技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于制備JAK1抑制劑的方法以及所述抑制劑的新形式。

發(fā)明背景

蛋白激酶(PK)調(diào)控多種生物過程，尤其包括細(xì)胞生長、存活、分化、器官形成、形態(tài)發(fā)生、新血管形成、組織修復(fù)和再生。蛋白激酶還在許多人類疾病(包括癌癥)中起特殊作用。細(xì)胞因子、低分子量多肽或糖蛋白調(diào)控許多涉及對膿毒病的宿主炎性反應(yīng)的途徑。細(xì)胞因子影響細(xì)胞分化、增殖和活化，且可調(diào)節(jié)促發(fā)炎性和消炎性反應(yīng)，從而允許宿主對病原體作出適當(dāng)反應(yīng)。許多細(xì)胞因子的信號傳導(dǎo)涉及蛋白酪氨酸激酶的Janus激酶家族(JAK)和訊號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化蛋白(STAT)。存在四種已知的哺乳動(dòng)物JAK：JAK1(Janus激酶-1)、JAK2、JAK3(也稱為白細(xì)胞Janus激酶；JAKL；和L-JAK)和TYK2(蛋白酪氨酸激酶2)。

細(xì)胞因子刺激的免疫和發(fā)炎反應(yīng)促進(jìn)疾病發(fā)?。褐T如重癥聯(lián)合免疫缺陷病(SCID)的發(fā)病起因于對免疫系統(tǒng)的抑制，而過度活性或不當(dāng)免疫/發(fā)炎反應(yīng)促進(jìn)自體免疫性疾病(例如哮喘、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、甲狀腺炎、心肌炎)和諸如硬皮病和骨關(guān)節(jié)炎的疾病發(fā)病(Ortmann,R.A.,T.Cheng等人,(2000)Arthritis Res 2(1):16-32)。

JAK表達(dá)缺乏與許多疾病狀態(tài)相關(guān)。舉例而言，Jak1-/-小鼠在出生時(shí)發(fā)育不良，無法養(yǎng)育且在圍產(chǎn)期死亡(Rodig,S.J.,M.A.Meraz等人,(1998)Cell 93(3):373-83)。Jak2-/-小鼠胚胎為貧血的且由于不存在定向紅細(xì)胞生成而在交配后第12.5天左右死亡。

認(rèn)為JAK/STAT途徑且尤其是所有四種JAK在哮喘反應(yīng)、慢性阻塞性肺病、支氣管炎和下呼吸道的其它相關(guān)發(fā)炎性疾病的致病機(jī)制中起作用。通過JAK傳導(dǎo)信號的多種細(xì)胞因子與上呼吸道的發(fā)炎性疾病/病狀相關(guān)，諸如影響鼻和鼻竇的疾病/病狀(例如鼻炎和鼻竇炎)，無論是否為經(jīng)典過敏反應(yīng)。JAK/STAT途徑還牽涉眼部發(fā)炎性疾病/病狀和慢性過敏反應(yīng)。

JAK/STAT在癌癥中活化可通過細(xì)胞因子刺激(例如IL-6或GM-CSF)或通過諸如SOCS(抑制因子或細(xì)胞因子信號傳導(dǎo))或PIAS(活化STAT的蛋白抑制劑)的內(nèi)源性JAK信號傳導(dǎo)抑制因子減少來發(fā)生(Boudny,V.和Kovarik,J.,Neoplasm.49:349-355,2002)。STAT信號傳導(dǎo)的活化以及其它JAK下游途徑(例如Akt)與許多癌癥類型中的不良預(yù)后相關(guān)(Bowman,T.等人,Oncogene 19:2474-2488,2000)。通過JAK/STAT進(jìn)行信號傳導(dǎo)的循環(huán)細(xì)胞因子的含量升高在惡病質(zhì)和/或慢性疲勞中起病因性作用。因此，出于超出潛在抗腫瘤活性以外的原因，JAK抑制可能有益于癌癥患者。

JAK2酪氨酸激酶可有益于患有骨髓增生性病癥的患者，例如真性紅細(xì)胞增多癥(PV)、原發(fā)性血小板增多癥(ET)、髓樣組織化生伴隨骨髓纖維化(MMM)(Levin等人,Cancer Cell,第7卷,2005:387-397)。對JAK2V617F激酶的抑制減少造血細(xì)胞增殖，表明JAK2為在患有PV、ET和MMM的患者中進(jìn)行藥理學(xué)抑制的潛在靶標(biāo)。

對JAK的抑制可有益于罹患諸如銀屑病和皮膚敏感化的皮膚免疫病癥的患者。認(rèn)為銀屑病的維持依賴于許多發(fā)炎性細(xì)胞因子以及各種趨化因子和生長因子(JCI,113:1664-1675)，其中許多種通過JAK進(jìn)行信號傳導(dǎo)(Adv Pharmacol.2000；47:113-74)。

因此，持續(xù)需要可抑制諸如JAK的激酶的新的或改進(jìn)的藥劑，以便開發(fā)旨在增強(qiáng)或抑制免疫性和發(fā)炎性途徑(諸如用于器官移植的免疫抑制劑)的新的且更有效的藥物，以及用于預(yù)防和治療自體免疫性疾病、涉及過度活性發(fā)炎性反應(yīng)的疾病(例如濕疹)、過敏、癌癥(例如前列腺癌、白血病、多發(fā)性骨髓瘤)和由其它療法所致的一些免疫反應(yīng)(例如皮疹或接觸性皮炎或腹瀉)的藥劑。本文中所描述的本發(fā)明化合物以及其組合物和方法是針對這些需要和其它目的。

發(fā)明概要

本發(fā)明提供制備式Ia化合物的方法：

所述方法包括在第一溶劑組分存在下使式Ib化合物：

與強(qiáng)堿反應(yīng)。

本申請?zhí)峁?-((2R,5S)-5-(2-((R)-1-羥基乙基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈的無水形式。

本申請還提供2-((2R,5S)-5-(2-((R)-1-羥基乙基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈的一水合物形式。

本申請還提供可用于合成式Ia化合物的各種中間體。

附圖簡述

圖1顯示實(shí)施例9的化合物的DSC溫譜圖特征。

圖2顯示實(shí)施例9的化合物的TGA溫譜圖特征。

圖3顯示實(shí)施例9的化合物的XRPD圖譜特征。

圖4顯示實(shí)施例10的化合物的DSC溫譜圖特征。

圖5顯示實(shí)施例10的化合物的TGA溫譜圖特征。

圖6顯示實(shí)施例10的化合物的XRPD圖譜特征。

圖7顯示實(shí)施例9的化合物的氣相吸附/脫附等溫線(第1循環(huán))特征。

圖8顯示實(shí)施例9的化合物的氣相吸附/脫附等溫線(第4循環(huán))特征。

圖9顯示實(shí)施例9的化合物在動(dòng)態(tài)氣相吸附(DVS)研究前后的XRPD圖譜疊加。

圖10顯示實(shí)施例9的化合物在設(shè)在75％相對濕度和40℃的濕度室中5天之后的XRPD圖譜特征。

圖11顯示實(shí)施例9的化合物在設(shè)在75％相對濕度和40℃的濕度室中5天之后的TGA溫譜圖特征。

圖12顯示實(shí)施例9的化合物在設(shè)在75％相對濕度和40℃的濕度室中5天之后的DSC溫譜圖特征。

圖13顯示實(shí)施例9的化合物在設(shè)在90％相對濕度和30℃的濕度室中7天之后的XRPD圖譜特征。

圖14顯示實(shí)施例9的化合物在設(shè)在90％相對濕度和30℃的濕度室中7天之后的TGA溫譜圖特征。

圖15顯示實(shí)施例9的化合物在設(shè)在90％相對濕度和30℃的濕度室中7天之后的DSC溫譜圖特征。

發(fā)明詳述

本發(fā)明尤其提供用于制備以下化合物的方法和中間體：2-((2R,5S)-5-(2-((R)-1-羥基乙基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈，其為式Ia化合物：

以及式Ia化合物的新形式。式Ia化合物包括所述化合物的無水形式和水合形式。舉例而言，本申請?zhí)峁┦絀a化合物的新無水形式和新一水合物形式。一水合物形式具有式II：

本申請?zhí)峁?-((2R,5S)-5-(2-((R)-1-羥基乙基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈的無水形式。

在一些實(shí)施方案中，所述無水形式基本上經(jīng)分離。在一些實(shí)施方案中，所述無水形式為結(jié)晶的。

在一些實(shí)施方案中，所述無水形式的特征在于具有在約185℃開始的吸熱峰的差示掃描量熱法溫譜圖。在一些實(shí)施方案中，所述無水形式的特征在于在約190℃處具有吸熱峰的差示掃描量熱法(DSC)溫譜圖。在一些實(shí)施方案中，所述無水形式具有基本上如圖1中所示的DSC溫譜圖。

在一些實(shí)施方案中，所述無水形式的特征在于直至200℃具有約1.25％重量損失的熱解重量分析(TGA)溫譜圖。在一些實(shí)施方案中，所述無水形式具有基本上如圖2中所示的TGA溫譜圖。

在一些實(shí)施方案中，就選自約8.8°、約10.5°、約16.3°、約17.5°、約19.1°、約21.2°、約24.0°和約26.4°的2θ而言，所述無水形式具有至少一個(gè)XRPD峰。在一些實(shí)施方案中，就選自約8.8°、約10.5°、約16.3°、約17.5°、約19.1°、約21.2°、約24.0°和約26.4°的2θ而言，所述無水形式具有至少兩個(gè)XRPD峰。在一些實(shí)施方案中，就選自約8.8°、約10.5°、約16.3°、約17.5°、約19.1°、約21.2°、約24.0°和約26.4°的2θ而言，所述無水形式具有至少三個(gè)XRPD峰。在一些實(shí)施方案中，就選自約8.8°、約10.5°、約16.3°、約17.5°、約19.1°、約21.2°、約24.0°和約26.4°的2θ而言，所述無水形式具有至少四個(gè)XRPD峰。在一些實(shí)施方案中，就選自約8.8°、約16.3°、約19.1°、約24.0°和約26.4°的2θ而言，所述無水形式具有至少四個(gè)XRPD峰。

在一些實(shí)施方案中，所述無水形式具有基本上如圖3中所示的XRPD圖譜。在一些實(shí)施方案中，所述無水形式具有基本上如圖7中所示的氣相吸附/脫附等溫線。在一些實(shí)施方案中，所述無水形式具有基本上如圖8中所示的氣相吸附/脫附等溫線。

本申請還提供2-((2R,5S)-5-(2-((R)-1-羥基乙基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈一水合物的一水合物形式，其為式II化合物：

在一些實(shí)施方案中，所述一水合物形式具有約5％的水含量。在一些實(shí)施方案中，所述一水合物形式基本上經(jīng)分離。在一些實(shí)施方案中，所述一水合物形式為結(jié)晶的。

在一些實(shí)施方案中，所述一水合物形式的特征在于具有在約69℃開始的吸熱峰的DSC溫譜圖。在一些實(shí)施方案中，所述一水合物形式的特征在于在約106℃處具有吸熱峰的DSC溫譜圖。

在一些實(shí)施方案中，所述一水合物形式的特征在于具有在約131℃開始的吸熱峰的DSC溫譜圖。在一些實(shí)施方案中，所述一水合物形式的特征在于在約140℃處具有吸熱峰的DSC溫譜圖。在一些實(shí)施方案中，所述一水合物形式具有基本上如圖4中所示的DSC溫譜圖。

在一些實(shí)施方案中，所述一水合物形式的特征在于直至150℃具有約5％重量損失的TGA溫譜圖。在一些實(shí)施方案中，所述一水合物形式具有基本上如圖5中所示的TGA溫譜圖。

在一些實(shí)施方案中，就選自約8.5°、約8.7°、約14.6°、約15.1°、約19.4°、約25.1°和約26.5°的2θ而言，所述一水合物形式具有至少一個(gè)XRPD峰。在一些實(shí)施方案中，就選自約8.5°、約8.7°、約14.6°、約15.1°、約19.4°、約25.1°和約26.5°的2θ而言，所述一水合物形式具有至少兩個(gè)XRPD峰。在一些實(shí)施方案中，就選自約8.5°、約8.7°、約14.6°、約15.1°、約19.4°、約25.1°和約26.5°的2θ而言，所述一水合物形式具有至少三個(gè)XRPD峰。在一些實(shí)施方案中，就選自約8.5°、約8.7°、約14.6°、約15.1°、約19.4°、約25.1°和約26.5°的2θ而言，所述一水合物形式具有至少四個(gè)XRPD峰。在一些實(shí)施方案中，所述一水合物形式具有基本上如圖6中所示的XRPD圖譜。

典型地認(rèn)為反射(峰)的XRPD圖譜為特定結(jié)晶形式的指紋。眾所周知，XRPD峰的相對強(qiáng)度可廣泛變化，尤其取決于樣品制備技術(shù)、晶體尺寸分布、所使用的各種過濾器、樣品固定程序和所使用的特定儀器。在一些情況下，可觀察觀察到新峰，或現(xiàn)有峰可能消失，此取決于儀器類型或設(shè)定。如本文中所使用，術(shù)語“峰”是指相對高度/強(qiáng)度為最大峰高度/強(qiáng)度的至少約4％的反射。此外，儀器變化和其它因素可能影響2θ值。因而，諸如本文中所報(bào)告的峰指定可能變化±約0.2°(2θ)，且如本文中的XRPD內(nèi)容中所使用的術(shù)語“基本上”和“約”意欲涵蓋上述變化。

同樣，與DSC、TGA或其它熱實(shí)驗(yàn)相關(guān)的溫度讀數(shù)可變化約±3℃，此取決于儀器、特定設(shè)定、樣品制備等。因此，本文中所報(bào)告的具有“基本上”如任何圖中所示的DSC溫譜圖的結(jié)晶形式或術(shù)語“約”應(yīng)理解為包括此種變化。

本申請還提供形成2-((2R,5S)-5-(2-((R)-1-羥基乙基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈的無水形式的方法，所述方法包括：

(i)將正庚烷添加至第一混合物中，所述第一混合物包含式II化合物：

和第一溶劑組分，其中所述第一溶劑組分包含乙酸乙酯。

在一些實(shí)施方案中，所述第一溶劑組分還包含甲醇。

在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括在(i)之前：

(ii)將所述式II化合物溶解于甲醇中以形成第二混合物，所述第二混合物包含式Ia化合物和第二溶劑組分，所述第二溶劑組分包含甲醇；

(iii)對所述第二混合物進(jìn)行精過濾；和

(iv)向所述第二混合物中添加乙酸乙酯以形成所述第一混合物。

在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括將所述第一混合物加熱至約60℃至約75℃的溫度。

在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括經(jīng)由蒸餾移除至少一部分乙酸乙酯和甲醇，以形成所述第一混合物。

本申請還提供制備式Ia化合物的方法：

所述方法包括使式Ib化合物：

與強(qiáng)堿在第一溶劑組分存在下進(jìn)行反應(yīng)。

在一些實(shí)施方案中，所述強(qiáng)堿為醇鹽堿。

在一些實(shí)施方案中，所述強(qiáng)堿為堿金屬C_1-6醇鹽。

在一些實(shí)施方案中，所述強(qiáng)堿為叔丁醇鉀。

在一些實(shí)施方案中，所述第一溶劑組分包含異丙醇。

在一些實(shí)施方案中，所述第一溶劑組分包含異丙醇和四氫呋喃。

在一些實(shí)施方案中，組合物與強(qiáng)堿的反應(yīng)是在約室溫的溫度下進(jìn)行。

在一些實(shí)施方案中，其中以1當(dāng)量式Ib化合物計(jì)，使用約0.05至約0.15當(dāng)量強(qiáng)堿。

在一些實(shí)施方案中，式Ib化合物在所述式Ib化合物與所述強(qiáng)堿的所述反應(yīng)之前即存在于包含式Ib化合物和式Ia化合物的組合物中。

在一些實(shí)施方案中，與式Ib化合物反應(yīng)的強(qiáng)堿稱為第一強(qiáng)堿。

在一些實(shí)施方案中，式Ia化合物制備為式II化合物：

在一些實(shí)施方案中，包含式Ia化合物和式Ib化合物的組合物是通過如下方法制備，所述方法包括使包含式IIIa化合物和式IIIb化合物的組合物：

與式IV化合物：

在C_1-6烷基氧鎓試劑和第二溶劑組分存在下進(jìn)行反應(yīng)。

在一些實(shí)施方案中，在反應(yīng)之前，使所述式IV化合物與所述C_1-6烷基氧鎓在所述第二溶劑組分中反應(yīng)。

在一些實(shí)施方案中，所述反應(yīng)步驟稱為包含式IIIa化合物和式IIIb化合物的組合物的反應(yīng)。

在一些實(shí)施方案中，所述C_1-6烷基氧鎓試劑為三乙基氧鎓四氟硼酸鹽。

在一些實(shí)施方案中，所述第二溶劑組分包含乙醇。

在一些實(shí)施方案中，所述第二溶劑組分包含四氫呋喃。

在一些實(shí)施方案中，所述第二溶劑組分包含乙醇和四氫呋喃。

在一些實(shí)施方案中，式IIIa化合物和式IIIb化合物的組合物與式IV化合物的反應(yīng)是在回流溫度下進(jìn)行。

在一些實(shí)施方案中，以1當(dāng)量組合量的式IIIa化合物和式IIIb化合物計(jì)，使用約2至約4當(dāng)量的式IV化合物。

在一些實(shí)施方案中，以1當(dāng)量組合量的式IIIa化合物和式IIIb化合物計(jì)，使用約2至約4當(dāng)量的烷基氧鎓試劑。

在一些實(shí)施方案中，包含式IIIa化合物和式IIIb化合物的組合物是通過如下方法制備，所述方法包括使包含式Va化合物和式Vb化合物的組合物：

與氫氣在氫化催化劑和第三溶劑組分存在下進(jìn)行反應(yīng)。

在一些實(shí)施方案中，所述氫化催化劑為鈀/碳。

在一些實(shí)施方案中，所述第三溶劑組分包含2,2,2-三氟乙醇。

在一些實(shí)施方案中，所述反應(yīng)是在約20℃至約35℃的溫度下進(jìn)行。

在一些實(shí)施方案中，所述反應(yīng)步驟稱為包含式Va化合物和式Vb化合物的組合物的反應(yīng)。

在一些實(shí)施方案中，以式Va化合物和式Vb化合物的總質(zhì)量計(jì)，使用約5重量％至約15重量％的氫化催化劑。

在一些實(shí)施方案中，包含式Va化合物和式Vb化合物的組合物是通過如下方法制備，所述方法包括使式VI化合物：

或其鹽與式VII化合物：

在叔胺堿和第四溶劑組分存在下進(jìn)行反應(yīng)，其中：

X為鹵基。

在一些實(shí)施方案中，式VI化合物或其鹽為式VIa的鹽：

在一些實(shí)施方案中，X為氯基。

在一些實(shí)施方案中，所述叔胺堿為N-乙基-N-異丙基丙-2-胺。

在一些實(shí)施方案中，式VI化合物的反應(yīng)中所存在的叔胺堿稱為第一叔胺堿。

在一些實(shí)施方案中，所述第四溶劑組分包含N,N-二甲基甲酰胺。

在一些實(shí)施方案中，所述反應(yīng)是在約65℃至約75℃的溫度下進(jìn)行。

在一些實(shí)施方案中，所述反應(yīng)步驟稱為式VI化合物的反應(yīng)。

在一些實(shí)施方案中，式VI化合物或其鹽為式VIa的鹽：

所述第四溶劑組分包含N,N-二甲基甲酰胺；

所述叔胺堿為N-乙基-N-異丙基丙-2-胺；且

X為氯基。

本申請還提供制備式VI化合物的方法，所述方法包括使式VIII化合物：

在去保護(hù)條件下反應(yīng)，以形成式VI化合物或其鹽；

其中P¹為胺保護(hù)基。

在一些實(shí)施方案中，P¹為叔丁氧基羰基。

在一些實(shí)施方案中，去保護(hù)條件包括使式VIII化合物與強(qiáng)酸反應(yīng)。

在一些實(shí)施方案中，所述強(qiáng)酸為HCl。

在一些實(shí)施方案中，與式VIII化合物反應(yīng)的強(qiáng)酸稱為第一強(qiáng)酸。

在一些實(shí)施方案中，所述反應(yīng)是在約0℃至約40℃的溫度下進(jìn)行。

在一些實(shí)施方案中，所述反應(yīng)步驟稱為式VIII化合物的反應(yīng)。

在一些實(shí)施方案中，式VIII化合物是通過如下方法制備，所述方法包括使式IX化合物：

在強(qiáng)堿和第五溶劑組分存在下進(jìn)行反應(yīng)，其中指示順式鍵或反式鍵；且P¹為胺保護(hù)基。在一些實(shí)施方案中，P¹為叔丁氧基羰基。

在一些實(shí)施方案中，所述強(qiáng)堿為C_1-6醇鹽堿。

在一些實(shí)施方案中，所述醇鹽堿為堿金屬C_1-6醇鹽。

在一些實(shí)施方案中，所述醇鹽堿為甲醇鈉。

在一些實(shí)施方案中，所述強(qiáng)堿是以催化量存在。

在一些實(shí)施方案中，以1當(dāng)量式IX化合物計(jì)，催化量包括約0.010至約0.020當(dāng)量強(qiáng)堿。

在一些實(shí)施方案中，式IX化合物的反應(yīng)中所存在的強(qiáng)堿稱為第二強(qiáng)堿。

在一些實(shí)施方案中，所述第五溶劑組分包含四氫呋喃。

在一些實(shí)施方案中，所述反應(yīng)是在約0℃至5℃的溫度下進(jìn)行。

在一些實(shí)施方案中，所述反應(yīng)步驟稱為式IX化合物的反應(yīng)。

在一些實(shí)施方案中，式IX化合物是通過如下方法制備，所述方法包括使式X化合物：

在強(qiáng)酸和第六溶劑組分存在下進(jìn)行反應(yīng)，其中指示順式鍵或反式鍵；且P¹為胺保護(hù)基。在一些實(shí)施方案中，P¹為叔丁氧基羰基。

在一些實(shí)施方案中，所述強(qiáng)酸為對甲苯磺酸。

在一些實(shí)施方案中，所述強(qiáng)酸是以催化量存在。

在一些實(shí)施方案中，以1當(dāng)量式X化合物計(jì)，催化量包括約0.005至約0.015當(dāng)量強(qiáng)酸。

在一些實(shí)施方案中，式X化合物的反應(yīng)中所存在的強(qiáng)酸稱為第二強(qiáng)酸。

在一些實(shí)施方案中，所述第六溶劑組分包含甲醇。

在一些實(shí)施方案中，所述式X化合物在強(qiáng)酸存在下的反應(yīng)是在約室溫的溫度下進(jìn)行。

在一些實(shí)施方案中，式X化合物是通過以下方法制備，所述方法包括：

(i)使式XII化合物：

與Wittig試劑在第七溶劑組分存在下進(jìn)行反應(yīng)，其中所述Wittig試劑是通過如下方法制備，所述方法包括使式XXI化合物：

在強(qiáng)堿存在下進(jìn)行反應(yīng)，其中R^a和R^b各自獨(dú)立地為C_1-6烷基；且

P¹為胺保護(hù)基。在一些實(shí)施方案中，P¹為叔丁氧基羰基。

在一些實(shí)施方案中，在(i)之前，使式XXI化合物與所述強(qiáng)堿在所述第二溶劑組分中進(jìn)行反應(yīng)。

在一些實(shí)施方案中，R^a和R^b各自為乙基。

在一些實(shí)施方案中，所述強(qiáng)堿為叔丁醇鉀。

在一些實(shí)施方案中，式XXI化合物的反應(yīng)中所存在的強(qiáng)堿稱為堿。

在一些實(shí)施方案中，所述第七溶劑組分包含四氫呋喃。

在一些實(shí)施方案中，所述反應(yīng)是在約0℃至約5℃的溫度下進(jìn)行。

在一些實(shí)施方案中，所述反應(yīng)步驟稱為式XII化合物的反應(yīng)。

在一些實(shí)施方案中，以1當(dāng)量式XII化合物計(jì)，使用約1.0至約2.0當(dāng)量式XXI化合物。

在一些實(shí)施方案中，式XII化合物是通過如下方法制備，所述方法包括對式XIII化合物進(jìn)行氧化：

其中P¹為胺保護(hù)基。在一些實(shí)施方案中，P¹為叔丁氧基羰基。

在一些實(shí)施方案中，所述氧化包括向式XIII化合物中添加第一氧化劑以形成第一混合物。

在一些實(shí)施方案中，所述第一氧化劑為2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧基自由基(TEMPO)。

在一些實(shí)施方案中，添加所述第一氧化劑是在四-N-丁基氯化銨存在下進(jìn)行。

在一些實(shí)施方案中，添加所述第一氧化劑是在約室溫的溫度下進(jìn)行。

在一些實(shí)施方案中，所述氧化還包括向所述第一混合物中添加堿和第二氧化劑。

在一些實(shí)施方案中，所述第二氧化劑為N-鹵丁二酰亞胺化合物。

在一些實(shí)施方案中，所述第二氧化劑為N-氯丁二酰亞胺。

在一些實(shí)施方案中，式XIII化合物是通過如下方法制備，所述方法包括使式XV化合物：

與式XIV化合物：

在三氟化硼乙醚合物和第八溶劑組分存在下進(jìn)行反應(yīng)，其中P¹為胺保護(hù)基。在一些實(shí)施方案中，P¹為叔丁氧基羰基。

在一些實(shí)施方案中，所述第八溶劑組分包含丙酮。

在一些實(shí)施方案中，所述反應(yīng)是在約室溫的溫度下進(jìn)行。

在一些實(shí)施方案中，式XV化合物是通過如下方法制備，所述方法包括使式XVI化合物：

在還原劑和第九溶劑組分存在下進(jìn)行反應(yīng)，其中P¹為胺保護(hù)基。在一些實(shí)施方案中，P¹為叔丁氧基羰基。

在一些實(shí)施方案中，所述還原劑為硼氫化鋰。

在一些實(shí)施方案中，式XVI化合物的反應(yīng)中所存在的還原劑稱為第一還原劑。

在一些實(shí)施方案中，所述第九溶劑組分包含四氫呋喃。

在一些實(shí)施方案中，所述反應(yīng)是在約0℃至約40℃的溫度下進(jìn)行。

在一些實(shí)施方案中，所述反應(yīng)步驟稱為式XVI化合物的反應(yīng)。

在一些實(shí)施方案中，式VIII化合物是通過如下方法制備，所述方法包括使式XVII化合物：

與氫氣在氫化催化劑和第十溶劑組分存在下進(jìn)行反應(yīng)；

其中P¹為胺保護(hù)基。

式XVII中的基團(tuán)指示CN基團(tuán)相對于吡喃環(huán)中的氧可為E或Z。在一些實(shí)施方案中，P¹為叔丁氧基羰基。

在一些實(shí)施方案中，所述氫化催化劑為鈀/碳。

在一些實(shí)施方案中，以式XVII化合物的總質(zhì)量計(jì)，使用約5重量％至約15重量％的氫化催化劑。

在一些實(shí)施方案中，所述第十溶劑組分包含甲醇。

在一些實(shí)施方案中，式XVII化合物是通過以下方式制備：

(i)使式XVIII化合物：

與Wittig試劑在第十一溶劑組分存在下進(jìn)行反應(yīng)，其中所述Wittig試劑是通過如下方法制備，所述方法包括使式XXII化合物：

與強(qiáng)堿進(jìn)行反應(yīng)，其中：

R^a1、R^b1和R^c1各自獨(dú)立地為C_1-6烷基；

Y^-為鹵離子；且

P¹為胺保護(hù)基。

在一些實(shí)施方案中，P¹為叔丁氧基羰基。

在一些實(shí)施方案中，Y^-為Cl^-。

在一些實(shí)施方案中，R^a1、R^b1和R^c1各自為甲基。

在一些實(shí)施方案中，R^a1、R^b1和R^c1各自為正丁基。

在一些實(shí)施方案中，所述強(qiáng)堿為叔丁醇鉀。

在一些實(shí)施方案中，所述強(qiáng)堿為六甲基二硅疊氮化鋰。

在一些實(shí)施方案中，與式XXII化合物反應(yīng)的強(qiáng)堿稱為第四強(qiáng)堿。

在一些實(shí)施方案中，所述第十一溶劑組分包含四氫呋喃。

在一些實(shí)施方案中，所述第十一溶劑組分包含N,N-二甲基乙酰胺。

在一些實(shí)施方案中，所述第十一溶劑組分包含四氫呋喃和N,N-二甲基乙酰胺。

在一些實(shí)施方案中，式XVIII化合物是由如下方法形成，所述方法包括使式XIX化合物：

在弱有機(jī)酸和第十二溶劑組分存在下進(jìn)行反應(yīng)，其中P¹為胺保護(hù)基。在一些實(shí)施方案中，P¹為叔丁氧基羰基。

在一些實(shí)施方案中，所述弱有機(jī)酸為乙酸。

在一些實(shí)施方案中，所述第十二溶劑組分包含甲苯。

在一些實(shí)施方案中，所述反應(yīng)是在回流溫度下進(jìn)行。

在一些實(shí)施方案中，所述反應(yīng)步驟稱為式XIX化合物的反應(yīng)。

在一些實(shí)施方案中，式XIX化合物是由以下方法形成，所述方法包括：

(i)使式XX化合物：

與式XXIII化合物：

在胺堿和第十三溶劑組分存在下進(jìn)行反應(yīng)，以形成式XXIV化合物：

其中

R^a2為C_1-4烷氧基；

X¹為鹵基；且

P¹為胺保護(hù)基。

在一些實(shí)施方案中，P¹為叔丁氧基羰基。

在一些實(shí)施方案中，式XXIII化合物為氯甲酸乙酯。

在一些實(shí)施方案中，胺堿為N-甲基嗎啉。

在一些實(shí)施方案中，式XX化合物的反應(yīng)中所存在的胺堿稱為第二叔胺堿。

在一些實(shí)施方案中，所述第十三溶劑組分包含四氫呋喃。

在一些實(shí)施方案中，所述反應(yīng)是在約0℃的溫度下進(jìn)行。

在一些實(shí)施方案中，所述反應(yīng)步驟稱為式XX化合物的反應(yīng)。

在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括用還原劑還原所述式XXIV化合物。

在一些實(shí)施方案中，所述還原劑為硼氫化鈉。

在一些實(shí)施方案中，將所述還原劑溶解于第十四溶劑組分中。

在一些實(shí)施方案中，還原式XXIV化合物時(shí)所存在的還原劑稱為第二還原劑。

在一些實(shí)施方案中，所述第十四溶劑組分包含二甘醇二甲醚。

在一些實(shí)施方案中，所述還原是在約70℃至約80℃的溫度下進(jìn)行。

在一些實(shí)施方案中，所述還原步驟稱為式XXIV化合物的還原。

在一些實(shí)施方案中，包含式Ia化合物和式Ib化合物的組合物是通過如下方法制備，所述方法包括使包含式IIIa化合物和式IIIb化合物的組合物：

與(R)-4-甲氧基-2,2,5-三甲基-2,5-二氫噁唑：

或其鹽進(jìn)行反應(yīng)。

在一些實(shí)施方案中，包含式IIIa化合物和式IIIb化合物的組合物的所述反應(yīng)是在約60℃至約70℃的溫度下進(jìn)行。

在一些實(shí)施方案中，包含式IIIa化合物和式IIIb化合物的組合物的反應(yīng)是在第十五溶劑組分存在下進(jìn)行。

在一些實(shí)施方案中，所述第十五溶劑組分包含甲醇。

在一些實(shí)施方案中，所述(R)-4-甲氧基-2,2,5-三甲基-2,5-二氫噁唑是通過使(R)-2,2,5-三甲基噁唑烷-4-酮：

與三甲基氧鎓四氟硼酸鹽反應(yīng)來制備。

在一些實(shí)施方案中，以1當(dāng)量(R)-2,2,5-三甲基噁唑烷-4-酮計(jì)，使用約1當(dāng)量三甲基氧鎓四氟硼酸鹽。

在一些實(shí)施方案中，(R)-2,2,5-三甲基噁唑烷-4-酮的所述反應(yīng)是在約室溫下進(jìn)行。

在一些實(shí)施方案中，(R)-2,2,5-三甲基噁唑烷-4-酮的所述反應(yīng)是在第十六溶劑組分存在下進(jìn)行。

在一些實(shí)施方案中，所述第十六溶劑組分包含無水二氯甲烷。

在一些實(shí)施方案中，所述使(R)-2,2,5-三甲基噁唑烷-4-酮與三甲基氧鎓四氟硼酸鹽反應(yīng)以形成(R)-4-甲氧基-2,2,5-三甲基-2,5-二氫噁唑的步驟和所述使(R)-4-甲氧基-2,2,5-三甲基-2,5-二氫噁唑與包含式IIIa化合物和式IIIb化合物的組合物反應(yīng)的步驟是在同一器皿中在不分離(R)-4-甲氧基-2,2,5-三甲基-2,5-二氫噁唑的情況下進(jìn)行。

在一些實(shí)施方案中，包含式Ia化合物和式Ib化合物的組合物是通過如下方法制備，所述方法包括使包含式IIIa化合物和式IIIb化合物的組合物：

與(R)-2-羥基丙亞胺酸乙酯：

進(jìn)行反應(yīng)。

在一些實(shí)施方案中，包含式IIIa化合物和式IIIb化合物的組合物的所述反應(yīng)是在約75℃至約85℃的溫度下進(jìn)行。

在一些實(shí)施方案中，包含式IIIa化合物和式IIIb化合物的組合物還包含第十七溶劑組分。

在一些實(shí)施方案中，所述第十七溶劑組分包含乙醇。

在一些實(shí)施方案中，在使包含式IIIa化合物和式IIIb化合物的組合物進(jìn)行反應(yīng)之前，將(R)-2-羥基丙亞胺酸乙酯溶解于第十八溶劑組分中。

在一些實(shí)施方案中，所述第十八溶劑組分包含四氫呋喃。

在一些實(shí)施方案中，在使包含式IIIa化合物和式IIIb化合物的組合物進(jìn)行反應(yīng)之前，在約75℃至約85℃的溫度下加熱所述包含式IIIa化合物、式IIIb化合物和所述第十七溶劑組分的組合物。

在一些實(shí)施方案中，所述(R)-2-羥基丙亞胺酸乙酯是通過使(R)-乙酸-1-氰基乙酯：

與乙醇在強(qiáng)酸存在下進(jìn)行反應(yīng)來制備。

在一些實(shí)施方案中，(R)-乙酸-1-氰基乙酯與乙醇的所述反應(yīng)中所使用的所述強(qiáng)酸為氯化氫。

在一些實(shí)施方案中，以1當(dāng)量(R)-2-羥基丙亞胺酸乙酯計(jì)，使用約2.9至約3.1當(dāng)量乙醇。

在一些實(shí)施方案中，將(R)-乙酸-1-氰基乙酯與乙醇合并以形成乙醇混合物。

在一些實(shí)施方案中，將所述強(qiáng)酸添加至所述乙醇混合物中以形成另一混合物。

在一些實(shí)施方案中，在約-45℃至約-35℃的溫度下添加所述強(qiáng)酸。

在一些實(shí)施方案中，將所述強(qiáng)酸添加至所述乙醇混合物中以形成另一混合物還包括將所述另一混合物加熱至室溫。

在一些實(shí)施方案中，所述(R)-乙酸-1-氰基乙酯是通過使(R)-乙酸-1-氨基-1-氧代丙-2-基酯：

與氰尿酰氯反應(yīng)而形成。

在一些實(shí)施方案中，以1當(dāng)量(R)-乙酸-1-氨基-1-氧代丙-2-基酯計(jì)，使用約0.4至約0.5當(dāng)量氰尿酰氯。

在一些實(shí)施方案中，在(R)-乙酸-1-氨基-1-氧代丙-2-基酯的所述反應(yīng)之前，將(R)-乙酸-1-氨基-1-氧代丙-2-基酯與第十九溶劑組分混合。

在一些實(shí)施方案中，所述第十九溶劑組分包含N,N-二甲基甲酰胺。

在一些實(shí)施方案中，在(R)-乙酸-1-氨基-1-氧代丙-2-基酯的所述反應(yīng)之前，將氰尿酰氯溶解于第二十溶劑組分中。

在一些實(shí)施方案中，所述第二十溶劑組分包含2-甲氧基-2-甲基丙烷。

在一些實(shí)施方案中，(R)-乙酸-1-氨基-1-氧代丙-2-基酯的所述反應(yīng)是在約室溫下進(jìn)行。

在一些實(shí)施方案中，所述(R)-乙酸-1-氨基-1-氧代丙-2-基酯是通過在第三叔胺堿存在下用乙酰氯保護(hù)(R)-2-羥基丙酰胺：

而制備。

在一些實(shí)施方案中，所述第三叔胺堿為4-甲基嗎啉。

在一些實(shí)施方案中，以1當(dāng)量(R)-2-羥基丙酰胺計(jì)，使用約1至約1.1當(dāng)量乙酰氯。

在一些實(shí)施方案中，所述保護(hù)是在第二十一溶劑組分存在下進(jìn)行。

在一些實(shí)施方案中，所述第二十一溶劑組分包含四氫呋喃。

本申請還提供可用于制備式Ia化合物的中間體。

因此，本申請?zhí)峁┦絍III化合物：

其中P¹為胺保護(hù)基。

在一些實(shí)施方案中，P¹為叔丁氧基羰基。

本申請還提供式VIa的鹽：

本申請還提供式Va化合物：

或其鹽。

本申請還提供式Vb化合物：

或其鹽。

本申請還提供式IIIa化合物：

或其鹽。

本申請還提供式IIIb化合物：

或其鹽。

應(yīng)了解，個(gè)別實(shí)施方案的內(nèi)容中出于明確性目的而描述的某些本發(fā)明特征也可以組合形式提供于單一實(shí)施方案中(同時(shí)意欲所述實(shí)施方案可如同多個(gè)附屬形式中所書寫一般加以組合)。相反，單一實(shí)施方案的內(nèi)容中出于簡便目的而描述的各種本發(fā)明特征也可單獨(dú)或以任何適合的子組合形式提供。

在本說明書中各處，在群組或范圍中公開本發(fā)明化合物的取代基。尤其意欲本發(fā)明包括此類群組和范圍的成員的各個(gè)和每個(gè)個(gè)別子組合。舉例而言，術(shù)語“C_1-6烷基”尤其意欲個(gè)別地公開甲基、乙基、C₃烷基、C₄烷基、C₅烷基和C₆烷基。

如本文中所使用，術(shù)語“Wittig試劑”是指由式P(＝O)(C_1-6烷氧基)₂(C_1-6烷基-CN)的膦酸酯化合物在強(qiáng)堿(例如叔丁醇鉀)存在下的反應(yīng)形成的內(nèi)鎓鹽，其中烷氧基和烷基各自具有1至6個(gè)碳。在一些實(shí)施方案中，術(shù)語“Wittig試劑”是指由鏻鹽(例如氰基甲基(三甲基)氯化鏻或三丁基(氰基甲基)氯化鏻)在強(qiáng)堿(例如叔丁醇鉀)存在下的反應(yīng)形成的內(nèi)鎓鹽。

如本文中所使用，單獨(dú)或與其它術(shù)語組合使用的術(shù)語“C_n-m烷基”是指飽和烴基，其可為直鏈或分支鏈，具有n至m個(gè)碳原子。在一些實(shí)施方案中，烷基含有1至6個(gè)、1至4個(gè)或1至3個(gè)碳原子。烷基部分的實(shí)例包括但不限于諸如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-甲基-1-丁基、3-戊基、正己基、1,2,2-三甲基丙基以及類似基團(tuán)的化學(xué)基團(tuán)。

如本文中所使用，單獨(dú)或與其它術(shù)語組合使用的術(shù)語“C_1-6烷氧基”是指具有式-O-烷基的基團(tuán)，其中烷基具有1至6個(gè)碳。實(shí)例烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基(例如正丙氧基和異丙氧基)、丁氧基(例如正丁氧基、叔丁氧基)以及類似基團(tuán)。

如本文中所使用，術(shù)語“C_1-6烷基氧鎓試劑”是指具有式(C_1-6烷基)₃O⁺的陽離子基團(tuán)的試劑，其中所述C_1-6烷基是指具有1至6個(gè)碳的直鏈或分支鏈烷基。實(shí)例C_1-6烷基氧鎓試劑包括三甲基氧鎓四氟硼酸鹽、三乙基氧鎓四氟硼酸鹽(米爾文試劑)、三乙基氧鎓六氟磷酸鹽、三乙基氧鎓六氯銻酸鹽以及類似物?？购怆x子包括但不限于四氟硼酸根、六氟磷酸根和六氯銻酸根。

如本文中本文中所使用，術(shù)語“氨基”是指式-NH₂的基團(tuán)。

如本文中所使用，術(shù)語“胺堿”是指單取代的胺基團(tuán)(即，一級胺堿)、二取代的胺基團(tuán)(即，二級胺堿)或三取代的胺基團(tuán)(即，叔胺堿)。實(shí)例單取代的胺堿包括甲胺、乙胺、丙胺、丁胺以及類似物。實(shí)例二取代的胺堿包括二甲胺、二乙胺、二丙胺、二丁胺、吡咯烷、哌啶、氮雜環(huán)庚烷、嗎啉以及類似物。在一些實(shí)施方案中，叔胺具有式N(R')3，其中各R'獨(dú)立地為C_1-6烷基、3至10元環(huán)烷基、4至10元雜環(huán)烷基、1至10元雜芳基和5至10元芳基，其中所述3至10元環(huán)烷基、4至10元雜環(huán)烷基、1至10元雜芳基和5至10元芳基任選由1、2、3、4、5或6個(gè)C_1-6烷基取代。實(shí)例叔胺堿包括三甲胺、三乙胺、三丙胺、三異丙胺、三丁胺、三叔丁胺、N,N-二甲基乙胺、N-乙基-N-甲基丙-2-胺、N-乙基-N-異丙基丙-2-胺、N-甲基嗎啉以及類似物。在一些實(shí)施方案中，術(shù)語“叔胺堿”是指式N(R)₃的基團(tuán)，其中各R獨(dú)立地為直鏈或分支鏈C_1-6烷基。

如本文中所使用，單獨(dú)或與其它術(shù)語組合使用的術(shù)語“環(huán)烷基”是指非芳族環(huán)烴部分，其可任選含有一個(gè)或多個(gè)亞烯基作為環(huán)結(jié)構(gòu)的一部分。在一些實(shí)施方案中，環(huán)烷基為3至10元環(huán)烷基，其為單環(huán)或雙環(huán)。在一些實(shí)施方案中，環(huán)烷基為3至6元或3至7元單環(huán)環(huán)烷基。例示性環(huán)烷基包括1,2,3,4-四氫-萘、環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、環(huán)戊烯基、環(huán)己烯基、環(huán)己二烯基、環(huán)庚三烯基、降冰片基、降蒎基、降蒈基、金剛烷基以及類似基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，環(huán)烷基為環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基或環(huán)己基。

如本文中所使用，單獨(dú)或與其它術(shù)語組合使用的術(shù)語“芳基”是指單環(huán)或多環(huán)(例如具有2、3或4個(gè)稠合環(huán))芳族烴，諸如但不限于苯基、1-萘基、2-萘基、蒽基、菲基以及類似基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，芳基為C_6-10芳基。在一些實(shí)施方案中，芳基為萘環(huán)或苯基環(huán)。在一些實(shí)施方案中，芳基為苯基。

如本文中所使用，單獨(dú)或與其它術(shù)語組合的術(shù)語“雜芳基”是指單環(huán)或多環(huán)(例如2、3或4個(gè)稠合環(huán))芳族烴部分，其具有一個(gè)或多個(gè)選自氮、硫和氧的雜原子環(huán)成員。在一些實(shí)施方案中，雜芳基為5至10元雜芳基，其為單環(huán)或雙環(huán)，包含1至9個(gè)碳原子和1、2、3或4個(gè)獨(dú)立地選自氮、硫和氧的雜原子環(huán)成員。實(shí)例雜芳基包括但不限于吡啶、嘧啶、吡嗪、噠嗪、吡咯、吡唑、唑基、噁唑、噻唑、咪唑、呋喃、噻吩、喹啉、異喹啉、吲哚、苯并噻吩、苯并呋喃、苯并異噁唑、咪唑并[1,2-b]噻唑、嘌呤或其類似基團(tuán)。

如本文中所使用，單獨(dú)或與其它術(shù)語組合使用的術(shù)語“雜環(huán)烷基”是指非芳族環(huán)系統(tǒng)，其可任選含有一個(gè)或多個(gè)亞烯基或亞炔基作為環(huán)結(jié)構(gòu)的一部分，且其具有至少一個(gè)獨(dú)立地選自氮、硫和氧的雜原子環(huán)成員。當(dāng)雜環(huán)烷基含有多于一個(gè)雜原子時(shí)，雜原子可相同或不同。雜環(huán)烷基可包括單環(huán)或多環(huán)(例如具有2、3或4個(gè)稠合的、螺環(huán)的或橋接的環(huán))環(huán)系統(tǒng)。在一些實(shí)施方案中，雜環(huán)烷基為5至10元雜環(huán)烷基，其為單環(huán)或雙環(huán)，包含2至9個(gè)碳原子和1、2、3或4個(gè)獨(dú)立地選自氮、硫和氧的雜原子環(huán)成員。雜環(huán)烷基的實(shí)例包括1,2,3,4-四氫-喹啉、氮雜環(huán)丁烷、氮雜環(huán)庚烷、吡咯烷、哌啶、哌嗪、嗎啉、硫代嗎啉、吡喃和2-氧代-1,3-噁唑烷環(huán)。

如本文中所使用，術(shù)語“堿金屬”包括鋰、鈉和鉀。

如本文中所使用，單獨(dú)或與其它術(shù)語組合使用的“鹵基”或“鹵素”包括氟、氯、溴和碘。

實(shí)例“N-鹵丁二酰亞胺化合物”包括但不限于N-氯丁二酰亞胺、N-溴丁二酰亞胺和N-碘丁二酰亞胺。

如本文中所使用，術(shù)語“醇鹽堿”是指具有式(C_1-6烷基)O^-的基團(tuán)的堿，其中所述C_1-6烷基是指具有1至6個(gè)碳的直鏈或分支鏈烷基。實(shí)例醇鹽堿包括但不限于甲醇鹽、乙醇鹽、丙醇鹽、異丙醇鹽、正丁醇鹽、異丁醇鹽、叔丁醇鹽以及類似物。

如本文中所使用，術(shù)語“堿金屬醇鹽”是指式M(O-C_1-6烷基)的基團(tuán)，其中M是指堿金屬(例如鋰、鈉或鉀)，且C_1-6烷基是指具有1至6個(gè)碳的直鏈或分直鏈烷基。實(shí)例堿金屬醇鹽包括但不限于甲醇鈉、乙醇鈉、異丙醇鈉、叔丁醇鈉、甲醇鋰、乙醇鋰、甲醇鉀、乙醇鉀、叔丁醇鉀以及類似物。

如本文中所使用，術(shù)語“氫化催化劑”是指適合于催化氫化反應(yīng)(即，化合物與氫氣的反應(yīng))的金屬(例如鈀、鎳或銠)催化劑。實(shí)例氫化催化劑包括但不限于鈀/碳、林德拉催化劑(沉積于碳酸鈣或硫酸鋇上的鈀)、威爾金森催化劑、HRuCl(PPh₃)₃、RhCl(PPh₃)₃、[Rh(COD)Cl]₂、[Ir(COD)(PMePh₂)₂]⁺、[Rh(1,5-環(huán)辛二烯)(PPh₃)₂]⁺、PtO₂(亞當(dāng)氏催化劑)、鈀/碳、鈀黑、林德拉催化劑(沉積于碳酸鈣或硫酸鋇上且經(jīng)鉛處理的鈀)以及類似物。在一些實(shí)施方案中，氫化催化劑為Nishimura,Heterogeneous Catalytic Hydrogenation for Organic Synthesis,第1版,Wiley(2001年4月17日)或Chaloner,Homogeneous Hydrogenation,第1版,Springer Netherlands(2010年12月6日)中所發(fā)現(xiàn)的氫化催化劑，這兩個(gè)文獻(xiàn)各自以全文引用的方式并入本文中。

適當(dāng)P¹保護(hù)基包括但不限于Wuts和Greene,Protective Groups in Organic Synthesis,第4版,John Wiley&Sons:New Jersey,第696-887頁(且具體地，第872-887頁)(2007)中所描繪的用于胺的保護(hù)基，該文獻(xiàn)以全文引用的方式并入本文中。實(shí)例胺保護(hù)基包括但不限于苯甲氧基羰基(Cbz)、2,2,2-三氯乙氧基羰基(Troc)、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基(Teoc)、2-(4-三氟甲基苯基磺?；?乙氧基羰基(Tsc)、叔丁氧基羰基(BOC)、1-金剛烷氧基羰基(Adoc)、2-金剛烷基羰基(2-Adoc)、2,4-二甲基戊-3-基氧基羰基(Doc)、環(huán)己基氧基羰基(Hoc)、1,1-二甲基-2,2,2-三氯乙氧基羰基(TcBOC)、乙烯基、2-氯乙基、2-苯基磺?；一?、烯丙基、苯甲基、2-硝基苯甲基、4-硝基苯甲基、聯(lián)苯-4-吡啶基甲基、N',N'-二甲基肼基、甲氧基甲基、叔丁氧基甲基(Bum)、苯甲氧基甲基(BOM)或2-四氫吡喃基(THP)、三(C_1-4烷基)甲硅烷基(例如三(異丙基)甲硅烷基)、1,1-二乙氧基甲基或N-三甲基乙酰氧基甲基(POM)。

實(shí)例氧化劑包括戴斯-馬丁氧化劑、2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧基自由基(TEMPO)、N-鹵丁二酰亞胺(例如N-溴丁二酰亞胺、N-氯丁二酰亞胺、N-碘丁二酰亞胺)以及類似物。

實(shí)例還原劑包括堿金屬氫硼化物(例如硼氫化鋰、硼氫化鈉、硼氫化鉀等)、堿金屬鋁氫化物(例如氫化鋰鋁、氫化鈉鋁)、氫氣(例如H₂/Pd/碳)以及類似物。

實(shí)例酸可為無機(jī)酸或有機(jī)酸，且包括但不限于強(qiáng)酸和弱酸。一些實(shí)例酸包括鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、對甲苯磺酸、4-硝基苯甲酸、甲烷磺酸、苯磺酸、三氟乙酸和硝酸。一些弱酸包括但不限于乙酸、丙酸、丁酸、苯甲酸、酒石酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸和癸酸。

一些實(shí)例強(qiáng)堿包括但不限于氫氧化物、醇鹽、金屬氨化物、金屬氫化物、金屬二烷基氨化物和芳基胺，其中醇鹽包括甲基、乙基和叔丁基氧化物的鋰、鈉和鉀鹽；金屬氨化物包括氨化鈉、氨化鉀和氨化鋰；金屬氫化物包括氫化鈉、氫化鉀和氫化鋰；且金屬二烷基氨化物包括經(jīng)甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、三甲基甲硅烷基和環(huán)己基取代的酰胺的鋰、鈉和鉀鹽。

所有化合物以及藥物學(xué)上可接受的鹽(例如水合物和溶劑合物)可被發(fā)現(xiàn)與諸如水和溶劑的其它物質(zhì)在一起，或可為經(jīng)分離的。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物或其鹽基本上經(jīng)分離。“基本上經(jīng)分離”意謂化合物至少部分地或基本上與形成或檢測到其的環(huán)境分離。部分分離可包括例如本發(fā)明化合物中富含的組合物。基本分離可包括以重量計(jì)含有至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％、至少約90％、至少約95％、至少約97％或至少約99％本發(fā)明化合物或其鹽的組合物。用于分離化合物及其鹽的方法為本領(lǐng)域中的常規(guī)方法。

如本文中所使用，術(shù)語“反應(yīng)”是如本領(lǐng)域中已知加以使用且大體上是指使化學(xué)試劑以允許其分子層面上的相互作用從而達(dá)成化學(xué)或物理轉(zhuǎn)化的方式在一起。在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)涉及兩種試劑，其中相對于第一試劑使用一當(dāng)量或多當(dāng)量第二試劑。本文中所描述的方法的反應(yīng)步驟可歷經(jīng)一定時(shí)間且在適合于制備所鑒別的產(chǎn)物的條件下來進(jìn)行。

本文中所描述的方法的反應(yīng)可在適合的溶劑中進(jìn)行，所述溶劑可由有機(jī)合成領(lǐng)域技術(shù)人員容易地選擇。適合的溶劑在進(jìn)行反應(yīng)的溫度下，例如在可介于溶劑的凝固溫度至溶劑的沸騰溫度范圍內(nèi)的溫度下，可實(shí)質(zhì)上不與起始物質(zhì)(反應(yīng)物)、中間體或產(chǎn)物反應(yīng)。指定反應(yīng)可在一種溶劑或多于一種溶劑的混合物中進(jìn)行。取決于特定反應(yīng)步驟，可選擇適用于特定反應(yīng)步驟的溶劑。在一些實(shí)施方案中，可在不存在溶劑的情況下，諸如當(dāng)至少一種試劑為液體或氣體時(shí)進(jìn)行反應(yīng)。

“溶劑組分”可為一種溶劑或者兩種或兩種以上溶劑的混合物。

如本文中所使用，作為詞組“溶劑組分”的前綴的“第二”、“第三”、“第四”等是用于區(qū)分溶劑組分與先前或稍后的方法步驟中所使用的其它溶劑組分，而非指示必須存在多種溶劑。

適合的溶劑可包括鹵化溶劑，諸如四氯化碳、溴二氯甲烷、二溴氯甲烷、三溴甲烷、三氯甲烷、溴氯甲烷、二溴甲烷、氯丁烷、二氯甲烷、四氯乙烯、三氯乙烯、1,1,1-三氯乙烷、1,1,2-三氯乙烷、1,1-二氯乙烷、2-氯丙烷、α,α,α-三氟丁烯、1,2-二氯乙烷、1,2-二溴乙烷、六氟苯、1,2,4-三氯苯、1,2-二氯苯、氯苯、氟苯、其混合物以及類似物。

適合的醚溶劑包括：二甲氧基甲烷、四氫呋喃、1,3-二噁烷、1,4-二噁烷、呋喃、乙醚、乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚、二乙二醇二甲醚(二甘醇二甲醚)、二乙二醇二乙醚、三乙二醇二甲醚、苯甲醚、叔丁基甲醚、其混合物以及類似物。

適合的質(zhì)子性溶劑可包括例如且不限于水、甲醇、乙醇、2-硝基乙醇、2-氟乙醇、2,2,2-三氟乙醇、乙二醇、1-丙醇、2-丙醇、2-甲氧基乙醇、1-丁醇、2-丁醇、異丁醇、叔丁醇、2-乙氧基乙醇、二乙二醇、1-戊醇、2-戊醇或3-戊醇、新戊醇、第三戊醇、二乙二醇單甲醚、二乙二醇單乙醚、環(huán)己醇、苯甲醇、苯酚或甘油。

適合的非質(zhì)子性溶劑可包括例如且不限于四氫呋喃(THF)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N,N-二甲基乙酰胺(DMA)、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氫-2(1H)-嘧啶酮(DMPU)、1,3-二甲基-2-咪唑烷酮(DMI)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、甲酰胺、N-甲基乙酰胺、N-甲基甲酰胺、乙腈、二甲亞砜、丙腈、甲酸乙酯、乙酸甲酯、六氯丙酮、丙酮、乙基甲基酮、乙酸乙酯、環(huán)丁砜、N,N-二甲基丙酰胺、四甲基脲、硝基甲烷、硝基苯或六甲基磷酰胺。

適合的烴溶劑包括苯、環(huán)己烷、戊烷、己烷、甲苯、環(huán)庚烷、甲基環(huán)己烷、庚烷、乙苯、間二甲苯、鄰二甲苯或?qū)Χ妆?、辛烷、茚烷、壬烷或萘?/p>

本文中所描述的方法的反應(yīng)可在空氣中或在惰性氛圍下進(jìn)行。典型地，含有基本上可與空氣反應(yīng)的試劑或產(chǎn)物的反應(yīng)可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的空氣敏感性合成技術(shù)進(jìn)行。

在一些實(shí)施方案中，化合物的制備可包括添加酸或堿以影響例如對諸如酸加成鹽的鹽形式的所要反應(yīng)或形成的催化作用。

實(shí)例酸可為無機(jī)酸或有機(jī)酸。無機(jī)酸包括鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸和硝酸。有機(jī)酸包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、苯甲酸、4-硝基苯甲酸、甲烷磺酸、對甲苯磺酸、苯磺酸、酒石酸、三氟乙酸、丙炔酸、丁酸、2-丁炔酸、乙烯基乙酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸和癸酸。

實(shí)例堿包括氫氧化鋰、氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鋰、碳酸鈉、碳酸鉀和碳酸氫鈉。一些實(shí)例強(qiáng)堿包括但不限于氫氧化物、醇鹽、金屬氨化物、金屬氫化物、金屬二烷基氨化物和芳基胺，其中醇鹽包括甲基、乙基和叔丁基氧化物的鋰、鈉和鉀鹽；金屬氨化物包括氨化鈉、氨化鉀和氨化鋰；金屬氫化物包括氫化鈉、氫化鉀和氫化鋰；且金屬二烷基氨化物包括經(jīng)甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、三甲基甲硅烷基和環(huán)己基取代的酰胺的鋰、鈉和鉀鹽。

在根據(jù)本文中所描述的方法制備化合物后，可使用諸如濃縮、過濾、萃取、固相萃取、再結(jié)晶、色譜以及類似操作的通常分離和純化操作來分離所要產(chǎn)物。

如本文中所使用的表述“室溫”在本領(lǐng)域中應(yīng)能理解且大體上是指約為進(jìn)行反應(yīng)的室內(nèi)的溫度的溫度(例如反應(yīng)溫度)，例如約20℃至約30℃的溫度。

本文中所描述的方法的反應(yīng)可在適當(dāng)溫度下進(jìn)行，該溫度可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。反應(yīng)溫度將取決于例如以下因素：試劑和溶劑(如果存在時(shí))的熔點(diǎn)和沸點(diǎn)；反應(yīng)熱力學(xué)(例如劇烈放熱反應(yīng)可能需要在降溫下進(jìn)行)；和反應(yīng)動(dòng)力學(xué)(例如高活化能障壁可能需要高溫)。

本文中所描述的化合物的制備可包括對各種化學(xué)基團(tuán)進(jìn)行保護(hù)和去保護(hù)(例如胺基團(tuán)的保護(hù)和去保護(hù))。對保護(hù)和去保護(hù)的需要以及適當(dāng)保護(hù)基的選擇可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。保護(hù)基的化學(xué)性質(zhì)可見于例如Wuts和Greene,Protective Groups in Organic Synthesis,第4版,John Wiley&Sons:New Jersey,(2007)中，該文獻(xiàn)以全文引用的方式并入本文中。對本文中所描述的保護(hù)基以及形成和裂解方法的調(diào)整可在必要時(shí)根據(jù)不同取代基進(jìn)行調(diào)整。

如本文中所使用，術(shù)語“去保護(hù)條件”是指適合于使胺保護(hù)基裂解的條件。在一些實(shí)施方案中，去保護(hù)條件可包括在強(qiáng)酸存在下、在強(qiáng)堿存在下、在還原劑存在下或在氧化劑存在下使保護(hù)基裂解。胺保護(hù)基的去保護(hù)可通過本領(lǐng)域中已知的用于移除胺的特定保護(hù)基的方法來實(shí)現(xiàn)，諸如Wuts和Greene,Protective Groups in Organic Synthesis,第4版,John Wiley&Sons:New Jersey,第696-887頁(且具體地，第872-887頁)(2007)中的方法，該文獻(xiàn)以全文引用的方式并入本文中。在一些實(shí)施方案中，處理包括使經(jīng)保護(hù)的化合物在酸性條件(例如鹽酸或三氟乙酸)下進(jìn)行反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，溫度為約室溫、約15℃至約40℃的溫度或約15℃至約30℃的溫度。

可根據(jù)本領(lǐng)域中已知的任何適合的方法監(jiān)測反應(yīng)。舉例而言，可通過諸如核磁共振光譜法(例如¹H或¹³C)、紅外光譜法、分光亮度法(例如UV-可見光)、質(zhì)譜法的光譜手段或通過諸如高效液相色譜法(HPLC)或薄層色譜法(TLC)的色譜方法監(jiān)測產(chǎn)物形成。

本文中采用詞組“藥物學(xué)上可接受”來指化合物、材料、組合物和/或劑型在合理醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)適合與人和動(dòng)物的組織接觸使用而無過度毒性、刺激、過敏反應(yīng)或其它問題或并發(fā)癥，與合理效益/風(fēng)險(xiǎn)比相稱。

本發(fā)明還包括本文中所描述的化合物的藥物學(xué)上可接受的鹽。如本文中所使用，“藥物學(xué)上可接受的鹽”是指所公開的化合物的衍生物，其中通過將現(xiàn)有酸或堿部分轉(zhuǎn)化成其鹽形式對母體化合物進(jìn)行修飾。藥物學(xué)上可接受的鹽的實(shí)例包括但不限于堿性殘基(諸如胺)的礦物鹽或有機(jī)酸鹽；酸性殘基(諸如羧酸)的堿金屬鹽或有機(jī)鹽；以及類似物。本發(fā)明的藥物學(xué)上可接受的鹽包括母體化合物的例如由無毒無機(jī)酸或有機(jī)酸形成的無毒鹽。本發(fā)明的藥物學(xué)上可接受的鹽可通過常規(guī)化學(xué)方法由含有堿性或酸性部分的母體化合物合成。一般而言，此類鹽可通過使這些化合物的游離酸或堿形式與化學(xué)計(jì)算量的適當(dāng)堿或酸在水中或在有機(jī)溶劑中或在兩者的混合物中反應(yīng)來制備；一般而言，如醚、乙酸乙酯、醇(例如甲醇、乙醇、異丙醇或丁醇)或乙腈(ACN)的非水性介質(zhì)較優(yōu)選。適合的鹽的清單可見于Remington's Pharmaceutical Sciences,第17版,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1985,第1418頁和Journal of Pharmaceutical Science,66,2(1977)中，這些文獻(xiàn)各自以全文引用的方式并入本文中。在一些實(shí)施方案中，本文中所描述的化合物包括N-氧化物形式。

方法

式Ia化合物2-((2R,5S)-5-(2-((R)-1-羥基乙基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈為選擇性JAK1抑制劑。相對于JAK2，式Ia化合物優(yōu)先抑制JAK1(例如JAK1/JAK2IC₅₀比>10)。

JAK1在許多細(xì)胞因子和生長因子信號傳導(dǎo)路徑中起重要作用，信號傳導(dǎo)路徑在失調(diào)時(shí)可導(dǎo)致或造成疾病狀態(tài)。舉例而言，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，IL-6含量升高，已表明其在該疾病中具有不利影響(Fonesca,J.E.等人,Autoimmunity Reviews,8:538-42,2009)。由于IL-6至少部分通過JAK1進(jìn)行信號傳導(dǎo)，故預(yù)期通過JAK1抑制來直接或間接地拮抗IL-6將提供臨床效益(Guschin,D.,N.等人,Embo J14:1421,1995；Smolen,J.S.等人,Lancet 371:987,2008)。此外，在一些癌癥中，JAK1突變，從而導(dǎo)致不理想的組成性腫瘤細(xì)胞生長和存活(Mullighan CG,Proc Natl Acad Sci U S A.106:9414-8,2009；Flex E.等人,J Exp Med.205:751-8,2008)。在其它自體免疫性疾病和癌癥中，活化JAK1的發(fā)炎性細(xì)胞因子的全身含量升高還可造成所述疾病和/或相關(guān)癥狀。因此，患有此類疾病的患者可受益于JAK1抑制。JAK1的選擇性抑制劑可為有效的，同時(shí)避免不必要且可能不理想的抑制其它JAK激酶的作用。

JAK1的選擇性抑制劑(相對于其它JAK激酶)與較弱相比可具有多種治療優(yōu)勢。就對JAK2的選擇性而言，許多重要的細(xì)胞因子和生長因子通過JAK2進(jìn)行信號傳導(dǎo)，包括例如紅細(xì)胞生成素(Epo)和血小板生成素(Tpo)(Parganas E等人,Cell.93:385-95,1998)。Epo為紅細(xì)胞產(chǎn)生的關(guān)鍵生長因子；因此缺乏Epo依賴性信號傳導(dǎo)可導(dǎo)致紅細(xì)胞數(shù)目減少和貧血(Kaushansky K,NEJM 354:2034-45,2006)。JAK2依賴性生長因子的另一實(shí)例Tpo在控制巨核細(xì)胞(即，產(chǎn)生血小板的細(xì)胞)的增殖和成熟方面起重要作用(Kaushansky K,NEJM 354:2034-45,2006)。因此，Tpo信號傳導(dǎo)減少將減少巨核細(xì)胞數(shù)目(巨核細(xì)胞減少癥)且降低循環(huán)血小板計(jì)數(shù)(血小板減少癥)。由此可導(dǎo)致不理想和/或不可控制的出血。減少對諸如JAK3和Tyk2的其它JAK的抑制還可能為理想的，因?yàn)槿狈@些激酶的功能型式的人已顯示受許多疾病困擾，諸如嚴(yán)重合并性免疫缺失或高免疫球蛋白E綜合征(Minegishi,Y等人,Immunity 25:745-55,2006；Macchi P等人,Nature.377:65-8,1995)。因此，就減少副作用(包括免疫抑制、貧血和血小板減少癥)而言，對其它JAK具有降低的親和力的JAK1抑制劑與較弱選擇性抑制劑相比將具有顯著優(yōu)勢。

本發(fā)明的另一方面涉及治療個(gè)體(例如患者)的JAK相關(guān)疾病或病癥的方法，所述方法是通過向需要此種治療的個(gè)體施用治療有效量或劑量的本發(fā)明化合物或其藥物組合物。JAK相關(guān)疾病可包括直接或間接與JAK的表達(dá)或活性(包括過度表達(dá)和/或異?；钚运?相關(guān)的任何疾病、病癥或病狀。JAK相關(guān)疾病還可包括可通過調(diào)節(jié)JAK活性加以預(yù)防、改善或治愈的任何疾病、病癥或病狀。

JAK抑制劑可用于治療各種JAK相關(guān)疾病或病癥。JAK相關(guān)疾病的實(shí)例包括涉及免疫系統(tǒng)的疾病，包括例如器官移植排斥(例如同種異體移植物排斥和移植物對抗宿主疾病)。JAK相關(guān)疾病的其它實(shí)例包括自體免疫性疾病，例如多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、青少年關(guān)節(jié)炎、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、I型糖尿病、狼瘡、銀屑病、發(fā)炎性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩氏病、重癥肌無力、免疫球蛋白腎病、心肌炎、自體免疫性甲狀腺病癥、慢性阻塞性肺病(COPD)以及類似疾病。在一些實(shí)施方案中，自體免疫性疾病為自體免疫性大皰性皮膚病癥，諸如尋常天皰瘡(PV)或大皰性類天皰瘡(BP)。

JAK相關(guān)疾病的其它實(shí)例包括過敏性病狀，諸如哮喘、食物過敏、濕疹性皮炎、接觸性皮炎、特應(yīng)性皮炎(特應(yīng)性濕疹)和鼻炎。JAK相關(guān)疾病的其它實(shí)例包括病毒性疾病，諸如埃-巴二氏病毒(EBV)、乙型肝炎、丙型肝炎、HIV、HTLV 1、水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)和人乳頭狀瘤病毒HPV)。

JAK相關(guān)疾病的其它實(shí)例包括與軟骨翻轉(zhuǎn)相關(guān)的疾病，例如痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、敗血性或感染性關(guān)節(jié)炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、反射性交感神經(jīng)營養(yǎng)不良、骨痛退化癥、提策綜合征(Tietze syndrome)、肋關(guān)節(jié)病、地方性變形性骨關(guān)節(jié)炎、Mseleni病、Handigodu病、由纖維肌痛癥引起的退化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、硬皮病或強(qiáng)直性脊椎炎。

JAK相關(guān)疾病的其它實(shí)例包括先天性軟骨畸形，包括遺傳性軟骨溶解、軟骨發(fā)育不良和假性軟骨發(fā)育不良(例如小耳癥、無耳癥和干骺端軟骨發(fā)育不良)。

JAK相關(guān)疾病或病狀的其它實(shí)例包括皮膚病癥，諸如銀屑病(例如尋常銀屑病)、特應(yīng)性皮炎、皮疹、皮膚刺激、皮膚敏感(例如接觸性皮炎或過敏性接觸性皮炎)。舉例而言，某些物質(zhì)(包括一些藥物)在局部施用時(shí)可能導(dǎo)致皮膚敏感。在一些實(shí)施方案中，共同施用或連續(xù)施用至少一種本發(fā)明JAK抑制劑與引起不需要的敏感的藥劑可有助于治療此種不需要的敏感或皮炎。在一些實(shí)施方案中，通過局部施用至少一種本發(fā)明JAK抑制劑來治療皮膚病癥。

JAK相關(guān)疾病或病狀的其它實(shí)例包括以實(shí)性腫瘤為特征的疾病或病狀(例如前列腺癌、腎癌、肝癌、胰癌、胃癌、乳癌、肺癌、頭頸癌、甲狀腺癌、惡性膠質(zhì)瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、卡斯特曼氏病(Castleman’s disease)、子宮平滑肌肉瘤、黑素瘤等)、血液學(xué)癌癥(例如淋巴瘤、諸如急性淋巴母細(xì)胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)的白血病或多發(fā)性骨髓瘤)和皮膚癌，諸如皮膚T細(xì)胞淋巴瘤(CTCL)和皮膚B細(xì)胞淋巴瘤。實(shí)例CTCL包括塞扎里綜合征(Sezary syndrome)和蕈樣真菌病。JAK相關(guān)疾病或病狀的其它實(shí)例包括肺動(dòng)脈高壓。

JAK相關(guān)疾病或病狀的其它實(shí)例包括炎癥相關(guān)的癌癥。在一些實(shí)施方案中，癌癥與發(fā)炎性腸病相關(guān)。在一些實(shí)施方案中，發(fā)炎性腸病為潰瘍性結(jié)腸炎。在一些實(shí)施方案中，發(fā)炎性腸病為克羅恩氏病。在一些實(shí)施方案中，炎癥相關(guān)的癌癥為結(jié)腸炎相關(guān)的癌癥。在一些實(shí)施方案中，炎癥相關(guān)的癌癥為結(jié)腸癌或結(jié)腸直腸癌。在一些實(shí)施方案中，癌癥為胃癌、胃腸道類癌腫瘤、胃腸基質(zhì)腫瘤(GIST)、腺癌、小腸癌或直腸癌。

JAK相關(guān)疾病或病狀的其它實(shí)例包括以以下各項(xiàng)的表達(dá)為特征的疾病或病狀：JAK2突變體，諸如在假激酶域中具有至少一個(gè)突變的JAK2突變體(例如JAK2V617F)；在假激酶域外具有至少一個(gè)突變的JAK2突變體；JAK1突變體；JAK3突變體；紅細(xì)胞生成素受體(EPOR)突變體；或CRLF2表達(dá)失調(diào)。

JAK相關(guān)疾病可還包括脊髓增生性疾病(MPD)，諸如真性紅細(xì)胞增多癥(PV)、原發(fā)性血小板增多癥(ET)、骨髓纖維化伴隨骨髓組織化生(MMM)、原發(fā)性骨髓纖維化(PMF)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性單核細(xì)胞性白血病(CMML)、嗜酸性粒細(xì)胞增多綜合征(HES)、系統(tǒng)性肥大細(xì)胞病(SMCD)以及類似疾病。在一些實(shí)施方案中，骨髓增生性病癥為骨髓纖維化(例如原發(fā)性骨髓纖維化(PMF)或真性紅細(xì)胞增多癥/原發(fā)性血小板增多癥后骨髓纖維化(PV后/ET后MF))。在一些實(shí)施方案中，骨髓增生性病癥為原發(fā)性血小板增多癥后骨髓纖維化(ET后MF)。在一些實(shí)施方案中，骨髓增生性病癥為真性紅細(xì)胞增多癥后骨髓纖維化(PV后MF)。

JAK相關(guān)疾病還包括骨髓發(fā)育不良綜合征(MDS)。

如本文中所使用，脊髓發(fā)育不良綜合征意欲涵蓋以一個(gè)或多個(gè)主要骨髓細(xì)胞系上的無效造血為特征的異質(zhì)性和克隆性造血障礙。脊髓發(fā)育不良綜合征與骨髓衰竭、周圍血液細(xì)胞減少癥和發(fā)展急性骨髓性白血病(AML)的傾向相關(guān)。此外，可在約50％患有MDS的病例中檢測到克隆性細(xì)胞遺傳學(xué)異常。1997年，世界衛(wèi)生組織(The World He alth Organization，WHO)聯(lián)合血液病理學(xué)學(xué)會(huì)(Society for Hematopat hology，SH)和歐洲血液病理學(xué)學(xué)會(huì)(European Association of Hemato pathology，EAHP)對造血系統(tǒng)腫瘤提出新分類(Harris等人,J Clin O ncol 1999；17:3835-3849；Vardiman等人,Blood 2002；100:2292-2302)。對于MDS，WHO不僅利用French-American-British(FAB)分類的形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)，而且并入可獲得的基因、生物和臨床特征來定義MDS的子集(Bennett等人,Br J Haematol 1982；51:189-199)。2008年，對MD S的WHO分類(表1)進(jìn)行進(jìn)一步精化以允許通過并入新臨床和科學(xué)信息對單譜系發(fā)育不良進(jìn)行精確且與預(yù)后相關(guān)的再分類(Vardiman等人,Blood 2009；114:937-951；Swerdlow等人,WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues.第4版.Lyon Fra nce:IARC Press；2008:88-103；Bunning和Germing,“Myelodyspla stic syndromes/neoplasms”第5章,Swerdlow等人編,WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues.(第4版):Lyon,France:IARC Press；2008:88-103)。

表1. 2008WHO骨髓發(fā)育不良綜合征重新分類

在一些實(shí)施方案中，本申請?zhí)峁┮环N在需要治療的患者中治療脊髓發(fā)育不良綜合征(MDS)的方法，其包括向所述患者施用式Ia化合物或其藥物學(xué)上可接受的鹽，其中所述MDS選自單系發(fā)育不良性難治性血細(xì)胞減少癥(RCUD)、環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞性難治性貧血(RARS)、多系發(fā)育不良性難治性血細(xì)胞減少癥、原始細(xì)胞過多性難治性貧血-1(RAEB-1)、原始細(xì)胞過多性難治性貧血-2(RAEB-2)、未分類脊髓發(fā)育不良綜合征(MDS-U)和與孤立del(5q)相關(guān)的MDS。

在一些實(shí)施方案中，脊髓發(fā)育不良綜合征為單系發(fā)育不良性難治性血細(xì)胞減少癥(RCUD)。

在一些實(shí)施方案中，脊髓發(fā)育不良綜合征為環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞性難治性貧血(RARS)。

在一些實(shí)施方案中，脊髓發(fā)育不良綜合征為多系發(fā)育不良性難治性血細(xì)胞減少癥。

在一些實(shí)施方案中，脊髓發(fā)育不良綜合征為原始細(xì)胞過多性難治性貧血-1(RAEB-1)。

在一些實(shí)施方案中，脊髓發(fā)育不良綜合征為原始細(xì)胞過多性難治性貧血-2(RAEB-2)。

在一些實(shí)施方案中，脊髓發(fā)育不良綜合征為未分類脊髓發(fā)育不良綜合征(MDS-U)。

在一些實(shí)施方案中，脊髓發(fā)育不良綜合征為與孤立del(5q)相關(guān)的脊髓發(fā)育不良綜合征。

在一些實(shí)施方案中，脊髓發(fā)育不良綜合征為紅細(xì)胞生成刺激劑難治愈的。

JAK相關(guān)疾病或病狀的其它實(shí)例包括通過施用本發(fā)明化合物改善其它藥物的皮膚學(xué)副作用。舉例而言，許多藥劑造成不需要的過敏反應(yīng)，其可體現(xiàn)為痤瘡樣皮疹或相關(guān)皮炎。具有此類不理想副作用的藥劑的實(shí)例包括抗癌藥，諸如吉非替尼、西妥昔單抗、埃羅替尼以及類似物。本發(fā)明化合物可與具有不理想皮膚學(xué)副作用的藥劑組合(例如同時(shí)或依序)施用全身或局部(例如位于皮炎附近)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物可與一種或多種其它藥物一起施用局部，其中其它藥物在不存在本發(fā)明化合物的情況下局部施用時(shí)會(huì)導(dǎo)致接觸性皮炎、過敏性接觸性敏化或類似皮膚病癥。因此，本發(fā)明的組合物包括含有本發(fā)明化合物和可能導(dǎo)致皮炎、皮膚病癥或相關(guān)副作用的另一藥劑的局部配制物。

其它JAK相關(guān)疾病包括炎癥和發(fā)炎性疾病。實(shí)例發(fā)炎性疾病包括結(jié)節(jié)病、發(fā)炎性眼病(例如虹膜炎、葡萄膜炎、鞏膜炎、結(jié)膜炎或相關(guān)疾病)、發(fā)炎性呼吸道疾病(例如上呼吸道，包括鼻和鼻竇，諸如鼻炎或鼻竇炎；或下呼吸道，包括支氣管炎、慢性阻塞性肺病以及類似疾病)、發(fā)炎性肌病(諸如心肌炎)和其它發(fā)炎性疾病。在一些實(shí)施方案中，炎癥性眼病為瞼炎。

其它JAK相關(guān)疾病包括局部缺血再灌注損傷或與發(fā)炎性缺血性事件相關(guān)的疾病或病狀(諸如中風(fēng)或心跳驟停)、內(nèi)毒素驅(qū)動(dòng)的疾病狀態(tài)(例如旁路手術(shù)后并發(fā)癥或造成慢性心臟衰竭的慢性內(nèi)毒素狀態(tài))、厭食癥、惡病質(zhì)、疲勞(諸如由癌癥引起或與其相關(guān)的疲勞)、再狹窄、硬化性皮炎、纖維化、與低血氧或星形細(xì)胞膠質(zhì)化相關(guān)的病狀(諸如糖尿病性視網(wǎng)膜病、癌癥或神經(jīng)退化)和其它發(fā)炎性疾病，諸如全身性發(fā)炎性反應(yīng)綜合征(SIRS)和膿毒性休克。

其它JAK相關(guān)疾病包括痛風(fēng)和前列腺大小由于例如良性前列腺肥大或良性前列腺增生而增大以及骨吸收病，諸如骨質(zhì)疏松癥或骨關(guān)節(jié)炎、與以下各項(xiàng)相關(guān)的骨吸收?。杭に夭黄胶夂?或激素療法、自體免疫性疾病(例如骨結(jié)節(jié)病)或癌癥(例如骨髓瘤)。

其它JAK相關(guān)疾病包括干眼癥。如本文中所使用，“干眼癥”意欲涵蓋Dry Eye Workshop(DEWS)的最近官方報(bào)導(dǎo)中所匯總的疾病狀態(tài)，其將干眼癥定義為“導(dǎo)致不適、視力障礙和淚膜不穩(wěn)定伴隨潛在眼表損傷的癥狀的多因素性淚液和眼表疾病”。其伴隨有淚膜滲透壓增加和眼表炎癥。Lemp,“The Definition and Classification of Dry Eye Disease:Report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye Workshop”,The Ocular Surface,5(2),75-92,2007年4月，該文獻(xiàn)以全文引用的方式并入本文中。在一些實(shí)施方案中，干眼癥選自淚液缺乏型干眼癥(ADDE)或蒸發(fā)過強(qiáng)型干眼癥或其適當(dāng)組合。在一些實(shí)施方案中，干眼癥為休格倫氏綜合征干眼癥(SSDE)。在一些實(shí)施方案中，干眼癥為非休格倫氏綜合征干眼癥(NSSDE)。

其它JAK相關(guān)疾病包括結(jié)膜炎、葡萄膜炎(包括慢性葡萄膜炎)、脈絡(luò)膜炎、視網(wǎng)膜炎、睫狀體炎、鞏膜炎、表層鞏膜炎或虹膜炎。其它JAK相關(guān)疾病包括與病毒感染相關(guān)的呼吸功能障礙或衰竭，諸如流感和SARS。

組合療法

一種或多種附加藥劑，諸如化學(xué)治療劑、消炎劑、類固醇、免疫抑制劑以及PI3Kδ、mTor、Bcr-Abl、Flt-3、RAF和FAK激酶抑制劑，諸如以全文引用的方式并入本文中的WO 2006/056399中所描述者，或其它藥劑，可與本文中所描述的化合物組合使用，用于治療JAK相關(guān)疾病、病癥或病狀。所述一種或多種附加藥劑可同時(shí)或依序施用患者。

實(shí)例化學(xué)治療劑包括蛋白體抑制劑(例如硼替佐米)、沙利度胺、雷利度胺和DNA損傷劑，諸如美法侖、阿霉素、環(huán)磷酰胺、長春新堿、依托泊苷、亞硝脲氮芥以及類似物。

實(shí)例類固醇包括皮質(zhì)類固醇，諸如地塞米松或強(qiáng)的松。

實(shí)例Bcr-Abl抑制劑包括屬于美國專利第5,521,184號、WO 04/005281和美國序列號60/578,491中所公開的類別和種類的化合物以及藥物學(xué)上可接受的鹽，這些文獻(xiàn)均以全文引用的方式并入本文中。

實(shí)例適合Flt-3抑制劑包括如WO 03/037347、WO 03/099771和WO 04/046120中所公開的化合物以及藥物學(xué)上可接受的鹽，這些文獻(xiàn)均以全文引用的方式并入本文中。

實(shí)例適合RAF抑制劑包括如WO 00/09495和WO 05/028444中所公開的化合物以及藥物學(xué)上可接受的鹽，所述兩文獻(xiàn)均以全文引用的方式并入本文中。

實(shí)例適合FAK抑制劑包括如WO 04/080980、WO 04/056786、WO 03/024967、WO 01/064655、WO 00/053595和WO 01/014402中所公開的化合物以及藥物學(xué)上可接受的鹽，這些文獻(xiàn)均以全文引用的方式并入本文中。

在一些實(shí)施方案中，附加藥劑選自IMiD、抗IL-6藥劑、抗TNF-α藥劑、低甲基化藥劑和生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑(BRM)。

一般而言，BRM為由活生物體制備用于治療疾病的物質(zhì)，其可能天然存在于體內(nèi)或可在實(shí)驗(yàn)室中制備。BRM的實(shí)例包括IL-2、干擾素、各種類型群落刺激因子(CSF、GM-CSF、G-CSF)、單株抗體，諸如阿昔單抗、依那西普、英利昔單抗、利妥昔單抗、曲妥珠單抗和高劑量抗壞血酸。

在一些實(shí)施方案，抗TNF-α藥劑為英利昔單抗和依那西普。

在一些實(shí)施方案中，低甲基化藥劑為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑。在一些實(shí)施方案中，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑選自5-氮雜胞苷和地西他濱。

一般而言，IMiD為免疫調(diào)節(jié)劑。在一些實(shí)施方案中，IMiD選自沙利度胺、來那度胺、泊馬度胺、CC-11006和CC-10015。

在一些實(shí)施方案中，附加藥劑選自抗胸腺細(xì)胞球蛋白、重組人粒細(xì)胞群落刺激因子(G CSF)、粒細(xì)胞-單核細(xì)胞CSF(GM-CSF)、紅細(xì)胞生成刺激劑(ESA)和環(huán)孢霉素。

在一些實(shí)施方案中，附加藥劑為附加JAK抑制劑。在一些實(shí)施方案中，附加JAK抑制劑為托法替尼或魯索替尼。

在一些實(shí)施方案中，一種或多種本發(fā)明化合物可與一種或多種其它激酶抑制劑組合使用，包括伊馬替尼，尤其是用于治療對伊馬替尼或其它激酶抑制劑具有抗性的患者。

在一些實(shí)施方案中，適合的化學(xué)治療劑可選自抗代謝物劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶1抑制劑、鉑類似物、紫杉烷、蒽環(huán)類和EGFR抑制劑以及其組合。

在一些實(shí)施方案中，抗代謝物劑包括卡培他濱、吉西他濱和氟尿嘧啶(5-FU)。

在一些實(shí)施方案中，紫杉烷包括太平洋紫杉醇、(可注射懸浮液用太平洋紫杉醇蛋白結(jié)合粒子)和(多烯紫杉醇)。

在一些實(shí)施方案中，鉑類似物包括奧沙利鉑、順鉑和卡鉑。

在一些實(shí)施方案中，拓?fù)洚悩?gòu)酶1抑制劑包括伊立替康和拓?fù)涮婵怠?/p>

在一些實(shí)施方案中，蒽環(huán)類包括阿霉素或阿霉素的脂質(zhì)體配制物。

在一些實(shí)施方案中，化學(xué)治療劑為FOLFIRINOX(5-FU、甲酰四氫葉酸、伊立替康和奧沙利鉑)。在一些實(shí)施方案中，化學(xué)治療劑為吉西他濱和(可注射懸浮液用太平洋紫杉醇蛋白結(jié)合粒子)。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的一種或多種JAK抑制劑可與化學(xué)治療劑組合使用，用于治療癌癥，諸如多發(fā)性骨髓瘤，且與對單獨(dú)化學(xué)治療劑的反應(yīng)相比，可在不加重其毒性效應(yīng)的情況下改善治療反應(yīng)。舉例而言，用于治療多發(fā)性骨髓瘤的附加藥劑的實(shí)例可包括而不限于美法侖、美法侖加強(qiáng)的松[MP]、阿霉素、地塞米松和Velcade(硼替佐米)。用于治療多發(fā)性骨髓瘤的其它附加藥劑包括Bcr-Abl、Flt-3、RAF和FAK激酶抑制劑。加和或協(xié)同效應(yīng)為組合本發(fā)明的JAK抑制劑與附加藥劑的理想結(jié)果。此外，多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞對諸如地塞米松的藥劑的抗性在用本發(fā)明的JAK抑制劑治療后為可逆轉(zhuǎn)的。所述藥劑可與本發(fā)明化合物組合于單一或連續(xù)劑型中，或所述藥劑可作為單獨(dú)劑型同時(shí)或依序施用。

在一些實(shí)施方案中，向患者施用諸如地塞米松的皮質(zhì)類固醇與至少一種JAK抑制劑的組合，其中與連續(xù)施用相反，地塞米松是間歇性地施用。

在一些其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的一種或多種JAK抑制劑與其它治療劑的組合可在骨髓移植或干細(xì)胞之前、期間和/或之后施用患者。

在一些實(shí)施方案中，附加治療劑為醋酸氟輕松或雙甲丙酰龍(AL-2178，Vexol，Alcon)。

在一些實(shí)施方案中，附加治療劑為環(huán)孢霉素

在一些實(shí)施方案中，附加治療劑為皮質(zhì)類固醇。在一些實(shí)施方案中，皮質(zhì)類固醇為曲安西龍、地塞米松、氟輕松、可體松、潑尼松龍或氟米龍。

在一些實(shí)施方案中，附加治療劑選自Dehydrex^TM(Holles Labs)、Civamide(Opko)、透明質(zhì)酸鈉(Vismed，Lantibio/TRB Chemedia)、環(huán)孢霉素(ST-603，Sirion Therapeutics)、ARG101(T)(睪丸酮，Argentis)、AGR1012(P)(Argentis)、依卡倍特鈉(Senju-Ista)、吉法酯(Santen)、15-(s)-羥基二十碳四烯酸(15(S)-HETE)、西維美林、強(qiáng)力霉素(ALTY-0501，Alacrity)、米諾環(huán)素、iDestrin^TM(NP50301，Nascent Pharmaceuticals)、環(huán)孢霉素A(Nova22007，Novagali)、土霉素(耐久霉素，MOLI1901，Lantibio)、CF101((2S,3S,4R,5R)-3,4-二羥基-5-[6-[(3-碘苯基)甲基氨基]嘌呤-9-基]-N-甲基-環(huán)氧丁烷-2-氨基甲酰，Can-Fite Biopharma)、沃克洛林(voclosporin)(LX212或LX214，Lux Biosciences)、ARG103(Agentis)、RX-10045(合成消退素類似物，Resolvyx)、DYN15(Dyanmis Therapeutics)、來格列酮(DE011，Daiichi Sanko)、TB4(RegeneRx)、OPH-01(Ophtalmis Monaco)、PCS101(Pericor Science)、REV1-31(Evolutec)、Lacritin(Senju)、瑞巴匹特(Otsuka-Novartis)、OT-551(Othera)、PAI-2(University of Pennsylvania and Temple University)、毛果蕓香堿、他克莫司、吡美莫司(AMS981，Novartis)、依碳氯替潑諾、利妥昔單抗、地夸磷索四鈉(INS365，Inspire)、KLS-0611(Kissei Pharmaceuticals)、脫氫表雄固酮、阿那白滯素、依法珠單抗、霉酚酸鈉、依那西普羥氯奎、NGX267(TorreyPines Therapeutics)、托珠單抗、吉西他濱、奧沙利鉑、L-天冬酰胺或沙利度胺。

在一些實(shí)施方案中，附加治療劑為抗血管生成劑、膽堿能激動(dòng)劑、TRP-1受體調(diào)節(jié)劑、鈣離子通道阻斷劑、粘蛋白促分泌劑、MUC1刺激劑、鈣調(diào)磷酸酶抑制劑、皮質(zhì)類固醇、P2Y2受體激動(dòng)劑、毒蕈堿受體激動(dòng)劑、mTOR抑制劑、另一JAK抑制劑、Bcr-Abl激酶抑制劑、Flt-3激酶抑制劑、RAF激酶抑制劑和FAK激酶抑制劑，諸如WO2006/056399中所描述者，該文獻(xiàn)以全文引用的方式并入本文中。在一些實(shí)施方案中，附加治療劑為四環(huán)素衍生物(例如米諾環(huán)素或強(qiáng)力霉素)。在一些實(shí)施方案中，附加治療劑結(jié)合FKBP12。

在一些實(shí)施方案中，附加治療劑為烷基化劑或DNA交聯(lián)劑；抗代謝物/脫甲基劑(例如5-氟脲嘧啶、卡培他濱或阿扎胞苷)；抗激素療法(例如激素受體拮抗劑、SERM或芳香酶抑制劑)；有絲分裂抑制劑(例如長春新堿或太平洋紫杉醇)；拓?fù)洚悩?gòu)酶(I或II)抑制劑(例如米托蒽醌和伊立替康)；細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑(例如ABT-737)；核酸療法(例如反義或RNAi)；核受體配體(例如激動(dòng)劑和/或拮抗劑：全反式視黃酸或貝沙羅汀)；后生靶向劑，諸如組蛋白脫乙酰酶抑制劑(例如伏立諾他)、低甲基化劑(例如地西他濱)；蛋白質(zhì)穩(wěn)定性調(diào)節(jié)劑，諸如Hsp90抑制劑、泛素和/或泛素樣結(jié)合或解離分子；或EGFR抑制劑(埃羅替尼)。

在一些實(shí)施方案中，附加治療劑為潤眼滴劑(也稱為“人造淚液”)，其包括但不限于含有聚乙烯醇、羥丙基甲基纖維素、甘油、聚乙二醇(例如PEG400)或羧甲基纖維素的組合物。人造淚液可通過補(bǔ)償淚膜的潤濕和潤滑能力下降而輔助治療干眼癥。在一些實(shí)施方案中，附加治療劑為粘液溶解藥，諸如N-乙?；腚装彼?，其可與粘蛋白相互作用且因此降低淚膜的粘性。

在一些實(shí)施方案中，附加治療劑包括抗生素、抗病毒劑、抗真菌劑、麻醉劑、消炎劑(包括類固醇消炎劑和非類固醇消炎劑)和抗過敏劑。適合的藥劑的實(shí)例包括氨基糖苷，諸如阿米卡星、正大霉素、托普霉素、鏈霉素、奈替米星和卡那霉素；氟喹諾酮，諸如環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星、洛美沙星、左氧氟沙星和依諾沙星；萘啶；磺酰胺；多粘菌素；氯霉素；新霉素；巴母霉素；甲磺酸粘菌素；桿菌肽；萬古霉素；四環(huán)素；利福平以及衍生物(“利福平類”)；環(huán)絲氨酸；β-內(nèi)酰胺；頭孢菌素；兩性霉素；氟康唑；5-氟胞嘧啶；游霉素；霉康唑；酮康唑；皮質(zhì)類固醇；雙氯芬酸；氟比洛芬；酮咯酸；舒洛芬；色甘酸；洛度沙胺；左卡巴司?。惠吝蜻?；安他唑啉；非尼臘明；或氮雜內(nèi)酯類抗生素。

藥物配制物和劑型

當(dāng)用作藥物時(shí)，本發(fā)明化合物可呈藥物組合物形式施用。這些組合物可用藥物技術(shù)中所熟知的方式制備，且可通過各種途徑施用，此取決于需要局部治療或全身治療和欲治療的區(qū)域。施用可為局部(包括經(jīng)皮、經(jīng)表皮、經(jīng)眼和粘膜，包括鼻內(nèi)、陰道和直腸遞送)、經(jīng)肺(例如通過吸入或吹入粉劑或氣霧劑，包括通過噴霧器；氣管內(nèi)或鼻內(nèi))、經(jīng)口或非經(jīng)腸。非經(jīng)腸施用包括靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)或注射或輸注；或顱內(nèi)，例如鞘內(nèi)或心室內(nèi)施用。非經(jīng)腸施用可呈單次團(tuán)注劑型，或可例如通過連續(xù)灌注泵。用于局部施用的藥物組合物和配制物可包括經(jīng)皮貼片、軟膏、洗液、乳膏、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧、液體和粉劑。常規(guī)藥物載體、水性、粉狀或油性基質(zhì)、增稠劑以及類似物可能為必需的或理想的。

本發(fā)明還包括藥物組合物，其含有作為活性成分的本發(fā)明化合物或其藥物學(xué)上可接受的鹽與一種或多種藥物學(xué)上可接受的載體(賦形劑)的組合。在一些實(shí)施方案中，所述組合物適合于局部施用。在制備本發(fā)明的組合物時(shí)，典型地將活性成分與賦形劑混合，通過賦形劑稀釋或包裝在呈例如膠囊、香囊、紙張或其它容器形式的此種載體內(nèi)。當(dāng)賦形劑充當(dāng)稀釋劑時(shí)，其可為充當(dāng)活性成分的媒介物、載體或介質(zhì)的固體、半固體或液體材料。因而，所述組合物可呈片劑、丸劑、粉劑、口含錠、香囊、扁囊、酏劑、懸浮液、乳液、溶液、糖漿、氣霧劑(呈固體形式或處于液體介質(zhì)中)、含有例如至多10重量％活性化合物的軟膏、軟明膠膠囊和硬明膠膠囊、栓劑、無菌可注射溶液和無菌包裝粉劑形式。

在制備配制物時(shí)，活性化合物在與其它成分組合之前可經(jīng)研磨以獲得適當(dāng)粒度。如果活性化合物基本上不溶，則其可研磨至小于200目的粒度。如果活性化合物基本上可溶于水，則可通過研磨來調(diào)節(jié)粒度以獲得在配制物中基本上均勻分布，例如約40目。

本發(fā)明化合物可使用已知研磨程序進(jìn)行研磨，諸如濕磨，以獲得適合于片劑形成且適合于其它配制物類型的粒度。本發(fā)明化合物的細(xì)粉狀(納米粒子)制劑可通過本領(lǐng)域中已知的方法來制備，例如參見國際申請第WO 2002/000196號。

適合的賦形劑的一些實(shí)例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯樹膠、磷酸鈣、海藻酸鹽、黃芪膠、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿和甲基纖維素。配制物可另外包含：潤滑劑，諸如滑石、硬脂酸鎂和礦物油；潤濕劑；乳化劑和懸浮劑；防腐劑，諸如羥基苯甲酸甲酯和羥基苯甲酸丙酯；甜味劑；和調(diào)味劑。本發(fā)明的組合物可經(jīng)配制以便在通過使用本領(lǐng)域中已知的程序施用患者之后獲得活性成分的快速、持續(xù)或延遲釋放。

在一些實(shí)施方案中，藥物組合物包含硅化微晶纖維素(SMCC)和至少一種本文中所描述的化合物或其藥物學(xué)上可接受的鹽。在一些實(shí)施方案中，硅化微晶纖維素包含約98％微晶纖維素和約2％二氧化硅w/w。

在一些實(shí)施方案中，所述組合物為包含至少一種本文中所描述的化合物或其藥物學(xué)上可接受的鹽和至少一種藥物學(xué)上可接受的載體的持續(xù)釋放組合物。在一些實(shí)施方案中，所述組合物包含至少一種本文中所描述的化合物或其藥物學(xué)上可接受的鹽和至少一種選自微晶纖維素、乳糖一水合物、羥丙基甲基纖維素和聚環(huán)氧乙烷的組分。在一些實(shí)施方案中，所述組合物包含至少一種本文中所描述的化合物或其藥物學(xué)上可接受的鹽和微晶纖維素、乳糖一水合物和羥丙基甲基纖維素。在一些實(shí)施方案中，所述組合物包含至少一種本文中所描述的化合物或其藥物學(xué)上可接受的鹽和微晶纖維素、乳糖一水合物和聚環(huán)氧乙烷。在一些實(shí)施方案中，所述組合物還包含硬脂酸鎂或二氧化硅。在一些實(shí)施方案中，微晶纖維素為Avicel PH102^TM。在一些實(shí)施方案中，乳糖一水合物為Fast-flo 316^TM。在一些實(shí)施方案中，羥丙基甲基纖維素為羥丙基甲基纖維素2208K4M(例如Methocel K4 M Premier^TM)和/或羥丙基甲基纖維素2208 K100LV(例如Methocel K00LV^TM)。在一些實(shí)施方案中，聚環(huán)氧乙烷為聚環(huán)氧乙烷WSR 1105(例如Polyox WSR 1105^TM)。

在一些實(shí)施方案中，使用濕式?；▉懋a(chǎn)生所述組合物。在一些實(shí)施方案中，使用干式?；▉懋a(chǎn)生所述組合物。

所述組合物可配制成單位劑型，各劑量含有約5至約1,000mg(1g)，更通常約100mg至約500mg活性成分。在一些實(shí)施方案中，各劑量含有約10mg活性成分。在一些實(shí)施方案中，各劑量含有約50mg活性成分。在一些實(shí)施方案中，各劑量含有約25mg活性成分。術(shù)語“單位劑型”是指適合作為整體劑量用于人類個(gè)體和其它哺乳動(dòng)物的物理離散單元，各單位含有經(jīng)計(jì)算可產(chǎn)生所要療效且與適合的藥物賦形劑締合的預(yù)定量的活性物質(zhì)。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物含有約5mg至約50mg活性成分。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，此包括包含約5mg至約10mg、約10mg至約15mg、約15mg至約20mg、約20mg至約25mg、約25mg至約30mg、約30mg至約35mg、約35mg至約40mg、約40mg至約45mg或約45mg至約50mg活性成分的化合物或組合物。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物含有約50mg至約500mg活性成分。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，此包括含有約50mg至約100mg、約100mg至約150mg、約150mg至約200mg、約200mg至約250mg、約250mg至約300mg、約350mg至約400mg或約450mg至約500mg活性成分的化合物或組合物。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物含有約500mg至約1,000mg活性成分。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，此包括含有約500mg至約550mg、約550mg至約600mg、約600mg至約650mg、約650mg至約700mg、約700mg至約750mg、約750mg至約800mg、約800mg至約850mg、約850mg至約900mg、約900mg至約950mg或約950mg至約1,000mg活性成分的化合物或組合物。

活性化合物可在較寬劑量范圍內(nèi)有效且一般以藥物學(xué)有效量施用。然而，應(yīng)理解，實(shí)際施用的化合物的量通常將由醫(yī)師根據(jù)相關(guān)情形決定，包括欲治療的病狀、所選施用途徑、所施用的實(shí)際化合物、個(gè)別患者的年齡、體重和反應(yīng)、患者癥狀的嚴(yán)重程度以及類似因素。

為了制備諸如片劑的固體組合物，將主要活性成分與藥物賦形劑混合以形成含有本發(fā)明化合物的均質(zhì)混合物的固體預(yù)配制組合物。當(dāng)這些預(yù)配制組合物稱為均質(zhì)時(shí)，活性成分典型地均勻分散于整個(gè)組合物中，使得所述組合物可容易地再分成相等有效單位劑型，諸如片劑、丸劑和膠囊劑。隨后將此固體預(yù)配制物再分成含有例如約0.1至約1000mg本發(fā)明活性成分的上述類型的單位劑型。

本發(fā)明的片劑或丸劑可經(jīng)包衣或混配以獲得可提供延長作用時(shí)間的優(yōu)勢的劑型。舉例而言，片劑或丸劑可包含內(nèi)部劑量和外部劑量組分，后者呈處于前者上的包膜形式。兩種組分可由腸衣層隔開，腸衣層用于抵抗在胃中崩解且允許內(nèi)部組分完整進(jìn)入十二指腸或延遲釋放。多種物質(zhì)可用于此類腸衣層或包衣，此類材料包括許多聚合酸和聚合酸與諸如蟲膠、鯨蠟醇和乙酸纖維素的材料的混合物。

可并入本發(fā)明的化合物和組合物以用于經(jīng)口或通過注射施用的液體形式包括水溶液、經(jīng)適當(dāng)調(diào)味的糖漿、水或油懸浮液和與可食用油(諸如棉籽油、芝麻油、椰子油或花生油)的調(diào)味乳液以及酏劑和類似藥物媒介物。

用于吸入或吹入的組合物包括處于藥物學(xué)上可接受的水性或有機(jī)溶劑或其混合物中的溶液和懸浮液和粉劑。液體或固體組合物可含有如上文所描述的適合的藥物學(xué)上可接受的賦形劑。在一些實(shí)施方案中，組合物是通過口或鼻呼吸途徑施用以獲得局部或全身效應(yīng)。組合物可通過使用惰性氣體而霧化。霧化溶液可由霧化裝置直接呼吸，或可將霧化裝置連接于面罩帳或間歇性正壓呼吸機(jī)。溶液、懸浮液或粉末組合物可以適當(dāng)方式由遞送配制物的裝置經(jīng)口或鼻施用。

局部配制物可含有一種或多種常規(guī)載體。在一些實(shí)施方案中，軟膏可含有水和一種或多種選自例如液體石蠟、聚氧乙烯烷基醚、丙二醇、白凡士林以及類似物的疏水性載體。乳膏的載體組合物可基于水與甘油和一種或多種其它組分(例如單硬脂酸甘油酯、PEG-單硬脂酸甘油酯和鯨蠟基硬脂醇)的組合。凝膠可使用異丙醇和水與其它組分(諸如甘油、羥乙基纖維素以及類似物)的適合組合進(jìn)行配制。在一些實(shí)施方案中，局部配制物含有至少約0.1wt％、至少約0.25wt％、至少約0.5wt％、至少約1wt％、至少約2wt％或至少約5wt％的本發(fā)明化合物。局部配制物可適當(dāng)?shù)匕b于例如100g的管內(nèi)，任選附帶有治療所選適應(yīng)癥(例如銀屑病或其它皮膚病狀)的說明書。

施用患者的化合物或組合物的量將取決于施用何物、施用目的(諸如預(yù)防或治療)、患者狀態(tài)、施用方式以及類似因素而變化。在治療應(yīng)用中，組合物可以足以治愈或至少部分阻滯疾病以及并發(fā)癥的癥狀的量施用已罹患所述疾病的患者。有效劑量將取決于所治療的疾病病狀以及主治臨床醫(yī)師依據(jù)諸如疾病嚴(yán)重程度、患者年齡、體重和一般狀況等因素而作出的判斷。

施用患者的組合物可呈上述藥物組合物形式。這些組合物可通過常規(guī)滅菌技術(shù)進(jìn)行滅菌，或可進(jìn)行無菌過濾。水溶液可經(jīng)包裝以便依原樣使用，或經(jīng)凍干，在施用之前將凍干制劑與無菌水性載體組合?；衔镏苿┑膒H值典型地將在3與11之間，優(yōu)選為5至9且最優(yōu)選為7至8。應(yīng)理解，使用某些前述賦形劑、載體或穩(wěn)定劑將形成藥物鹽。

本發(fā)明化合物的治療劑量可根據(jù)例如進(jìn)行治療的特定用途、化合物的施用方式、患者的健康狀況和處方醫(yī)師的判斷而變化。本發(fā)明化合物在藥物組合物中的比例或濃度可依據(jù)許多因素而變化，包括劑量、化學(xué)特征(例如疏水性)和施用途徑。舉例而言，本發(fā)明化合物可以含有約0.1％至約10％w/v所述化合物的水性生理學(xué)緩沖溶液形式提供以用于非經(jīng)腸施用。一些典型劑量范圍為每天約1μg/kg至約1g/kg體重。在一些實(shí)施方案中，劑量范圍為每天約0.01mg/kg至約100mg/kg體重。劑量有可能依據(jù)諸如疾病或病癥的類型和進(jìn)展程度、特定患者的總體健康狀態(tài)、所選化合物的相對生物學(xué)效力、賦形劑配方以及施用途徑的變量而變化。有效劑量可由得自于體外或動(dòng)物模型測試系統(tǒng)的劑量反應(yīng)曲線外推。

本發(fā)明的組合物可還包含一種或多種附加藥物劑，諸如化學(xué)治療劑、類固醇、消炎化合物或免疫抑制劑，其實(shí)例于上文中列出。

在一些實(shí)施方案中，化合物或其藥物學(xué)上可接受的鹽是作為眼用組合物施用。因此，在一些實(shí)施方案中，所述方法包括施用所述化合物或其藥物學(xué)上可接受的鹽和眼用可接受的載體。在一些實(shí)施方案中，眼用組合物為液體組合物、半固體組合物、插入物、膜、微?；蚣{米粒子。

在一些實(shí)施方案中，眼用組合物為液體組合物。在一些實(shí)施方案中，眼用組合物為半固體組合物。在一些實(shí)施方案中，眼用組合物為局部組合物。局部組合物包括但不限于液體和半固體組合物。在一些實(shí)施方案中，眼用組合物為局部組合物。在一些實(shí)施方案中，局部組合物包括水溶液、水性懸浮液、軟膏或凝膠。在一些實(shí)施方案中，眼用組合物是局部施用于眼前部、上眼皮下、下眼瞼上和結(jié)膜囊中。在一些實(shí)施方案中，眼用組合物經(jīng)滅菌。滅菌可通過已知技術(shù)來實(shí)現(xiàn)，如對溶液進(jìn)行滅菌過濾或通過安瓿中加熱溶液以備使用。本發(fā)明的眼用組合物還可含有適合于制備眼用配制物的藥物賦形劑。此類賦形劑的實(shí)例為防腐劑、緩沖劑、螯合劑、抗氧化劑和用于調(diào)節(jié)滲透壓的鹽。

如本文中所使用，術(shù)語“眼用可接受的載體”是指可含有和釋放化合物或其藥物學(xué)上可接受的鹽且與眼睛相容的任何物質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，眼用可接受的載體為水或水性溶液或懸浮液，但還包括油諸如用于制備軟膏的那些以及諸如用于眼部插入物的聚合物基質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，組合物可為包含化合物或其藥物學(xué)上可接受的鹽的水性懸浮液。液體眼用組合物，包括軟膏和懸浮液，可具有適合于所選施用途徑的粘度。在一些實(shí)施方案中，眼用組合物的粘度在約1,000至約30,000厘泊范圍內(nèi)。

在一些實(shí)施方案中，眼用組合物可還包含以下各項(xiàng)中的一項(xiàng)或多項(xiàng)：界面活性劑、佐劑、緩沖劑、抗氧化劑、張力調(diào)節(jié)劑、防腐劑(例如EDTA、BAK(苯扎氯銨)、亞氯酸鈉、過硼酸鈉、聚季銨鹽-1)、增稠劑或粘度調(diào)節(jié)劑(例如羧甲基纖維素、羥甲基纖維素、聚乙烯醇、聚乙二醇、乙二醇400、丙二醇羥甲基纖維素、羥丙基瓜耳膠、透明質(zhì)酸和羥丙基纖維素)以及類似物。配制物中的添加劑可包括但不限于氯化鈉、碳酸氫鈉、山梨酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯己定、蓖麻油和過硼酸鈉。

水性眼用組合物(溶液或懸浮液)一般不含生理學(xué)上或眼用有害的組分。在一些實(shí)施方案中，將經(jīng)純化的水或去離子水用于組合物中?？赏ㄟ^添加任何生理學(xué)上和眼用可接受的pH值調(diào)節(jié)酸、堿或緩沖劑將pH值調(diào)節(jié)至約5.0至8.5范圍內(nèi)。酸的眼用可接受的實(shí)例包括乙酸、硼酸、檸檬酸、乳酸、磷酸、鹽酸以及類似酸，且堿的實(shí)例包括氫氧化鈉、磷酸鈉、硼酸鈉、檸檬酸鈉、乙酸鈉、乳酸鈉、氨丁三醇、三羥甲基氨基甲烷以及類似物。鹽和緩沖劑包括檸檬酸鹽/葡萄糖、碳酸氫鈉、氯化銨和上述酸與堿的混合物。

在一些實(shí)施方案中，所述方法包括形成或提供與眼睛外表面接觸的治療劑貯庫。貯庫是指不會(huì)由淚液或其它眼部清除機(jī)制快速移除的治療劑源。由此通過單次施用允許眼睛外表面上的流體中繼續(xù)、持續(xù)存在高濃度的治療劑。不希望受任何理論束縛，認(rèn)為吸收和滲透可取決于溶解的藥物濃度和外部組織與含藥物的流體的接觸持續(xù)時(shí)間。在藥物通過眼部流體清除和/或吸收至眼組織中而移除時(shí)，再提供藥物，例如從貯庫溶解于補(bǔ)充的眼部流體中。因此，使用貯庫可能更容易促進(jìn)眼部組織負(fù)載更多不溶性治療劑。在一些實(shí)施方案中，貯庫可保持多達(dá)八小時(shí)或更久。在一些實(shí)施方案中，眼用貯庫形式包括但不限于水性聚合物懸浮液、軟膏和固體插入物。

在一些實(shí)施方案中，眼用組合物為軟膏或凝膠。在一些實(shí)施方案中，眼用組合物為基于油的遞送媒介物。在一些實(shí)施方案中，所述組合物包含石蠟油或羊毛脂基質(zhì)，其中添加有活性成分(通常0.1％至2％)和賦形劑。常用基質(zhì)可包括但不限于礦物油、石蠟油及其組合。在一些實(shí)施方案中，軟膏呈帶狀施用于下眼瞼上。

在一些實(shí)施方案中，眼用組合物為眼用插入物。在一些實(shí)施方案中，眼用插入物為生物學(xué)惰性的、軟的、生物可消化的、粘彈性的、在暴露于治療劑之后對滅菌穩(wěn)定的、抗氣載細(xì)菌感染的、生物可消化的、生物相容的和/或粘彈性的。在一些實(shí)施方案中，插入物包含眼用可接受的基質(zhì)，例如聚合物基質(zhì)?；|(zhì)典型地為聚合物，且治療劑一般分散于其中或與聚合物基質(zhì)鍵結(jié)。在一些實(shí)施方案中，治療劑可通過溶解或共價(jià)鍵水解而從基質(zhì)中緩慢釋放。在一些實(shí)施方案中，聚合物為生物可消化的(可溶的)且其溶解速率可控制分散于其中的治療劑的釋放速率。在另一形式中，聚合物基質(zhì)為諸如通過水解而分解，從而釋放與其鍵結(jié)或分散于其中的治療劑的生物可降解聚合物。在其它實(shí)施方案中，基質(zhì)和治療劑可環(huán)繞有附加聚合物包衣以進(jìn)一步控制釋放。在一些實(shí)施方案中，插入物包含生物可降解聚合物，諸如聚己內(nèi)酯(PCL)、乙烯/乙酸乙烯酯共聚物(EVA)、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚氨酯、尼龍或聚(dl-乳交酯-乙交酯)共聚物(PLGA)或這些物質(zhì)中任一種的共聚物。在一些實(shí)施方案中，治療劑是分散于基質(zhì)材料中，或分散于聚合之前的用于制備基質(zhì)材料的單體組合物中。在一些實(shí)施方案中，治療劑的量為約0.1％至約50％或約2％至約20％。在其它實(shí)施方案中，使用生物可降解或生物可消化的聚合物基質(zhì)，使得無須移除用過的插入物。在生物可降解或生物可消化聚合物降解或溶解時(shí)，釋放治療劑。

在其它實(shí)施方案中，眼用插入物包含聚合物，包括但不限于Wagh等人,“Polymers used in ocular dosage form and drug delivery systems”,Asian J.Pharm.,第12-17頁(2008年1月)中所描述的聚合物，該文獻(xiàn)以全文引用的方式并入本文中。在一些實(shí)施方案中，插入物包含選自聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯聚合物或共聚物(例如得自Rohm或Degussa的家族聚合物)、羥甲基纖維素、聚丙烯酸、聚(酰胺基胺)枝狀物、聚(二甲基硅氧烷)、聚環(huán)氧乙烷、聚(丙交酯-乙交酯)共聚物、聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯)、聚(乙烯醇)或聚(富馬酸亞丙酯)的聚合物。在一些實(shí)施方案中，插入物包含R。在一些實(shí)施方案中，插入物為450kDa聚丙烯酸-半胱氨酸綴合物。

在一些實(shí)施方案中，眼用組合物為眼用膜。適合于此類膜的聚合物包括但不限于Wagh等人(如上)中所描述的聚合物。在一些實(shí)施方案中，膜為軟接觸式透鏡，諸如由N,N-二乙基丙烯酰胺與跟乙二醇二甲基丙烯酸酯交聯(lián)的甲基丙烯酸的共聚物制成的軟接觸式透鏡。

在一些實(shí)施方案中，眼用組合物包含微球體或納米粒子。在一些實(shí)施方案中，微球體包含明膠。在一些實(shí)施方案中，將微球體經(jīng)玻璃體內(nèi)或視網(wǎng)膜下注入眼后部、脈絡(luò)膜空間、鞏膜。在一些實(shí)施方案中，微球體或納米粒子包含聚合物，包括但不限于Wagh等人(如上)中所描述的聚合物，該文獻(xiàn)以全文引用的方式并入本文中。在一些實(shí)施方案中，聚合物為殼聚糖、諸如聚丙烯酸的聚羧酸、白蛋白粒子、透明質(zhì)酸酯、聚衣康酸、聚(丁基)氰基丙烯酸酯、聚己內(nèi)酯、聚(異丁基)己內(nèi)酯、聚(乳酸-羥基乙酸)共聚物或聚(乳酸)。在一些實(shí)施方案中，微球體或納米粒子包含固體脂質(zhì)粒子。

在一些實(shí)施方案中，眼用組合物包含離子交換樹脂。在一些實(shí)施方案中，離子交換樹脂為無機(jī)沸石或合成有機(jī)樹脂。在一些實(shí)施方案中，離子交換樹脂包括但不限于Wagh等人(如上)中所描述的離子交換樹脂，該文獻(xiàn)以全文引用的方式并入本文中。在一些實(shí)施方案中，離子交換樹脂為經(jīng)部分中和的聚丙烯酸。

在一些實(shí)施方案中，眼用組合物為水性聚合物懸浮液。在一些實(shí)施方案中，治療劑或聚合物懸浮劑是懸浮于水性介質(zhì)中。在一些實(shí)施方案中，水性聚合物懸浮液可經(jīng)配制以使其在眼中的粘度與其在施用眼中之前所具有的粘度相同或基本上相同。在一些實(shí)施方案中，其可經(jīng)配制以使得與淚液接觸后凝膠化增加。

經(jīng)標(biāo)記化合物和檢定方法

本發(fā)明的另一方面涉及經(jīng)標(biāo)記的本發(fā)明化合物(經(jīng)放射標(biāo)記、經(jīng)熒光標(biāo)記等)，其不僅可用于成像技術(shù)，而且可用于體外和體內(nèi)檢定，用于對組織樣品(包括人類)中的JAK進(jìn)行定位和定量，以及用于通過抑制經(jīng)標(biāo)記化合物的結(jié)合來識別JAK配體。因此，本發(fā)明包括含有此類經(jīng)標(biāo)記化合物的JAK檢定。

本發(fā)明還包括經(jīng)同位素標(biāo)記的本發(fā)明化合物。‘經(jīng)同位素”或“放射標(biāo)記”的化合物為一個(gè)或多個(gè)原子由原子質(zhì)量或質(zhì)量數(shù)不同于自然界中通常發(fā)現(xiàn)(即，天然存在)的原子質(zhì)量或質(zhì)量數(shù)不同的原子置換或取代的本發(fā)明化合物。可并入本發(fā)明化合物中的適合放射性核素包括但不限于³H(氚也寫作T)、¹¹C、¹³C、¹⁴C、¹³N、¹⁵N、¹⁵O、¹⁷O、¹⁸O、¹⁸F、³⁵S、³⁶Cl、⁸²Br、⁷⁵Br、⁷⁶Br、⁷⁷Br、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I和¹³¹I。并入本發(fā)明的經(jīng)放射標(biāo)記化合物中的放射性核素將取決于該經(jīng)放射標(biāo)記化合物的特定應(yīng)用。舉例而言，對于體外JAK標(biāo)記和競爭檢定，并入³H、¹⁴C、⁸²Br、¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S或的化合物一般將最適用。對于放射成像應(yīng)用，¹¹C、¹⁸F、¹²⁵I、¹²³I、¹²⁴I、¹³¹I、⁷⁵Br、⁷⁶Br或⁷⁷Br一般將最適用。

應(yīng)理解，“經(jīng)放射標(biāo)記”或“經(jīng)標(biāo)記的化合物”為并入至少一種放射性核素的化合物。在一些實(shí)施方案中，放射性核素選自由³H、¹⁴C、¹²⁵I、³⁵S和⁸²Br組成的組。在一些實(shí)施方案中，化合物并入1、2或3個(gè)氘原子。

本發(fā)明可還包括用于將放射性同位素并入本發(fā)明化合物中的合成方法。用于將放射性同位素并入有機(jī)化合物中的合成方法在本領(lǐng)域中為熟知的，且本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易識別可用于本發(fā)明化合物的方法。

經(jīng)標(biāo)記的本發(fā)明化合物可用于篩選檢定以鑒別/評估化合物。舉例而言，可通過追蹤標(biāo)記以監(jiān)測經(jīng)標(biāo)記的新合成或鑒別的化合物(即，測試化合物)與JAK接觸時(shí)的濃度變化來評估其結(jié)合JAK的能力。舉例而言，可評估測試化合物(經(jīng)標(biāo)記)減少已知可結(jié)合JAK的另一化合物(即，標(biāo)準(zhǔn)化合物)的結(jié)合的能力。因此，測試化合物與標(biāo)準(zhǔn)化合物競爭結(jié)合JAK的能力直接與其結(jié)合親和力相關(guān)。相反，在一些其它篩選檢定中，標(biāo)準(zhǔn)化合物經(jīng)標(biāo)記且測試化合物未經(jīng)標(biāo)記。因此，監(jiān)測經(jīng)標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)化合物的濃度以評估標(biāo)準(zhǔn)化合物與測試化合物之間的競爭，且由此確定測試化合物的相對結(jié)合親和力。

試劑盒

本發(fā)明還包括可用于例如治療或預(yù)防JAK相關(guān)疾病或病癥(諸如癌癥)的藥物試劑盒，其包括一個(gè)或多個(gè)含有包含治療有效量的本發(fā)明化合物的藥物組合物的容器。如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，此類試劑盒可視需要還包括多種常規(guī)藥物試劑盒組件中的一種或多種，諸如含一種或多種藥物學(xué)上可接受的載體的容器、附加容器等。試劑盒中還可包括呈插頁形式或呈標(biāo)簽形式的說明書，指示欲施用的組分的量、關(guān)于投藥的指導(dǎo)和/或關(guān)于混合組分的指導(dǎo)。

合成

可根據(jù)以上實(shí)施方案且如以下流程I至III進(jìn)一步說明來合成式Ia化合物。在流程I中，(i)與(ii)在胺堿(例如N,N-二異丙基乙胺)存在下進(jìn)行親核性偶合，獲得化合物(iii-a)與化合物(iii-b)的異構(gòu)混合物。隨后在氫化條件下(例如在氫氣和氫催化劑(例如鈀/碳)存在下)還原硝基，獲得化合物(iv-a)與化合物(iv-b)的異構(gòu)混合物。(iv-a)和(iv-b)與(R)-(+)-乳酰胺在烷基氧鎓試劑(例如三乙基氧鎓四氟硼酸鹽)存在下偶合且隨后環(huán)化，獲得具有式Ia和式Ib的稠合三環(huán)化合物的混合物。隨后在反消旋條件下(例如在強(qiáng)堿(例如叔丁醇鉀)存在下)反應(yīng)，產(chǎn)生式Ia化合物的單一異構(gòu)體2-((2R,5S)-5-(2-((R)-1-羥基乙基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈，其可任選水合以形成式II的一水合物化合物。

流程I

在流程II中，可通過使(i)在還原劑(例如硼氫化鋰)存在下反應(yīng)來獲得經(jīng)胺保護(hù)的二醇(ii)，在2,2-二甲氧基丙烷和三氟化硼乙醚合物存在下進(jìn)行不對稱保護(hù)以形成噁唑烷(iii)，從而產(chǎn)生式VI化合物。游離醇(iii)在氧化條件下反應(yīng)，獲得醛(iv)，隨后在改進(jìn)型Wittig-Horner條件下(例如在(氰基甲基)膦酸二乙酯和叔丁醇鉀存在下)反應(yīng)，以形成順式異構(gòu)體與反式異構(gòu)體的混合物(v)。在強(qiáng)酸(例如對甲苯磺酸)存在下對(v)進(jìn)行去保護(hù)，獲得化合物(vi)，在強(qiáng)堿(例如甲醇鈉)存在下進(jìn)行環(huán)化，以形成經(jīng)胺保護(hù)的吡喃化合物(vii)。在標(biāo)準(zhǔn)條件下(例如在強(qiáng)酸存在下)進(jìn)行去保護(hù)，獲得胺鹽(viii)。

流程II

在流程III中，可產(chǎn)生式VI化合物。因此，對羧酸(i)進(jìn)行不對稱羰基還原，獲得羥基酯化合物(ii)，隨后在弱有機(jī)酸(例如乙酸)存在下進(jìn)行環(huán)化，以形成氨基內(nèi)酯(iii)。使(iii)在改進(jìn)的Wittig條件下(例如在氰基甲基(三甲基)氯化鏻和叔丁醇鉀存在下或者在三丁基(氰基甲基)氯化鏻和叔丁醇鉀存在下反應(yīng)，獲得(iv)的順式異構(gòu)體與反式異構(gòu)體的混合物。在氫氣和氫化催化劑(例如鈀/碳)存在下對烯烴(iv)進(jìn)行還原，獲得(v)的R異構(gòu)體與S異構(gòu)體的混合物。在標(biāo)準(zhǔn)條件下(例如在強(qiáng)酸存在下)對胺進(jìn)行去保護(hù)，獲得胺鹽(vi)。

流程III

舉例而言，可根據(jù)流程IV中所示的方法制備中間體(R)-4-甲氧基-2,2,5-三甲基-2,5-二氫噁唑。舉例而言，(R)-2-羥基丙酰胺(i)與2,2-二甲氧基丙烷(ii)在三鹵化硼乙醚合物(例如BF₃OEt₂)存在下反應(yīng)，獲得(R)-2,2,5-三甲基噁唑烷-4-酮(iii)。使化合物(iii)與甲基化劑(例如Me₃O⁺BF₄^-)反應(yīng)，且隨后在堿(例如碳酸鈉)存在下進(jìn)行反應(yīng)，獲得(R)-4-甲氧基-2,2,5-三甲基-2,5-二氫噁唑(v)。

流程IV

還可例如根據(jù)流程V中所示的方法制備式Ia化合物與式Ib化合物的混合物。首先使(R)-2,2,5-三甲基噁唑烷-4-酮(i)與甲基化劑(例如Me₃O⁺BF₄^-)反應(yīng)，以形成(R)-4-甲氧基-2,2,5-三甲基-2,5-二氫噁唑(ii)，隨后與2-((2R,5S)-5-(6-氨基噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基氨基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈和2-((2S,5S)-5-(6-氨基噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基氨基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈的混合物(iii)反應(yīng)，獲得式Ia化合物與式Ib化合物的混合物(iv)。

流程V

還可例如根據(jù)流程VI中所示的方法制備式Ia化合物與式Ib化合物的混合物。首先在標(biāo)準(zhǔn)醇保護(hù)條件(例如與乙酰氯反應(yīng))下保護(hù)(R)-2-羥基丙酰胺(i)，以形成(R)-乙酸-1-氨基-1-氧代-丙-2-基酯(ii)，隨后與氰尿酰氯反應(yīng)，以形成(R)-乙酸-1-氰基乙酯(iii)。隨后在酸催化劑(例如氯化氫)存在下使(iii)與乙醇反應(yīng)，獲得(R)-2-羥基丙亞胺酸乙酯(iv)，隨后與2-((2R,5S)-5-(6-氨基噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基氨基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈與2-((2S,5S)-5-(6-氨基噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基氨基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈的混合物(v)反應(yīng)，形成式Ia化合物與式Ib化合物的混合物(vi)。

流程VI

實(shí)施例

將通過特定實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。以下實(shí)施例是出于說明的目的而提供且不意欲以任何方式限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)容易地認(rèn)識到可改變或變更以產(chǎn)生本質(zhì)上相同的結(jié)果的各種不重要參數(shù)。

在Waters質(zhì)量導(dǎo)向型分餾系統(tǒng)上對所制備的一些化合物進(jìn)行開放取用制備型LC-MS純化。用于操作這些系統(tǒng)的基本設(shè)備設(shè)定、方案和控制軟件已詳細(xì)描述于文獻(xiàn)中。參見例如“Two-Pump At Column Dilution Configuration for Preparative LC-MS”,K.Blom,J.Combi.Chem.,4,295(2002)；“Optimizing Preparative LC-MS Configurations and Methods for Parallel Synthesis Purification”,K.Blom,R.Sparks,J.Doughty,G.Everlof,T.Haque,A.Combs,J.Combi.Chem.,5,670(2003)；和“Preparative LC-MS Purification:Improved Compound Specific Method Optimization”,K.Blom,B.Glass,R.Sparks,A.Combs,J.Combi.Chem.,6,874-883(2004)。典型地以下條件下對所分離的化合物進(jìn)行分析型液相色譜質(zhì)譜(LCMS)以獲得純度：儀器：Agilent 1100系列，LC/MSD，柱：Waters Sunfire^TMC₁₈ 5μm，2.1×5.0mm，緩沖液：移動(dòng)相A：0.025％TFA/水和移動(dòng)相B：0.025％TFA/乙腈；在3分鐘內(nèi)梯度2％至80％B，流速1.5mL/min。

使用差示掃描量熱法(DSC)來分析所制備的一些化合物。典型DSC條件如下：

TA儀器差示掃描量熱儀，Q200型，具有自動(dòng)取樣器。溫度范圍：30℃至350℃；溫升速率：10℃/min；Tzero鋁樣品盤和蓋；氮?dú)饬?0mL/min。

使用熱解重量分析(TGA)來分析所制備的一些化合物。典型TGA條件如下：

TA儀器熱解重量分析儀，Q500型。溫度范圍：20℃至600℃；溫升速率：20℃/min；氮?dú)獯祾吡鳎?0mL/min；平衡吹掃流：60mL/min；樣品吹掃流；鉑樣品盤。

PerkinElmer熱解重量分析儀，Pyris 1型。溫度范圍：25℃至300℃；溫升速率：10℃/min；氮?dú)獯祾邭饬鳎?0mL/min；TGA陶瓷坩堝樣品夾。

使用X射線粉末衍射(XRPD)來分析所制備的一些化合物。典型XRPD條件如下：

Bruker D2PHASER X射線粉末衍射儀；X射線輻射波長：CuKAI；X射線功率：30KV、10mA；樣品粉末：分散于零背景樣品夾上；一般測量條件：起始角度-5度；終止角度-60度；取樣-0.015度；掃描速度-2度/分鐘。

Rigaku MiniFlex X射線粉末衍射儀；X射線輻射來自于銅Cu具有K_β濾光片；X射線功率：30KV、15mA；樣品粉末：分散于零背景樣品夾上。一般測量條件：起始角度-3度；終止角度-45度；取樣-0.02度；掃描速度-2度/分鐘。

使用動(dòng)態(tài)氣相吸附(DVS)來分析所制備的一些化合物。典型DVS條件如下：

SGA-100對稱氣相吸附分析儀得自VTI公司。在四個(gè)循環(huán)中以10％相對濕度(RH)增量完成濕氣吸收概況分析，其中第一吸附從25％至95％RH，隨后以10％增量從95％至5％RH進(jìn)行解吸。平衡標(biāo)準(zhǔn)為5分鐘內(nèi)0.0050wt％，其中最大平衡時(shí)間為180分鐘；數(shù)據(jù)記錄間隔：2.00min或0.0100wt％。所有吸附和解吸均在室溫(25℃)下進(jìn)行。未進(jìn)行預(yù)干燥步驟。

在濕度室中處理之后分析所制備的一些化合物。典型濕度室條件如下：

溫度：40℃；相對濕度：75％；時(shí)間：5天。

溫度：30℃；相對濕度：90％；時(shí)間：7天。

實(shí)施例1. 2-((2R,5S)-5-氨基四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈鹽酸鹽和2-((2S,5S)-5-氨基四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈鹽酸鹽(程序1)

步驟1.(S)-1,5-二羥基戊-2-基氨基甲酸叔丁酯

在室溫下，在配備頂置式機(jī)械攪拌器、熱電偶、回流冷凝器、加料漏斗和氮?dú)馊肟诘奈孱i5-L圓底燒瓶中置放硼氫化鋰(29.9g，1.37mol，2.0當(dāng)量)。將四氫呋喃(THF，1.12L)裝入燒瓶中，同時(shí)維持內(nèi)部溫度低于40℃。隨后將所得溶液冷卻至0℃至5℃，隨后經(jīng)多于50分鐘的時(shí)段經(jīng)由加料漏斗添加(S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)戊二酸二甲酯(189g，0.687mol)于THF(0.60L)中的溶液。使所得反應(yīng)混合物逐漸升溫至室溫且在室溫下攪拌17h，且隨后冷卻至15℃。隨后經(jīng)3h向反應(yīng)混合物中逐滴添加甲醇(MeOH，415mL)以淬滅殘余硼氫化鋰。在添加甲醇期間，觀察到劇烈氣體逸出。隨后在減壓下對經(jīng)淬滅的反應(yīng)混合物進(jìn)行濃縮以移除大部分溶劑，且用乙酸乙酯(EtOAc，350mL)和水(300mL)處理殘余物。在室溫下將所得懸浮液攪拌15分鐘，隨后經(jīng)由燒結(jié)漏斗進(jìn)行過濾。分離濾液的兩個(gè)相且用EtOAc(100mL)萃取水相。用鹽水(150mL)洗滌所合并的有機(jī)相，經(jīng)無水硫酸鈉干燥，且在減壓下濃縮，獲得呈白色固體狀的粗制(S)-1,5-二羥基戊-2-基氨基甲酸叔丁酯(135g，89.7％)，其不經(jīng)進(jìn)一步純化即用于隨后的反應(yīng)中。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ6.42(d,J＝8.5Hz,1H),4.52(t,J＝5.5Hz,1H),4.33(t,J＝5.1Hz,1H),3.42-3.21(m,4H),3.18(dt,J＝10.5,6.1Hz,1H),1.54-1.44(m,1H),1.41-1.28(m,11H),1.22-1.16(m,1H)ppm。

步驟2.(S)-4-(3-羥基丙基)-2,2-二甲基噁唑烷-3-甲酸叔丁酯

在室溫下，在配備頂置式機(jī)械攪拌器、熱電偶、加料漏斗和氮?dú)馊肟诘奈孱i5-L圓底燒瓶中置放(S)-1,5-二羥基戊-2-基氨基甲酸叔丁酯(105g，0.479mol)和丙酮(4.0L)。隨后在室溫下依序用2,2-二甲氧基丙烷(64.8g，0.622mol，1.3當(dāng)量)和三氟化硼乙醚合物(BF₃-Et₂O，6.1mL，0.048mol，0.10當(dāng)量)處理該溶液。在室溫下將所得反應(yīng)混合物攪拌18h，隨后添加三乙胺(TEA，40.0mL，0.287mol，0.60當(dāng)量)。隨后在減壓下濃縮所得混合物以移除大部分溶劑，且用EtOAc(1000mL)和水(200mL)處理殘余物。分離兩相且用鹽水(200mL)洗滌有機(jī)相，經(jīng)硫酸鈉干燥，且在減壓下濃縮。通過柱色譜法(SiO₂，用0至50％乙酸乙酯/己烷進(jìn)行梯度洗脫)純化殘余物，獲得呈無色油狀的(S)-4-(3-羥基丙基)-2,2-二甲基噁唑烷-3-甲酸叔丁酯(95.0g，76.5％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ4.39(t,J＝5.1Hz,1H),3.85(dd,J＝8.7,5.7Hz,1H),3.72(s,1H),3.66(dd,J＝8.8,1.3Hz,1H),3.42-3.32(m,2H),1.61-1.54(m,1H),1.51-1.24(m,18H)ppm。

步驟3.(S)-2,2-二甲基-4-(3-氧代丙基)噁唑烷-3-甲酸叔丁酯

在室溫下，在配備頂置式機(jī)械攪拌器、熱電偶、加料漏斗和氮?dú)馊肟诘奈孱i5-L圓底燒瓶中置放(S)-4-(3-羥基丙基)-2,2-二甲基噁唑烷-3-甲酸叔丁酯(110.0g，0.424mol)和二氯甲烷(DCM，1200mL)。隨后在室溫下用2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧基自由基(TEMPO，6.6g，0.042mol，0.10當(dāng)量)和四正丁基氯化銨(11.8g，0.042mol，0.10當(dāng)量)處理所得溶液，隨后在室溫下向反應(yīng)混合物中依序添加碳酸氫鈉水溶液(174g，2.08mol，5.0當(dāng)量)和碳酸鉀水溶液(28.7g，0.208mol，0.50當(dāng)量)。在劇烈攪拌所得混合物的同時(shí)，在室溫下添加N-氯丁二酰亞胺(69.1g，0.518mol，1.22當(dāng)量)。隨后在室溫下將所得反應(yīng)混合物再攪拌3h，隨后轉(zhuǎn)移至分離漏斗。分離濾液的兩相且用DCM(250mL)萃取水相。用鹽水(2×300mL)洗滌所合并的有機(jī)層，經(jīng)無水硫酸鈉干燥，在減壓下濃縮，且在真空下干燥，獲得呈淺橘色油狀的粗制(S)-2,2-二甲基-4-(3-氧代丙基)噁唑烷-3-甲酸叔丁酯(109.1g，100％)，其不經(jīng)進(jìn)一步純化即用于隨后的反應(yīng)中。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ9.64(s,1H),4.01-3.60(m,3H),2.39(dd,J＝10.9,4.0Hz,2H),1.84-1.64(m,2H),1.47-1.38(m,15H)ppm。

步驟4.(S)-4-(4-氰基丁-3-烯基)-2,2-二甲基噁唑烷-3-甲酸叔丁酯

在室溫下，在氮?dú)夥諊?，在配備頂置式機(jī)械攪拌器、熱電偶和加料漏斗的三頸3-L圓底燒瓶中置放叔丁醇鉀(1M THF溶液，1000mL，1.00mol，1.11當(dāng)量)和四氫呋喃(THF，700mL)。將溶液冷卻至0℃至5℃，且經(jīng)由加料漏斗逐滴添加氰基甲基膦酸二乙酯(177.2g，1.00mol，1.11當(dāng)量)，同時(shí)維持內(nèi)部溫度在10℃以下。隨后在室溫下將所得反應(yīng)混合物攪拌2h，且標(biāo)記為溶液A以供用于隨后的反應(yīng)。在室溫下，在配備頂置式機(jī)械攪拌器、熱電偶、加料漏斗和氮?dú)馊肟诘膯为?dú)五頸12-L圓底燒瓶中置放(S)-2,2-二甲基-4-(3-氧代丙基)噁唑烷-3-甲酸叔丁酯(232.0g，0.901mol)和THF(3500mL)。將所得溶液冷卻至0℃至5℃，且標(biāo)記為溶液B。隨后將溶液A逐滴添加至溶液B中，同時(shí)維持內(nèi)部溫度在5℃以下。使所得反應(yīng)混合物逐漸升溫至室溫且在室溫下攪拌1h。向反應(yīng)混合物中加入水(500mL)且分離兩相。隨后用EtOAc(2×100mL)萃取水相。用鹽水(2×100mL)洗滌所合并的有機(jī)相，經(jīng)無水硫酸鎂干燥，且在減壓下濃縮。通過柱色譜法(SiO₂，用0至30％乙酸乙酯/己烷進(jìn)行梯度洗脫)純化殘余物，獲得呈無色油狀的(S)-4-(4-氰基丁-3-烯基)-2,2-二甲基噁唑烷-3-甲酸叔丁酯(179.0g，70.8％)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ6.84(dt,J＝16.4,6.8Hz,0.5H),6.66(dt,J＝10.9,7.7Hz,0.5H),5.83-5.51(m,1H),3.92-3.49(m,3H),2.35-2.05(m,2H),1.73-1.52(m,2H),1.45-1.38(m,15H)。

步驟5.(S)-6-氰基-1-羥基己-5-烯-2-基氨基甲酸叔丁酯

在室溫下，在配備頂置式機(jī)械攪拌器、熱電偶、加料漏斗和氮?dú)馊肟诘奈孱i5-L圓底燒瓶中置放(S)-4-(4-氰基丁-3-烯基)-2,2-二甲基噁唑烷-3-甲酸叔丁酯(179.0g，0.638mol)和甲醇(2000mL)。將所得無色溶液冷卻至0℃至5℃，隨后用催化量的對甲苯磺酸(PTSA，12.1g，0.064mol，0.10當(dāng)量)進(jìn)行處理。使所得反應(yīng)混合物逐漸升溫至室溫且在室溫下再攪拌17h。隨后在室溫下向反應(yīng)混合物中添加碳酸氫鈉水溶液(100mL)，且在減壓下將所得混合物濃縮至約500mL。隨后用乙酸乙酯(2×500mL)萃取殘余物。用鹽水(2×100mL)洗滌所合并的有機(jī)相，經(jīng)無水硫酸鎂干燥，在減壓下濃縮，且在真空下干燥，獲得呈淡粉色油狀的粗制(S)-6-氰基-1-羥基己-5-烯-2-基氨基甲酸叔丁酯(144.2g，94％)，其不經(jīng)進(jìn)一步純化即用于隨后的反應(yīng)中。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ6.72(dt,J＝16.3,6.9Hz,0.5H),6.53(dt,J＝10.9,7.6Hz,0.5H),5.51-5.08(m,1H),4.73(s,1H),3.83-3.34(m,3H),2.49(dt,J＝11.3,5.9Hz,1H),2.31(q,J＝7.0Hz,1H),1.74-1.57(m,3H),1.44(s,9H)。

步驟6.(S)-6-(氰基甲基)四氫-2H-吡喃-3-基氨基甲酸叔丁酯(順式異構(gòu)體與反式異構(gòu)體的混合物)

在室溫下，在配備頂置式機(jī)械攪拌器、熱電偶、加料漏斗和氮?dú)馊肟诘奈孱i5-L圓底燒瓶中置放(S)-6-氰基-1-羥基己-5-烯-2-基氨基甲酸叔丁酯(173.0g，0.720mol)和四氫呋喃(1700mL)。將溶液冷卻至0℃至5℃，隨后經(jīng)由加料漏斗逐滴添加甲醇鈉(0.5M甲醇溶液，21.30mL，0.011mol，0.015當(dāng)量)于THF(90mL)中的溶液，同時(shí)維持內(nèi)部溫度在5℃以下。在5℃以下將所得反應(yīng)混合物再攪拌1h，隨后依序向反應(yīng)混合物中添加鹽水(500mL)和叔丁基甲醚(TBME，400mL)。分離兩相且用TBME(250mL)萃取水相。用鹽水(250mL)洗滌所合并的有機(jī)相，經(jīng)無水硫酸鎂干燥，在減壓下濃縮，且在真空下干燥，獲得呈粘度固體狀的粗制(S)-6-(氰基甲基)四氫-2H-吡喃-3-基氨基甲酸叔丁酯(173.0g，100％)。所獲得的呈順式異構(gòu)體與反式異構(gòu)體的混合物形式的粗產(chǎn)物不經(jīng)進(jìn)一步純化即用于隨后的反應(yīng)中。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ5.13(s,0.5H),4.25(s,0.5H),4.10(ddd,J＝10.9,4.7,2.2Hz,0.5H),3.89(d,J＝12.1Hz,0.5H),3.72(s,0.5H),3.66-3.57(m,1.5H),3.56-3.49(m,0.5H),3.03(t,J＝10.8Hz,0.5H),2.54(dd,J＝6.0,2.5Hz,2H),2.19-2.08(m,0.5H),2.00(d,J＝13.2Hz,0.5H),1.87(d,J＝13.1Hz,0.5H),1.65-1.62(m,2H),1.44(d,J＝6.5Hz,9H),1.38-1.24(m,0.5H)。

步驟7. 2-((2R,5S)-5-氨基四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈鹽酸鹽和2-((2S,5S)-5-氨基四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈鹽酸鹽(反式異構(gòu)體與順式異構(gòu)體的混合物)

在室溫下，在配備頂置式機(jī)械攪拌器、熱電偶、加料漏斗和氮?dú)馊肟诘奈孱i5-L圓底燒瓶中置放(S)-6-(氰基甲基)四氫-2H-吡喃-3-基氨基甲酸叔丁酯(順式異構(gòu)體與反式異構(gòu)體的混合物，173.0g，0.720mol)和二氯甲烷(1730mL)。隨后經(jīng)由加料漏斗用4.0M氯化氫(HCl)于1,4-二噁烷中的溶液(720mL，2.880mol，4.0當(dāng)量)處理所得溶液。在室溫下將所得反應(yīng)混合物攪拌2h，隨后添加叔丁基甲醚(TBME，1000mL)。在室溫下將所得懸浮液攪拌30分鐘。通過過濾收集所形成的白色固體，用TBME(280mL)洗滌且在真空烘箱中在50℃下利用氮?dú)獯祾哌M(jìn)行干燥，獲得呈反式異構(gòu)體與順式異構(gòu)體的混合物形式的2-((2R,5S)-5-氨基四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈鹽酸鹽和2-((2S,5S)-5-氨基四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈鹽酸鹽(114.0g，89.6％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.31(s,3H),4.03(ddd,J＝10.8,4.5,2.2Hz,0.5H),3.92(d,J＝12.6Hz,0.5H),3.71-3.58(m,1H),3.51(ddp,J＝8.8,4.4,2.1Hz,0.5H),3.36(s,0.5H),3.25(s,0.5H),3.04(s,0.5H),2.87-2.56(m,2H),2.08(d,J＝12.7Hz,0.5H),1.98-1.72(m,1.5H),1.70-1.46(m,1.5H),1.36(qd,J＝13.2,3.9Hz,0.5H)ppm；¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ118.48(118.33),72.52(72.07),67.75(67.56),45.53(44.36),28.59(24.33),26.78(24.06),23.42(23.14)ppm；對于C₇H₁₂N₂O，LCMS計(jì)算值:140.2(游離胺),實(shí)測值:141(M⁺+H)；鹽比率(HCl對游離胺):1.00。

實(shí)施例2. 2-((2R,5S)-5-氨基四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈鹽酸鹽和2-((2S,5S)-5-氨基四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈鹽酸鹽(程序2)

步驟1.(4S)-4-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5-羥基戊酸甲酯

在室溫下用4-甲基嗎啉(17g，168.1mmol，1.1當(dāng)量)處理(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5-甲氧基-5-氧代戊酸(40.00g，153.1mmol)于四氫呋喃(600mL)中的溶液。將所得混合物冷卻至0℃，隨后用氯甲酸乙酯(18g，165.9mmol，1.08當(dāng)量)逐滴處理。在0℃下將所得反應(yīng)混合物再攪拌20分鐘，隨后經(jīng)硅藻土進(jìn)行過濾。用THF(50mL)洗滌硅藻土床，且將澄清濾液溶液冷卻至0℃。隨后用固體NaBH₄(3.00g，79.3mmol，0.52當(dāng)量)和NaBH₄(2.9g，76.1mmol，0.50當(dāng)量)于二甘醇二甲醚(40mL)中的溶液來處理經(jīng)冷卻的溶液。在室溫下將所得反應(yīng)混合物攪拌3h，隨后用1.0M HCl水溶液(100mL)處理。隨后在室溫下將混合物攪拌10分鐘。濾出無機(jī)固體且用EtOAc(100mL)沖洗。隨后將乙酸乙酯(1100mL)添加至濾液中，且在減壓下濃縮所合并的濾液溶液以移除溶劑(1200mL)。隨后用飽和碳酸氫鈉水溶液(50mL)和水(2×50mL)洗滌剩余混合物。隨后在減壓下濃縮有機(jī)相，獲得粗制(4S)-4-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5-羥基戊酸甲酯(37.9g)，其不經(jīng)進(jìn)一步純化即用于隨后的反應(yīng)中。

步驟2.(S)-(6-氧代四氫-2H-吡喃-3-基)氨基甲酸叔丁酯

將粗制(4S)-4-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5-羥基戊酸甲酯(37.9g，153.1mmol)于甲苯(600mL)和乙酸(200mL)中的溶液加熱至回流后維持60分鐘。隨后通過在大氣壓下共沸蒸餾來移除溶劑。在共沸蒸餾期間，引入附加量的甲苯(600mL)且移除總計(jì)1200mL混合溶劑。隨后經(jīng)3h將殘余混合物冷卻至室溫且在室溫下攪拌2h。通過過濾收集固體，用正庚烷(100mL)洗滌，且在減壓下在40℃以下干燥，獲得所要[(3S)-6-氧代四氫-2H-吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯(25g，兩個(gè)步驟的總產(chǎn)率75％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.39(dd,J＝11.5,5.4Hz,1H),4.18(dd,J＝11.4,4Hz,1H),4.00(s,1H),2.69-2.54(m,2H),2.22(dq,J＝13.2,6.6Hz,1H),1.86(dq,J＝14.6,7.3Hz,1H),1.43(s,9H)；對于C₁₀H₁₇NO₄，GCMS計(jì)算值:215.25；實(shí)測值:215.1。

步驟3.[(3S,6Z)-6-(氰基亞甲基)四氫-2H-吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯和[(3S,6E)-6-(氰基亞甲基)四氫-2H-吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯

方法A.

對氰基甲基(三甲基)氯化鏻(8.8g，58.06mmol，1.25當(dāng)量)于N,N-二甲基乙酰胺(DMAC，50ml)中的溶液進(jìn)行脫氣且冷卻至0℃。隨后在0℃下用1.0M六甲基二硅疊氮化鋰的THF溶液(LHMDS，53.4mL，53.4mmol，1.15當(dāng)量)處理經(jīng)冷卻的溶液。在0℃下將所得混合物攪拌60分鐘，隨后在0℃下用[(3S)-6-氧代四氫-2H-吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯(10g，46.46mmol)于THF(40mL)中的溶液處理。在0℃下將反應(yīng)混合物攪拌2h，隨后在室溫下攪拌隔夜。隨后用水(100mL)淬滅反應(yīng)混合物且分離兩相。用叔丁基甲醚(TBME，2×150mL)萃取水相。用水(2×150mL)洗滌所合并的有機(jī)相，隨后在減壓下濃縮，獲得呈[(3S,6Z)-6-(氰基亞甲基)四氫-2H-吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯與[(3S,6E)-6-(氰基亞甲基)四氫-2H-吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯的混合物形式的粗制所要產(chǎn)物(11g，99％)，其不經(jīng)進(jìn)一步純化和分離即用于隨后的反應(yīng)中。通過硅膠柱色譜法(SiO₂，用0至30％叔丁基甲醚(MTBE)/庚烷進(jìn)行梯度洗脫)獲得個(gè)別異構(gòu)體的分析樣品。

對于(3S,6E)-異構(gòu)體：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.82(s,1H),4.67(s,1H).4.12(dd,1H),3.93(m,1H),3.81(dd,1H),2.79(dt,1H),2.58(m,1H),2.12(dt,1H),1.69(dt,1H),1.40(s,9H)；對于C₁₂H₁₈N₂O₃，GCMS計(jì)算值:238.28；實(shí)測值:238.1。

對于(3S,6Z)-異構(gòu)體：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.81(s,1H),4.48(s,1H),4.19(dt,1H),3.95(m,2H).2.48(m,2H),2.09(m,1H),1.58(m,1H),1.40(s,9H)；對于C₁₂H₁₈N₂O₃，GCMS計(jì)算值:238.28；實(shí)測值:238.1。

方法B.

在0℃下經(jīng)5分鐘用固體叔丁醇鉀(220g，1.97mol)逐份處理三丁基(氰基甲基)氯化鏻(593g，2.14mol)于THF(5.9L)中的混合物。經(jīng)4h使所得混合物逐漸升溫至室溫。隨后在室溫下用呈固體狀的(S)-(6-氧代四氫-2H-吡喃-3-基)氨基甲酸叔丁酯(184g，0.855mol)處理所得內(nèi)鎓鹽溶液，且在70℃下加熱所得反應(yīng)混合物并且在70℃下攪拌16h。當(dāng)NMR分析指示起始物質(zhì)耗盡時(shí)，將反應(yīng)混合物逐漸冷卻至室溫。將所得漿液傾入含有飽和碳酸氫鈉水溶液(5L)和冰(1000g)的50-L分離漏斗中。添加乙酸乙酯(6L)且將混合物攪拌10分鐘。分離兩層且用EtOAc(3L)萃取水層。用飽和氯化鈉水溶液(3×4L)洗滌所合并的有機(jī)層，經(jīng)硫酸鈉干燥，且在減壓下濃縮。將所得深色油溶解于DCM(500mL)中且通過柱色譜法(SiO₂，用20％至40％乙酸乙酯/庚烷進(jìn)行梯度洗脫)加以純化，獲得呈[(3S,6Z)-6-(氰基亞甲基)四氫-2H-吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯與[(3S,6E)-6-(氰基亞甲基)四氫-2H-吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯的混合物形式的所要產(chǎn)物(177g，產(chǎn)率87％)，其不經(jīng)進(jìn)一步純化和分離即用于隨后的反應(yīng)中。通過硅膠柱色譜法(SiO₂，用0至30％叔丁基甲醚(TBME)/庚烷進(jìn)行梯度洗脫)獲得兩種異構(gòu)體的分析樣品。

對于(3S,6E)-異構(gòu)體：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.82(s,1H),4.67(s,1H).4.12(dd,1H),3.93(m,1H),3.81(dd,1H),2.79(dt,1H),2.58(m,1H),2.12(dt,1H),1.69(dt,1H),1.40(s,9H)；對于C₁₂H₁₈N₂O₃，GCMS計(jì)算值:238.28；實(shí)測值:238.1。

對于(3S,6Z)-異構(gòu)體：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.81(s,1H),4.48(s,1H),4.19(dt,1H),3.95(m,2H),2.48(m,2H),2.09(m,1H),1.58(m,1H),1.40(s,9H)；對于C₁₂H₁₈N₂O₃，GCMS計(jì)算值:238.28；實(shí)測值:238.1。

步驟4.[(3S,6S)-6-(氰基甲基)四氫-2H-吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯和[(3S,6R)-6-(氰基甲基)四氫-2H-吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯

在20psi下對[(3S,6Z)-6-(氰基亞甲基)四氫-2H-吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯和[(3S,6E)-6-(氰基亞甲基)四氫-2H-吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯(110g，0.462mol)和鈀/碳(10wt％Pd-C,50％濕潤，14g)于甲醇(1.1L)中的混合物進(jìn)行氫化，直至氫氣吸收停止(4至12h)。使反應(yīng)混合物經(jīng)硅藻土(100g)進(jìn)行過濾，且用甲醇(500mL)洗滌硅藻土床。在減壓下濃縮所合并的濾液，獲得呈灰白色固體狀的粗還原產(chǎn)物。通過與甲苯(2×500mL)和正庚烷(2×500mL)一起在減壓下進(jìn)行共沸蒸餾來進(jìn)一步干燥粗產(chǎn)物，以移除殘余甲醇和水，獲得呈非對映異構(gòu)體混合物形式的[(3S,6S)-6-(氰基甲基)四氫-2H-吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯和[(3S,6R)-6-(氰基甲基)四氫-2H-吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯(111g，幾乎為定量產(chǎn)率)，其不經(jīng)進(jìn)一步純化和分離即直接用于隨后的反應(yīng)中。¹H NMR(300MHz,CDCl₃,呈兩種非對映異構(gòu)體的混合物形式)δ5.15(br s,1H),4.29(br s,1H),4.14-4.07(m,1H),3.94-3.87(m,1H),3.77-3.44(m,5H),3.09-3.01(m,1H),2.58-2.49(m,4H),2.18-2.09(m,1H),2.05-1.95(m,1H),1.92-1.81(m,1H),1.76-1.51(m,5H),1.46(s,9H),1.44(s,9H)；對于C₁₂H₂₀N₂O₃，GCMS計(jì)算值:240.30；實(shí)測值:240.1。

步驟5. 2-((2S,5S)-5-氨基四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈鹽酸鹽和2-((2R,5S)-5-氨基四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈鹽酸鹽

經(jīng)30分鐘用4M HCl于1,4-二噁烷中的溶液(1L，3.99mol，4.0當(dāng)量)逐滴處理[(3S,6S)-6-(氰基甲基)四氫-2H-吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯和[(3S,6R)-6-(氰基甲基)四氫-2H-吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯(240g，0.999mol)于二氯甲烷(2.44L)中的溶液，同時(shí)將內(nèi)部溫度保持在25℃以下。在室溫下將所得反應(yīng)混合物攪拌3h。當(dāng)經(jīng)過濾樣品的¹H NMR分析指示反應(yīng)完畢時(shí)，向反應(yīng)混合物中添加叔丁基甲醚(TBME，675mL)且在室溫下將所得混合物攪拌30分鐘。通過在氮?dú)鈱酉逻^濾來收集所形成的白色固體，用TBME(600mL)洗滌且在真空烘箱中在氮?dú)鈱酉逻M(jìn)一步干燥16h，獲得呈順式異構(gòu)體與反式異構(gòu)體的混合物形式的2-((2S,5S)-5-氨基四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈鹽酸鹽和2-((2R,5S)-5-氨基四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈鹽酸鹽(151.7g，產(chǎn)率86％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)(順式異構(gòu)體與反式異構(gòu)體的混合物)δ8.31(s,3H),4.03(ddd,J＝10.8,4.5,2.2Hz,0.5H),3.92(d,J＝12.6Hz,0.5H),3.71-3.58(m,1H),3.51(ddp,J＝8.8,4.4,2.1Hz,0.5H),3.36(s,0.5H),3.25(s,0.5H),3.04(s,0.5H),2.87-2.56(m,2H),2.08(d,J＝12.7Hz,0.5H),1.98-1.72(m,1.5H),1.70-1.46(m,1.5H),1.36(qd,J＝13.2,3.9Hz,0.5H)ppm；¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ118.48(118.33),72.52(72.07),67.75(67.56),45.53(44.36),28.59(24.33),26.78(24.06),23.42(23.14)ppm；對于C₇H₁₂N₂O，LCMS計(jì)算值:140.2(游離胺),實(shí)測值:141(M⁺+H)；鹽比率(HCl對游離胺):1.00。

實(shí)施例3. 2-((2R,5S)-5-(6-硝基噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基氨基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈和2-((2S,5S)-5-(6-硝基噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基氨基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈

在室溫下用二異丙基乙胺(DIPEA，4897g，46.13mol，3.84當(dāng)量)處理2-((2S,5S)-5-氨基四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈鹽酸鹽和2-((2R,5S)-5-氨基四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈鹽酸鹽(2464g，13.95mol，1.16當(dāng)量)和7-氯-6-硝基噻吩并[3,2-b]吡啶(2581g，12.02mol)于N,N-二甲基甲酰胺(DMF，12.3L)中的混合物。將所得反應(yīng)混合物加熱至65℃至75℃后維持2至6h，直至HPLC顯示反應(yīng)完畢。在55℃以上向反應(yīng)混合物中添加水(36.9L)以使粗所要產(chǎn)物沉淀，且使所得混合物逐漸冷卻至15℃至30℃，并且在15℃至30℃下攪拌1至2h。通過過濾收集黃色固體，用水(36.9L)和正庚烷(30.8L)洗滌，且在真空烘箱中在45℃至50℃下干燥至恒定重量，獲得呈2-((2R,5S)-5-(6-硝基噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基氨基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈與2-((2S,5S)-5-(6-硝基噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基氨基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈的混合物形式的粗所要產(chǎn)物(3550g，92.8％)，其不經(jīng)進(jìn)一步純化和分離即用于隨后的反應(yīng)中。通過柱色譜法分離(SiO₂，用0至50％乙酸乙酯/庚烷進(jìn)行梯度洗脫)獲得順式異構(gòu)體和反式異構(gòu)體的分析樣品。

對于(2R,5S)-異構(gòu)體：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.09(s,1H),8.87(d,J＝9.1Hz,1H),8.35(d,J＝5.5Hz,1H),7.53(d,J＝5.5Hz,1H),4.32(ddq,J＝14.4,10.1,4.3Hz,1H),4.17(ddd,J＝10.9,4.5,2.2Hz,1H),3.66(ddd,J＝9.2,6.8,4.5Hz,1H),3.52(t,J＝10.6Hz,1H),2.85(dd,J＝17.0,4.4Hz,1H),2.76(dd,J＝17.0,6.8Hz,1H),2.28-2.23(m,1H),191-1.81(m,2H),1.61-1.43(m,1H)ppm；¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ159.30,147.11,145.78,136.17,125.59,125.47,118.47,116.54,71.79,70.18,50.25,29.95,29.18,23.14ppm；C₁₄H₁₄N₄O₃S(MW 318.3),LCMS(EI)m/e 319(M⁺+H)。

對于(2S,5S)-異構(gòu)體：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.69(d,J＝8.5Hz,1H),9.14(s,1H),8.37(d,J＝5.5Hz,1H),7.54(d,J＝5.5Hz,1H),4.49(d,J＝8.6Hz,1H),4.03(d,J＝11.9Hz,1H),3.89(d,J＝10.4Hz,1H),3.75(dd,J＝7.1,3.6Hz,1H),2.84(dd,J＝17.1,4.3Hz,1H),2.71(dd,J＝17.1,7.0Hz,1H),2.07-2.04(m,2H),1.75-1.40(m,2H)ppm；¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ159.15,147.26,145.49,136.22,125.56,125.28,118.16,116.77,72.53,70.31,47.99,27.84,25.08,23.65ppm；C₁₄H₁₄N₄O₃S(MW 318.3),LCMS(EI)m/e 319(M⁺+H)。

實(shí)施例4. 2-((2R,5S)-5-(6-氨基噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基氨基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈和2-((2S,5S)-5-(6-氨基噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基氨基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈

在室溫下用鈀/碳(10wt％Pd-C，50％濕潤，200g)處理2-((2R,5S)-5-(6-硝基噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基氨基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈和2-((2S,5S)-5-(6-硝基噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基氨基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈(2000g，6.28mol)于2,2,2-三氟乙醇(8.1L)中的溶液。對所得反應(yīng)混合物進(jìn)行脫氣，且用氮?dú)庠偬畛淙?，隨后用氫氣再填充三次。氫化反應(yīng)在20℃至35℃與50psi氫氣壓力下進(jìn)行。當(dāng)HPLC顯示反應(yīng)完畢時(shí)，將壓力降至大氣壓，隨后進(jìn)行脫氣且用氮?dú)庠偬畛淙巍ｋS后使混合物經(jīng)硅藻土(667g)進(jìn)行過濾，且用甲醇(8L)沖洗硅藻土床。隨后在50℃以下在減壓下濃縮濾液，獲得呈2-((2R,5S)-5-(6-氨基噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基氨基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈與2-((2S,5S)-5-(6-氨基噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基氨基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈的混合物形式的所要粗產(chǎn)物(2242g)。此混合物是呈含有殘余溶劑的發(fā)泡體形式獲得，不可在硅膠柱上分離且不經(jīng)進(jìn)一步純化即用于隨后的反應(yīng)中。

對于(2R,5S)-異構(gòu)體：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.93(s,1H),7.55(d,J＝5.6Hz,1H),7.20(d,J＝5.6Hz,1H),4.91(d,J＝9.7Hz,1H),4.82(s,2H),4.06-3.77(m,2H),3.55(dtt,J＝8.7,4.5,2.1Hz,1H),3.24(t,J＝10.3Hz,1H),2.92-2.62(m,2H),2.20-1.97(m,1H),1.88-1.70(m,1H),1.66-1.51(m,1H),1.50-1.37(m,1H)ppm；¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ150.28,136.88,134.86,128.10,124.86,124.82,118.55,117.95,72.14,71.70,49.30,30.79,29.74,23.32ppm；C₁₄H₁₆N₄OS(MW 288.3),LCMS(EI)m/e 289(M⁺+H)。

對于(2S,5S)-異構(gòu)體：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.01(s,1H),7.59(d,J＝5.5Hz,1H),7.22(d,J＝5.5Hz,1H),5.09(d,J＝9.6Hz,1H),4.76(s,2H),3.99(d,J＝9.6Hz,1H),3.87(d,J＝11.7Hz,1H),3.75(dd,J＝11.7,2.2Hz,1H),3.66(dddd,J＝10.3,7.2,4.4,2.6Hz,1H),2.85-2.62(m,2H),1.86-1.69(m,2H),1.63(qd,J＝12.7,12.2,4.4Hz,1H),1.52-1.44(m,1H)ppm；¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ150.81,137.91,135.84,128.17,125.36,124.83,118.71,118.61,72.37,70.23,46.81,27.08,24.94,23.44ppm；C₁₄H₁₆N₄OS(MW 288.3),LCMS(EI)m/e 289(M⁺+H)。

實(shí)施例5. 2-((2R,5S)-5-(2-((R)-1-羥基乙基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈和2-((2S,5S)-5-(2-((R)-1-羥基乙基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈

在反應(yīng)器A中，在-10℃至0℃下用Et₃O-BF₄(4405g，22.96mol，3.0當(dāng)量)處理(R)-(+)-乳酰胺的懸浮液(2045g，22.96mol，3.0當(dāng)量)于THF(10.1L)中的懸浮液。隨后在10℃以下攪拌反應(yīng)器A中的所得混合物，直至形成澄清溶液。在反應(yīng)器B中，將2-((2R,5S)-5-(6-氨基噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基氨基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈與2-((2S,5S)-5-(6-氨基噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基氨基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈(2207g，7.65mol)于乙醇(66.2L)中的混合物加熱至回流，以獲得澄清溶液。隨后將反應(yīng)器A中的溶液逐漸添加至反應(yīng)器B中的混合物中，同時(shí)將反應(yīng)器B中的混合物維持在回流下。將反應(yīng)器B中的所得反應(yīng)混合物維持在回流下，直至HPLC顯示反應(yīng)完畢。隨后使反應(yīng)器B中的反應(yīng)混合物冷卻至10℃至30℃，隨后逐漸添加碳酸氫鈉水溶液(664g，7.4L)。在添加碳酸氫鈉水溶液以調(diào)節(jié)至pH 8-9期間，將內(nèi)部溫度控制在35℃以下。隨后在室溫下將所得混合物再攪拌30分鐘，隨后經(jīng)硅藻土(1kg)進(jìn)行過濾。在過濾之后，用乙醇(5.0L)沖洗硅藻土床。在減壓下在60℃以下濃縮所合并的濾液，且添加二氯甲烷(17.7L)以溶解殘余物。隨后用1N HCl水溶液(19.0L)處理所得DCM溶液，以便將水相調(diào)節(jié)至pH 1。隨后在室溫下將混合物攪拌30分鐘。分離兩相且丟棄DCM相。隨后用DCM(8.6L)洗滌酸性水相。分離兩相且丟棄DCM相。隨后依序用乙酸乙酯(30.6L)和固體碳酸鈉(540g)處理酸性水相。在室溫下攪拌所得混合物，直至水相達(dá)到pH 9-10。隨后將正庚烷(60.0L)添加至混合物中，且在室溫下將所得混合物攪拌至少1h。通過過濾收集固體且用水(8.6L)和正庚烷(8.6L)洗滌，隨后溶解于甲醇與DCM的混合物中。隨后使所得MeOH與DCM溶液經(jīng)硅膠床進(jìn)行過濾，且用MeOH與DCM混合物(以體積計(jì)1:9)洗滌硅膠床。在減壓下濃縮所合并的溶液，獲得呈白色發(fā)泡體狀的第一批所要產(chǎn)物(1450g)，即2-((2R,5S)-5-(2-((R)-1-羥基乙基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈與2-((2S,5S)-5-(2-((R)-1-羥基乙基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈的混合物。隨后分離濾液的兩相且用DCM(2×25.0L)萃取水相。在減壓下濃縮所合并的有機(jī)萃取物，且通過硅膠柱色譜法(SiO₂，用0.5％至7.5％MeOH/DCM進(jìn)行梯度洗脫)，獲得呈白色發(fā)泡體狀的第二批所要產(chǎn)物(515g；總計(jì)1965g，75％)，還呈2-((2R,5S)-5-(2-((R)-1-羥基乙基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈與2-((2S,5S)-5-(2-((R)-1-羥基乙基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈的混合物形式。兩種非對映異構(gòu)體的混合物不可通過硅膠柱色譜法加以分離，且不經(jīng)進(jìn)一步分離即用于隨后的反應(yīng)中。

對于(2R,5S)-異構(gòu)體：¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ9.00(s,1H),8.03(d,J＝5.5Hz,1H),7.69(d,J＝5.5Hz,1H),5.96(s,1H),5.22(s,1H),5.11(s,1H),4.31(t,J＝11.0Hz,1H),4.22-4.08(m,1H),4.02(s,1H),2.96(dd,J＝17.0,4.2Hz,1H),2.84(dd,J＝17.0,6.6Hz,1H),2.65(qd,J＝12.7,4.3Hz,1H),2.19(d,J＝10.0Hz,1H),2.06(d,J＝13.4Hz,1H),1.72(dd,J＝12.6,3.7Hz,1H),1.66(d,J＝6.5Hz,3H)ppm；¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ157.95,152.11,141.57,136.18,135.24,127.98,126.79,119.08,116.12,72.42,68.87,62.95,51.67,30.39,28.44,24.09,22.36ppm；C₁₇H₁₈N₄O₂S(MW 342.4),LCMS(EI)m/e 343(M⁺+H)。

對于(2S,5S)-異構(gòu)體：¹H NMR(400MHz,CD₃CN)δ8.93(s,1H),7.80(d,J＝5.5Hz,1H),7.63(d,J＝5.5Hz,1H),5.38(s,1H),5.00(dq,J＝9.4,4.7Hz,1H),4.43(dd,J＝11.8,9.3Hz,1H),4.26(dd,J＝8.6,3.7Hz,1H),4.16(s,1H),4.03-3.89(m,1H),3.17(dd,J＝17.1,8.6Hz,1H),2.87(dd,J＝17.2,5.4Hz,1H),2.57(dtd,J＝14.8,10.8,4.2Hz,1H),2.20-1.99(m,2H),1.88-1.82(m,1H),1.73(d,J＝6.4Hz,3H)ppm；¹³C NMR(101MHz,CD₃CN)δ158.04,152.88,142.12,136.81,136.46,127.44,127.14,119.04,116.97,70.00,64.83,64.03,54.55,28.06,25.73,22.46,21.94ppm；C₁₇H₁₈N₄O₂S(MW 342.4),LCMS(EI)m/e 343(M⁺+H)。

實(shí)施例6. 2-((2R,5S)-5-(2-((R)-1-羥基乙基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈一水合物(粗產(chǎn)物)

在室溫下用1.0M叔丁醇鉀的THF溶液(234mL，0.234mol，0.10當(dāng)量)處理2-((2R,5S)-5-(2-((R)-1-羥基乙基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈與2-((2S,5S)-5-(2-((R)-1-羥基乙基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈(800g，2.34mol)于2-丙醇(IPA，16L)中的混合物。在室溫下將所得反應(yīng)混合物攪拌20h。當(dāng)HPLC顯示堿促進(jìn)的外消旋反應(yīng)完畢時(shí)，用0.1M HCl水溶液(約2.4L)處理反應(yīng)混合物以調(diào)節(jié)至pH 6-7。隨后在減壓下在50℃以下濃縮混合物，以部分移除IPA(約9.6L)，且在室溫下用水(10.5L)處理殘余物。隨后在室溫下將所得混合物攪拌2h。通過過濾收集固體，用IPA與水的混合物(2.4L，以體積計(jì)1:2)洗滌，且在減壓下在50℃以下干燥至恒定重量，獲得呈白色固體狀的粗制2-((2R,5S)-5-(2-((R)-1-羥基乙基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈一水合物(657g，78％)。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ9.00(s,1H),8.03(d,J＝5.5Hz,1H),7.69(d,J＝5.5Hz,1H),5.96(s,1H),5.22(s,1H),5.11(s,1H),4.31(t,J＝11.0Hz,1H),4.22-4.08(m,1H),4.02(s,1H),2.96(dd,J＝17.0,4.2Hz,1H),2.84(dd,J＝17.0,6.6Hz,1H),2.65(qd,J＝12.7,4.3Hz,1H),2.19(d,J＝10.0Hz,1H),2.06(d,J＝13.4Hz,1H),1.72(dd,J＝12.6,3.7Hz,1H),1.66(d,J＝6.5Hz,3H)ppm；¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ157.95,152.11,141.57,136.18,135.24,127.98,126.79,119.08,116.12,72.42,68.87,62.95,51.67,30.39,28.44,24.09,22.36ppm；C₁₇H₁₈N₄O₂S(MW342.4),LCMS(EI)m/e 343(M⁺+H)；水含量(通過KF):5.15％。

實(shí)施例7. 2-((2R,5S)-5-(2-((R)-1-羥基乙基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈(無水結(jié)晶游離堿)

對2-((2R,5S)-5-(2-((R)-1-羥基乙基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈一水合物(650g，1.80mol)于甲醇(7L)中的溶液進(jìn)行精過濾，隨后在大氣壓下濃縮以移除甲醇(5L)。隨后用乙酸乙酯(8.5L)處理所得經(jīng)濃縮的溶液，且繼續(xù)進(jìn)行大氣壓蒸餾以移除溶劑(5.3L)。隨后在60℃至75℃下將正庚烷(7.8L)逐漸添加至殘余混合物中，并且使所得混合物逐漸冷卻降至室溫且在室溫下攪拌至少1.5h。通過過濾收集固體，用正庚烷(2.0L)洗滌，且在真空中在50℃以下干燥至恒定重量，獲得呈白色固體狀的無水結(jié)晶2-((2R,5S)-5-(2-((R)-1-羥基乙基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈(586g，95％)。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ9.00(s,1H),8.03(d,J＝5.5Hz,1H),7.69(d,J＝5.5Hz,1H),5.96(s,1H),5.22(s,1H),5.11(s,1H),4.31(t,J＝11.0Hz,1H),4.22-4.08(m,1H),4.02(s,1H),2.96(dd,J＝17.0,4.2Hz,1H),2.84(dd,J＝17.0,6.6Hz,1H),2.65(qd,J＝12.7,4.3Hz,1H),2.19(d,J＝10.0Hz,1H),2.06(d,J＝13.4Hz,1H),1.72(dd,J＝12.6,3.7Hz,1H),1.66(d,J＝6.5Hz,3H)ppm；¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ157.95,152.11,141.57,136.18,135.24,127.98,126.79,119.08,116.12,72.42,68.87,62.95,51.67,30.39,28.44,24.09,22.36ppm；C₁₇H₁₈N₄O₂S(MW342.4),LCMS(EI)m/e 343(M⁺+H)。

實(shí)施例8. 2-((2R,5S)-5-(2-((R)-1-羥基乙基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈一水合物

在室溫下將無水結(jié)晶2-((2R,5S)-5-(2-((R)-1-羥基乙基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈(585g，1.71mol)于水(5.9L)中的懸浮液攪拌2h。當(dāng)XRPD證實(shí)無水結(jié)晶形式完全轉(zhuǎn)化成一水合物結(jié)晶形式時(shí)，通過過濾收集固體且用水(2.9L)洗滌。在20℃至50℃下在真空烘箱中或通過從過濾器抽真空來干燥濕濾餅，直至通過KF所分析的水含量為5±0.3％，獲得呈白色固體狀的結(jié)晶2-((2R,5S)-5-(2-((R)-1-羥基乙基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈一水合物(602g，98％)。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ9.00(s,1H),8.03(d,J＝5.5Hz,1H),7.69(d,J＝5.5Hz,1H),5.96(s,1H),5.22(s,1H),5.11(s,1H),4.31(t,J＝11.0Hz,1H),4.22-4.08(m,1H),4.02(s,1H),2.96(dd,J＝17.0,4.2Hz,1H),2.84(dd,J＝17.0,6.6Hz,1H),2.65(qd,J＝12.7,4.3Hz,1H),2.19(d,J＝10.0Hz,1H),2.06(d,J＝13.4Hz,1H),1.72(dd,J＝12.6,3.7Hz,1H),1.66(d,J＝6.5Hz,3H)ppm；¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ157.95,152.11,141.57,136.18,135.24,127.98,126.79,119.08,116.12,72.42,68.87,62.95,51.67,30.39,28.44,24.09,22.36ppm；對于C₁₇H₁₈N₄O₂S，LCMS計(jì)算值:342.4,實(shí)測值:343(M⁺+H)；水含量:5.15％。

實(shí)施例9. 2-((2R,5S)-5-(2-((R)-1-羥基乙基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈(無水結(jié)晶游離堿)

對非晶((2R,5S)-5-{2-[(1R)-1-羥基乙基]-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基}四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈(84.5g，247mmol)于甲醇(MeOH，800mL)中的溶液進(jìn)行精過濾且轉(zhuǎn)移至配備回流冷凝器的五頸5L圓底燒瓶中。使用額外的200mL甲醇洗滌過濾漏斗。向所得甲醇溶液中添加乙酸乙酯(2000mL)并且經(jīng)30分鐘將所得澄清溶液加熱至70℃。隨后在大氣壓下蒸餾甲醇與乙酸乙酯的混合物。當(dāng)所收集的溶劑混合物達(dá)到1700mL時(shí)再添加2000mL乙酸乙酯且繼續(xù)進(jìn)行大氣壓蒸餾。當(dāng)所收集的總?cè)軇┗旌衔镞_(dá)到4000mL時(shí)(在約8h內(nèi))，燒瓶中的剩余溶液變渾濁且逐漸形成固體。繼續(xù)進(jìn)行大氣壓蒸餾，直至所收集的總?cè)軇┗旌衔镞_(dá)到4250mL，且燒瓶中的剩余溶劑混合物(主要為乙酸乙酯)為約750mL。隨后在約70℃下將正庚烷(1150mL)緩慢添加至燒瓶中(EtOAc:正庚烷為約1:1.5)，且使所得混合物逐漸冷卻至室溫。在室溫下將混合物再攪拌2至3h以引發(fā)結(jié)晶。通過過濾收集固體，用正庚烷(2×300mL)洗滌，且在真空烘箱中在50℃下用N₂吹掃進(jìn)行干燥，獲得呈白色無水結(jié)晶粉末狀的((2R,5S)-5-{2-[(1R)-1-羥基乙基]-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基}四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈(78.1g，92.4％)。

C₁₇H₁₈N₄O₂S(MW 342.42),LCMS(EI)m/e 343(M⁺+H)；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.00(s,1H),8.03(d,J＝5.5Hz,1H),7.69(d,J＝5.5Hz,1H),5.97(s,1H),5.22(s,1H),5.11(s,1H),4.30(t,J＝11.0Hz,1H),4.17(s,1H),4.02(s,1H),2.96(dd,J＝17.0,4.2Hz,1H),2.86(dd,J＝17.0,6.6Hz,1H),2.76-2.56(m,1H),2.19(d,J＝10.6Hz,1H),2.06(d,J＝13.2Hz,1H),1.72(dd,J＝12.6,3.7Hz,1H),1.66(d,J＝6.5Hz,3H)ppm；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ157.95,152.11,141.57,136.18,135.24,127.98,126.79,119.08,116.12,72.42,68.87,62.95,51.67,30.39,28.44,24.09,22.36ppm.；水含量(通過KF):1.15重量％。圖1中所示的DSC溫譜圖顯示在185.05℃下開始且在189.71℃下達(dá)到峰值的一個(gè)吸熱事件，其與化合物熔融有關(guān)。在約260℃下的吸熱事件與化合物分解相關(guān)。圖2中所示的TGA溫譜圖顯示直至200℃的重量損失為1.25％。在200℃以上的溫度下，由于化合物分解，觀察到顯著重量損失。測定標(biāo)題化合物的XRPD圖譜且示于圖3中。以下表2中提供2θ峰的清單。

表2

實(shí)施例10. 2-((2R,5S)-5-(2-((R)-1-羥基乙基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈一水合物

在配備回流冷凝器、熱電偶和磁性攪拌棒的2-L圓底燒瓶中加入非晶2-((2R,5S)-5-(2-((R)-1-羥基乙基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈(93.0g，272mmol)和異丙醇(IPA，1116mL)。將所得懸浮液加熱至50℃至55℃以獲得澄清溶液。在50℃下通過過濾漏斗對溶液進(jìn)行精過濾。使用額外量的異丙醇(IPA，47mL)洗滌過濾漏斗。經(jīng)30分鐘向所合并的溶液中添加水(930mL)，同時(shí)將內(nèi)部溫度維持在45℃至50℃下。在添加水后逐漸出現(xiàn)白色沉淀物。通過在真空下用50℃水浴進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)來移除IPA。在蒸餾期間，添加額外量的水(1209mL)以便將混合物的總體積保持在約1500mL。在真空蒸餾之后，使所得混合物逐漸冷卻至室溫且在室溫下攪拌1至2h。通過過濾收集固體，用水(186mL)洗滌，且在室溫下在過濾漏斗上用外罩真空干燥16h，獲得呈白色結(jié)晶粉末狀的2-((2R,5S)-5-(2-((R)-1-羥基乙基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈一水合物(91.6g，94％)。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ9.00(s,1H),8.03(d,J＝5.5Hz,1H),7.69(d,J＝5.5Hz,1H),5.96(s,1H),5.22(s,1H),5.11(s,1H),4.31(t,J＝11.0Hz,1H),4.22-4.08(m,1H),4.02(s,1H),2.96(dd,J＝17.0,4.2Hz,1H),2.84(dd,J＝17.0,6.6Hz,1H),2.65(qd,J＝12.7,4.3Hz,1H),2.19(d,J＝10.0Hz,1H),2.06(d,J＝13.4Hz,1H),1.72(dd,J＝12.6,3.7Hz,1H),1.66(d,J＝6.5Hz,3H)ppm；¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ157.95,152.11,141.57,136.18,135.24,127.98,126.79,119.08,116.12,72.42,68.87,62.95,51.67,30.39,28.44,24.09,22.36ppm；C₁₇H₁₈N₄O₂S(MW342.42),LCMS(EI)m/e 343(M⁺+H)。水含量(通過KF):5.15重量％。通過DSC測定熔融/分解范圍且示于圖4中。DSC溫譜圖顯示在69.37℃開始且在106.41℃達(dá)到峰值的一個(gè)脫水吸熱事件，隨后為在131.01℃開始且在139.99℃達(dá)到峰值的熔融。TGA溫譜圖(圖5)顯示直至150℃的重量損失為4.9％，該值對應(yīng)于一水合物的水含量。在200℃之后，所述化合物開始分解。測定標(biāo)題化合物的XRPD圖譜且示于圖6中。2θ峰的清單提供于以下表3中。

表3

實(shí)施例11.動(dòng)態(tài)氣相吸附

對實(shí)施例9的化合物進(jìn)行動(dòng)態(tài)氣相吸附(DVS)研究以監(jiān)測吸水性、水合物形成和脫水以及固體形式轉(zhuǎn)化。在四個(gè)循環(huán)中以10％相對濕度(RH)增量完成濕氣吸收概況分析，其中第一吸附從25％至95％RH，隨后以10％增量從95％至5％RH進(jìn)行解吸。平衡標(biāo)準(zhǔn)如下：5分鐘內(nèi)0.0050wt％，其中最大平衡時(shí)間為180分鐘。所有吸附和解吸均在室溫(25℃)下進(jìn)行。未對樣品進(jìn)行預(yù)干燥步驟。無水形式的水吸附在85％RH以下較緩慢且在85％RH以上較快速。XRPD圖譜在DVS前后的變化表明固體形式變化。在DVS循環(huán)4之后，無水形式完全轉(zhuǎn)化成水合形式。在環(huán)境儲(chǔ)存條件下，無水形式將緩慢吸收水且轉(zhuǎn)化成水合形式。從水合物形成無水形式的脫水過程非常緩慢，即使在5％RH下。水合形式在較寬濕度條件范圍內(nèi)具有物理穩(wěn)定性。氣相吸附/解吸等溫線示于圖7和圖8中。DVS前后的XRPD圖譜疊加示于圖9中。

實(shí)施例12.濕度室研究A

將實(shí)施例9的化合物在設(shè)定在40℃和75％相對濕度的濕度室中置放5天。通過XRPD、TGA和DSC分析所得樣品，如圖10至圖12中所示?；赬RPD數(shù)據(jù)，無水結(jié)晶游離堿轉(zhuǎn)化成結(jié)晶水合物形式。水含量(通過KF)為4.6％且通過TGA觀測到的重量損失為5.01％。

實(shí)施例13.濕度室研究B

將實(shí)施例9的化合物在設(shè)定在30℃和90％相對濕度(RH)的濕度室中置放7天。通過XRPD、TGA和DSC分析所得樣品，如圖13至圖15中所示。基于XRPD，無水結(jié)晶游離堿轉(zhuǎn)化成結(jié)晶水合物形式。30℃/90％RH樣品的XRPD圖譜對應(yīng)于獲自無水結(jié)晶游離堿原料藥的水性懸浮液的水合物形式。水含量(通過KF)為4.72％且通過TGA觀測到的重量損失為5.05％。

實(shí)施例14.(R)-4-甲氧基-2,2,5-三甲基-2,5-二氫噁唑

步驟1.(R)-2,2,5-三甲基噁唑烷-4-酮

在室溫下向(2R)-2-羥基丙酰胺(30g，337mmol)于丙酮中的溶液中添加2,2-二甲氧基丙烷(51.8mL，421mmol，1.25當(dāng)量)和三氟化硼乙醚合物(BF₃-Et₂O，92.13mL，16.8mmol，0.05當(dāng)量)。隨后在室溫下將所得反應(yīng)混合物攪拌隔夜。當(dāng)TLC指示反應(yīng)完畢時(shí)，在減壓下在35℃以下移除溶劑并且將殘余物添加至甲基叔丁基醚(MTBE，350mL)中。用飽和碳酸氫鈉(NaHCO₃)水溶液(15mL)、固體碳酸氫鈉(NaHCO₃，4g)和固體硫酸鈉(Na₂SO₄，30g)處理該溶液且在室溫下將所得混合物攪拌30分鐘。濾出固體且用甲基叔丁基醚(MTBE，50mL)洗滌。分離所合并的濾液的兩相，并且用水(30mL)洗滌有機(jī)相且用硫酸鈉(Na₂SO₄，20g)干燥。在移除干燥劑之后，在減壓下濃縮濾液且將溶劑換成正己烷以獲得所要產(chǎn)物。通過過濾收集固體，用正己烷洗滌并且干燥，得到呈白色結(jié)晶固體狀的所要產(chǎn)物(R)-2,2,5-三甲基噁唑烷-4-酮(42g，97％)。¹H NMR(400MHz,CD₂Cl₂)δ7.66(s,1H),4.37(q,J＝6.7Hz,1H),1.47(s,3H),1.44(s,3H),1.36(d,J＝6.7Hz,3H)ppm；¹³C NMR(101MHz,CD₂Cl₂)δ175.58(s),90.70(s),73.76(s),29.97(s),28.52(s),18.60(s)ppm。

步驟2.(R)-4-甲氧基-2,2,5-三甲基-2,5-二氫噁唑

在室溫下向(R)-2,2,5-三甲基噁唑烷-4-酮(20g，155mmol)于二氯甲烷(DCM，200mL)中的溶液中添加三甲氧鎓四氟化物(Me₃O⁺BF₄^-，24.1g，155mmol，1.0當(dāng)量)。在室溫下將所得反應(yīng)混合物攪拌6小時(shí)。當(dāng)¹H-NMR指示反應(yīng)完畢時(shí)，將反應(yīng)混合物添加至二氯甲烷(DCM，100mL)中且冷卻至0℃至5℃。隨后用2M碳酸鈉水溶液(Na₂CO₃，230mL)處理所得溶液，同時(shí)將內(nèi)部溫度維持在0℃至5℃。分離兩相且用水(2×100mL)洗滌有機(jī)相，經(jīng)硫酸鈉(Na₂SO₄，50g)干燥且在減壓下濃縮，得到呈黃色油狀的粗制所要產(chǎn)物(R)-4-甲氧基-2,2,5-三甲基-2,5-二氫噁唑(19g，87％)，其不經(jīng)進(jìn)一步純化即可直接用于隨后的反應(yīng)中。通過真空蒸餾獲得呈無色油狀的純所要產(chǎn)物(12g；在50mba下的沸點(diǎn)為50℃)。¹H NMR(400MHz,CD₂Cl₂)δ4.58(q,J＝6.6Hz,1H),3.80(s,3H),1.41(s,3H),1.35(s,3H),1.29(d,J＝6.6Hz,3H)ppm；¹³C NMR(101MHz,CD₂Cl₂)δ169.80(s),103.90(s),75.08(s),56.46(s),30.50(s),28.69(s),20.07(s)ppm。

實(shí)施例15. 2-((2R,5S)-5-(2-((R)-1-羥基乙基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈和2-((2S,5S)-5-(2-((R)-1-羥基乙基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈的替代制備

在室溫下向燒瓶中添加(R)-2,2,5-三甲基噁唑烷-4-酮(6.7g，52mmol)、三甲基氧鎓四氟硼酸鹽(Me₃O⁺BF₄^-，7.7g，52mmol)和無水二氯甲烷(DCM，50mL)。隨后在室溫下將所得混合物攪拌2小時(shí)。當(dāng)¹H NMR顯示(R)-4-甲氧基-2,2,5-三甲基-2,5-二氫噁唑的形成已完畢時(shí)，在室溫下向反應(yīng)混合物中加入2-((2R,5S)-5-(6-氨基噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基氨基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈與2-((2S,5S)-5-(6-氨基噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基氨基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈的混合物(實(shí)施例4，5.0g，17.3mmol)。隨后通過向反應(yīng)混合物中添加甲醇并且蒸餾以移除二氯甲烷而將溶劑換成甲醇(80mL)。隨后將所得反應(yīng)混合物加熱至65℃后維持1.5小時(shí)。當(dāng)HPLC顯示反應(yīng)完畢時(shí)，在減壓下移除溶劑且用二氯甲烷(80mL)處理殘余物。隨后依序用飽和碳酸氫鈉水溶液(NaHCO₃，10mL)和固體NaHCO₃(11.6g，139mmol)處理所得混合物，隨后在室溫下攪拌30min。使混合物經(jīng)Na₂SO₄干燥且過濾液體。通過過濾移除固體且分離濾液的兩相。用水(2×25mL)洗滌有機(jī)相，經(jīng)Na₂SO₄干燥并濃縮。隨后將殘余物溶解于0.1M鹽酸(HCl)水溶液中，且用二氯甲烷(2×20mL)洗滌所得酸性水溶液。隨后用NaHCO₃中和酸性水溶液，以使粗制所要產(chǎn)物沉淀。通過過濾收集固體，用水洗滌并且干燥，得到呈2-((2R,5S)-5-(2-((R)-1-羥基乙基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈與2-((2S,5S)-5-(2-((R)-1-羥基乙基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈的混合物形式的所要產(chǎn)物(5.0g，產(chǎn)率84％)。

兩種對映異構(gòu)體的混合物不可通過硅膠柱色譜法分離，且不經(jīng)進(jìn)一步分離即直接用于隨后的反應(yīng)中(參見例如實(shí)施例6)。

對于(2R,5S)-異構(gòu)體：¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ9.00(s,1H),8.03(d,J＝5.5Hz,1H),7.69(d,J＝5.5Hz,1H),5.96(s,1H),5.22(s,1H),5.11(s,1H),4.31(t,J＝11.0Hz,1H),4.22-4.08(m,1H),4.02(s,1H),2.96(dd,J＝17.0,4.2Hz,1H),2.84(dd,J＝17.0,6.6Hz,1H),2.65(qd,J＝12.7,4.3Hz,1H),2.19(d,J＝10.0Hz,1H),2.06(d,J＝13.4Hz,1H),1.72(dd,J＝12.6,3.7Hz,1H),1.66(d,J＝6.5Hz,3H)ppm；¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ157.95,152.11,141.57,136.18,135.24,127.98,126.79,119.08,116.12,72.42,68.87,62.95,51.67,30.39,28.44,24.09,22.36ppm；C₁₇H₁₈N₄O₂S(MW 342.4),LCMS(EI)m/e 343(M⁺+H)。

對于(2S,5S)-異構(gòu)體：¹H NMR(400MHz,CD₃CN)δ8.93(s,1H),7.80(d,J＝5.5Hz,1H),7.63(d,J＝5.5Hz,1H),5.38(s,1H),5.00(dq,J＝9.4,4.7Hz,1H),4.43(dd,J＝11.8,9.3Hz,1H),4.26(dd,J＝8.6,3.7Hz,1H),4.16(s,1H),4.03-3.89(m,1H),3.17(dd,J＝17.1,8.6Hz,1H),2.87(dd,J＝17.2,5.4Hz,1H),2.57(dtd,J＝14.8,10.8,4.2Hz,1H),2.20-1.99(m,2H),1.88-1.82(m,1H),1.73(d,J＝6.4Hz,3H)ppm；¹³C NMR(101MHz,CD₃CN)δ158.04,152.88,142.12,136.81,136.46,127.44,127.14,119.04,116.97,70.00,64.83,64.03,54.55,28.06,25.73,22.46,21.94ppm；C₁₇H₁₈N₄O₂S(MW 342.4),LCMS(EI)m/e 343(M⁺+H)。

實(shí)施例16. 2-((2R,5S)-5-(2-((R)-1-羥基乙基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈和2-((2S,5S)-5-(2-((R)-1-羥基乙基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈的替代制備

步驟1.(R)-乙酸-1-氨基-1-氧代丙-2-基酯

在室溫下，在氮?dú)庀孪蚺鋫浠亓骼淠鳌⒌獨(dú)馊肟?、熱電偶和磁性攪拌棒?-L三頸圓底燒瓶中加入(R)-2-羥基丙酰胺(49.95g，543.8mmol)和四氫呋喃(THF，300mL)。通過冰-水浴將所得黃色溶液冷卻至0℃至5℃，隨后加入乙酰氯(40.60mL，571.0mmol，1.05當(dāng)量)，同時(shí)將內(nèi)部溫度維持在20℃以下。在內(nèi)部溫度降回5℃以下之后，加入4-甲基嗎啉(59.2mL，538.0mmol，0.99當(dāng)量)，同時(shí)將內(nèi)部溫度維持在10℃以下。隨后在室溫下將所得反應(yīng)混合物攪拌4小時(shí)，隨后過濾混合物以移除固體。用THF(60mL)洗滌固體且在減壓下濃縮濾液，獲得呈白色至灰白色固體狀的粗制所要產(chǎn)物(R)-乙酸-1-氨基-1-氧代丙-2-基酯(75.0g，105.2％)，其不經(jīng)進(jìn)一步純化即直接用于下一反應(yīng)中。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ7.42(s,1H),7.14(s,1H),4.84(q,J＝7.6Hz,1H),2.03(s,3H),1.29(d,J＝7.6Hz,3H)ppm。

步驟2.(R)-乙酸-1-氰基乙酯

在氮?dú)庀孪蚺鋫浠亓骼淠?、氮?dú)馊肟?、熱電偶和磁性攪拌棒?-L三頸圓底燒瓶中加入粗制(R)-乙酸-1-氨基-1-氧代丙-2-基酯(70.0g，533.8mmol)和N,N-二甲基甲酰胺(DMF，280mL)。隨后在室溫下用含氰尿酰氯(44.0g，240.0mmol)的2-甲氧基-2-甲基丙烷(TBME，600mL)處理所得淡黃色溶液。在室溫下將反應(yīng)混合物攪拌16小時(shí)。過濾白色固體且用TBME(800mL)洗滌。依序用飽和碳酸氫鈉水溶液(NaHCO₃，200mL)、水(4×200mL)和鹽水(100mL)洗滌所合并的有機(jī)濾液。隨后用無水MgSO₄(15g)干燥所得有機(jī)相，且在減壓下濃縮，獲得呈無色至淡黃色油狀的粗制所要產(chǎn)物(R)-乙酸-1-氰基乙酯(42.03g，69.6％)，其不經(jīng)進(jìn)一步純化即直接用于隨后的反應(yīng)中。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ5.46(q,J＝7.6Hz,1H),2.09(s,3H),1.53(d,J＝7.6Hz,3H)ppm。

步驟3.(R)-2羥基丙亞胺酸乙酯

在室溫下向配備磁性攪拌棒的100mL圓底燒瓶中加入粗制(R)-乙酸-1-氰基乙酯(1.021g，8.665mmol)和乙醇(EtOH，1.518mL，26.0mmol)。隨后將所得溶液冷卻至-40℃，隨后在氯化氫(HCl)氣體中鼓泡45秒。隨后使反應(yīng)混合物逐漸升溫至室溫。在16小時(shí)之后，使反應(yīng)混合物冷卻至0℃，隨后依序加入四氫呋喃(THF，2.0mL，25mmol)和4-甲基嗎啉(0.865mL，7.87mmol)。通過過濾移除固體且處于濾液中的粗制所要產(chǎn)物(R)-2-羥基丙亞胺酸乙酯不經(jīng)進(jìn)一步純化即直接用于隨后的反應(yīng)中。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ11.14(s,1H),4.52-4.40(m,3H),1.36-1.31(m,6H)ppm。

步驟4. 2-((2R,5S)-5-(2-((R)-1-羥基乙基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈和2-((2S,5S)-5-(2-((R)-1-羥基乙基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈

在室溫下，在氮?dú)庀孪蚺鋫涞獨(dú)馊肟凇犭娕己痛判詳嚢璋舻娜i100-mL圓底燒瓶中加入含2-((2R,5S)-5-(6-氨基噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基氨基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈與2-((2S,5S)-5-(6-氨基噻吩并[3,2-b]吡啶-7-基氨基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈的混合物(實(shí)施例4，0.30g，1.04mmol)的乙醇(EtOH，4.0mL)。隨后將混合物加熱至80℃以獲得澄清溶液，隨后在80℃下向乙醇溶液中添加先前步驟中所產(chǎn)生的粗制(R)-2-羥基丙亞胺酸乙酯于THF中的溶液。當(dāng)如HPLC所指示，1小時(shí)之后反應(yīng)完畢時(shí)，使反應(yīng)混合物冷卻至室溫。過濾經(jīng)冷卻的反應(yīng)混合物且在減壓下濃縮濾液，獲得呈2-((2R,5S)-5-(2-((R)-1-羥基乙基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈與2-((2S,5S)-5-(2-((R)-1-羥基乙基)-1H-咪唑并[4,5-d]噻吩并[3,2-b]吡啶-1-基)四氫-2H-吡喃-2-基)乙腈的混合物形式的粗制所要產(chǎn)物(0.3g，產(chǎn)率84％)，其不可通過硅膠柱色譜法分離且不經(jīng)進(jìn)一步分離即直接用于隨后的反應(yīng)中(參見例如實(shí)施例6)。

對于(2R,5S)-異構(gòu)體：¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ9.00(s,1H),8.03(d,J＝5.5Hz,1H),7.69(d,J＝5.5Hz,1H),5.96(s,1H),5.22(s,1H),5.11(s,1H),4.31(t,J＝11.0Hz,1H),4.22-4.08(m,1H),4.02(s,1H),2.96(dd,J＝17.0,4.2Hz,1H),2.84(dd,J＝17.0,6.6Hz,1H),2.65(qd,J＝12.7,4.3Hz,1H),2.19(d,J＝10.0Hz,1H),2.06(d,J＝13.4Hz,1H),1.72(dd,J＝12.6,3.7Hz,1H),1.66(d,J＝6.5Hz,3H)ppm；¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ157.95,152.11,141.57,136.18,135.24,127.98,126.79,119.08,116.12,72.42,68.87,62.95,51.67,30.39,28.44,24.09,22.36ppm；C₁₇H₁₈N₄O₂S(MW 342.4),LCMS(EI)m/e 343(M⁺+H)。

對于(2S,5S)-異構(gòu)體：¹H NMR(400MHz,CD₃CN)δ8.93(s,1H),7.80(d,J＝5.5Hz,1H),7.63(d,J＝5.5Hz,1H),5.38(s,1H),5.00(dq,J＝9.4,4.7Hz,1H),4.43(dd,J＝11.8,9.3Hz,1H),4.26(dd,J＝8.6,3.7Hz,1H),4.16(s,1H),4.03-3.89(m,1H),3.17(dd,J＝17.1,8.6Hz,1H),2.87(dd,J＝17.2,5.4Hz,1H),2.57(dtd,J＝14.8,10.8,4.2Hz,1H),2.20-1.99(m,2H),1.88-1.82(m,1H),1.73(d,J＝6.4Hz,3H)ppm；¹³C NMR(101MHz,CD₃CN)δ158.04,152.88,142.12,136.81,136.46,127.44,127.14,119.04,116.97,70.00,64.83,64.03,54.55,28.06,25.73,22.46,21.94ppm；C₁₇H₁₈N₄O₂S(MW 342.4),LCMS(EI)m/e 343(M⁺+H)。

實(shí)施例A：體外JAK激酶檢定

根據(jù)Park等人,Analytical Biochemistry 1999,269,94-104中所描述的以下體外檢定測試本文中的化合物對JAK靶標(biāo)的抑制活性。使用桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)人JAK1的催化域(a.a.837-1142)、JAK2的催化域(a.a.828-1132)和JAK3的催化域(a.a.781-1124)并且純化。通過測量生物素標(biāo)記肽的磷酸化來檢定JAK1、JAK2或JAK3的催化活性。通過均相時(shí)間分辨熒光(HTRF)來檢測磷酸化肽。針對各激酶，在含有處于含100mM NaCl、5mM DTT和0.1mg/mL(0.01％)BSA的50mM Tris(pH 7.8)緩沖液中的所述酶、ATP和500nM肽的40μL反應(yīng)物中測量化合物的IC₅₀。對于1mM IC₅₀測量，反應(yīng)物中的ATP濃度為1mM。在室溫下進(jìn)行反應(yīng)1小時(shí)，且隨后用20μL含45mM EDTA、300nM SA-APC、6nM Eu-Py20的檢定緩沖液(Perkin Elmer，Boston，MA)終止。與經(jīng)銪標(biāo)記的抗體結(jié)合40分鐘，且在PHERA星形培養(yǎng)盤讀數(shù)器(BMG，Cary，NC)上測量HTRF信號。在實(shí)施例A檢定中在1mM ATP下測試式Ia化合物，且發(fā)現(xiàn)其在JAK1下的IC₅₀≤100nM且在JAK2下的IC₅₀≤1000nM，其中JAK2/JAK1比率>10。

實(shí)施例B：細(xì)胞檢定

可將依賴于細(xì)胞因子且因此依賴于JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以便生長的癌細(xì)胞系以6000個(gè)細(xì)胞/孔(96孔培養(yǎng)盤形式)鋪涂于RPMI 1640、10％FBS和1nG/mL適當(dāng)細(xì)胞因子中?？蓪⒒衔锾砑又罝MSO/培養(yǎng)基(最終濃度0.2％DMSO)中的細(xì)胞中，且在37℃、5％CO₂下培育72小時(shí)。依序使用CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega)和TopCount(Perkin Elmer，Boston，MA)定量來評定化合物對細(xì)胞活力的效應(yīng)。使用具有相同檢定讀出值的非JAK驅(qū)動(dòng)細(xì)胞系來平行測量化合物的潛在脫靶效應(yīng)。典型地，所有實(shí)驗(yàn)均以一式兩份進(jìn)行。

還可使用以上細(xì)胞系來檢查化合物對JAK激酶或潛在下游底物(諸如STAT蛋白、Akt、Shp2或Erk)的磷酸化的效應(yīng)?？稍诟粢辜?xì)胞因子饑餓之后進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)，隨后與化合物一起短暫預(yù)培育(2小時(shí)或更短)，且進(jìn)行細(xì)胞因子刺激約1小時(shí)或更短。隨后從細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)，并且使用可區(qū)分磷酸化蛋白與總蛋白的抗體，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的技術(shù)加以分析，包括蛋白質(zhì)印跡法或ELISA。這些實(shí)驗(yàn)可利用正常細(xì)胞或癌細(xì)胞來研究化合物對腫瘤細(xì)胞存活生物學(xué)或發(fā)炎性疾病介體的活性。舉例而言，關(guān)于后者，可使用諸如IL-6、IL-12、IL-23或IFN的細(xì)胞因子刺激JAK活化，從而引起STAT蛋白磷酸化且可能引起轉(zhuǎn)錄譜(通過陣列或qPCR技術(shù)加以評定)或蛋白質(zhì)(諸如IL-17)的產(chǎn)生和/或分泌?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員常用的技術(shù)來測量化合物抑制這些細(xì)胞因子介導(dǎo)的效應(yīng)的能力。為了評定化合物對JAK2的效應(yīng)，可用諸如GM-CSF或Tpo的JAK2依賴性生長因子刺激初代細(xì)胞或細(xì)胞系，從細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)，且使用可區(qū)分磷酸化蛋白與總蛋白的抗體，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的技術(shù)(包括蛋白質(zhì)印跡法或ELISA)加以分析。

還可在設(shè)計(jì)用于評估本文中的化合物對突變JAK(例如脊髓增生性病癥中發(fā)現(xiàn)的JAK2V617F突變)的效力和活性的細(xì)胞模型中對其進(jìn)行測試。這些實(shí)驗(yàn)通常利用異位表達(dá)野生型或突變JAK激酶的血液學(xué)譜系細(xì)胞因子依賴性細(xì)胞(例如BaF/3)(James,C.等人,Nature434:1144-1148；Staerk,J.等人JBC 280:41893-41899)。終點(diǎn)包括化合物對細(xì)胞存活、增殖和磷酸化JAK、STAT、Akt或Erk蛋白的效應(yīng)。

可評估本文中的某些化合物抑制T細(xì)胞增殖的活性。此種檢定可被視為第二細(xì)胞因子(即JAK)驅(qū)動(dòng)增殖檢定且還為免疫抑制或免疫活化抑制的簡單檢定。以下為可以何種方式進(jìn)行此類實(shí)驗(yàn)的簡要陳述。使用Ficoll Hypaque分離法由人全血樣品制備周圍血液單核細(xì)胞(PBMC)，且可通過淘析由PBMC獲得T細(xì)胞(2000級分)?？稍?7℃下將新分離的人T細(xì)胞以2×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml的密度在培養(yǎng)基(補(bǔ)充有10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的RPMI 1640)中維持多達(dá)2天。對于IL-2刺激的細(xì)胞增殖分析，首先用植物細(xì)胞凝集素(PHA)以10μg/mL的最終濃度將T細(xì)胞處理72小時(shí)。在用PBS洗滌一次之后，以6000個(gè)細(xì)胞/孔鋪涂于96孔培養(yǎng)盤中且在100U/mL人IL-2(ProSpec-Tany TechnoGene；Rehovot，Israel)存在下在培養(yǎng)基中用化合物以不同的濃度進(jìn)行處理。在37℃下將培養(yǎng)盤培育72h且使用CellTiter-Glo Luminescent試劑，按照制造商建議的方案(Promega；Madison，WI)評定增殖指數(shù)。

實(shí)施例C：體內(nèi)抗腫瘤效力

可在人腫瘤異種移植模型中在免疫受損小鼠中評估本文中的化合物。舉例而言，可使用INA-6漿細(xì)胞瘤細(xì)胞系的致瘤性變體經(jīng)皮下接種SCID小鼠(Burger,R.等人,Hematol J.2:42-53,2001)。隨后可將攜帶腫瘤的動(dòng)物隨機(jī)分入藥物處理組或媒介物處理組，且可通過許多通常途徑(包括經(jīng)口、經(jīng)腹膜內(nèi)或使用可植入泵連續(xù)輸注)中的任一種施用不同劑量的化合物。使用測徑規(guī)追蹤一定時(shí)間內(nèi)的腫瘤生長。此外，可在開始處理之后的任何時(shí)間收集腫瘤樣品以便如上文所描述(實(shí)施例B)加以分析，從而評估化合物對JAK活性和下游信號傳導(dǎo)途徑的效應(yīng)。另外，可使用由其它已知激酶驅(qū)動(dòng)(例如Bcr-Abl)的異種移植腫瘤模型(諸如K562腫瘤模型)來評定化合物的選擇性。

實(shí)施例D：鼠類皮膚接觸延遲型過敏性反應(yīng)測試

還可在T細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的鼠類延遲型過敏性測試模型中測試本文中的化合物(抑制JAK靶標(biāo))的效力。鼠類皮膚接觸延遲型過敏性(DTH)反應(yīng)被視為臨床接觸性皮炎和其它T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的皮膚免疫病癥(諸如銀屑病)的有效模型(Immunol Today.1998年1月；19(1):37-44)。鼠類DTH與銀屑病共有多種特征，包括免疫浸潤、伴隨發(fā)炎性細(xì)胞因子增加和角質(zhì)細(xì)胞過度增殖。此外，在臨床治療銀屑病方面有效的許多類別藥劑也是小鼠中的DTH反應(yīng)的有效抑制劑(Agents Actions.1993年1月；38(1-2):116-21)。

在第0天和第1天，通過向Balb/c小鼠的經(jīng)剃刮腹部局部施用抗原2,4-二硝基-氟苯(DNFB)對其進(jìn)行致敏。在第5天，使用工程師用測微計(jì)測量耳部的厚度。記錄此測量值且用作基線。隨后通過局部施用總計(jì)20μL(內(nèi)耳殼上10μL和外耳殼上10μL)的DNFB(濃度0.2％)對動(dòng)物雙耳進(jìn)行攻擊。在攻擊之后24至72小時(shí)，再次測量耳部。在致敏和攻擊階段中(第-1天至第7天)或在攻擊階段之前或攻擊階段中(通常在第4天至第7天午后)用測試化合物進(jìn)行處理。全身或局部(向耳部局部施用處理)施用測試化合物處理(以不同的濃度)。與未經(jīng)處理的情況相比，耳部腫脹減輕指示測試化合物的效力。引起20％或更大程度的減輕的化合物被視為有效的。在一些實(shí)驗(yàn)中，對小鼠進(jìn)行攻擊而非致敏(陰性對照)。

可通過免疫組織化學(xué)分析來證實(shí)測試化合物的抑制效應(yīng)(抑制JAK-STAT途徑活化)。JAK-STAT途徑活化引起功能轉(zhuǎn)錄因子的形成和移位。此外，免疫細(xì)胞流入和角質(zhì)細(xì)胞增殖增加還將在耳部提供可研究和定量的獨(dú)特表達(dá)譜。使用與磷酸化STAT3(克隆58E12，Cell Signaling Technologies)特異性相互作用的抗體對經(jīng)福爾馬林固定且經(jīng)石蠟包埋的耳部切片(在DTH模型中的攻擊階段之后收集)進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。在比較用DTH模型中，用測試化合物、媒介物或地塞米松(臨床上有效的銀屑病治療)處理小鼠耳部或不進(jìn)行任何處理。測試化合物和地塞米松均可定性且定量地產(chǎn)生相似轉(zhuǎn)錄變化，且測試化合物和地塞米松均可減少浸潤細(xì)胞數(shù)目。全身和局部施用測試化合物均可產(chǎn)生抑制效應(yīng)，即，減少浸潤細(xì)胞數(shù)目和抑制轉(zhuǎn)錄變化。

實(shí)施例E：體內(nèi)消炎活性

可在設(shè)計(jì)用于復(fù)制單一或復(fù)雜炎癥反應(yīng)的嚙齒動(dòng)物或非嚙齒動(dòng)物模型中評估本文中的化合物。舉例而言，可使用關(guān)節(jié)炎的嚙齒動(dòng)物模型來評估預(yù)防性或治療性給與的化合物的治療潛力。這些模型包括但不限于小鼠或大鼠膠原蛋白誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎、大鼠佐劑誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎和膠原蛋白抗體誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎。自體免疫性疾病，包括但不限于多發(fā)性硬化、I型糖尿病、葡萄膜炎、甲狀腺炎、重癥肌無力、免疫球蛋白腎病、心肌炎、氣管敏化(哮喘)、狼瘡或結(jié)腸炎，還可用于評估本文中的化合物的治療潛力。這些模型在研究學(xué)會(huì)中已充分確立且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知(Current Protocols in Immunology,第3卷,Coligan,J.E.等人,Wiley Press；Methods in Molecular Biology:第225卷,Inflammation Protocols.,Winyard,P.G.和Willoughby,D.A.,Humana Press,2003)。

實(shí)施例F：用于治療干眼癥、葡萄膜炎和結(jié)膜炎的動(dòng)物模型

可在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的一個(gè)或多個(gè)干眼癥臨床前模型中評估藥劑，包括但不限于兔刀豆凝集素A(ConA)淚腺模型、東莨菪堿小鼠模型(皮下或經(jīng)皮)、肉毒菌小鼠淚腺模型或引起眼部腺體功能障礙的許多自發(fā)性嚙齒動(dòng)物自體免疫性模型(例如NOD-SCID、MRL/lpr或NZB/NZW)中的任一種(Barabino等人,Experimental Eye Research 2004,79,613-621；和Schrader等人,Developmental Opthalmology,Karger 2008,41,298-312，各文獻(xiàn)以全文引用的方式并入本文中)。這些模型中的終點(diǎn)可包括眼部腺體和眼部(角膜等)的組織病理學(xué)和可能包括測量淚液產(chǎn)生的經(jīng)典Schirmer測試或其改進(jìn)型式(Barabino等人)。可通過經(jīng)由多種施用途徑(例如全身或局部)給藥來評定活性，此舉可在可測量的疾病存在前后開始。

可在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的一個(gè)或多個(gè)臨床前葡萄膜炎模型中評估藥劑。這些包括但不限于實(shí)驗(yàn)自體免疫性葡萄膜炎(EAU)和內(nèi)毒素誘導(dǎo)型葡萄膜炎(EIU)模型。EAU實(shí)驗(yàn)可在兔、大鼠或小鼠中進(jìn)行且可包括被動(dòng)或主動(dòng)免疫。舉例而言，任何數(shù)目的視網(wǎng)膜抗原均可用于使動(dòng)物對相關(guān)免疫原敏感，此后可用同一抗原對動(dòng)物進(jìn)行眼部攻擊。EIU模型更嚴(yán)重且包括局部或全身施用亞致死劑量的脂多糖。EIU和EAU模型兩者的終點(diǎn)可尤其包括眼底檢查、組織病理學(xué)。Smith等人已綜述這些模型(Immunology and Cell Biology 1998,76,497-512，該文獻(xiàn)以全文引用的方式并入本文中)?？赏ㄟ^經(jīng)由多種施用途徑(例如全身或局部)給藥來評定活性，此舉可在可測量的疾病存在前后開始。以上列出的一些模型還可發(fā)展鞏膜炎/鞏膜表層炎、脈絡(luò)膜炎、睫狀體炎或虹膜炎，且因此可用于研究化合物用于對這些疾病進(jìn)行治療性治療的潛在活性。

還可在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的一個(gè)或多個(gè)臨床前結(jié)膜炎模型中評估藥劑。這些包括但不限于利用豚鼠、大鼠或小鼠的嚙齒動(dòng)物模型。豚鼠模型包括利用以諸如卵清蛋白的抗原或豚草進(jìn)行的主動(dòng)或被動(dòng)免疫和/或免疫攻擊方案的模型(綜述于Groneberg,D.A.等人,Allergy 2003,58,1101-1113中，該文獻(xiàn)以全文引用的方式并入本文中)。大鼠和小鼠模型與豚鼠模型(還由Groneberg綜述)大體上相似。可通過經(jīng)由多種施用途徑(例如全身或局部)給藥來評定活性，此舉可在可測量的疾病存在前后開始。此類研究的終點(diǎn)可包括例如對諸如結(jié)膜的眼部組織的組織學(xué)、免疫學(xué)、生物化學(xué)或分子分析。

實(shí)施例G：體內(nèi)骨保護(hù)

可在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種骨量減少癥、骨質(zhì)疏松癥或骨吸收臨床前模型中評估化合物。舉例來說，可使用切除卵巢的嚙齒動(dòng)物來評估化合物影響骨重建和/或密度的標(biāo)識和標(biāo)記物的能力(W.S.S.Jee和W.Yao,J Musculoskel.Nueron.Interact.,2001,1(3),193-207，該文獻(xiàn)以全文引用的方式并入本文中)?；蛘?，可在療法(例如糖皮質(zhì)激素)誘導(dǎo)型骨量減少癥模型中的對照或經(jīng)化合物處理的嚙齒動(dòng)物中評估骨密度和結(jié)構(gòu)(Yao等人,Arthritis and Rheumatism,2008,58(6),3485-3497；和id.58(11),1674-1686，所述兩文獻(xiàn)以全文引用的方式并入本文中)。另外，可在上述嚙齒動(dòng)物關(guān)節(jié)炎模型(實(shí)施例E)中評估化合物對骨吸收和密度的效應(yīng)。所有這些模型的終點(diǎn)可能變化，但通常包括組織學(xué)和放射性評定以及骨重建的免疫組織學(xué)和適當(dāng)生物化學(xué)標(biāo)記物。

實(shí)施例H：S100A9轉(zhuǎn)基因小鼠模型

先前已證明S100A9轉(zhuǎn)基因小鼠顯示MDSC骨髓累積伴隨發(fā)展?jié)u進(jìn)性多譜系血細(xì)胞減少癥和細(xì)胞學(xué)發(fā)育不良，與MDS相似。此外，通過全反式視黃酸治療或活性攜帶基于免疫受體酪氨酸的活化基序(攜帶ITAM)的連接蛋白(DAP12)干擾CD33信號傳導(dǎo)達(dá)成MDSC早期強(qiáng)制成熟來挽救血液學(xué)表型且緩解該疾病。此系統(tǒng)可可用于在臨床前模型中測試JAK1抑制對類MDS疾病的效應(yīng)。J.Clin.Invest.,123(11):4595-4611(2013)。因此，通過經(jīng)口管飼給與JAK1選擇性抑制劑。監(jiān)測化合物減輕S100A9轉(zhuǎn)基因小鼠中所觀察到的血細(xì)胞減少癥和細(xì)胞學(xué)發(fā)育不良的能力。

根據(jù)先前描述，對本發(fā)明的各種修改以及本文中所描述的修改對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易見。此類修改還意欲屬于所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。2013年10月31日提交的美國序列號14/068,796以全文引用的方式并入本文中。本申請中所引用的各參考文獻(xiàn)，包括所有專利、專利申請和公開案均以全文引用的方式并入本文中。