分子攜帶誤摻入的堿基。隨著克隆擴增過程繼續(xù)，這兩個分子用作模板以產(chǎn)生更多的DNA分子。最終的克隆群體可以由大約相等量的野生型和誤摻入的分子兩者組成，盡管隨機事件可能使比率偏斜。由分子的混合群體產(chǎn)生的混合信號產(chǎn)生“低質(zhì)量”堿基識別(base call)。誤摻入事件發(fā)生的時機(timing)(循環(huán)數(shù))，連同在擴增的早期循環(huán)中發(fā)生的隨機效應(yīng)，將影響存在于特定克隆群體中的野生型和突變體分子的比例。

在一個實施方案中，本發(fā)明的方法可用于實質(zhì)性減少或消除在第一延伸期間可能產(chǎn)生的高質(zhì)量錯誤。

在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法還可以用于減少由在擴增的前幾個循環(huán)期間核苷酸的誤摻入引起的錯誤。

根據(jù)本發(fā)明，提供了具有改善的準確性的測序方法，所述方法包括：

提供核酸模板；

通過線性擴增直接從所述模板核酸產(chǎn)生包含彼此緊密接近保持(retained in close proximity to each other)或可鑒定為從相同模板核酸獲得的多個互補寡核苷酸鏈的群體；并且

對所述接近保持(said proximity retained)(例如表面結(jié)合)的寡核苷酸實施測序反應(yīng)。

優(yōu)選地，存在有至少三輪的線性擴增。

通過具有最小數(shù)量的三輪線性擴增，與典型的指數(shù)擴增方法相比，任何引入的錯誤的影響將被稀釋。例如，如果我們假設(shè)從表面上的ssDNA鏈A開始，那么線性擴增僅在每輪中產(chǎn)生拷貝A’，而指數(shù)擴增在第一輪中產(chǎn)生A’，但然后在隨后的輪次中A和A’兩者，那么在第一輪產(chǎn)生A’中產(chǎn)生的錯誤將導(dǎo)致A’鏈在第1輪的100％錯誤(對于兩種擴增)，在第2輪的50％錯誤(對于兩種擴增)，但是然后在第3輪時，只有1/3的A’鏈在線性擴增中具有錯誤，但對于指數(shù)擴增，2/4的A’鏈具有錯誤。在這之后，使用指數(shù)擴增繼續(xù)產(chǎn)生具有錯誤的A’鏈的50％，而使用本方法，使用核酸模板的線性擴增，錯誤變得更稀釋。

下面的實例顯示了用于線性擴增和指數(shù)擴增的錯誤傳播的比較，其中A和A’表示制備的鏈，并且粗體和下劃線表示含有突變的鏈。

優(yōu)選地，該方法還包括在線性擴增輪次之后且實施測序反應(yīng)之前實施互補鏈群體的進一步(指數(shù))擴增的步驟。

任選地，包含通過線性擴增直接從模板核酸獲得的多個互補鏈的群體在它們結(jié)合到表面時保持彼此緊密接近。

或者，包含通過線性擴增直接從模板核酸獲得的多個互補鏈的群體由于它們保持在防止或限制擴散的凝膠或乳液中而保持彼此緊密接近。

優(yōu)選地，提供多個核酸模板，并且產(chǎn)生多個互補鏈群體，其中每個群體直接自模板衍生，并且從每個模板衍生的群體衍生的成員保持彼此緊密接近。

有利地，通過在克隆擴增之前通過特定表面結(jié)合文庫分子的線性擴增創(chuàng)建分子，由所述線性擴增創(chuàng)建的分子保持緊密接近。以這種方式的表面結(jié)合非常容易地導(dǎo)致進一步的測序步驟。自相同模板衍生的線性擴增分子群體的緊密接近保持也可以通過在線性擴增后雜交或附著擴增分子來實現(xiàn)，例如如果使用滾環(huán)擴增的話。緊密接近的保持還可以通過在凝膠或乳液內(nèi)進行線性擴增循環(huán)以防止自由擴散來實現(xiàn)。這允許利用稀釋效應(yīng)，使得任何誤摻入錯誤將被稀釋掉(因為通過線性擴增創(chuàng)建的互補鏈群體中的兩個分子將攜帶相同突變是極不可能的)。雖然完全在溶液中的線性擴增步驟(即，對于直接從相同核酸模板獲得的群體，沒有互補鏈的緊密接近保持)將降低總體錯誤率，但其仍然導(dǎo)致“高質(zhì)量錯誤”得到維持(being carried through)，因為此類情況下的誤摻入步驟(無論在溶液線性擴增步驟中還是在指數(shù)擴增步驟中)將導(dǎo)致攜帶突變的簇(cluster)。本方法允許區(qū)分由于延伸誤差所致的假象(artefacts)，因為它們(在表面結(jié)合或以其它方式接近保持或擴散受限)線性擴增期間被凝膠稀釋掉，而真實突變在樣品自身中。

任選地，該方法包括將核酸模板附著到表面的步驟。這可以通過將所述核酸模板與位于表面上的第一引物雜交?；蛘撸梢詫⒛０搴怂嶂苯痈街奖砻?。

優(yōu)選地，互補鏈群體的進一步擴增利用附著于表面的另外的擴增引物，所述另外的擴增引物不參與線性擴增步驟。

任選地，(直接從核酸模板)線性擴增包括以下步驟：

將所述核酸模板與第一引物雜交；

延伸所述第一引物以產(chǎn)生所述模板的互補鏈；

變性以釋放保持緊密接近的互補鏈(例如它保持結(jié)合于表面，因此完全不移動或在附近再雜交之前不擴散得較遠)；并且

重復(fù)雜交和擴增步驟以產(chǎn)生直接從模板核酸獲得的表面結(jié)合互補鏈的群體。

任選地，線性擴增可以使用重組酶聚合酶擴增(RPA)。

任選地，線性擴增可以使用“Wildfire^TM”(Life Technologies)類型擴增，通過模板步行過程(template walking process)制備模板鏈的線性拷貝。

優(yōu)選地，克隆擴增步驟是橋式擴增。

優(yōu)選地，該方法包括測序步驟。

任選地，第一引物結(jié)合到固體支持物。

優(yōu)選地，固體支持物是平面元件。

優(yōu)選地，固體支持物是流動池。

任選地，固體支持物是珠。

或者，在附著于固體支持物的表面之前環(huán)化單鏈模板核酸，例如通過雜交進行。

環(huán)化可以使用環(huán)連接酶(circligase)。

滾環(huán)擴增(RCA)導(dǎo)致直接從模板核酸獲得的互補鏈的多聯(lián)體。

優(yōu)選地，然后將多聯(lián)體結(jié)合到固體支持物。

優(yōu)選地，固體支持物包含多個第二引物或其片段。

第二引物的片段不具有足夠的大小以允許在線性擴增步驟中使用的條件下直接延伸。

優(yōu)選地，所述方法包括將反向互補寡核苷酸與第二引物片段雜交的步驟，其中所述反向互補寡核苷酸在其5’端包含作為全長第二引物序列的一部分的額外堿基。

復(fù)制雜交的引物以延長表面引物，從而使它們適于進一步用于例如指數(shù)擴增。

任選地，將第二引物或其片段接枝(graft)到附著點上。

可以通過鏈霉抗生物素蛋白/生物素連接或通過鏈霉抗生物素蛋白/雙重生物素連接接枝。

任選地，固體支持物上的僅約一半的接枝位點被第一引物占據(jù)。

或者，可以存在偏斜比率(skewed ratio)。

任選地，可以通過寡核苷酸濃度，溫育時間和/或溫度來控制接枝過程。

優(yōu)選地，隨后將第二引物接枝到剩余的可用接枝附著點上。

接枝可以通過使用硫代磷酸酯/鹽(thiophosphate)或點擊化學(xué)(click chemistry)。

點擊化學(xué)包括可以快速且可靠地使用以將小單元連接在一起的其它化學(xué)物質(zhì)。

任選地，線性擴增步驟可以在顯著高于第二引物或其片段的解鏈溫度(Tm)的溫度下進行，并且擴增的第二部分在低于第二引物的Tm的溫度下進行。

任選地，當(dāng)與固體支持物結(jié)合時，第一引物中的至少一些是封閉的(blocked)。

然后，可以使用標準技術(shù)在至少初始線性擴增輪后解封閉(unblock)此類引物，并且可以用于進一步的擴增輪次。

根據(jù)另一方面，提供了測序方法，其包括第一方面的線性擴增步驟。

為了更好地理解本發(fā)明，將僅通過示例并參考以下附圖來描述實施方案，其中：

圖1示出了第一延伸期間的誤摻入錯誤的示意圖；和

圖2示出了在擴增的第一循環(huán)期間的誤摻入錯誤的示意圖；和

圖3示出了用于高通量測序中的提高的準確性的測序結(jié)構(gòu)的部分的實例的側(cè)視圖；和

圖4示出了用于高通量測序中的提高的準確性的測序結(jié)構(gòu)的部分的另一個實例的側(cè)視圖；和

圖5A至5F示出了圖4的測序結(jié)構(gòu)的側(cè)視圖并且顯示了通過線性擴增形成DNA分子的小克隆群體的過程的實例；和

圖6A至6F示出了圖4的測序結(jié)構(gòu)的側(cè)視圖并且示出了通過線性擴增稀釋DNA聚合酶錯誤的實例；和

圖7A至7E示出了圖4的測序結(jié)構(gòu)的側(cè)視圖并且顯示了通過用聚合酶延伸將短P7寡核苷酸引物轉(zhuǎn)化為全長引物的過程的實例；和

圖8A至8D示出了圖3的測序結(jié)構(gòu)的側(cè)視圖并且顯示了在線性擴增后將第二寡核苷酸引物附著到流動池的過程的實例；和

圖9A示出了通過滾環(huán)擴增(RCA)線性擴增文庫的過程的實例；和

圖9B示出了測序結(jié)構(gòu)的側(cè)視圖，并且顯示了將圖9A的多聯(lián)體DNA分子接種到流動池上的過程的實例；

圖10A至10C示出了測序結(jié)構(gòu)的側(cè)視圖，并且示出了直接在流動池上線性擴增環(huán)狀文庫分子的過程的實例；和

圖11A至11E示出了測序結(jié)構(gòu)的側(cè)視圖，并示出了經(jīng)由夾板寡核苷酸(splint oligonucleotide)將文庫分子連接到流動池上用于線性擴增的過程的實例。

在某些未示出的實施方案中，本發(fā)明的方法使用凝膠或乳液來防止通過特異性模板核酸/文庫分子的線性擴增形成的互補鏈群體的顯著擴散。

在各種實施方案中，本發(fā)明的方法使用包含單個“全長”表面結(jié)合的寡核苷酸引物(例如，全長P5引物)的固體表面和線性擴增以產(chǎn)生DNA分子的小克隆群體。

圖3示出了用于高通量測序中的提高的準確性的測序結(jié)構(gòu)300的一部分的實例的側(cè)視圖。測序結(jié)構(gòu)300包括固體支持物310。在一個實例中，固體支持物310是平面結(jié)構(gòu)，如流動池。在另一個實例中，固體支持物310是珠(未示出)。多個全長P5寡核苷酸引物315可以結(jié)合到測序結(jié)構(gòu)300的表面。用于附著P7寡核苷酸引物的多個附著點320可以結(jié)合到固體支持物310的表面。可以使用附著點320，例如以在線性擴增步驟之后，將全長P7寡核苷酸引物附著到固體支持物310，如參考圖8A至8D更詳細描述的。

圖4示出了用于高通量測序中的提高的準確性的測序結(jié)構(gòu)400的一部分的實例的側(cè)視圖。測序結(jié)構(gòu)400包括固體支持物410和多個全長P5寡核苷酸引物415。測序結(jié)構(gòu)400還包括多個短P7寡核苷酸引物420。短P7寡核苷酸引物420不具有足夠長度以支持擴增，但可以是在擴增方案中的后續(xù)步驟中延伸。在一個實例中，短P7寡核苷酸引物420可通過將較長的反向互補寡核苷酸與短P7寡核苷酸引物420雜交并用DNA聚合酶和dNTP(未示出)延伸短P7寡核苷酸引物420來延伸。此引物延伸步驟可在線性擴增步驟之后進行，如下文參照圖7A至7E更詳細描述。或者，線性擴增步驟可以在顯著高于短P7寡核苷酸引物420的解鏈溫度(Tm)的溫度下進行，并且擴增的第二部分在低于短P7寡核苷酸引物420的Tm的溫度下進行。因為擴增的第二部分在低于短P7寡核苷酸引物420的Tm的溫度下進行，短P7寡核苷酸引物420可參與擴增過程。

圖5A至5F示出了圖4的測序結(jié)構(gòu)400的側(cè)視圖，并且顯示了通過線性擴增形成DNA分子的小克隆群體的過程的實例。通過線性擴增形成DNA分子的小克隆群體的過程的實例可以包括但不限于以下步驟。

在一個步驟中，圖5A顯示了接種的DNA分子510與P5寡核苷酸引物415的雜交。

在另一步驟中，圖5B顯示P5寡核苷酸引物415的延伸以產(chǎn)生互補鏈515a。互補鏈515a通過P5寡核苷酸引物415結(jié)合到固體支持物410的表面。

在另一步驟中，圖5C顯示在第二擴增循環(huán)(例如，變性，退火和延伸)中接種的DNA分子510與第二P5寡核苷酸引物的雜交。延伸第二P5寡核苷酸引物415以產(chǎn)生第二互補鏈515b?；パa鏈515b也通過P5寡核苷酸引物415結(jié)合到固體支持物410的表面。

在另一步驟中，圖5D顯示在第三擴增循環(huán)(例如，變性，退火和延伸)中接種的DNA分子510與第三P5寡核苷酸引物的雜交。延伸第三P5寡核苷酸引物415以產(chǎn)生第三互補鏈515c?；パa鏈515c也通過P5寡核苷酸引物415結(jié)合到固體支持物410的表面。

在另一步驟中，圖5E顯示在第四擴增循環(huán)(例如，變性，退火和延伸)中接種的DNA分子510與第四P5寡核苷酸引物的雜交。延伸第四P5寡核苷酸引物415以產(chǎn)生第四互補鏈515d?；パa鏈515d也通過P5寡核苷酸引物415結(jié)合到固體支持物410的表面。擴增過程可以重復(fù)任何次數(shù)。在一個實例中，將線性擴增過程重復(fù)10個循環(huán)。

在另一步驟中，圖5F顯示在所需數(shù)目的擴增循環(huán)完成時除去接種的DNA模板510。互補鏈515的小群體保持結(jié)合到固體支持物410。在完成線性擴增過程后，許多未使用的P5寡核苷酸引物415也可存在于固體支持物410的表面上(未示出)。

在線性擴增過程中，僅將原始接種的DNA分子用作模板以產(chǎn)生新分子。因為只有原始接種的DNA分子用作模板，所以在線性擴增期間可能引入的錯誤不會被傳播。例如，在作為小克隆群體(通過線性擴增產(chǎn)生)的一部分的所有分子中在相同位置引入相同誤差的可能性非常低。例如，如果使用的聚合酶的準確性為99.9％(即每1000個核苷酸一個錯誤)，則在“n”數(shù)目的分子中在相同位置具有相同誤差的概率等于(0.001)ⁿ。因此，在兩個分子中在相同位置具有突變的概率是一百萬之一，并且在三個分子中是十億分之一。注意，這些計算沒有考慮所引入的突變可彼此不同。例如，如果T是正確的堿基，則一個分子可攜帶A，而另一個分子可攜帶C突變。通過線性擴增從原始分子創(chuàng)建多個拷貝導(dǎo)致準確性的顯著改進，即，與不包括線性擴增的初始步驟的標準擴增程序中的0.1％誤差相比，實際上是無錯誤的技術(shù)。當(dāng)執(zhí)行某些應(yīng)用時，用本文中所述的方法可以實現(xiàn)的高準確性水平是特別有益的。例如，當(dāng)觀察體細胞突變(即癌癥)時，共有覆蓋不能用于“淘汰(weed out)”由于在第一延伸和橋式擴增步驟期間的誤摻入而導(dǎo)致的測序錯誤。通過使用該方法，可以更有信心的是特定的SNP是真正的體細胞突變，而不是誤摻入事件。

在另一個實例中，如果在第一輪線性擴增期間引入錯誤，然后另外九個線性擴增循環(huán)再產(chǎn)生九個具有正確堿基的分子，則約90％的信號將由正確的堿基表示。因為90％的信號將由正確的堿基表示，所以仍然可以識別(call)正確的堿基。相比之下，在標準克隆擴增方案(即，第一次延伸，隨后直接是表面擴增，其中兩種引物存在于流動池表面上并積極參與擴增步驟)，第一擴增循環(huán)中的錯誤可導(dǎo)致大約50％的攜帶突變的分子(盡管通過隨機效應(yīng)，該百分比可以顯著更高)。因為大約50％(或可能更高)的分子可能攜帶突變，所以很難確定正確的堿基。

圖6A至6F示出了圖4的測序結(jié)構(gòu)400的側(cè)視圖，并且示出了通過線性擴增稀釋DNA聚合酶錯誤的實例。

在一個步驟中，圖6A顯示了接種的DNA分子610與P5寡核苷酸引物415的雜交。

在另一個步驟中，圖6B顯示P5寡核苷酸引物415的延伸以產(chǎn)生互補鏈615a。互補鏈615a通過P5寡核苷酸引物415結(jié)合到固體支持物410的表面。

在另一步驟中，圖6C顯示在第二線性擴增循環(huán)(例如，變性，退火和延伸)中接種的DNA分子610與第二P5寡核苷酸引物的雜交。延伸第二P5寡核苷酸引物415以產(chǎn)生第二互補鏈615b。在第二次延伸期間，通過DNA聚合酶引入誤摻入錯誤620。互補鏈615b也通過P5寡核苷酸引物415結(jié)合固體支持物410的表面。因為短P7寡核苷酸引物420長度不足以支持擴增，所以其中具有錯誤620的鏈615b不能參與擴增過程，并且不傳播錯誤620。所有其它擴增鏈615，即615a，615c和615d在該特定位置具有正確的核苷酸。

在另一步驟中，圖6D顯示在第三線性擴增循環(huán)(例如，變性，退火和延伸)中接種的DNA分子610與第三P5寡核苷酸引物的雜交。延伸第三P5寡核苷酸引物415以產(chǎn)生第三互補鏈615c。互補鏈615c也通過P5寡核苷酸引物415結(jié)合到固體支持物410的表面。因為短P7寡核苷酸引物420長度不足以支持擴增，所以其中具有錯誤620的鏈615b不能參與擴增過程，并且不傳播錯誤620。所有其它擴增鏈615，即615a，615c和615d在該特定位置具有正確的核苷酸。

在另一步驟中，圖6E顯示在第四線性擴增循環(huán)(例如，變性，退火和延伸)中接種的DNA分子610與第四P5寡核苷酸引物的雜交。延伸第四P5寡核苷酸引物415以產(chǎn)生第四互補鏈615d?；パa鏈615d也通過P5寡核苷酸引物415結(jié)合固體支持物410的表面。同樣，因為短P7寡核苷酸引物420長度不足以支持擴增，所以其中具有錯誤620的鏈615b不能參與擴增過程且錯誤620不傳播。擴增過程可以重復(fù)任何次數(shù)?？梢曰诳山邮艿腻e誤水平來選擇線性擴增循環(huán)的數(shù)量。因為大多數(shù)互補鏈615在任何特定位置處具有正確的核苷酸序列，所以可以進行測序期間正確的堿基識別。

在另一步驟中，圖6F顯示在所需數(shù)目的線性擴增循環(huán)完成時除去接種的DNA模板610?；パa鏈615的小群體保持結(jié)合于固體支持物410。

通過在包含短P7寡核苷酸引物的流動池表面上的線性擴增產(chǎn)生的互補鏈的小克隆群體可以在將短P7寡核苷酸引物轉(zhuǎn)化為全長引物之后進一步擴增?；蛘?，可以在使短P7引物能夠參與如前所述的擴增過程的較低溫度下進行進一步的擴增循環(huán)。

圖7A至7E示出了圖4的測序結(jié)構(gòu)400的側(cè)視圖，并且顯示了通過用聚合酶延伸將短P7寡核苷酸引物420轉(zhuǎn)化為全長引物的過程的實例。通過延伸轉(zhuǎn)化短P7寡核苷酸引物420的方法的實例可以包括但不限于以下步驟。

在一個步驟中，圖7A顯示了接種的DNA分子710與P5寡核苷酸引物415的雜交。

在另一步驟中，圖7B顯示通過線性擴增產(chǎn)生的小克隆群體715，如參考圖5B至5F所述。

在另一個步驟中，圖7C顯示了與短P7寡核苷酸引物420雜交的多個反向互補寡核苷酸720。反向互補寡核苷酸720在其5'端包含作為全長P7引物序列的一部分的額外堿基。也可以雜交寡核苷酸720，然后將另一個寡核苷酸730與所述寡核苷酸720雜交。然后可以將寡核苷酸引物420和另外的寡核苷酸730連接在一起，以產(chǎn)生較長的P7表面寡核苷酸。

在另一步驟中，圖7D顯示短P7寡核苷酸引物420已經(jīng)通過DNA聚合酶延伸至全長寡核苷酸引物725。全長寡核苷酸引物725現(xiàn)在可用于橋式擴增過程。

在另一個步驟中，圖7E顯示了使用全長寡核苷酸引物725和P5寡核苷酸引物415在橋式擴增過程中產(chǎn)生的DNA分子730的較大的克隆群體。

圖8A至8D示出了圖3的測序結(jié)構(gòu)300的側(cè)視圖，并且示出了在線性擴增后將第二寡核苷酸引物附著到流動池的過程的實例。在線性擴增后附著第二寡核苷酸的過程的實例可以包括但不限于以下步驟。

在一個步驟中，圖8A顯示了接種的DNA分子810與P5寡核苷酸引物315的雜交。

在另一個步驟中，圖8B顯示了通過線性擴增產(chǎn)生的小克隆群體815，如參照圖5B至5F所述。

在另一個步驟中，圖8C顯示了多個第二P7寡核苷酸引物820與附著點320的附著。在一個實例中，P7寡核苷酸引物820通過鏈霉抗生物素蛋白/生物素連接接枝到附著點320上(也可以使用雙生物素，因為就其與鏈霉抗生物素蛋白的相互作用而言，其與單一生物素相比更穩(wěn)定)。在該實例中，附著點320包含鏈霉抗生物素蛋白，P7寡核苷酸引物820是生物素化的。在另一個實例中，控制固體支持物310與P5寡核苷酸引物315的初始接枝，使得固體支持物310上的接枝位點僅約一半被P5寡核苷酸引物315占據(jù)?？梢钥刂平又^程，例如，通過寡核苷酸濃度，溫育時間和/或溫度。P7寡核苷酸引物820隨后使用硫代磷酸酯或點擊化學(xué)(即，可以快速并可靠地將小單元連接在一起的其它化學(xué)物質(zhì))接枝到剩余的可用接枝位點(例如，附著點320)上。

在另一個步驟中，圖8D顯示了在橋式擴增過程中使用接枝寡核苷酸引物820和P5寡核苷酸引物415產(chǎn)生的DNA分子825的較大的克隆群體。

圖9A示出了通過滾環(huán)擴增(RCA)線性擴增文庫的過程900的示例。過程900可以例如在溶液中執(zhí)行?；蛘撸^程900可直接在固體表面上執(zhí)行。如步驟1所示，將雙鏈DNA模板910變性以形成單鏈DNA模板915。雙鏈DNA模板910包括與P5和P7寡核苷酸引物序列雜交的銜接頭區(qū)。如步驟2所示，使用酶環(huán)連接酶將單鏈DNA模板915環(huán)化以形成環(huán)狀DNA模板920。如步驟3所示，在RCA過程中擴增環(huán)狀DNA模板920以產(chǎn)生線性多聯(lián)體DNA分子925。環(huán)狀DNA模板920的RCA從多聯(lián)體DNA分子925中的相同初始模板分子產(chǎn)生10s-100s線性拷貝。如參考圖9B所述，可使用多聯(lián)體DNA分子925來接種簇生長。線性拷貝全部通過復(fù)制原始環(huán)狀分子形成，因此不傳播在RCA步驟期間發(fā)生的任何誤摻入事件。

圖9B示出了測序結(jié)構(gòu)950的側(cè)視圖，并且顯示了將圖9A的多聯(lián)體DNA分子接種到流動池上的過程的實例。測序結(jié)構(gòu)950包括固體支持物955。在一個實例中，固體支持物955是流動池。結(jié)合在固體支持物955的表面上的是多個P5寡核苷酸引物960和多個P7寡核苷酸引物965。將多聯(lián)體DNA分子925接種到固體支持物955的表面上并與P5寡核苷酸引物960雜交。通過初級延伸大多數(shù)(如果不是全部)包含在多聯(lián)體DNA分子925中的線性拷貝啟動簇生長。然后可以使用標準簇擴增方法(如果需要的話)，為隨后的測序提供足夠的材料。還可以使用具有單一類型的引物的表面。在這種情況下的克隆群體將通過RCA產(chǎn)物的單個延伸步驟進行。

圖10A至10C示出了測序結(jié)構(gòu)1000的側(cè)視圖，并且顯示了直接在流動池上線性擴增環(huán)狀文庫分子的過程的實例。直接在流動池上線性擴增環(huán)狀文庫分子的過程的實例可以包括但不限于以下步驟。

在一個步驟中，圖10A顯示測序結(jié)構(gòu)1000。測序結(jié)構(gòu)1000包括流動池1010。多個P5寡核苷酸引物1015和多個P7寡核苷酸引物1020結(jié)合在流動池1010的表面上結(jié)合。將單鏈環(huán)DNA模板1025接種到流動池1010的表面上并與P5寡核苷酸引物1015雜交。

在另一步驟中，圖10B顯示在RCA過程中環(huán)狀DNA模板1025的線性擴增，以產(chǎn)生互補多聯(lián)體DNA分子1030。

在另一個步驟中，圖10C示出了通過P5寡核苷酸引物1015結(jié)合流動池1010的多聯(lián)體DNA分子1030。在該實例中，僅顯示了3個線性擴增的插入序列，但是多聯(lián)體DNA分子1030可以包含10s-100s的原始DNA模板的線性拷貝。多聯(lián)體DNA分子1030具有重復(fù)結(jié)構(gòu)P5-插入序列-P7'-P5-插入序列-P7'-P5-插入序列二-P7'。在橋式擴增的第一任選循環(huán)期間，多聯(lián)體DNA分子1030可以與多個P7寡核苷酸引物1020(未示出)雜交。隨后將P7寡核苷酸引物1020延伸以產(chǎn)生P7-插入序列-P5'鏈(及其一些多聯(lián)體)(未示出)。然后，橋式擴增的后續(xù)循環(huán)將照常進行，并且將傾向于有利于較短的插入序列，使得大多數(shù)鏈僅含有1個插入序列。然后可以使用標準簇擴增方法(如果需要的話)，為后續(xù)測序提供足夠的材料。

圖11A至11E示出了測序結(jié)構(gòu)1100的側(cè)視圖，并且顯示了經(jīng)由夾板寡核苷酸將文庫分子連接到流動池上用于線性擴增的過程的實例。經(jīng)由夾板寡核苷酸將文庫分子連接到流動池上用于線性擴增的過程的實例可包括但不限于以下步驟。

在一個步驟中，圖11A顯示測序結(jié)構(gòu)1100。測序結(jié)構(gòu)1100包括流動池1110.在流動池1110的表面上結(jié)合有多個封閉的P5寡核苷酸引物1115，多個P7寡核苷酸引物1120和多個的P5捕獲引物1125。在一個實例中，封閉的P5寡核苷酸引物1115是3'磷酸封閉的寡核苷酸。在另一個實例中，封閉的P5寡核苷酸引物1115包含存在于Illumina測序技術(shù)中使用的完全功能性核苷酸上的3'可逆性封閉。還可能具有選擇的長度的短P5引物，使得在一定溫度以上它們不能參與擴增過程。然后可以在已經(jīng)進行線性擴增步驟之后延長這些短P5引物。

在另一個步驟中，圖11B顯示文庫模板分子1130通過夾板寡核苷酸1135連接到P5捕獲引物1125上。文庫模板分子1130不包括與封閉的寡核苷酸引物1115互補的序列。夾板寡核苷酸1135包括與文庫模板分子1130和捕獲引物1125的一部分互補的序列。夾板寡核苷酸1135促進文庫模板分子1130與P5捕獲引物1125連接以形成連接的模板分子1140。

在另一步驟中，圖11C顯示將連接的模板分子1140線性擴增到周圍的游離P7寡核苷酸引物1120上，以產(chǎn)生線性擴增的分子1145。

在另一個步驟中，圖11D顯示了封閉的P5寡核苷酸引物1115的解封閉，以產(chǎn)生多個解封閉的P5寡核苷酸引物1150。在一個實例中，使用T4激酶或磷酸酶將3'磷酸封閉的P5寡核苷酸引物1115解封閉(即轉(zhuǎn)化為3'OH)?；蛘?，如果3'封閉是存在于Illumina測序技術(shù)中使用的完全功能性核苷酸上的3'可逆封閉，則可以使用Illumina的切割試劑除去3'封閉。

在另一步驟中，圖11E顯示了使用標準簇擴增過程的擴增，即2引物介導(dǎo)的擴增方法以產(chǎn)生克隆擴增群體1155。

在本發(fā)明的另一個實施方案中，固體支持物可以是珠。在一個實例中，可在乳液中進行基于珠的線性擴增以確保擴增群體的克隆性。在另一個實例中，可以將單個珠接種在單獨的納米孔中，以確保擴增群體的克隆性。在另一個實例中，珠可以懸浮在凝膠狀溶液內(nèi)以防止或基本上最小化珠的自由運動。

在本發(fā)明的另一個實施方案中，可以在珠上進行線性擴增。一個或多個珠在線性擴增期間可以在流動池內(nèi)部，或者線性擴增可以在流動池外部發(fā)生，并且一個或多個珠在線性擴增輪次或步驟之后流入流動池中。然后可以將核酸(DNA)復(fù)制到珠上以在表面上制備拷貝，或者可以使用標準技術(shù)從珠釋放核酸分子，并使其在流動池的表面上輕微擴散，保持緊密接近局部化。測序可以使用已知技術(shù)在此進行，例如通過合成測序，或者然后可以形成簇，即使用橋式擴增(有效地提供由原始線性擴增群體形成和在原始線性擴增群體內(nèi)形成的簇)和使用已知測序技術(shù)確定的共有序列。例如，如果具有相同基因組序列的10個簇具有位置9處的G并且一個具有T，則有可能棄去T并將其確信識別為G。可以基于位置信息以及還基于序列信息對序列進行分組。

獨特的分子標識符(UMI)也可以用于所提出的方法。如果在模板核酸文庫中實施UMI，則可以使用UMI信息來鑒定“姐妹”分子，即源自相同模板核酸的分子。

在又一個實例中，可以使珠粘附到玻璃棉或金屬棉上以防止它們在溶液周圍移動。