本申請(qǐng)要求2014年9月16日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.62/051,159的權(quán)益，所述臨時(shí)申請(qǐng)的公開內(nèi)容在此通過(guò)引用全文并入。
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開屬于造血干細(xì)胞的基因組工程領(lǐng)域，特別是造血細(xì)胞的基因組的靶向修飾。
背景技術(shù)：
：在用于大量疾病的基因治療中最有希望的方法之一涉及使用干細(xì)胞的體外遺傳修飾，然后移植并在患者體內(nèi)植入經(jīng)修飾的細(xì)胞。當(dāng)引入的干細(xì)胞顯示長(zhǎng)期持久性和多譜系分化時(shí)是特別有希望的。造血干細(xì)胞(最常見(jiàn)的是基于CD34細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)的富集的細(xì)胞形式)是最特別有用的細(xì)胞群，因?yàn)樗鼈兛梢匀菀撰@得并含有長(zhǎng)期造血干細(xì)胞(LT-HSC)，其可以在移植后重建整個(gè)造血譜系。已經(jīng)描述了用于基因組DNA的靶向裂解(cleavage)的各種方法和組合物。這種靶向裂解事件可用于例如誘導(dǎo)靶向誘變，誘導(dǎo)細(xì)胞DNA序列的靶向缺失，并促進(jìn)來(lái)自任何生物體的細(xì)胞中預(yù)定染色體基因座處的靶向重組。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利No.9,045,763；美國(guó)專利No.9,005,973；美國(guó)專利No.8,956,828；美國(guó)專利No.8,945,868；美國(guó)專利No.8,586,526；美國(guó)專利No.6,534,261；美國(guó)專利No.6,599,692；美國(guó)專利No.6,503,717；美國(guó)專利No.6,689,558；美國(guó)專利No.7,067,317；美國(guó)專利No.7,262,054；美國(guó)專利No.7,888,121；美國(guó)專利No.7,972,854；美國(guó)專利No.7,914,796；美國(guó)專利No.7,951,925；美國(guó)專利No.8,110,379；美國(guó)專利No.8,409,861；美國(guó)專利公布20030232410；美國(guó)專利公布20050208489；美國(guó)專利公布20050026157；美國(guó)專利公布20050064474；美國(guó)專利公布20060063231；美國(guó)專利公布20080159996；美國(guó)專利公布201000218264；美國(guó)專利公布20120017290；美國(guó)專利公布20110265198；美國(guó)專利公布20130137104；美國(guó)專利公布20130122591；美國(guó)專利公布20130177983與美國(guó)專利公布20130177960和美國(guó)專利公布20150056705以及美國(guó)申請(qǐng)No.14/706,747，其公開內(nèi)容通過(guò)引用整體并入本文以用于所有目的。這些方法通常涉及使用工程改造裂解系統(tǒng)來(lái)誘導(dǎo)靶DNA序列中的雙鏈斷裂(DSB)或切口，使得通過(guò)錯(cuò)誤產(chǎn)生過(guò)程導(dǎo)致的斷裂的修復(fù)(如非同源末端連接(NHEJ))或使用修復(fù)模板的修復(fù)(同源性定向修復(fù)或HDR)可以導(dǎo)致基因的敲除或目的序列的插入(靶向整合)。隨后的修復(fù)途徑(NHEJ與HDR或兩者)通常取決于修復(fù)模板的存在和幾種競(jìng)爭(zhēng)性修復(fù)途徑的活性。在不存在外部供應(yīng)的修復(fù)模板(例如供體)的情況下引入的雙鏈斷裂通常用于經(jīng)由通過(guò)細(xì)胞NHEJ途徑引入的突變使靶基因失活。NHEJ途徑可以基于微觀同源介導(dǎo)的末端連接而分離成標(biāo)準(zhǔn)Ku依賴性途徑和替代的Ku獨(dú)立途徑，該微觀同源介導(dǎo)的末端連接利用了在裂解位點(diǎn)附近的直接重復(fù)的短軌道。通過(guò)這兩個(gè)NHEJ途徑進(jìn)行基因編輯后的插入和/或缺失(“indel”)模式不同，這可能導(dǎo)致突變的功能結(jié)果方面的差異，具體取決于應(yīng)用。在攜帶與雙鏈斷裂的旁側(cè)序列同源的段(stretch)的外部供應(yīng)的供體的存在下，使用供體分子的同源性定向基因修復(fù)(HDR)可以用于改變單堿基或小段的序列(“基因校正”)，或者在另一方面，用于將整個(gè)表達(dá)盒(“基因添加”)靶向插入預(yù)定的基因組位置。裂解可以通過(guò)使用特異性核酸酶，例如工程改造的鋅指核酸酶(ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALEN)，或使用具有工程改造的crRNA/tracrRNA的CRISPR/Cas系統(tǒng)('單導(dǎo)向RNA')以指導(dǎo)特異性裂解。參見(jiàn)例如美國(guó)專利No.8,697,359和No.8,932,814以及美國(guó)專利公布No.20150056705。此外，靶向核酸酶正在基于Argonaute系統(tǒng)開發(fā)(例如，來(lái)自嗜熱棲熱菌(T.thermophilus)，稱為“TtAgo'，參見(jiàn)Swarts等人(2014)Nature507(7491)：258-261)，其也可能具有在基因組編輯和基因治療中的用途?？梢岳檬褂蒙鲜龊怂崦赶到y(tǒng)中的一種的靶向裂解來(lái)使用HDR或NHEJ介導(dǎo)的方法將核酸插入特定的靶位置。然而，將核酸酶系統(tǒng)和供體兩者都遞送到細(xì)胞可能是有問(wèn)題的。例如，通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)遞送供體或核酸酶到細(xì)胞中可能對(duì)受體細(xì)胞有毒，特別是對(duì)于作為原代細(xì)胞的細(xì)胞是有毒的，因此不如來(lái)自細(xì)胞系的細(xì)胞那樣健康。CD34+干細(xì)胞或祖細(xì)胞是特征在于其自我更新和/或分化成淋巴譜系細(xì)胞(例如T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞)和髓細(xì)胞譜系細(xì)胞(例如單核細(xì)胞、紅細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞)的能力的異質(zhì)的成組的細(xì)胞。它們的異質(zhì)性源于CD34+干細(xì)胞群體內(nèi)有多個(gè)亞組，亞組通常反映特定組的多能性(不管是否是譜系定型的(lineagecommitted))。例如，屬于CD38-的CD34+細(xì)胞是更原始的、未成熟的CD34+祖細(xì)胞(也稱為長(zhǎng)期造血祖細(xì)胞)，而屬于CD34+CD38+(短期造血祖細(xì)胞)是譜系定型的(參見(jiàn)Stellaetal(1995)Hematologica80:367-387)。當(dāng)該群體隨后沿著分化途徑進(jìn)一步向下進(jìn)展時(shí)，CD34標(biāo)記喪失。CD34+干細(xì)胞在臨床細(xì)胞治療中具有巨大的潛力。紅血細(xì)胞(RBC)或紅細(xì)胞是血液的主要細(xì)胞組分。實(shí)際上，RBC在人類中占細(xì)胞的四分之一。人類中的成熟RBC沒(méi)有細(xì)胞核和許多其他細(xì)胞器，并且全部是血紅蛋白，血紅蛋白是存在于RBC中的金屬蛋白，其功能是攜帶氧氣至組織以及攜帶二氧化碳離開組織并返回到肺部以便去除。所述蛋白構(gòu)成RBC干重的約97％并且它使血液的攜氧能力提高約70倍。血紅蛋白是包含兩條α樣珠蛋白鏈和兩條β樣珠蛋白鏈以及4個(gè)血紅素基團(tuán)的異四聚體。在成人中，α2β2四聚體被稱為血紅蛋白A(HbA)或成人血紅蛋白。通常，α和β珠蛋白鏈以近似1:1的比率合成并且這個(gè)比率在血紅蛋白和RBC穩(wěn)定化方面似乎是關(guān)鍵的。實(shí)際上，在一類珠蛋白基因不足表達(dá)的一些情況下(參見(jiàn)下文)，降低另一類型的珠蛋白的表達(dá)(例如使用特異性siRNA)，從而恢復(fù)這種1:1的比率，減輕了突變細(xì)胞表型的一些方面(參見(jiàn)Voonetal(2008)Haematologica93(8):1288)。在發(fā)育中的胎兒中，產(chǎn)生不同形式的血紅蛋白(胎兒血紅蛋白(HbF))，其相比于血紅蛋白A對(duì)氧具有更大的結(jié)合親和力，以使得氧可經(jīng)由母體血流遞送至嬰兒的系統(tǒng)。胎兒血紅蛋白也含有兩條α珠蛋白鏈，但代替成人β珠蛋白鏈，其具有兩條胎兒γ珠蛋白鏈(即，胎兒血紅蛋白是α2γ2)。在妊娠約30周時(shí)，胎兒中γ珠蛋白的合成開始下降，而β珠蛋白的產(chǎn)生增加。至大約10月齡時(shí)，新生兒的血紅蛋白幾乎全部是α2β2，但一些HbF持續(xù)到成年期(總血紅蛋白的約1-3％)。從產(chǎn)生γ至產(chǎn)生β的開關(guān)的調(diào)節(jié)相當(dāng)復(fù)雜，并且主要涉及γ珠蛋白的表達(dá)下調(diào)與β珠蛋白表達(dá)的同時(shí)上調(diào)。在編碼血紅蛋白鏈的序列中的遺傳缺陷可造成多種疾病，稱為血紅蛋白病，包括鐮狀細(xì)胞貧血和地中海貧血。在大多數(shù)患有血紅蛋白病的患者中，仍存在編碼γ珠蛋白的基因，但由于如上所述在圍產(chǎn)期發(fā)生的正?；蛞种?，因而表達(dá)相對(duì)較低。據(jù)估計(jì)，在美國(guó)有1/5000的人群患有鐮狀細(xì)胞疾病(SCD)，大多是撒哈拉以南非洲裔人群。鐮狀細(xì)胞雜合性似乎對(duì)于防止瘧疾存在益處，因此這種特性可能已經(jīng)隨著時(shí)間推移經(jīng)過(guò)選擇，使得據(jù)估計(jì)在撒哈拉以南非洲，有三分之一的人口具有鐮狀細(xì)胞特性。鐮狀細(xì)胞疾病是由β珠蛋白基因中的突變?cè)斐?，其中氨基?6的谷氨酸被纈氨酸取代(在DNA水平上是GAG至GTG)，其中所產(chǎn)生的血紅蛋白被稱為“血紅蛋白S”或“HbS”。在較低氧條件下，HbS的脫氧形式的構(gòu)象轉(zhuǎn)變暴露出蛋白上E與F螺旋之間的疏水補(bǔ)丁。血紅蛋白中β鏈位置6的纈氨酸的疏水殘基能夠與所述疏水補(bǔ)丁締合，造成HbS分子聚集并形成纖維狀沉淀物。這些聚集體又造成RBC的異?；颉牋罨?，導(dǎo)致細(xì)胞的柔性損失。鐮狀化RBC不再能夠擠入毛細(xì)血管床中并且可能導(dǎo)致鐮狀細(xì)胞患者中的血管閉塞性危機(jī)。另外，鐮狀RBC比正常RBC更脆弱，并且易于溶血，最終導(dǎo)致患者中出現(xiàn)貧血。鐮狀細(xì)胞患者的治療和管理是終身主張，涉及抗生素治療、疼痛管理和在急性發(fā)作期間的輸血。一種方法是使用羥基脲，其通過(guò)增加γ珠蛋白的生產(chǎn)而部分地發(fā)揮其作用。然而，長(zhǎng)期羥基脲療法的長(zhǎng)期副作用仍然未知，并且治療引起不希望的副作用并且在不同患者之間可能具有可變的功效。盡管鐮狀細(xì)胞治療的功效增加，但患者的預(yù)期壽命仍然僅為55至59歲并且疾病的相關(guān)發(fā)病率對(duì)患者的生活質(zhì)量具有深遠(yuǎn)的影響。因此，仍需要可用于基因組編輯的另外的方法和組合物，以校正異常基因或改變其他基因的表達(dá)，例如以治療血紅蛋白病，例如鐮狀細(xì)胞疾病。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本文公開用于改變表達(dá)或用于校正一種或多種編碼在遺傳性疾病(例如鐮狀細(xì)胞疾病)中所涉及的蛋白的基因(例如，產(chǎn)生疾病中的缺乏、不足或異常的蛋白和/或調(diào)節(jié)這些蛋白的蛋白)的方法和組合物。本發(fā)明描述了用于基因治療和基因組工程中的組合物和方法。這些蛋白的改變可以導(dǎo)致這些遺傳性疾病的治療。特別是，使用基因組編輯來(lái)校正異?；?，插入野生型基因或改變內(nèi)源基因的表達(dá)。一種方法涉及使用基因校正，其中有缺陷的內(nèi)源性β珠蛋白基因被靶向并且突變體序列被替換。一種方法進(jìn)一步涉及使用干細(xì)胞(例如，造血干細(xì)胞或RBC前體)的修飾，該干細(xì)胞然后可用于植入患者中，以治療血紅蛋白病。在一個(gè)方面，本文描述了經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞或細(xì)胞系，例如與相同類型的細(xì)胞或細(xì)胞系的野生型基因組序列相比而言。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞包含經(jīng)遺傳修飾的RBC前體(稱為“HSC”的造血干細(xì)胞)。細(xì)胞或細(xì)胞系對(duì)于修飾可以是雜合的或純合的。修飾可包括插入、缺失和/或其組合。在某些實(shí)施方案中，用工程改造的核酸酶和供體核酸修飾HSC，使得插入和表達(dá)野生型基因(例如珠蛋白基因)和/或校正內(nèi)源性異常基因。在某些實(shí)施方案中，修飾(例如插入)在核酸酶結(jié)合和/或裂解位點(diǎn)處或附近，包括但不限于對(duì)位于裂解和/或結(jié)合位點(diǎn)的位點(diǎn)的上游或下游的1-300個(gè)堿基對(duì)(或其間的任何數(shù)目的堿基對(duì))內(nèi)的序列進(jìn)行修飾；在結(jié)合和/或裂解位點(diǎn)的任一側(cè)的1-100個(gè)堿基對(duì)(或其間的任何數(shù)目的堿基對(duì))內(nèi)的修飾；在結(jié)合和/或裂解位點(diǎn)的任一側(cè)上的1至50個(gè)堿基對(duì)(或其間的任何數(shù)目的堿基對(duì))內(nèi)的修飾；和/或?qū)怂崦附Y(jié)合位點(diǎn)和/或裂解位點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)的修飾。在某些實(shí)施方案中，修飾是在或接近(例如，1-300個(gè)堿基對(duì)或其間的任何數(shù)目的堿基對(duì))SEQIDNO:23或SEQIDNO:24。在其他實(shí)施方案中，修飾是SEQIDNO:23或SEQIDNO:24的1-100個(gè)堿基對(duì)(或其間的任何數(shù)目的堿基對(duì))。在某些實(shí)施方案中，修飾是在SEQIDNO:23和/或SEQIDNO:24內(nèi)，例如在SEQIDNO:23或SEQIDNO:24的1個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)的修飾。在一些情況下，用于插入的野生型基因序列編碼野生型β珠蛋白。在其他情況下，內(nèi)源性異常基因是β珠蛋白基因，例如一個(gè)或多個(gè)校正內(nèi)源性異常人β-血紅蛋白(Hbb)基因中的至少一個(gè)突變的基因組修飾。在一些方面，β珠蛋白基因的修飾允許轉(zhuǎn)錄的RNA的適當(dāng)剪接。在其他方面，β珠蛋白基因的修飾校正鐮狀等位基因中的突變，使得編碼多肽序列中第六位置的錯(cuò)誤纈氨酸氨基酸的密碼子GTG被改變?yōu)镚AG，其編碼谷氨酸，如在野生型多肽中所發(fā)現(xiàn)的。還提供了從如本文所述的經(jīng)遺傳修飾的干細(xì)胞的部分或完全分化的細(xì)胞(例如，RBC或RBC前體細(xì)胞)。還提供了組合物，例如包含本文所述的經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞的藥物組合物。在另一個(gè)方面，本文描述結(jié)合于基因組中目標(biāo)區(qū)域(例如，β珠蛋白基因)中的靶位點(diǎn)的鋅指蛋白(ZFP)，其中該ZFP包含一個(gè)或多個(gè)工程改造的鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，ZFP是裂解目標(biāo)靶基因組區(qū)域的鋅指核酸酶(ZFN)，其中該ZFN包含一個(gè)或多個(gè)工程改造的鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域和核酸酶裂解結(jié)構(gòu)域或裂解半結(jié)構(gòu)域。裂解結(jié)構(gòu)域和裂解半結(jié)構(gòu)域可以獲自例如各種限制核酸內(nèi)切酶和/或歸巢核酸內(nèi)切酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，裂解半結(jié)構(gòu)域是源自IIS型限制核酸內(nèi)切酶(例如，F(xiàn)okI)。在某些實(shí)施方案中，鋅指結(jié)構(gòu)域識(shí)別珠蛋白或安全港基因中的靶位點(diǎn)。在某些實(shí)施方案中，鋅指結(jié)構(gòu)域包含5或6個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域并識(shí)別珠蛋白基因中的靶位點(diǎn)(例如，示于表1A中的具有5或6個(gè)含識(shí)別螺旋區(qū)域的指的鋅指蛋白)。在另一個(gè)方面，本文描述結(jié)合于基因組中目標(biāo)區(qū)域(例如，β珠蛋白基因)中的靶位點(diǎn)的TALE蛋白(類轉(zhuǎn)錄激活因子)，其中該TALE包含一個(gè)或多個(gè)工程改造的TALE結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，TALE是裂解目標(biāo)靶基因組區(qū)域的核酸酶(TALEN)，其中該TALEN包含一個(gè)或多個(gè)工程改造的TALEDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和核酸酶裂解結(jié)構(gòu)域或裂解半結(jié)構(gòu)域。裂解結(jié)構(gòu)域和裂解半結(jié)構(gòu)域可以獲自例如各種限制核酸內(nèi)切酶和/或歸巢核酸內(nèi)切酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，裂解半結(jié)構(gòu)域是源自IIS型限制核酸內(nèi)切酶(例如，F(xiàn)okI)。在另一個(gè)方面，本文描述結(jié)合于基因組中目標(biāo)區(qū)域(例如，疾病相關(guān)基因)中的靶位點(diǎn)的CRISPR/Cas或TtAgo系統(tǒng)，其中該CRISPR/Cas系統(tǒng)包含CRIPSR/Cas核酸酶和工程改造的crRNA/tracrRNA(或單導(dǎo)向RNA)。在某些實(shí)施方案中，CRISPR/Cas或TtAgo系統(tǒng)識(shí)別珠蛋白基因中的靶標(biāo)。在一些實(shí)施方案中，促進(jìn)細(xì)胞的基因組工程改造的核酸酶作為肽遞送，而在其他實(shí)施方案中，其作為編碼核酸酶的核酸遞送。在一些實(shí)施方案中，多于一種的核酸酶被使用，并且可以被以核酸形式、蛋白形式或其組合形式遞送。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼核酸酶的核酸是mRNA，并且在一些情況下，mRNA被保護(hù)。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，mRNA可以包含ARCA帽和/或可以包含經(jīng)修飾和未修飾的核苷酸的混合物。核酸酶可以包括鋅指核酸酶(ZFN)、TALE-核酸酶(TALEN)、TtAgo或CRISPR/Cas核酸酶系統(tǒng)或其組合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼核酸酶的核酸通過(guò)電穿孔遞送。在另一方面，本文描述了用于在細(xì)胞中核酸酶介導(dǎo)的裂解后增加靶向整合(例如，經(jīng)由HDR)的方法。在某些實(shí)施方案中，所述方法包括以下步驟：(i)將一種或多種核酸酶(和/或mRNA或表達(dá)構(gòu)建體，如果需要的話，其表達(dá)核酸酶和一種或多種單導(dǎo)向RNA)與一個(gè)或多個(gè)供體分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，和(ii)在引入核酸酶之前、期間和/或之后，將影響和/或增加干細(xì)胞擴(kuò)增而不損失干細(xì)胞或分化的一種或多種因子引入該細(xì)胞和/或含有該細(xì)胞的培養(yǎng)基中。供體可以在編碼核酸酶的核酸之前、之后或與其同時(shí)遞送。供體可以通過(guò)病毒和/或非病毒基因轉(zhuǎn)移方法遞送。在其他實(shí)施方案中，供體通過(guò)腺相關(guān)病毒(AAV)遞送至細(xì)胞。在一些情況下，AAV包含與衣殼血清型相比屬于異源血清型的LTR。在其他實(shí)施方案中，供體通過(guò)慢病毒(lentivirus)遞送至細(xì)胞。在一些情況下，慢病毒是整合酶缺陷型慢病毒(IDLV)。在某些實(shí)施方案中，供體核酸通過(guò)非同源依賴性方法(例如，NHEJ)整合。如上所述，在體內(nèi)裂解時(shí)，供體序列可以以靶向方式整合到在DSB位置處的細(xì)胞基因組中。供體序列可以包括用于產(chǎn)生DSB的一種或多種核酸酶的一個(gè)或多個(gè)相同的靶位點(diǎn)。因此，供體序列可以被用于裂解內(nèi)部期望整合的內(nèi)源基因的一種或多種相同的核酸酶裂解。在某些實(shí)施方案中，供體序列包括來(lái)自用于誘導(dǎo)DSB的核酸酶的不同核酸酶靶位點(diǎn)。靶細(xì)胞的基因組中的DSB可以通過(guò)任何機(jī)制產(chǎn)生。在某些實(shí)施方案中，DSB由一個(gè)或多個(gè)鋅指核酸酶(ZFN)、包含鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域(其被工程改造以結(jié)合目標(biāo)區(qū)域內(nèi)的序列)的融合蛋白和裂解結(jié)構(gòu)域或裂解半結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生。在其他實(shí)施方案中，DSB由與核酸酶結(jié)構(gòu)域(TALEN)融合的一個(gè)或多個(gè)TALEDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(天然存在的或非天然存在的)產(chǎn)生。在另外的實(shí)施方案中，使用CRISPR/Cas核酸酶系統(tǒng)產(chǎn)生DSB，其中工程改造的單導(dǎo)向RNA或其功能等同物用于將核酸酶引導(dǎo)至基因組中的靶位點(diǎn)。在另外的實(shí)施方案中，使用TtAgo系統(tǒng)產(chǎn)生DSB。在另一方面，本發(fā)明提供了用于在核酸酶介導(dǎo)的細(xì)胞基因組裂解后增加基因破壞和/或靶向整合(例如基因校正)的試劑盒(例如ZFN、TAL-效應(yīng)結(jié)構(gòu)域核酸酶融合蛋白、TtAgo系統(tǒng)、或工程化的歸巢內(nèi)切核酸酶或具有CRISPR/Cas系統(tǒng)的工程化導(dǎo)向RNA)。試劑盒通常包括：一種或多種結(jié)合靶位點(diǎn)的核酸酶，一種或多種影響干細(xì)胞擴(kuò)增和/或分化的因子，以及用于將核酸酶和干細(xì)胞影響因子導(dǎo)入細(xì)胞使得核酸酶介導(dǎo)的基因破壞和/或靶向整合增強(qiáng)的說(shuō)明書。任選地，含有核酸酶的靶位點(diǎn)的細(xì)胞也可以包括在本文所述的試劑盒中。在某些實(shí)施方案中，試劑盒包含至少一種具有靶基因和能夠在靶基因內(nèi)進(jìn)行裂解的已知核酸酶的構(gòu)建體。此類試劑盒可用于優(yōu)化多種不同宿主細(xì)胞類型中的裂解條件。本發(fā)明考慮的其他試劑盒可以包括能夠在基因組內(nèi)的已知靶基因座內(nèi)進(jìn)行裂解的已知核酸酶，并且可以另外包含供體核酸。在一些方面，供體DNA可編碼多肽、調(diào)節(jié)區(qū)域或結(jié)構(gòu)核酸。在一些實(shí)施方案中，多肽是報(bào)告基因(例如GFP)。這樣的試劑盒對(duì)于優(yōu)化是有用的。這樣的試劑盒可用于優(yōu)化供體整合或構(gòu)建特異性修飾的細(xì)胞、細(xì)胞系和含有基因破壞或靶向插入物的動(dòng)物的條件。在其他方面，描述了將如本文所述的經(jīng)遺傳修飾的干細(xì)胞施用給受試者的方法。本文所述的經(jīng)遺傳修飾的血細(xì)胞前體(“HSC/PC”)通常被提供于骨髓移植物中并且HSC/PC在體內(nèi)分化并成熟。在一些實(shí)施方案中，在G-CSF誘導(dǎo)的動(dòng)員后分離HSC/PC，并且在其他情況下，細(xì)胞是從人類骨髓或臍帶中分離的。在一些方面，通過(guò)經(jīng)設(shè)計(jì)以敲除特異性基因或調(diào)節(jié)序列的核酸酶處理來(lái)編輯HSC/PC。在其他方面，用工程改造的核酸酶和供體核酸修飾HSC/PC，以使得插入并表達(dá)野生型基因或其他目標(biāo)基因和/或校正內(nèi)源異常基因。在一些實(shí)施方案中，在輕度骨髓清除性預(yù)調(diào)節(jié)后，將修飾的HSC/PC施用至患者。在其他方面，在完全骨髓清除后施用HSC/PC，以使得在植入后，100％的造血細(xì)胞是源自經(jīng)修飾的HSC/PC。此外，細(xì)胞可以在細(xì)胞周期的G2期停止。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因HSC/PC細(xì)胞和/或動(dòng)物包括編碼人類基因的轉(zhuǎn)基因。在一些情況下，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物包含在對(duì)應(yīng)于外源轉(zhuǎn)基因的內(nèi)源基因座處的敲除，從而使得能開發(fā)出其中可孤立地研究人類蛋白的體內(nèi)系統(tǒng)。這些轉(zhuǎn)基因模型可用于篩選目的以鑒定可與目標(biāo)人類蛋白相互作用或修飾目標(biāo)人類蛋白的小分子或大的生物分子或其他實(shí)體。在一些方面，將轉(zhuǎn)基因整合至通過(guò)任何本文所述方法獲得的干細(xì)胞(例如，胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞、造血干細(xì)胞等)或動(dòng)物胚胎中的所選基因座(例如，安全港)中，然后植入胚胎以使得活體動(dòng)物出生。然后將動(dòng)物飼養(yǎng)至性成熟并使其產(chǎn)生后代，其中至少一些后代包含編輯的內(nèi)源基因序列或整合的轉(zhuǎn)基因。鑒于作為整體的公開內(nèi)容，這些和其他方面對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見(jiàn)的。附圖說(shuō)明圖1A至1E顯示使用IDLV供體在CD34+細(xì)胞中的β-珠蛋白基因座處的裂解和校正。圖1A(SEQIDNO:3)顯示了β-珠蛋白的外顯子IDNA序列的一部分，其顯示ZFN靶位點(diǎn)(下劃線)在起始密碼子(粗體)和鐮狀突變(粗體，斜體)上。圖1B是顯示人臍帶血CD34+細(xì)胞中β-珠蛋白基因座處的靶向裂解的凝膠。細(xì)胞在用編碼ZFN的體外轉(zhuǎn)錄的mRNA電穿孔后三天進(jìn)行分析。'模擬(Mock)'代表未處理的CD34+細(xì)胞。箭頭表示PCR擴(kuò)增和用Nuclease酶切后的切割條帶。圖1C是在β珠蛋白基因中的相對(duì)于外顯子1和2的鐮狀突變處的位點(diǎn)特異性基因校正的示意圖。還示出了供體構(gòu)建體和在由ZFN裂解并通過(guò)HDR修復(fù)后得到的基因組DNA的細(xì)節(jié)。指示了鐮狀突變和HhaIRFLP(星號(hào))的位置。用于SurveyorNuclease和RFLP測(cè)定的引物位置如下所示。外顯子按比例；斜劃線標(biāo)記表示不按比例的區(qū)域。圖1D是在ZFN和供體存在下靶向基因修飾β-珠蛋白的RFLP凝膠。臍帶血(CB)CD34+細(xì)胞用體外轉(zhuǎn)錄的ZFNmRNA電穿孔和/或用包含如凝膠頂部所示的IDLV的供體轉(zhuǎn)導(dǎo)。細(xì)胞在處理后4天收獲，從供體區(qū)域外部進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用HhaI酶酶切，并在瓊脂糖凝膠上分離。箭頭顯示裂解的產(chǎn)物，表明將RFLP摻入靶位點(diǎn)的基因組中。圖1E是顯示在指定條件下CD34+細(xì)胞中基因修飾百分比的圖形。CBCD34+細(xì)胞用體外轉(zhuǎn)錄的ZFNmRNA電穿孔并用供體IDLV轉(zhuǎn)導(dǎo)。細(xì)胞在處理后三天收獲，從供體區(qū)域外進(jìn)行PCR擴(kuò)增并且qPCR用設(shè)計(jì)用于特異性檢測(cè)產(chǎn)生HhaIRFLP的沉默堿基變化的摻入的引物完成，以及歸一化為結(jié)合在擴(kuò)增子中的β-珠蛋白基因座的外顯子2中的引物，(對(duì)于所有條件，n＝4)。在用ZFN和供體處理的約18％的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)基因修飾。圖2A至2D顯示了優(yōu)化用于轉(zhuǎn)導(dǎo)的ZFN和IDLV劑量的結(jié)果。圖2A、圖2B和圖2C是顯示滴定ZFNmRNA后的結(jié)果的圖形。用增加量的體外轉(zhuǎn)錄的ZFNmRNA對(duì)CD34+細(xì)胞進(jìn)行電穿孔，并用恒定量的供體IDLV轉(zhuǎn)導(dǎo)CD34+細(xì)胞。模擬(Mock)表示未處理的細(xì)胞，ZFN表示僅用30μg/mL的每種ZFN電穿孔的樣品，IDLV表示僅用脈沖處理并用2E+07TU/ml供體IDLV轉(zhuǎn)導(dǎo)的樣品。圖2A顯示了通過(guò)用于RFLP的qPCR測(cè)定的電穿孔后3天的基因修飾率。圖2B顯示了電穿孔后1天的擴(kuò)增倍數(shù)，圖2C顯示了通過(guò)臺(tái)盼(trypan)排除染料確定的在電穿孔后1天的細(xì)胞活力，(對(duì)于所有條件，n＝8)。圖2D顯示了供體整合酶缺陷型慢病毒載體(IDLV)的示意圖：相對(duì)于長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)中的啟動(dòng)子元件，將β-珠蛋白的1.1kb區(qū)域反向克隆到慢病毒骨架中，其中3'LTR含有在反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中轉(zhuǎn)移到前病毒DNA的5'LTR中的自我失活(SIN)缺失。UTR：非翻譯區(qū)，RRE：rev-反應(yīng)元件，Int：內(nèi)含子。圖3A至3C是顯示供體IDLV的滴定的圖。用恒定量的體外轉(zhuǎn)錄的ZFNmRNA對(duì)CD34+細(xì)胞進(jìn)行電穿孔，并用遞增量的供體IDLV轉(zhuǎn)導(dǎo)CD34+細(xì)胞。模擬表示未處理的細(xì)胞，ZFN表示僅用10μg/mL的每種ZFN電穿孔的樣品，IDLV表示僅用脈沖處理并用6E+07TU/ml供體IDLV轉(zhuǎn)導(dǎo)的樣品。圖3A顯示了通過(guò)用于RFLP的qPCR測(cè)定的電穿孔后3天的基因修飾率。圖3B顯示了電穿孔后1天的擴(kuò)增倍數(shù)，圖3C顯示了通過(guò)臺(tái)盼排除染料確定的在電穿孔后1天的細(xì)胞活力，(對(duì)于所有條件n＝6)。圖4A-4F顯示了使用寡核苷酸供體在CD34+細(xì)胞中的β珠蛋白基因座處使用ZFN對(duì)33488/33501進(jìn)行校正。圖4A顯示了寡核苷酸指導(dǎo)的基因修飾(SEQIDNO:4和SEQIDNO:5)的示意圖。圖4B是β-珠蛋白基因座的AvrII酶切的PCR擴(kuò)增子的凝膠。該片段含有天然AvrII位點(diǎn)，其裂解作為AvrII酶切的內(nèi)部對(duì)照(凝膠上的較低條帶)。箭頭指示AvrII裂解產(chǎn)物。在寡聚物供體和ZFN的存在下，存在15％的基因校正率。圖4C顯示SBS#33501ZFN結(jié)合位點(diǎn)(SEQIDNO:53(對(duì)于WT)和SEQIDNO:54(對(duì)于SMS))的沉默突變的六個(gè)可能位點(diǎn)。鐮狀突變用斜體顯示，可能的沉默突變位點(diǎn)(SMS)以粗體顯示。圖4D顯示沉默突變?cè)黾恿甩?珠蛋白的基因校正。用ZFN和所示的供體寡核苷酸轉(zhuǎn)染mPBCD34+細(xì)胞。通過(guò)高通量測(cè)序測(cè)定相關(guān)沉默突變的引入。白色條表示插入和缺失(indel)；灰色條表示基因校正。圖4E顯示沉默突變阻斷ZFN再裂解。檢查具有indel的等位基因以用作同源性介導(dǎo)的修飾的證據(jù)。顯示了還具有NHEJ驅(qū)動(dòng)的indel的證據(jù)的具有基因修飾的等位基因的百分比。圖4F顯示了ZFN濃度和供體類型的優(yōu)化。通過(guò)高通量DNA測(cè)序測(cè)定NHEJ驅(qū)動(dòng)的indel(白色條)和基因校正(灰色條)。鑒于高通量DNA測(cè)序的深度，預(yù)期測(cè)量誤差非常低。WT：野生型；SMS：沉默突變位點(diǎn)；oligo：寡核苷酸。圖5顯示供體長(zhǎng)度和鏈的優(yōu)化。用設(shè)計(jì)為將三堿基對(duì)序列引入β-珠蛋白基因座的ZFN和寡核苷酸的組合轉(zhuǎn)染mPBCD34+細(xì)胞。收獲細(xì)胞，并通過(guò)高通量DNA測(cè)序(HTS)測(cè)定該短序列的NHEJ驅(qū)動(dòng)的indel和靶向整合(“TI”)的水平。每個(gè)樣品獲得約4-9,000個(gè)序列讀數(shù)。圖6A和6B描述部分HDR事件，并揭示在寡核苷酸介導(dǎo)的基因修飾期間的合成從左到右進(jìn)行。圖6A顯示來(lái)自圖3F的ZFN加上SMS124供體的高通量DNA測(cè)序數(shù)據(jù)，其中測(cè)定了部分HDR產(chǎn)物(SMS1、SMS12、SMS24和SMS4等位基因)的證據(jù)。在該實(shí)驗(yàn)中約41％的基因修飾中，6％的修飾來(lái)自SMS12事件，而SMS24等位基因幾乎完全缺失(0.03％)。這種不對(duì)稱意味著DNA合成從左到右進(jìn)行。圖6B證實(shí)了這一點(diǎn)，顯示了使用來(lái)自所有三種ZFN濃度的數(shù)據(jù)的平均值，其中從30μg/mL和60μg/mL樣品的事件向上歸一化以匹配在15μg/mL樣品中觀察到的約41％的基因修飾。圖7A-7D顯示β-珠蛋白基因簇上的靶標(biāo)裂解分析。圖7A是GFP捕獲的說(shuō)明如下：K562紅白血病細(xì)胞用體外轉(zhuǎn)錄的mRNA電穿孔，并用表達(dá)GFP的IDLV載體轉(zhuǎn)導(dǎo)。將細(xì)胞培養(yǎng)60天以稀釋所有未捕獲的GFP，之后使用熒光激活細(xì)胞分選(FACS)分選GFP陽(yáng)性細(xì)胞。對(duì)樣品進(jìn)行nrLAM-PCR，并完成載體整合位點(diǎn)分析。顯示了使用聚類分析確定的β-珠蛋白和δ-珠蛋白的最常見(jiàn)整合位點(diǎn)的概述。HBB：野生型人血紅蛋白β；HBD：人血紅蛋白δ。圖7B顯示在ZFN切割位點(diǎn)周圍的β-珠蛋白基因簇中的染色體11上的部分珠蛋白基因座的比對(duì)(SEQIDNO:6至SEQIDNO:11)。ZFN結(jié)合位點(diǎn)加下劃線，鐮狀突變加粗，斜體。HBB：野生型人血紅蛋白β；HBD：人血紅蛋白δ；HBE1：人血紅蛋白ε；HBBP1：人血紅蛋白β假基因1；HBG1：人血紅蛋白γA；HBG2：人血紅蛋白γG。圖7C是顯示用ZFN體外轉(zhuǎn)錄的mRNA處理的或未處理(模擬)的CD34+細(xì)胞的Nuclease測(cè)定的凝膠。每個(gè)指定的β珠蛋白簇基因在與靶位點(diǎn)具有最高同源性的區(qū)域周圍擴(kuò)增，并用Nuclease裂解。通過(guò)光密度法對(duì)條帶進(jìn)行定量。圖7D是顯示如圖7B所示的SCD患者骨髓樣品的Nuclease測(cè)定的凝膠。γ-珠蛋白基因中的單核苷酸多態(tài)性的雜合性產(chǎn)生背景裂解，即使在未暴露于ZFN的樣品(細(xì)箭頭)中也是如此。圖8是顯示ZFN和寡核苷酸修飾的HSPC的菌落形成潛力的圖形。將mPBCD34+細(xì)胞模擬轉(zhuǎn)染，用10ug/mLZFN轉(zhuǎn)染，或用ZFN和寡核苷酸供體(3μM)轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)5天后，將細(xì)胞接種在含甲基纖維素和細(xì)胞因子的培養(yǎng)基中并分化。生長(zhǎng)十五天后，將菌落形成單位(CFU)計(jì)數(shù)并在形態(tài)學(xué)上分類為紅細(xì)胞(E)、爆發(fā)形成單位-紅細(xì)胞(BFU-E)、粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞(GM)或粒細(xì)胞/紅細(xì)胞/巨噬細(xì)胞/巨核細(xì)胞(GEMM)。圖9A和9B顯示了在紅細(xì)胞分化期間修飾的細(xì)胞的穩(wěn)定性。圖9顯示mPBCD34+細(xì)胞用0μg/mL、3.75μg/mL、7.5μg/mL、15μg/mL或30μg/mL的ZFN和3μM的寡核苷酸供體轉(zhuǎn)染或僅用寡核苷酸供體轉(zhuǎn)染。誘導(dǎo)細(xì)胞分化成紅細(xì)胞，并在0天、6天、12天、15天和18天后取出等分試樣。從細(xì)胞制備基因組DNA，并通過(guò)高通量測(cè)序測(cè)定經(jīng)基因修飾的細(xì)胞的頻度。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每個(gè)樣品獲得約10-50,000個(gè)序列讀數(shù)。圖9B顯示工程細(xì)胞中珠蛋白的HPLC分析。圖10A-10E顯示了經(jīng)ZFN和供體處理過(guò)的細(xì)胞移植到NSG小鼠中。圖10顯示了用ZFN+IDLV處理并體外培養(yǎng)的整體移植細(xì)胞在電穿孔后7天通過(guò)用于RFLP的qPCR確定的基因修飾率。模擬細(xì)胞未被處理，(n＝3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn))。圖10B是顯示通過(guò)對(duì)ZFN+IDLV修飾的CD34+細(xì)胞的高通量測(cè)序評(píng)價(jià)的鐮狀堿基的修飾的圖形。β-珠蛋白基因座的測(cè)序結(jié)果顯示包括鐮狀堿基(T)的改變的野生型以及在切割位點(diǎn)的插入和缺失(indel)的全部對(duì)準(zhǔn)讀數(shù)的百分比。與圖10A中的樣品相同。改變的堿基用白色表示；indel用灰色表示。圖10C是顯示在移植后5周和8周經(jīng)移植的小鼠的外周血中的移植效果(engraftment)的圖形。通過(guò)對(duì)來(lái)自接受模擬處理的或經(jīng)ZFN+IDLV處理的細(xì)胞的小鼠的細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)，將人移植效果確定作為全部hCD45+和mCD45+細(xì)胞中的hCD45+細(xì)胞的百分比。模擬用空心的菱形表示；ZFN+IDLV用實(shí)心的菱形表示。(n＝3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)；模擬：n＝5，ZFN+IDLV：n＝12)。圖10D是顯示CD34+細(xì)胞用Oligo、ZFN或ZFN+Oligo電穿孔并在體外培養(yǎng)，然后移植入NSG小鼠的圖形。鐮狀堿基和indel的修飾率(n＝1)如圖10C所示。圖10E是顯示來(lái)自接受經(jīng)Oligo處理的、ZFN處理的或ZFN+Oligo處理的細(xì)胞的小鼠的細(xì)胞的在如圖10C的外周血中的移植效果的圖形。Oligo用圓表示；ZFN用三角形表示；ZFN+Oligo用菱形表示。(Oligo：n＝8，ZFN：n＝7，ZFN+Oligo：n＝9)，n.s.指不顯著，*表示p<0.05，**表示p<0.01。圖11A和11B顯示了在第8周移植NSG小鼠的譜系分析。在移植后8周，對(duì)用模擬(mock)和ZFN和供體處理的細(xì)胞移植的NSG小鼠的外周血進(jìn)行免疫表型分析。使用流式細(xì)胞術(shù)列舉對(duì)B細(xì)胞(CD19)、T細(xì)胞(CD3)、造血祖細(xì)胞(CD34)、骨髓祖細(xì)胞(CD33)和自然殺傷細(xì)胞(CD56)的標(biāo)記物呈陽(yáng)性的人CD45+細(xì)胞的百分比。圖11A是顯示來(lái)自用模擬處理的或經(jīng)ZFN+IDLV處理的細(xì)胞移植的小鼠的細(xì)胞的圖形，(n＝3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)；模擬：n＝5，ZFN+IDLV：n＝12)。圖11B是顯示來(lái)自用經(jīng)Oligo處理的、ZFN處理的或ZFN+Oligo處理的細(xì)胞移植的小鼠的細(xì)胞的圖形，(Oligo：n＝8，ZFN：n＝7，ZFN+Oligo：n＝9)。n.s.指不顯著；星號(hào)表示顯著性，*表示p<0.05，**表示p<0.01。圖12A至12D顯示了最終外周血移植效果和譜系分析。圖12A是顯示移植后16周移植的小鼠的外周血中的移植效果的圖形。通過(guò)對(duì)來(lái)自接受模擬或ZFN+IDLV處理的細(xì)胞的小鼠的細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)，將人移植效果確定為全部hCD45+和mCD45+細(xì)胞中的hCD45+細(xì)胞的百分比。模擬用空心的菱形表示；ZFN+IDLV用實(shí)心的菱形表示。圖12B是顯示移植后16周時(shí)移植NSG小鼠的外周血的免疫表型分析的圖形。使用對(duì)來(lái)自接受模擬或ZFN+IDLV處理的細(xì)胞的小鼠的細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)，列舉了對(duì)B細(xì)胞(CD19)、T細(xì)胞(CD3)、造血祖細(xì)胞(CD34)、骨髓祖細(xì)胞(CD33)和自然殺傷細(xì)胞(CD56)的標(biāo)記物呈陽(yáng)性的hCD45+細(xì)胞的百分比。模擬用空心的菱形表示；(n＝3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)；模擬：n＝5，ZFN+IDLV：n＝12)。圖12C是顯示來(lái)自接受Oligo處理的、ZFN處理的或ZFN+Oligo處理的細(xì)胞的小鼠的細(xì)胞的在如圖12A的外周血中的移植效果的圖形。Oligo用圓表示；ZFN用三角形表示；ZFN+Oligo用菱形表示。圖12D是顯示來(lái)自接受Oligo處理的、ZFN處理的或ZFN+Oligo處理的細(xì)胞的小鼠的細(xì)胞的在如圖12B的外周血中的譜系分析的圖形。Oligo用圓表示；ZFN用三角形表示；ZFN+Oligo用菱形表示；(Oligo：n＝8，ZFN：n＝7，ZFN+Oligo：n＝9)。n.s.指不顯著；*表示p<0.05。圖13A-13C顯示基因修飾的細(xì)胞存留在NSG小鼠中。圖13A是顯示在16周時(shí)的移植的小鼠的骨髓和脾臟中的、來(lái)自接受模擬或ZFN+IDLV處理的細(xì)胞的小鼠的細(xì)胞中的基因修飾率的圖形。收獲組織，提取并擴(kuò)增基因組DNA，且用qPCR分析并入的RFLP。模擬用空心的菱形表示；ZFN+IDLV用實(shí)心的菱形表示。圖13B是顯示在通過(guò)對(duì)圖13A中描述的樣品的高通量測(cè)序評(píng)價(jià)的鐮狀突變處的校正的圖。β-珠蛋白基因座的測(cè)序結(jié)果顯示含有在鐮狀突變處的修飾堿基的全部對(duì)準(zhǔn)讀數(shù)的百分比。模擬用空心的菱形表示；ZFN+IDLV用實(shí)心的菱形表示。(n＝3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)；模擬：n＝5，ZFN+IDLV：n＝12)。圖13C是顯示來(lái)自如圖13B所述的接受Oligo處理的、ZFN處理的、或ZFN+Oligo處理的細(xì)胞的小鼠的細(xì)胞中的在鐮狀突變處的校正的圖形。模擬用空心的菱形表示；ZFN用三角形表示；ZFN+IDLV用實(shí)心的菱形表示。(Oligo：n＝8，ZFN：n＝7，ZFN+Oligo：n＝9)。n.s.指不顯著；星號(hào)表示顯著性，*表示p<0.05，**表示p<0.01。圖14A至14D顯示了最終骨髓移植效果和譜系分析。圖14A是顯示移植后16周移植的小鼠的骨髓中的移植效果的圖形。通過(guò)對(duì)來(lái)自接受模擬或ZFN+IDLV處理的細(xì)胞的小鼠的細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)，將人移植效果確定為全部hCD45+和mCD45+細(xì)胞中的hCD45+細(xì)胞的百分比。模擬用空心的菱形表示；ZFN+IDLV用實(shí)心的菱形表示。圖14B是顯示移植后16周時(shí)移植NSG小鼠的骨髓的免疫表型分析的圖形。使用對(duì)來(lái)自接受模擬或ZFN+IDLV處理的細(xì)胞的小鼠的細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)，列舉了對(duì)B細(xì)胞(CD19)、T細(xì)胞(CD3)、造血祖細(xì)胞(CD34)、骨髓祖細(xì)胞(CD33)和自然殺傷細(xì)胞(CD56)的標(biāo)記物呈陽(yáng)性的hCD45+細(xì)胞的百分比。模擬用空心的菱形表示；(n＝3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)；模擬：n＝5，ZFN+IDLV：n＝12)。圖14C是顯示來(lái)自接受Oligo處理的、ZFN處理的或ZFN+Oligo處理的細(xì)胞的小鼠的細(xì)胞的在如圖14A的骨髓中的移植效果的圖形。Oligo用圓表示；ZFN用三角形表示；ZFN+Oligo用菱形表示。圖14D是顯示來(lái)自接受Oligo處理的、ZFN處理的或ZFN+Oligo處理的細(xì)胞的小鼠的細(xì)胞的在如圖12B的骨髓中的譜系分析的圖形。Oligo用圓表示；ZFN用三角形表示；ZFN+Oligo用菱形表示；(Oligo：n＝8，ZFN：n＝7，ZFN+Oligo：n＝9)。n.s.指不顯著；*表示p<0.05。圖15A至15C顯示了鐮狀骨髓CD34+細(xì)胞的分化。圖15A是顯示SCD患者骨髓CD34+細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)的圖形，所述SCD患者骨髓CD34+細(xì)胞用體外轉(zhuǎn)錄的ZFNmRNA電穿孔，并用在鐮狀位置攜帶WT堿基的供體IDLV轉(zhuǎn)導(dǎo)，且在紅細(xì)胞條件下生長(zhǎng)。圖15B是表示針對(duì)接種的每200個(gè)細(xì)胞識(shí)別的每種類型的造血菌落的全部菌落形成單位的圖形。圖15C是顯示形成的菌落相對(duì)于接種的細(xì)胞總數(shù)的百分比的圖形。CFU：菌落形成單位；BFU：造粒單元；GEMM：粒細(xì)胞、紅細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞；E：紅細(xì)胞，GM：粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞；G：粒細(xì)胞；M：?jiǎn)魏思?xì)胞，星號(hào)表示顯著性，*表示p<0.05，**表示p<0.01，(n＝2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)；模擬：n＝3；僅ZFN：n＝4；僅IDLV：n＝3，ZFN+IDLV：n＝6)。圖16A至16D顯示鐮狀骨髓CD34+細(xì)胞的功能校正。鐮狀細(xì)胞病患者骨髓CD34+細(xì)胞用體外轉(zhuǎn)錄的ZFNmRNA電穿孔，并用在鐮狀位置攜帶WT堿基的供體IDLV轉(zhuǎn)導(dǎo)，且在紅細(xì)胞條件下生長(zhǎng)。圖16A是顯示在電穿孔后12天通過(guò)用于并入的RFLP的qPCR分析的基因修飾率的圖形。圖16B是顯示通過(guò)高通量測(cè)序評(píng)價(jià)的鐮狀突變處的校正的圖形。β-珠蛋白基因座的測(cè)序結(jié)果顯示含有在鐮狀突變處的經(jīng)校正的WT堿基(A)以及在切割位點(diǎn)的插入和缺失(indel)處的全部對(duì)準(zhǔn)讀數(shù)的百分比。經(jīng)校正的堿基用白色表示；indel用灰色表示。圖16C顯示了對(duì)在培養(yǎng)終止時(shí)分化的紅系細(xì)胞的HPLC分析。將細(xì)胞沉淀(pelleted)，裂解，并通過(guò)高效液相色譜(HPLC)分析上清液。左圖顯示了SCD模擬樣品，右圖顯示了SCDZFN+IDLV樣品。陰影表示HbA:WT成人血紅蛋白峰。圖16D是由主峰表示的曲線下的總面積中HbA的百分比的定量圖。HbA：WT成人血紅蛋白，HbF：胎兒血紅蛋白，HbS：鐮狀血紅蛋白。n.s.：不顯著，(n＝2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)；模擬：n＝3；僅ZFN：n＝4；僅IDLV：n＝3，ZFN+IDLV：n＝6)。圖17A和17B顯示了使用寡核苷酸供體和不同濃度的鋅指核酸酶對(duì)47773/47817在CD34+細(xì)胞中的β-珠蛋白基因座處的校正。圖17A顯示了NHEJDNA修復(fù)的頻度。圖17B顯示了同源性依賴性DNA修復(fù)的頻度。除了鐮狀細(xì)胞突變之外，寡核苷酸供體包括圖4C所示的SMS12突變(黑色柱)或SMS012突變(灰色柱)。具體實(shí)施方式本文公開了用于轉(zhuǎn)導(dǎo)用于基因治療或基因組工程中的細(xì)胞的組合物和方法。特別地，通過(guò)靶向分裂進(jìn)行的外源序列的核酸酶介導(dǎo)的(即ZFN，TALEN、TtAgo或CRISPR/Cas系統(tǒng))靶向整合或基因組改變?cè)诩?xì)胞中有效地實(shí)現(xiàn)。對(duì)于HSC/PC的轉(zhuǎn)導(dǎo)和工程化特別有用的所述方法和組合物也可用于其他細(xì)胞類型，以提供包含在珠蛋白基因中的插入和/或缺失的經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞。具體地，本發(fā)明的方法和組合物可用于通過(guò)校正疾病相關(guān)等位基因來(lái)編輯珠蛋白基因，以治療和預(yù)防鐮狀細(xì)胞病。概述除非另外說(shuō)明，否則本文公開的方法的實(shí)踐以及組合物的制備和利用使用分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、計(jì)算化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA和如本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中得到充分解釋。參見(jiàn)例如Sambrook等，MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL，第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989，和第三版，2001；Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，JohnWiley&Sons，NewYork，1987和定期更新；叢書METHODSINENZYMOLOGY，AcademicPress，SanDiego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION，第三版，AcademicPress，SanDiego，1998；METHODSINENZYMOLOGY，第304卷，“Chromatin”(P.M.Wassarman和A.P.Wolffe編)，AcademicPress，SanDiego，1999；以及METHODSINMOLECULARBIOLOGY，第119卷，“ChromatinProtocols”(P.B.Becker編)HumanaPress，Totowa，1999。定義術(shù)語(yǔ)“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”可交換使用并且是指呈線性或環(huán)狀構(gòu)象以及呈單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。對(duì)于本公開的目的，這些術(shù)語(yǔ)不應(yīng)被理解為在聚合物長(zhǎng)度方面具有限制。所述術(shù)語(yǔ)可以涵蓋天然核苷酸以及在堿基、糖和/或磷酸酯部分(例如，硫代磷酸酯主鏈)中被修飾的核苷酸的已知類似物。一般來(lái)說(shuō)，特定核苷酸的類似物具有相同的堿基配對(duì)特異性；即，A的類似物將與T進(jìn)行堿基配對(duì)。術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”和“蛋白”可交換使用以指代氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語(yǔ)還適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸是相應(yīng)的天然存在的氨基酸的化學(xué)類似物或修飾衍生物的氨基酸聚合物。“結(jié)合”是指大分子之間(例如，蛋白與核酸之間)的序列特異性、非共價(jià)的相互作用。結(jié)合相互作用的組分并非全部都需要具有序列特異性(例如，接觸DNA主鏈中的磷酸酯殘基)，只要相互作用作為整體具有序列特異性即可。這些相互作用的一般特征在于，解離常數(shù)(Kd)為10-6M-1或更低。“親和力”是指結(jié)合強(qiáng)度：結(jié)合親和力增加與較低的Kd相關(guān)?！敖Y(jié)合蛋白”是能夠結(jié)合至另一分子的蛋白。結(jié)合蛋白可結(jié)合于例如DNA分子(DNA-結(jié)合蛋白)、RNA分子(RNA-結(jié)合蛋白)和/或蛋白分子(蛋白-結(jié)合蛋白)。在蛋白-結(jié)合蛋白的情況下，其可結(jié)合于自身(以形成同型二聚體、同型三聚體等)和/或其可結(jié)合于一種或多種不同蛋白的一個(gè)或多個(gè)分子。結(jié)合蛋白可具有一種以上類型的結(jié)合活性。例如，鋅指蛋白具有DNA結(jié)合、RNA結(jié)合和蛋白結(jié)合活性?！颁\指DNA結(jié)合蛋白”(或結(jié)合結(jié)構(gòu)域)是蛋白，或較大蛋白內(nèi)的結(jié)構(gòu)域，其以序列特異性方式通過(guò)一個(gè)或多個(gè)鋅指結(jié)合DNA，所述鋅指是結(jié)合結(jié)構(gòu)域內(nèi)的氨基酸序列的區(qū)域，其結(jié)構(gòu)通過(guò)鋅離子的配位穩(wěn)定化。術(shù)語(yǔ)鋅指DNA結(jié)合蛋白通?？s寫為鋅指蛋白或ZFP?！癟ALEDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域”或“TALE”是包含一個(gè)或多個(gè)TALE重復(fù)結(jié)構(gòu)域/單元的多肽。重復(fù)結(jié)構(gòu)域參與TALE與其同源靶DNA序列的結(jié)合。單一“重復(fù)單元”(也稱為“重復(fù)序列”)通常長(zhǎng)度為33-35個(gè)氨基酸并展現(xiàn)與天然存在的TALE蛋白內(nèi)的其他TALE重復(fù)序列的至少一些序列同源性。鋅指和TALE結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以“工程改造”以結(jié)合于預(yù)定核苷酸序列，例如經(jīng)由天然存在的鋅指或TALE蛋白的識(shí)別螺旋區(qū)域的工程改造(改變一個(gè)或多個(gè)氨基酸)進(jìn)行。因此，工程改造的DNA結(jié)合蛋白(鋅指或TALE)是非天然存在的蛋白。用于工程改造DNA-結(jié)合蛋白的方法的非限制性實(shí)例是設(shè)計(jì)和選擇。所設(shè)計(jì)的DNA結(jié)合蛋白是并非天然存在的蛋白，其設(shè)計(jì)/組成主要源于合理的標(biāo)準(zhǔn)。合理的設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)包括應(yīng)用替換規(guī)則和用于處理儲(chǔ)存現(xiàn)有的ZFP和/或TALE設(shè)計(jì)和結(jié)合數(shù)據(jù)的信息的數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息的計(jì)算化算法。參見(jiàn)例如美國(guó)專利6,140,081；6,453,242；6,534,261和8,586,526；還參見(jiàn)WO98/53058；WO98/53059；WO98/53060；WO02/016536和WO03/016496。“所選的”鋅指蛋白或TALE是自然界中不存在的蛋白，其產(chǎn)生主要是由于實(shí)驗(yàn)過(guò)程，例如噬菌體展示、相互作用捕集或雜交選擇。參見(jiàn)例如美國(guó)專利No.5,789,538；美國(guó)專利No.5,925,523；美國(guó)專利No.6,007,988；美國(guó)專利No.6,013,453；美國(guó)專利No.6,200,759；美國(guó)專利No.8,586,526；WO95/19431；WO96/06166；WO98/53057；WO98/54311；WO00/27878；WO01/60970；WO01/88197；WO02/099084。“TtAgo”是被認(rèn)為參與基因沉默的原核Argonaute蛋白。TtAgo源自嗜熱棲熱菌(Thermusthermophilus)。參見(jiàn)，例如，Swartsetal,ibid,G.Shengetal.,(2013)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.111,652)。“TtAgo系統(tǒng)”是所需的所有組件，包括例如，用于通過(guò)TtAgo酶裂解的導(dǎo)向DNA?！爸亟M”是指兩種多核苷酸之間的遺傳信息的交換過(guò)程，包括但不限于通過(guò)非同源末端連接(NHEJ)和同源重組的供體捕獲。為了本公開的目的，“同源重組”(HR)是指例如在經(jīng)由同源介導(dǎo)的修復(fù)機(jī)制在細(xì)胞中的雙鏈斷裂修復(fù)期間發(fā)生的這種交換的特殊形式。這個(gè)過(guò)程需要核苷酸序列同源性，使用“供體”分子來(lái)模板化“靶標(biāo)”分子(即，經(jīng)歷雙鏈斷裂者)的修復(fù)，并且被不同地稱為“非交叉基因轉(zhuǎn)換”或“短道基因轉(zhuǎn)換”，因?yàn)槠鋵?dǎo)致遺傳信息從供體轉(zhuǎn)移至靶標(biāo)。不希望受任何特定理論束縛，這種轉(zhuǎn)移可涉及在斷裂的靶標(biāo)和供體之間形成的異源雙鏈DNA的錯(cuò)配校正，和/或“合成依賴性鏈復(fù)性”，其中使用供體來(lái)再次合成將變成靶標(biāo)和/或相關(guān)過(guò)程的一部分的遺傳信息。這種特殊化HR通常導(dǎo)致靶標(biāo)分子的序列改變，以使得供體多核苷酸序列的一部分或全部被并入靶多核苷酸中。在本公開的方法中，一種或多種如本文所述的靶向核酸酶在靶序列(例如，細(xì)胞染色質(zhì))中預(yù)定位點(diǎn)處產(chǎn)生雙鏈斷裂(DSB)。DSB可以通過(guò)同源定向修復(fù)或通過(guò)非同源定向修復(fù)機(jī)制導(dǎo)致缺失和/或插入。缺失可以包括任何數(shù)目的堿基對(duì)。類似地，插入可以包括任何數(shù)目的堿基對(duì)，包括例如可選地與斷裂區(qū)域中的核苷酸序列具有同源性的“供體”多核苷酸的整合。供體序列可被物理整合，或者替代地，使用供體多核苷酸作為模板以經(jīng)由同源重組修復(fù)斷裂，從而導(dǎo)致如供體中的全部或一部分核苷酸序列引入細(xì)胞染色質(zhì)中。因此，細(xì)胞染色質(zhì)中的第一序列可改變，并且在某些實(shí)施方案中，可轉(zhuǎn)化成供體多核苷酸中存在的序列。因此，術(shù)語(yǔ)“置換(replaceorreplacement)”的使用可理解為表示一個(gè)核苷酸序列被另一個(gè)置換(即，在信息意義上的序列置換)，并且未必需要一個(gè)多核苷酸被另一個(gè)多核苷酸物理或化學(xué)置換。在任何本文所述的方法中，其他的鋅指蛋白、TALEN、TtAgo和/或CRIPSR/Cas系統(tǒng)可用于對(duì)細(xì)胞內(nèi)其他靶位點(diǎn)的另外的雙鏈裂解。本文所述的任何方法可用于插入任何大小的供體和/或通過(guò)靶向整合破壞目標(biāo)基因表達(dá)的供體序列來(lái)部分或完全地滅活細(xì)胞中的一個(gè)或多個(gè)靶序列。還提供了具有部分或完全失活的基因的細(xì)胞系。在任何本文所述的方法中，外源核苷酸序列(“供體序列”或“轉(zhuǎn)基因”)可含有與目標(biāo)區(qū)域中的基因組序列同源、但不同一的序列，從而刺激同源重組以將非同一序列插入目標(biāo)區(qū)域中。因此，在某些實(shí)施方案中，與目標(biāo)區(qū)域中的序列同源的供體序列的一部分展現(xiàn)與被置換的基因組序列有約80％至99％(或其間的任何整數(shù))序列同一性。在其他實(shí)施方案中，例如如果供體與具有100個(gè)以上連續(xù)堿基對(duì)的基因組序列之間僅相差1個(gè)核苷酸，則供體與基因組序列之間的同源性高于99％。在某些情況下，供體序列的非同源部分可能含有不存在于目標(biāo)區(qū)域中的序列，以使得新序列被引入目標(biāo)區(qū)域中。在這些情況下，非同源序列一般側(cè)接具有50-1,000個(gè)堿基對(duì)(或介于其間的任何整數(shù)值)或大于1,000的任何數(shù)目的堿基對(duì)的序列，其與目標(biāo)區(qū)域中的序列同源或同一。在其他實(shí)施方案中，供體序列與第一序列非同源，并且通過(guò)非同源重組機(jī)制插入基因組中。“裂解”是指DNA分子的共價(jià)主鏈的斷裂。裂解可通過(guò)多種方法起始，包括(但不限于)磷酸二酯鍵的酶促或化學(xué)水解。單鏈裂解和雙鏈裂解都是可能的，并且雙鏈裂解可能由于兩種不同的單鏈裂解事件而發(fā)生。DNA裂解可導(dǎo)致產(chǎn)生鈍端或交錯(cuò)端。在某些實(shí)施方案中，將融合多肽用于靶向雙鏈DNA裂解。“裂解半結(jié)構(gòu)域”是一種多肽序列，其結(jié)合第二多肽(同一或不同)形成具有裂解活性(優(yōu)選雙鏈裂解活性)的復(fù)合物。術(shù)語(yǔ)“第一和第二裂解半結(jié)構(gòu)域”、“+和–裂解半結(jié)構(gòu)域”和“右和左裂解半結(jié)構(gòu)域”可互換使用以指代二聚合的裂解半結(jié)構(gòu)域?qū)Α！肮こ谈脑斓牧呀獍虢Y(jié)構(gòu)域”是已經(jīng)被修飾以與另一個(gè)裂解半結(jié)構(gòu)域(例如，另一個(gè)工程改造的裂解半結(jié)構(gòu)域)形成專性異二聚體的裂解半結(jié)構(gòu)域。也參見(jiàn)美國(guó)專利公布No.7,888,121；No.7,914,796；No.8,034,598和No.8,823,618，其全文通過(guò)引用并入本文中。術(shù)語(yǔ)“序列”是指任何長(zhǎng)度的核苷酸序列，其可以是DNA或RNA；可以是線性、環(huán)狀或分枝的并且可以是單鏈或雙鏈。術(shù)語(yǔ)“供體序列”是指插入基因組中的核苷酸序列。供體序列可以具有任何長(zhǎng)度，例如長(zhǎng)度為介于2個(gè)和100,000,000個(gè)之間的核苷酸(或其間或其上的任何整數(shù)值)，優(yōu)選長(zhǎng)度為介于約100個(gè)和100,000個(gè)之間的核苷酸(或其間的任何整數(shù))，更優(yōu)選長(zhǎng)度為介于約2000個(gè)和20,000個(gè)之間的核苷酸(或其間的任何值)，并且甚至更優(yōu)選介于約5kb和15kb之間(或其間的任何值)?！叭旧|(zhì)”是包含細(xì)胞基因組的核蛋白結(jié)構(gòu)。細(xì)胞染色質(zhì)包含核酸，主要是DNA；和蛋白，包括組蛋白和非組蛋白染色體蛋白。大多數(shù)真核細(xì)胞染色質(zhì)以核小體形式存在，其中核小體核心包含與包含各兩個(gè)的組蛋白H2A、H2B、H3和H4的八聚體相關(guān)的約150個(gè)堿基對(duì)的DNA；并且接頭DNA(取決于生物體，具有可變長(zhǎng)度)在核小體核心之間延伸。組蛋白H1的分子一般與接頭DNA相關(guān)。為了本公開的目的，術(shù)語(yǔ)“染色質(zhì)”意在涵蓋所有類型的原核和真核細(xì)胞核蛋白。細(xì)胞染色質(zhì)包括染色體和游離體染色質(zhì)。“染色體”是包含細(xì)胞基因組的全部或一部分的染色質(zhì)復(fù)合物。細(xì)胞的基因組通常特征在于其核型，其是包含細(xì)胞基因組的所有染色體的集合。細(xì)胞基因組可包含一個(gè)或多個(gè)染色體?！坝坞x體(episome)”是復(fù)制核酸、核蛋白復(fù)合物或包含并非細(xì)胞的染色體核型的一部分的核酸的其他結(jié)構(gòu)。游離體的實(shí)例包括質(zhì)粒和某些病毒基因組?！翱山咏鼌^(qū)域”是細(xì)胞染色質(zhì)中的位點(diǎn)，其中存在于核酸中的靶位點(diǎn)可以通過(guò)識(shí)別靶位點(diǎn)的外源分子結(jié)合。不希望受任何特定理論的束縛，相信可接近區(qū)域是不被包裝到核小體結(jié)構(gòu)中的區(qū)域?？山咏鼌^(qū)域的不同結(jié)構(gòu)通?？梢酝ㄟ^(guò)其對(duì)化學(xué)和酶探針(例如核酸酶)的敏感性來(lái)檢測(cè)?！鞍形稽c(diǎn)”或“靶序列”是定義結(jié)合分子將結(jié)合的核酸的一部分(假如存在結(jié)合的充分條件的話)的核酸序列?！巴庠础狈肿邮峭ǔ２淮嬖谟诩?xì)胞中、但可以通過(guò)一種或多種遺傳、生物化學(xué)或其他方法引入細(xì)胞中的分子?！罢４嬖谟诩?xì)胞中”是在細(xì)胞的特定發(fā)育階段和環(huán)境條件方面測(cè)定。因此，例如，僅在肌肉的胚胎發(fā)育期間存在的分子是關(guān)于成人肌肉細(xì)胞的外源分子。類似地，由熱休克誘導(dǎo)的分子是關(guān)于非熱休克細(xì)胞的外源分子。外源分子可以包含例如不正常工作的內(nèi)源分子的正常工作形式或正常工作的內(nèi)源分子的不正常工作形式。外源分子尤其可以是小分子，例如通過(guò)組合化學(xué)方法產(chǎn)生；或者大分子，例如蛋白、核酸、碳水化合物、脂質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、多糖、上述分子的任何修飾衍生物，或任何包含一種或多種上述分子的復(fù)合物。核酸包括DNA和RNA，可以是單鏈或雙鏈的；可以是線性、分枝或環(huán)狀的；并且可以具有任何長(zhǎng)度。核酸包括能夠形成雙鏈體的核酸，以及形成三鏈體的核酸。參見(jiàn)例如美國(guó)專利No.5,176,996和No.5,422,251。蛋白包括(但不限于)DNA-結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、染色質(zhì)重塑因子、甲基化DNA結(jié)合蛋白、聚合酶、甲基化酶、去甲基化酶、乙酰化酶、去乙酰化酶、激酶、磷酸酶、整合酶、重組酶、連接酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶、促旋酶和解螺旋酶。外源分子可以是與內(nèi)源分子相同類型的分子，例如，外源蛋白或核酸。例如，外源核酸可以包含感染的病毒基因組、引入細(xì)胞中的質(zhì)?；蛴坞x體、或通常不存在于細(xì)胞中的染色體。用于將外源分子引入細(xì)胞中的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且包括但不限于脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移(即，脂質(zhì)體，包括中性和陽(yáng)離子性脂質(zhì))、電穿孔、直接注射、細(xì)胞融合、粒子轟擊、磷酸鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移和病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移。外源分子也可以是與內(nèi)源分子相同類型的分子，但源自與細(xì)胞來(lái)源不同的物種。例如，可將人核酸序列引入最初來(lái)源于小鼠或倉(cāng)鼠的細(xì)胞系。將外源分子引入植物細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且包括但不限于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、碳化硅(例如，WHISKERSTM)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移(即包括中性和陽(yáng)離子脂質(zhì)的脂質(zhì)體)、電穿孔，直接注射、細(xì)胞融合、粒子轟擊(例如使用“基因槍”)、磷酸鈣共沉淀，DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移和病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移。相比之下，“內(nèi)源”分子是通常在特定環(huán)境條件下在特定發(fā)育階段存在于特定細(xì)胞中的分子。例如，內(nèi)源核酸可以包含染色體，線粒體、葉綠體或其他細(xì)胞器的基因組，或天然存在的游離體核酸。其他的內(nèi)源分子可包括蛋白，例如，轉(zhuǎn)錄因子和酶。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“外源核酸的產(chǎn)物”包括多核苷酸和多肽產(chǎn)物，例如轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(多核苷酸，如RNA)和翻譯產(chǎn)物(多肽)。“融合”分子是其中優(yōu)選共價(jià)地連接兩個(gè)或更多個(gè)亞基分子的分子。亞基分子可以是相同化學(xué)類型的分子，或者可以是不同化學(xué)類型的分子。第一類型的融合分子的實(shí)例包括但不限于融合蛋白(例如，ZFP或TALEDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與一個(gè)或多個(gè)活化結(jié)構(gòu)域之間的融合體)和融合核酸(例如，編碼上述融合蛋白的核酸)。第二類型的融合分子的實(shí)例包括但不限于形成三鏈體的核酸與多肽之間的融合體，和小溝結(jié)合物與核酸之間的融合體。融合蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)可由融合蛋白向細(xì)胞的遞送或通過(guò)編碼融合蛋白的多核苷酸向細(xì)胞的遞送產(chǎn)生，其中所述多核苷酸被轉(zhuǎn)錄，并且將轉(zhuǎn)錄物翻譯，以生成融合蛋白。反式剪接、多肽裂解和多肽連接也可涉及蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)。用于將多核苷酸和多肽遞送至細(xì)胞的方法呈現(xiàn)于本公開中其他地方。為了本公開的目的，“基因”包括編碼基因產(chǎn)物(參見(jiàn)上文)的DNA區(qū)域，以及調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物的產(chǎn)生的所有DNA區(qū)域，無(wú)論這些調(diào)節(jié)序列是否與編碼和/或轉(zhuǎn)錄序列相鄰。因此，基因包括(但未必限于)啟動(dòng)子序列、終止子、翻譯調(diào)節(jié)序列例如核糖體結(jié)合位點(diǎn)和內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)、增強(qiáng)子、沉默子、絕緣子、邊界元件、復(fù)制起點(diǎn)、基質(zhì)連接位點(diǎn)和基因座控制區(qū)?！盎虮磉_(dá)”是指基因中所含的信息轉(zhuǎn)化成基因產(chǎn)物。基因產(chǎn)物可以是基因的直接轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(例如，mRNA、tRNA、rRNA、反義RNA、核糖酶、結(jié)構(gòu)RNA或任何其他類型的RNA)或通過(guò)mRNA的翻譯產(chǎn)生的蛋白?；虍a(chǎn)物還包括通過(guò)例如加帽、多腺苷酸化、甲基化和編輯等方法修飾的RNA，和通過(guò)例如甲基化、乙?；?、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化、肉豆蔻?；?myristilation)、和糖基化修飾的蛋白?；虮磉_(dá)的“調(diào)節(jié)”是指基因活性的變化。表達(dá)的調(diào)節(jié)可以包括但不限于基因活化和基因抑制?？梢允褂没蚪M編輯(例如，裂解、改變、失活、隨機(jī)突變)來(lái)調(diào)節(jié)表達(dá)。基因失活是指與不包括如本文所述的ZFP、TALE、TtAgo或CRISPR/Cas系統(tǒng)的細(xì)胞相比，基因表達(dá)的任何降低。因此，基因失活可以是部分的或完全的。“目標(biāo)區(qū)域”是細(xì)胞染色質(zhì)的任何區(qū)域，諸如，例如，需要結(jié)合外源分子的基因或者該基因內(nèi)或與該基因相鄰的非編碼序列。結(jié)合可用于靶向DNA裂解和/或靶向重組的目的。目標(biāo)區(qū)域可存在于例如染色體、游離體、細(xì)胞器基因組(例如，線粒體、葉綠體)或感染的病毒基因組中。目標(biāo)區(qū)域可在基因的編碼區(qū)域內(nèi)、轉(zhuǎn)錄的非編碼區(qū)域內(nèi)，例如，前導(dǎo)序列、尾隨序列或內(nèi)含子內(nèi)，或在編碼區(qū)域上游或下游的非轉(zhuǎn)錄區(qū)域內(nèi)。目標(biāo)區(qū)域的長(zhǎng)度可能小至單個(gè)核苷酸對(duì)或高達(dá)2,000個(gè)核苷酸對(duì)，或任何整數(shù)值的核苷酸對(duì)。“真核”細(xì)胞包括但不限于真菌細(xì)胞(例如酵母)、植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞和人類細(xì)胞(例如，T細(xì)胞)，包括干細(xì)胞(多潛能的和多能的)。術(shù)語(yǔ)“操作性連接”和“操作性地連接”(或可操作地連接)可關(guān)于兩種或更多種組分(例如序列元件)的并置互換使用，其中所述組分被布置以使得兩種組分正常發(fā)揮作用并允許至少一種組分可以介導(dǎo)施加在至少一種其他組分上的功能的可能性。通過(guò)說(shuō)明的方式，如果轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列響應(yīng)于一種或多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的存在或不存在來(lái)控制編碼序列的轉(zhuǎn)錄水平，則轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列例如啟動(dòng)子被操作性地連接至編碼序列。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列一般操作性地與編碼序列順式連接，但無(wú)需與其直接相鄰。例如，增強(qiáng)子是操作性地連接至編碼序列的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，盡管它們是不連續(xù)的。關(guān)于融合多肽，術(shù)語(yǔ)“操作性地連接”可以涉及如下事實(shí)：每一組分與其他組分連接執(zhí)行與其不如此連接將執(zhí)行的功能相同的功能。例如，關(guān)于其中ZFP、TALE、TtAgo或CasDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與活化結(jié)構(gòu)域融合的融合多肽，如果在融合多肽中，所述ZFP、TALE、TtAgo或CasDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域部分能夠結(jié)合其靶位點(diǎn)和/或其結(jié)合位點(diǎn)，而活化結(jié)構(gòu)域能夠上調(diào)基因表達(dá)，則所述ZFP、TALE、TtAgo或CasDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和所述活化結(jié)構(gòu)域是操作性連接的。當(dāng)融合多肽中的ZFP、TALE、TtAgo或CasDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與裂解結(jié)構(gòu)域融合時(shí)，如果在融合多肽中所述ZFP、TALE、TtAgo或CasDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域部分能夠結(jié)合其靶位點(diǎn)和/或其結(jié)合位點(diǎn)，而裂解結(jié)構(gòu)域能夠裂解靶位點(diǎn)附近的DNA，則所述ZFP、TALE、TtAgo或CasDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和所述裂解結(jié)構(gòu)域是操作性連接的。蛋白、多肽或核酸的“功能片段”是序列與全長(zhǎng)蛋白、多肽或核酸不同一、但保持與全長(zhǎng)蛋白、多肽或核酸相同的功能的蛋白、多肽或核酸。功能片段可以具有與相應(yīng)的天然分子相比更多、更少或相同數(shù)目的殘基，和/或可含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸或核苷酸取代。用于測(cè)定核酸功能(例如，編碼功能、與另一個(gè)核酸雜交的能力)的方法是本領(lǐng)域中公知的。類似地，用于測(cè)定蛋白功能的方法是公知的。例如，可例如通過(guò)過(guò)濾器結(jié)合、電泳遷移率變動(dòng)或免疫沉淀測(cè)定法來(lái)測(cè)定多肽的DNA結(jié)合功能。可通過(guò)凝膠電泳來(lái)測(cè)定DNA裂解。參見(jiàn)Ausubel等，同上?？衫缤ㄟ^(guò)共免疫沉淀、雙雜交測(cè)定法或遺傳性和生物化學(xué)互補(bǔ)來(lái)測(cè)定蛋白與另一種蛋白相互作用的能力。參見(jiàn)例如Fields等,(1989)Nature340:245-246；美國(guó)專利No.5,585,245和PCTWO98/44350。“載體”能夠轉(zhuǎn)移基因序列至靶細(xì)胞。通常，“載體構(gòu)建體”、“表達(dá)載體”和“基因轉(zhuǎn)移載體”意指能夠引導(dǎo)目標(biāo)基因的表達(dá)并且可以轉(zhuǎn)移基因序列至靶細(xì)胞的任何核酸構(gòu)建體。因此，所述術(shù)語(yǔ)包括克隆和表達(dá)媒介物，以及整合載體。術(shù)語(yǔ)“受試者”和“患者”可交換使用并且是指哺乳動(dòng)物，例如人患者和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物，以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，例如兔、狗、貓、大鼠、小鼠和其他動(dòng)物。因此，如本文所用的術(shù)語(yǔ)“受試者”或“患者”意指可施用本發(fā)明的核酸酶、供體和/或經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞的任何哺乳動(dòng)物患者或受試者。本發(fā)明的受試者包括具有病癥的那些?！案尚?Stemness)”是指任何細(xì)胞以干細(xì)胞樣方式作用的相對(duì)能力，即，任何特定干細(xì)胞可能有的全能性、多能性或寡能性以及擴(kuò)展或無(wú)限自我更新的程度。增強(qiáng)干細(xì)胞擴(kuò)增的因子可以在本發(fā)明的實(shí)踐中使用增強(qiáng)干細(xì)胞擴(kuò)增和/或分化的任何一個(gè)或多個(gè)因子?？梢詫⒁蜃又苯右爰?xì)胞(例如，作為編碼因子的基因)和/或可以引入周圍的培養(yǎng)基(包括飼養(yǎng)層和其他固體基質(zhì))以影響細(xì)胞。這些因子例如在誘導(dǎo)核酸酶介導(dǎo)的修飾之前、期間或之后的培養(yǎng)條件中的使用增加核酸酶介導(dǎo)的干細(xì)胞修飾的速率?？梢允褂玫囊蜃拥姆窍拗菩詫?shí)例包括SR1(一種芳基烴受體拮抗劑)、dmPGE2(一種前列腺素)、在文庫(kù)篩選中識(shí)別的化合物UM171和UM729(參見(jiàn)Pabstetal(2014)NatMeth11:436-442)、雷帕霉素(參見(jiàn)Wangetal(2014)Blood.pii:blood-2013-12-546218)、血管生成素樣蛋白(“Angptls”，例如Notch/delta/ANGPTL5(參見(jiàn)ZhangZhangetal(2008)Blood.111(7):3415-3423)，Angptl2,Angptl3,Angptl5,Angptl7,和Mfap4)、銅螯合劑四亞乙基戊胺(TEPA，參見(jiàn)deLimaetal(2008)BoneMarTrans41:771-778)、組蛋白脫乙酰酶(HPAC)抑制劑例如丙戊酸(參見(jiàn)Chaurasiaetal(2014)JClinInvest124:2378-2395)、IGF結(jié)合蛋白2(IGFBP2)、煙酰胺(參見(jiàn)Horwitzetal(2014)J.Clin.Invest124:3121-3128)、Tat-myc(參見(jiàn)WO2010025421)和tat-Bcl2(參見(jiàn)WO2014015312)融合蛋白、MAPK14/p38aLy2228820(參見(jiàn)Baudetetal(2012)Blood119(26):6255-6258)、自我更新基因的產(chǎn)物如HOXB4、OCT3/4臍帶血和/或MSC衍生的飼養(yǎng)層或稱為E4+EC的離體血管隙狀共培養(yǎng)系統(tǒng)(參見(jiàn)Butleretal(2012)Blood.120(6):1344–1347)、細(xì)胞因子、(非限制性實(shí)例，StemspanTMCC110,CC100,and/orH3000(StemcellTMtechnologies),Flt-3ligand,SCF,TPO)。在一些實(shí)施方案中，因子包括StemRegenin(SR1，參見(jiàn)例如美國(guó)專利No.8,741,640；Boitanoetal,(2010)Science329(5997):1345-1348)，一種芳烴受體(AhR)拮抗劑，其促進(jìn)離體CD34+細(xì)胞的擴(kuò)增使用在本文所述的方法和組合物中。在其他實(shí)施方案中，所述因子包括作為干細(xì)胞更新的激動(dòng)劑的UM171(參見(jiàn)Faresetal(2013)Blood:122(21))。在其他方面，所述因子包括一種或多種前列腺素，例如dmPGE2。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利No.8,168,428；Northetal(2007)Nature447(7147):1007-1011))。在一些方面，所述因子包括一種或多種激素，例如血管生成素樣蛋白(“Angptls”，例如Angptl2、Angptl3、Angptl5、Angptl7和Mfap4)和IGF結(jié)合蛋白2(IGFBP2)。參見(jiàn)例如美國(guó)專利No.7,807,464；Zhangetal(2008)111(7):3415–3423)。在其他方面，所述因子包括自我更新基因的一種或多種蛋白產(chǎn)物，例如HOXB4或使用的OCT。參見(jiàn)例如美國(guó)專利No.8,735,153；Wattsetal(2012)ExpHematol.40(3):187–196)。替代地，這些基因可以在培養(yǎng)基和/或干細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)。影響干細(xì)胞擴(kuò)增的因子還可以包括細(xì)胞支持方法，包括但不限于衍生自基質(zhì)細(xì)胞和/或MSC衍生的細(xì)胞的飼養(yǎng)層。參見(jiàn)例如Breemsetal(1998)Blood91(1):111-117和Maginetal.,(2009)StemCellsDev.2009Jan-Feb；18(1):173-86?？梢允褂萌魏魏线m量的一種或多種增強(qiáng)干細(xì)胞擴(kuò)增的因子，只要其有效增加核酸酶活性和核酸酶介導(dǎo)的基因組修飾即可。所使用的具體濃度可以容易地由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。在某些實(shí)施方案中，使用介于0.1nM至100μM之間的濃度，例如使用介于0.5μM至25μM之間的濃度，包括其間的任何量(例如，1μM至20μM，3μM至10μM等)。融合分子本文描述可用于在細(xì)胞中(特別是干細(xì)胞中)的所選的靶基因的裂解的組合物，例如核酸酶。在某些實(shí)施方案中，融合分子的一種或多種組分(例如核酸酶)是天然存在的。在其他實(shí)施方案中，融合分子的一種或多種組分(例如核酸酶)是非天然存在的，即，在DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或裂解結(jié)構(gòu)域中工程改造的。例如，天然存在的核酸酶的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域可被改變以結(jié)合至所選靶位點(diǎn)(例如，已經(jīng)工程改造以結(jié)合于不同于同源結(jié)合位點(diǎn)的位點(diǎn)的大范圍核酸酶(meganuclease))。在其他實(shí)施方案中，核酸酶包含異源DNA結(jié)合和裂解結(jié)構(gòu)域(例如，鋅指核酸酶；TAL-效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域DNA結(jié)合蛋白；具有異源裂解結(jié)構(gòu)域的大范圍核酸酶DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域)。A.DNA結(jié)合分子在某些實(shí)施方案中，本文所述的組合物和方法采用用于結(jié)合供體分子和/或結(jié)合細(xì)胞基因組中的目標(biāo)區(qū)域的大范圍核酸酶(歸巢內(nèi)切核酸酶)DNA結(jié)合分子(也稱為DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域)。天然存在的大范圍核酸酶識(shí)別15-40個(gè)堿基對(duì)裂解位點(diǎn)并且通常分成四個(gè)家族：LAGLIDADG家族、GIY-YIG家族、His-Cystbox家族和HNH家族。示例性歸巢核酸內(nèi)切酶包括I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII。其識(shí)別序列是已知的。也參見(jiàn)美國(guó)專利No.5,420,032；美國(guó)專利No.6,833,252；Belfortetal.(1997)NucleicAcidsRes.25:3379–3388；Dujonetal.(1989)Gene82:115–118；Perleretal.(1994)NucleicAcidsRes.22,1125–1127；Jasin(1996)TrendsGenet.12:224–228；Gimbleetal.(1996)J.Mol.Biol.263:163–180；Argastetal.(1998)J.Mol.Biol.280:345–353以及新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室目錄(NewEnglandBiolabscatalogue)。另外，歸巢核酸內(nèi)切酶和大范圍核酸酶的DNA結(jié)合特異性可以被工程改造以結(jié)合非天然靶位點(diǎn)。參見(jiàn)例如Chevalieretal.(2002)Molec.Cell10:895-905；Epinatetal.(2003)NucleicAcidsRes.31:2952-2962；Ashworthetal.(2006)Nature441:656-659；Paquesetal.(2007)CurrentGeneTherapy7:49-66；美國(guó)專利公布No.20070117128。在核酸酶作為總體的情形下，歸巢核酸內(nèi)切酶和大范圍核酸酶的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域可改變(即，使得核酸酶包括同源裂解結(jié)構(gòu)域)或可與異源裂解結(jié)構(gòu)域融合。在其他實(shí)施方案中，在本文所述的方法和組合物中使用的一種或者多種核酸酶的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含天然存在或工程改造(非天然存在)的TAL效應(yīng)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。參見(jiàn)例如美國(guó)專利No.8,586,526，其全文通過(guò)引用并入本文中。已知黃單胞菌(Xanthomonas)屬的植物病原細(xì)菌導(dǎo)致在重要的作物植物中產(chǎn)生許多疾病。黃單胞菌的致病性取決于保守的III型分泌(T3S)系統(tǒng)，其將25種以上不同的效應(yīng)蛋白注入植物細(xì)胞中。在這些注入蛋白中是轉(zhuǎn)錄活化子樣(TAL)效應(yīng)子，其模擬植物轉(zhuǎn)錄活化子并操縱植物轉(zhuǎn)錄組(參見(jiàn)Kayetal,(2007)Science318:648-651)。這些蛋白含有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域。一種最充分表征的TAL效應(yīng)子是來(lái)自通用型番茄瘡痂病辣椒斑點(diǎn)病菌(Xanthomonascampestgrispv.Vesicatoria)的AvrBs3(參見(jiàn)Bonasetal,(1989)MolGenGenet218:127-136和WO2010079430)。TAL效應(yīng)子含有串聯(lián)重復(fù)序列的中心化結(jié)構(gòu)域，每個(gè)重復(fù)序列含有約34個(gè)氨基酸，這對(duì)于這些蛋白的DNA結(jié)合特異性是關(guān)鍵的。另外，它們含有核定位序列和酸性轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域(關(guān)于綜述，參見(jiàn)SchornackSetal,(2006)JPlantPhysiol163(3):256-272)。另外，在植物病原細(xì)菌青枯雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)兩種基因，稱為brg11和hpx17，其與青枯雷爾氏菌生物1型菌株GMI1000和生物4型菌株RS1000中的黃單胞菌的AvrBs3家族同源(參見(jiàn)Heueretal,(2007)ApplandEnvirMicro73(13):4379-4384)。這些基因的核苷酸序列彼此具有98.9％同一性，但差異是在hpx17的重復(fù)結(jié)構(gòu)域中缺失1,575個(gè)堿基對(duì)。然而，兩種基因產(chǎn)物與黃單胞菌的AvrBs3家族蛋白具有小于40％的序列同一性。參見(jiàn)美國(guó)專利No.8,586,526，其全文通過(guò)引用并入本發(fā)明。這些TAL效應(yīng)子的特異性取決于在串聯(lián)重復(fù)序列中發(fā)現(xiàn)的序列。重復(fù)的序列包含約102個(gè)堿基對(duì)，重復(fù)序列通常彼此具有91-100％的同源性(Bonasetal，同上)。重復(fù)序列的多態(tài)性通常位于位置12和13，并且在12和13位的高變雙殘基(RVD)的同一性與TAL效應(yīng)子的靶序列中的連續(xù)核苷酸的同一性之間似乎存在一對(duì)一的對(duì)應(yīng)關(guān)系(參見(jiàn)Moscou和Bogdanove，(2009)Science326:1501和Bochetal(2009)Science326:1509-1512)。實(shí)驗(yàn)上，已經(jīng)確定用于這些TAL效應(yīng)子的DNA識(shí)別的天然編碼，使得位置12和13處的HD序列導(dǎo)致與胞嘧啶(C)結(jié)合，NG結(jié)合T，NI與A、C、G或T結(jié)合，NN結(jié)合A或G，而ING結(jié)合T。這些DNA結(jié)合重復(fù)序列已組裝成具有重復(fù)序列的新組合和數(shù)目的蛋白，以制備能夠與新序列相互作用并激活植物細(xì)胞內(nèi)的非內(nèi)源性報(bào)道基因的表達(dá)的人工轉(zhuǎn)錄因子(Bochetal.，同上)。工程改造的TAL蛋白已經(jīng)連接到FokI裂解半結(jié)構(gòu)域以產(chǎn)生TAL效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域核酸酶融合體(TALEN)。參見(jiàn)例如美國(guó)專利No.8,586,526；Christianetal((2010)<Geneticsepub10.1534/genetics.110.120717)。在某些實(shí)施方案中，TALE結(jié)構(gòu)域包含如在美國(guó)專利No.8,586,526中所述的N帽和/或C帽。在某些實(shí)施方案中，用于細(xì)胞基因組的體外裂解和/或靶向裂解的一種或多種核酸酶的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含鋅指蛋白。優(yōu)選地，鋅指蛋白是非天然存在的，因?yàn)樗?jīng)過(guò)工程改造以結(jié)合于所選的靶位點(diǎn)。參見(jiàn)例如Beerli等,(2002)NatureBiotechnol.20:135-141；Pabo等,(2001)Ann.Rev.Biochem.70:313-340；Isalan等,(2001)NatureBiotechnol.19:656-660；Segal等,(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12:632-637；Choo等,(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10:411-416；美國(guó)專利No.6,453,242；No.6,534,261；No.6,599,692；No.6,503,717；No.6,689,558；No.7,030,215；No.6,794,136；No.7,067,317；No.7,262,054；No.7,070,934；No.7,361,635；No.7,253,273；和美國(guó)專利公布No.2005/0064474；No.2007/0218528；No.2005/0267061，全部通過(guò)引用全文并入本文中。相比于天然存在的鋅指蛋白，工程改造的鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域可具有新結(jié)合特異性。工程改造方法包括(但不限于)合理的設(shè)計(jì)和各種類型的選擇。合理的設(shè)計(jì)包括例如使用包含三重(或四重)核苷酸序列和單獨(dú)的鋅指氨基酸序列的數(shù)據(jù)庫(kù)，其中每個(gè)三重或四重核苷酸序列與結(jié)合特定三重或四重序列的鋅指的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列締合。參見(jiàn)例如共同擁有的美國(guó)專利6,453,242和6,534,261，其全文通過(guò)引用并入本文中。示例性選擇方法(包括噬菌體展示和雙雜交系統(tǒng))公開于美國(guó)專利5,789,538；5,925,523；6,007,988；6,013,453；6,410,248；6,140,466；6,200,759；和6,242,568；以及WO98/37186；WO98/53057；WO00/27878；WO01/88197和GB2,338,237。另外，鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合特異性的增強(qiáng)已經(jīng)描述于例如共同擁有的WO02/077227中。另外，如這些和其他參考文獻(xiàn)中所公開的，鋅指結(jié)構(gòu)域和/或多指鋅指蛋白可使用任何合適的接頭序列(包括例如長(zhǎng)度為5個(gè)或更多個(gè)氨基酸的接頭)連接在一起。關(guān)于長(zhǎng)度為6個(gè)或更多個(gè)氨基酸的示例性接頭序列，還參見(jiàn)美國(guó)專利No.6,479,626；No.6,903,185；和No.7,153,949。本文描述的蛋白可包括蛋白的單獨(dú)的鋅指之間的合適接頭的任何組合。用于設(shè)計(jì)和構(gòu)建融合蛋白(和編碼其的多核苷酸)的靶位點(diǎn)、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的選擇和方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且詳細(xì)地描述于美國(guó)專利No.6,140,081；No.5789,538；No.6,453,242；No.6,534,261；No.5,925,523；No.6,007,988；No.6,013,453；No.6,200,759；WO95/19431；WO96/06166；WO98/53057；WO98/54311；WO00/27878；WO01/60970WO01/88197；WO02/099084；WO98/53058；WO98/53059；WO98/53060；WO02/016536和WO03/016496。另外，如這些和其他參考文獻(xiàn)中所公開的，鋅指結(jié)構(gòu)域和/或多指鋅指蛋白可使用任何合適的接頭序列(包括例如長(zhǎng)度為5個(gè)或更多個(gè)氨基酸的接頭)連接在一起。關(guān)于長(zhǎng)度為6個(gè)或更多個(gè)氨基酸的示例性接頭序列，還參見(jiàn)美國(guó)專利No.6,479,626；No.6,903,185；和No.7,153,949。本文所述的蛋白可包括蛋白的單獨(dú)的鋅指之間的合適接頭的任何組合。在某些實(shí)施方案中，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域是CRISPR/Cas核酸酶系統(tǒng)的一部分，包括例如單導(dǎo)向RNA(sgRNA)。參見(jiàn)例如美國(guó)專利No.8,697,359和美國(guó)專利公布No.20150056705。編碼系統(tǒng)的RNA組分的CRISPR(規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列)基因座和編碼蛋白的cas(CRISPR相關(guān))基因座(Jansenetal.,2002.Mol.Microbiol.43:1565-1575；Makarovaetal.,2002.NucleicAcidsRes.30:482-496；Makarovaetal.,2006.Biol.Direct1:7；Haftetal.,2005.PLoSComput.Biol.1:e60)構(gòu)成CRISPR/Cas核酸酶系統(tǒng)的基因序列。微生物宿主中的CRISPR基因座含有CRISPR相關(guān)(Cas)基因以及能夠?qū)RISPR介導(dǎo)的核酸裂解的特異性編程的非編碼RNA元件的組合。II型CRISPR是最好表征的系統(tǒng)之一，并且在四個(gè)連續(xù)步驟中進(jìn)行靶向DNA雙鏈斷裂。首先，兩個(gè)非編碼RNA，即pre-crRNA陣列和tracrRNA，從CRISPR基因座轉(zhuǎn)錄。第二，tracrRNA與pre-crRNA的重復(fù)區(qū)雜交，并將pre-crRNA的處理介導(dǎo)到含有單獨(dú)間隔序列的成熟crRNA中。第三，成熟的crRNA:tracrRNA復(fù)合物通過(guò)在crRNA上的間隔區(qū)和在靶DNA上的前間區(qū)(protospacer)之間的Watson-Crick堿基配對(duì)將Cas9引導(dǎo)到靶DNA，靶DNA鄰近前間區(qū)序列鄰近基序(PAM)，對(duì)于靶標(biāo)識(shí)別的額外要求。最后，Cas9介導(dǎo)靶DNA的裂解以在前間區(qū)內(nèi)產(chǎn)生雙鏈斷裂。CRISPR/Cas系統(tǒng)的活化包括三個(gè)步驟：(i)將外來(lái)DNA序列插入到CRISPR陣列中以防止未來(lái)在稱為“適應(yīng)”的過(guò)程中的攻擊，(ii)相關(guān)蛋白的表達(dá)，以及陣列的表達(dá)和加工，隨后是(iii)RNA介導(dǎo)的對(duì)外來(lái)核酸的干擾。因此，在細(xì)菌細(xì)胞中，幾種所謂的“Cas”蛋白參與CRISPR/Cas系統(tǒng)的天然功能，并且在諸如插入外來(lái)DNA等之類的功能中起作用。在某些實(shí)施方案中，Cas蛋白可能是天然存在的Cas蛋白的“功能衍生物”。天然序列多肽的“功能衍生物”是具有與天然序列多肽相同的定性生物特性的化合物?！肮δ苎苌铩卑ǖ幌抻谔烊恍蛄械钠魏吞烊恍蛄卸嚯牡难苌镆约捌淦?，條件是其具有與相應(yīng)的天然序列多肽相同的生物活性。本文涵蓋的生物活性是功能衍生物將DNA底物水解成片段的能力。術(shù)語(yǔ)“衍生物”涵蓋多肽的氨基酸序列變體、共價(jià)修飾和其融合體。Cas多肽或其片段的合適的衍生物包括(但不限于)Cas蛋白或其片段的突變體、融合體、共價(jià)修飾。Cas蛋白，其包括Cas蛋白或其片段，以及Cas蛋白或其片段的衍生物，可以從細(xì)胞獲得或化學(xué)合成或通過(guò)這兩種方法的組合來(lái)獲得。細(xì)胞可以是天然產(chǎn)生Cas蛋白的細(xì)胞，或是天然產(chǎn)生Cas蛋白并且被遺傳工程改造以便以更高的表達(dá)水平產(chǎn)生內(nèi)源性Cas蛋白或從外源導(dǎo)入的核酸產(chǎn)生Cas蛋白的細(xì)胞，所述核酸酸編碼與內(nèi)源性Cas相同或不同的Cas。在一些情況下，細(xì)胞不會(huì)天然產(chǎn)生Cas蛋白并且被遺傳工程改造以產(chǎn)生Cas蛋白。在一些實(shí)施方案中，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域是TtAgo系統(tǒng)的一部分(參見(jiàn)Swartsetal.，同上；Shengetal.，同上)。在真核生物中，基因沉默由Argonaute(Ago)家族的蛋白介導(dǎo)。在這個(gè)范例中，Ago與小的(19-31nt)RNA結(jié)合。這種蛋白-RNA沉默復(fù)合物通過(guò)小RNA和靶標(biāo)之間的Watson-Crick堿基配對(duì)識(shí)別靶RNA，并通過(guò)核內(nèi)溶解方式(endonucleolytically)裂解靶RNA(Vogel(2014)Science344:972-973)。相反，原核Ago蛋白結(jié)合小的單鏈DNA片段并且可能起到檢測(cè)和去除外源(通常是病毒)DNA的作用(Yuanetal.,(2005)Mol.Cell19,405；Olovnikov,etal.(2013)Mol.Cell51,594；Swartsetal.，同上)。示例性的原核生物Ago蛋白包括來(lái)自風(fēng)產(chǎn)液菌(Aquifexaeolicus)、類球紅細(xì)菌(Rhodobactersphaeroides)和嗜熱棲熱菌(Thermusthermophilus)的那些。最好表征的原核生物Ago蛋白之一是來(lái)自嗜熱棲熱菌的原核生物Ago蛋白(TtAgo；Swartsetal.，同上)。TtAgo與15nt或13-25nt的具有5'磷酸基團(tuán)的單鏈DNA片段締合。由TtAgo結(jié)合的這種“導(dǎo)向DNA”用于引導(dǎo)蛋白-DNA復(fù)合物結(jié)合DNA的第三方分子中的Watson-Crick互補(bǔ)DNA序列。一旦這些導(dǎo)向DNA中的序列信息已使得能識(shí)別靶DNA，則TtAgo-導(dǎo)向DNA復(fù)合物裂解靶DNA。這樣的機(jī)制也由TtAgo-導(dǎo)向DNA復(fù)合物的結(jié)構(gòu)支持，同時(shí)與其靶DNA結(jié)合(G.Shengetal.，同上)。來(lái)自類球紅細(xì)菌(RsAgo)的Ago具有相似的性質(zhì)(Olivnikovetal.，同上)。任意DNA序列的外源導(dǎo)向DNA可以加載到TtAgo蛋白上(Swartsetal.，同上)。由于TtAgo裂解的特異性由導(dǎo)向DNA引導(dǎo)，因此由外源的、研究者特定的導(dǎo)向DNA形成的TtAgo-DNA復(fù)合物將引導(dǎo)TtAgo靶DNA裂解至互補(bǔ)的研究者特定的靶DNA。以這種方式，可以在DNA中產(chǎn)生靶向的雙鏈斷裂。使用TtAgo-導(dǎo)向DNA系統(tǒng)(或來(lái)自其他生物體的直向同源Ago-導(dǎo)向DNA系統(tǒng))使得在細(xì)胞內(nèi)的基因組DNA能靶向裂解。這種裂解可以是單鏈的或雙鏈的。對(duì)于哺乳動(dòng)物基因組DNA的裂解，優(yōu)選使用為了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)而優(yōu)化的TtAgo密碼子的版本。此外，可能優(yōu)選的是，使用體外形成的TtAgo-DNA復(fù)合物處理細(xì)胞，其中TtAgo蛋白與細(xì)胞穿透肽融合。此外，可能優(yōu)選的是，使用已通過(guò)誘變改變的TtAgo蛋白的版本，以在37攝氏度具有改善的活性。Ago-RNA介導(dǎo)的DNA裂解可以用于影響大量的包括基因敲除、靶向基因添加、基因校正、本領(lǐng)域的用于開發(fā)DNA斷裂的標(biāo)準(zhǔn)的靶向基因缺失使用技術(shù)等在內(nèi)的結(jié)果。因此，核酸酶包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其特異性結(jié)合到期望插入供體(轉(zhuǎn)基因)的任何基因中的靶位點(diǎn)。B.裂解結(jié)構(gòu)域任何合適的裂解結(jié)構(gòu)域可以操作性地連接至DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域以形成核酸酶。例如，ZFPDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域已經(jīng)與核酸酶結(jié)構(gòu)域融合以產(chǎn)生ZFN，其是能夠通過(guò)其工程改造的(ZFP)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域識(shí)別其預(yù)期核酸靶標(biāo)并造成DNA經(jīng)由核酸酶活性在ZFP結(jié)合位點(diǎn)附近被切斷的功能實(shí)體，包括用于多種生物體中的基因組修飾。參見(jiàn)例如美國(guó)專利公布20030232410；20050208489；20050026157；20050064474；20060188987；20060063231；和國(guó)際公布WO07/014275。同樣，TALEDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域已經(jīng)與核酸酶結(jié)構(gòu)域融合以產(chǎn)生TALEN。參見(jiàn)例如美國(guó)公開No.5,886,526。也已經(jīng)描述了包含結(jié)合DNA并與裂解結(jié)構(gòu)域(例如Cas結(jié)構(gòu)域)締合以誘導(dǎo)靶向裂解的單導(dǎo)向RNA(sgRNA)的CRISPR/Cas核酸酶系統(tǒng)。參見(jiàn)例如美國(guó)專利No.8,697,359和No.8,932,814以及美國(guó)專利公布No.20150056705。如上文所示，裂解結(jié)構(gòu)域可與DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域是異源的，例如：鋅指DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和來(lái)自核酸酶的裂解結(jié)構(gòu)域；TALENDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和來(lái)自核酸酶的裂解結(jié)構(gòu)域；sgRNADNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和來(lái)自核酸酶的裂解結(jié)構(gòu)域(CRISPR/Cas)；和/或大范圍核酸酶DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和來(lái)自不同核酸酶的裂解結(jié)構(gòu)域。異源裂解結(jié)構(gòu)域可獲自任何核酸內(nèi)切酶或核酸外切酶?？色@得裂解結(jié)構(gòu)域的示例性核酸內(nèi)切酶包括但不限于限制核酸內(nèi)切酶和歸巢核酸內(nèi)切酶。裂解DNA的其他酶是已知的(例如，S1核酸酶；綠豆核酸酶；胰腺DNA酶I；微球菌核酸酶；酵母HO核酸內(nèi)切酶。這些酶中的一種或多種(或其功能片段)可用作裂解結(jié)構(gòu)域和裂解半結(jié)構(gòu)域的來(lái)源。類似地，裂解半結(jié)構(gòu)域可源自如上文所述的任何核酸酶或其部分，其需要二聚合以提供裂解活性。一般來(lái)說(shuō)，如果融合蛋白包含裂解半結(jié)構(gòu)域，則裂解需要兩個(gè)融合蛋白。替代地，可使用包含兩個(gè)裂解半結(jié)構(gòu)域的單一蛋白。兩個(gè)裂解半結(jié)構(gòu)域可源自相同的核酸內(nèi)切酶(或其功能片段)，或每個(gè)裂解半結(jié)構(gòu)域可源自不同的核酸內(nèi)切酶(或其功能片段)。另外，兩個(gè)融合蛋白的靶位點(diǎn)優(yōu)選彼此之間相互布置，以使得兩個(gè)融合蛋白與其相應(yīng)的靶位點(diǎn)的結(jié)合將裂解半結(jié)構(gòu)域置于彼此的空間方位中以使得裂解半結(jié)構(gòu)域例如通過(guò)二聚合能形成功能性裂解結(jié)構(gòu)域。因此，在某些實(shí)施方案中，靶位點(diǎn)的附近邊緣被5-8個(gè)核苷酸或15-18個(gè)核苷酸隔開。然而，任何整數(shù)數(shù)目的核苷酸或核苷酸對(duì)可以插入兩個(gè)靶位點(diǎn)之間(例如，2至50個(gè)核苷酸對(duì)或更多個(gè))。一般來(lái)說(shuō)，裂解位點(diǎn)位于靶位點(diǎn)之間。限制核酸內(nèi)切酶(限制酶)存在于許多物種中并且能夠序列特異性結(jié)合于DNA(在識(shí)別位點(diǎn))，并且在結(jié)合位點(diǎn)處或附近裂解DNA。某些限制酶(例如，IIS型)在從識(shí)別位點(diǎn)去除的位點(diǎn)裂解DNA并且具有可分離的結(jié)合和裂解結(jié)構(gòu)域。例如，IIS型酶FokI催化DNA的雙鏈裂解，在一條鏈上從其識(shí)別位點(diǎn)開始的9個(gè)核苷酸處以及在另一條鏈上從其識(shí)別位點(diǎn)開始的13個(gè)核苷酸處。參見(jiàn)例如美國(guó)專利5,356,802；5,436,150和5,487,994；以及Lietal.,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4275-4279；Lietal.,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2764-2768；Kimetal.,(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:883-887；Kimetal.等,(1994b)J.Biol.Chem.269:31,978-31,982。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白包含來(lái)自至少一種IIS型限制酶的裂解結(jié)構(gòu)域(或裂解半結(jié)構(gòu)域)和一個(gè)或多個(gè)鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其可能被工程改造或可能不被工程改造。示例性IIS型限制酶(其裂解結(jié)構(gòu)域可與結(jié)合結(jié)構(gòu)域分離)是FokI。這種特定的酶作為二聚體形式是具活性的。Bitinaiteetal.,(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:10,570-10,575。因此，為了本公開的目的，在所公開的融合蛋白中使用的FokI酶的部分被視為裂解半結(jié)構(gòu)域。因此，對(duì)于使用鋅指-FokI融合體的細(xì)胞序列的靶向雙鏈裂解和/或靶向置換，可使用各包含F(xiàn)okI裂解半結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)融合蛋白來(lái)重構(gòu)催化活性裂解結(jié)構(gòu)域。可選地，還可以使用含有鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)FokI裂解半結(jié)構(gòu)域的單一多肽分子。用于使用鋅指FokI融合物的靶向裂解和靶序列改變的參數(shù)在本公開內(nèi)容的其他地方提供。裂解結(jié)構(gòu)域或裂解半結(jié)構(gòu)域可以是保持裂解活性或保持多聚合(例如，二聚合)以形成功能性裂解結(jié)構(gòu)域的能力的蛋白的任何部分。示例性IIS型限制酶描述于以全文引用的方式并入本文中的國(guó)際公布WO07/014275中。其他限制酶也含有可分離的結(jié)合和裂解結(jié)構(gòu)域，并且這些由本公開所涵蓋。參見(jiàn)例如Robertsetal.,(2003)NucleicAcidsRes.31:418-420。在某些實(shí)施方案中，裂解結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)或多個(gè)減少或預(yù)防同型二聚合的工程改造的裂解半結(jié)構(gòu)域(也稱為二聚合結(jié)構(gòu)域突變體)，如例如美國(guó)專利公布No.20050064474；No.20060188987；No.20070305346和20080131962中所述，其全部的公開內(nèi)容都全文通過(guò)引用并入本文中。FokI的位置446、447、479、483、484、486、487、490、491、496、498、499、500、531、534、537和538處的氨基酸殘基都是影響FokI裂解半結(jié)構(gòu)域的二聚合的靶標(biāo)?？梢允褂枚嘤谝粋€(gè)的突變的裂解結(jié)構(gòu)域，例如在一個(gè)裂解半結(jié)構(gòu)域中的位置490(E→K)和538(I→K)突變，以產(chǎn)生工程改造的裂解半結(jié)構(gòu)域(稱為“E490K:I538K”)以及通過(guò)在另一個(gè)裂解半結(jié)構(gòu)域中的位置486(Q→E)和499(I→L)突變以產(chǎn)生工程改造的裂解半結(jié)構(gòu)域(稱為“Q486E:I499L”)；用Glu(E)殘基置換位置486處的野生型Gln(Q)殘基、用Leu(L)殘基置換位置499處的野生型Iso(I)殘基和用Asp(D)或Glu(E)殘基置換位置496處的野生型Asn(N)殘基的突變(也分別稱為“ELD”和“ELE”結(jié)構(gòu)域)；工程改造的裂解半結(jié)構(gòu)域包含在位置490、538和537(相對(duì)于野生型FokI進(jìn)行編號(hào))處的突變，例如用Lys(K)殘基置換位置490處的野生型Glu(E)殘基、用Lys(K)殘基置換位置538處的野生型Iso(I)殘基和用Lys(K)殘基或Arg(R)殘基置換位置537處的野生型His(H)殘基的突變(也分別稱為“KKK”和“KKR”結(jié)構(gòu)域)；和/或工程改造的裂解半結(jié)構(gòu)域包含在位置490和537(相對(duì)于野生型FokI進(jìn)行編號(hào))處的突變，例如用Lys(K)殘基置換位置490處的野生型Glu(E)殘基和用Lys(K)殘基或Arg(R)殘基置換位置537處的野生型His(H)殘基的突變(也分別稱為“KIK”和“KIR”結(jié)構(gòu)域)。參見(jiàn)例如美國(guó)專利No.7,914,796；No.8,034,598和No.8,623,618，其公開內(nèi)容通過(guò)引用整體并入本文以用于所有目的。在其他實(shí)施方案中，工程改造的裂解半結(jié)構(gòu)域包含“Sharkey”和/或“Sharkey”突變(參見(jiàn)Guoetal,(2010)J.Mol.Biol.400(1):96-107)。替代地，可使用所謂的“裂解酶”技術(shù)在體內(nèi)核酸靶位點(diǎn)處組裝核酸酶(參見(jiàn)例如美國(guó)專利公布No.20090068164)。這些裂解酶的組分可表達(dá)在單獨(dú)的表達(dá)構(gòu)建體上，或者可連接于一個(gè)開放閱讀框中，其中例如通過(guò)自裂解2A肽或IRES序列分離單獨(dú)的組分。組分可能是單獨(dú)的鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域或大范圍核酸酶核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域?？稍谑褂们搬槍?duì)活性篩選核酸酶，例如在基于酵母的染色體系統(tǒng)中，如美國(guó)專利No.8,563,314中所述。Cas9相關(guān)CRISPR/Cas系統(tǒng)包含兩種RNA非編碼組分：含有由同一的定向重復(fù)序列(DR)隔開的核酸酶引導(dǎo)序列(間隔序列)的tracrRNA和pre-crRNA陣列。為了使用CRISPR/Cas系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)基因組工程改造，這些RNA的兩種功能必須存在(參見(jiàn)Congetal,(2013)Sciencexpress1/10.1126/science1231143)。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)由單獨(dú)的表達(dá)構(gòu)建體或以單獨(dú)的RNA形式提供tracrRNA和pre-crRNA。在其他實(shí)施方案中，構(gòu)建嵌合RNA，其中將工程改造的成熟crRNA(賦予靶標(biāo)特異性)與tracrRNA(提供與Cas9相互作用)融合以產(chǎn)生嵌合的cr-RNA-tracrRNA雜合體(也稱為單導(dǎo)向RNA)。(參見(jiàn)Jinek，同上；和Cong，同上)。靶位點(diǎn)如上文所詳細(xì)描述的，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以經(jīng)過(guò)工程改造以結(jié)合于基因座任何所選序列。相比于天然存在的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，工程改造的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域可具有新結(jié)合特異性。合適的靶基因的非限制性實(shí)例是貝塔(β)珠蛋白基因(HBB)、伽馬(δ)珠蛋白基因(HBG1)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病11A(BCL11A)基因、Kruppel樣因子1(KLF1)基因、CCR5基因、CXCR4基因、PPP1R12C(AAVS1)基因、次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HPRT)基因、白蛋白基因、因子VIII基因、因子IX基因、富含亮氨酸的重復(fù)激酶2(LRRK2)基因、亨廷頓(Htt)基因、視紫紅質(zhì)(RHO)基因、囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)劑(CFTR)基因、表面活性蛋白B基因(SFTPB)、T細(xì)胞受體α(TRAC)基因、T細(xì)胞受體β(TRBC)基因、程序性細(xì)胞死亡1(PD1)基因、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4(CTLA-4)基因、人白細(xì)胞抗原(HLA)A基因、HLAB基因、HLAC基因、HLA-DPA基因、HLA-DQ基因、HLA-DRA基因、LMP7基因、與抗原加工(TAP)1基因相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)體、TAP2基因、tapasin基因(TAPBP)、II類主要組織相容性復(fù)合體反式激活因子(CIITA)基因、肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白基因(DMD)、糖皮質(zhì)激素受體基因(GR)、IL2RG基因、Rag-1基因、RFX5基因、FAD2基因、FAD3基因、ZP15基因、KASII基因、MDH基因和/或EPSPS基因。在某些實(shí)施方案中，核酸酶靶向“安全港”基因座，例如人類細(xì)胞中的AAVS1、HPRT、白蛋白和CCR5基因，和鼠細(xì)胞中的Rosa266(參見(jiàn)例如美國(guó)專利No.7,888,121；No.7,972,854；No.7,914,796；No.7,951,925；No.8,110,379；No.8,409,861；No.8,586,526；美國(guó)專利公布20030232410；20050208489；20050026157；20060063231；20080159996；201000218264；20120017290；20110265198；20130137104；20130122591；20130177983和20130177960)和植物中的Zp15基因座(參見(jiàn)美國(guó)專利US8,329,986)。供體在某些實(shí)施方案中，本公開涉及干細(xì)胞的基因組的核酸酶介導(dǎo)的修飾。如上文所示，插入外源序列(也稱為“供體序列”或“供體”或“轉(zhuǎn)基因”)，例如以缺失指定區(qū)域和/或校正突變基因或用于增加野生型基因的表達(dá)。將顯而易見(jiàn)的是，供體序列通常不與其所安置的基因組序列同一。供體序列可含有非同源序列，其側(cè)接兩個(gè)同源區(qū)域以允許在目標(biāo)位置處的有效HDR或可以通過(guò)非同源性定向修復(fù)機(jī)制整合。另外，供體序列可包含含有不與細(xì)胞染色質(zhì)中的目標(biāo)區(qū)域同源的序列的載體分子。供體分子可含有若干個(gè)不連續(xù)的與細(xì)胞染色質(zhì)同源的區(qū)域。此外，對(duì)于通常不存在于目標(biāo)區(qū)域中的序列的靶向插入，所述序列可存在于供體核酸分子中并側(cè)接與目標(biāo)區(qū)域中的序列同源的區(qū)域。與核酸酶一樣，可以將供體以任何形式引入。在某些實(shí)施方案中，以mRNA形式引入供體以消除修飾的細(xì)胞中的殘留病毒。在其他實(shí)施方案中，可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法使用DNA和/或病毒載體引入供體。參見(jiàn)例如美國(guó)專利公布No.20100047805和No.20110207221。供體可以以環(huán)狀或線性形式引入細(xì)胞中。如果以線性形式引入，則可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來(lái)保護(hù)供體序列的末端(例如，免于核酸外切降解)。例如，將一個(gè)或多個(gè)二脫氧核苷酸殘基添加至線性分子的3'端和/或?qū)⒆曰パa(bǔ)寡核苷酸連接至一端或兩端。參見(jiàn)例如Changetal.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:4959-4963；Nehlsetal.(1996)Science272:886-889。用于保護(hù)外源多核苷酸免于降解的其他方法包括但不限于添加末端氨基和使用經(jīng)修飾的核苷酸連鎖，例如，硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和O-甲基核糖或脫氧核糖殘基。在某些實(shí)施方案中，供體包括長(zhǎng)度大于1kb、例如介于2kb和200kb之間、介于2kb和10kb之間(或介于其間的任何數(shù)值)的序列(例如，編碼序列，也稱為轉(zhuǎn)基因)。供體也可以包括例如至少一個(gè)核酸酶靶位點(diǎn)。在某些實(shí)施方案中，供體包括至少2個(gè)靶位點(diǎn)，例如用于一對(duì)ZFN、TALEN、TtAgo或CRISPR/Cas核酸酶。通常，核酸酶靶位點(diǎn)是在轉(zhuǎn)基因序列外部，例如，轉(zhuǎn)基因序列的5'和/或3'，以裂解轉(zhuǎn)基因。核酸酶裂解位點(diǎn)可用于任何核酸酶。在某些實(shí)施方案中，雙鏈供體中所含的核酸酶靶位點(diǎn)是針對(duì)用于裂解內(nèi)源靶標(biāo)的相同核酸酶，在所述內(nèi)源靶標(biāo)中已經(jīng)由同源非依賴性方法整合裂解供體?？梢圆迦牍w以使得其表達(dá)受到整合位點(diǎn)處的內(nèi)源啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，所述內(nèi)源啟動(dòng)子即驅(qū)動(dòng)內(nèi)部已插入供體的內(nèi)源基因的表達(dá)的啟動(dòng)子。然而，將顯而易見(jiàn)的是，供體可包含啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子，例如組成型啟動(dòng)子或者誘導(dǎo)型或組織特異性啟動(dòng)子?？蓪⒐w分子插入內(nèi)源基因中以使得所有、一些或無(wú)內(nèi)源基因被表達(dá)。此外，盡管不是表達(dá)所需，但外源序列還可包括轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)序列，例如，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、絕緣子、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)、編碼2A肽的序列和/或多腺苷酸化信號(hào)。在本文所述的供體序列上攜帶的轉(zhuǎn)基因可使用本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(例如PCR)從質(zhì)粒、細(xì)胞或其他來(lái)源分離。供使用的供體可包括不同類型的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，包括超螺旋環(huán)狀、松弛環(huán)狀、線性等。替代地，它們可使用標(biāo)準(zhǔn)寡核苷酸合成技術(shù)來(lái)化學(xué)合成。另外，供體可被甲基化或缺乏甲基化。供體可呈細(xì)菌或酵母人工染色體(BAC或YAC)形式。本文所述的供體多核苷酸可包括一個(gè)或多個(gè)非天然堿基和/或主鏈。特別是，可使用本文所述的方法進(jìn)行具有甲基化胞嘧啶的供體分子的插入以在目標(biāo)區(qū)域中實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄休眠狀態(tài)。外源(供體)多核苷酸可包含任何目標(biāo)序列(外源序列)。示例性外源序列包括(但不限于)任何多肽編碼序列(例如，cDNA)、啟動(dòng)子序列、增強(qiáng)子序列、表位標(biāo)簽、標(biāo)記基因、裂解酶識(shí)別位點(diǎn)和各種類型的表達(dá)構(gòu)建體。標(biāo)記基因包括但不限于編碼介導(dǎo)抗生素抗性(例如，氨芐青霉素抗性、新霉素抗性、G418抗性、嘌呤霉素抗性)的序列、編碼有色或熒光或發(fā)光蛋白(例如，綠色熒光蛋白、增強(qiáng)型綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、熒光素酶)的序列，和介導(dǎo)增強(qiáng)的細(xì)胞生長(zhǎng)和/或基因擴(kuò)增的蛋白(例如，二氫葉酸還原酶)。表位標(biāo)簽包括例如一個(gè)或多個(gè)拷貝的FLAG、His、myc、Tap、HA或任何可檢測(cè)的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，供體還包含編碼需要在細(xì)胞中表達(dá)的任何多肽的多核苷酸，所述多肽包括但不限于抗體、抗原、酶、受體(細(xì)胞表面或核)、激素、淋巴因子、細(xì)胞因子、報(bào)告多肽、生長(zhǎng)因子和任何上述物質(zhì)的功能片段。編碼序列可以是例如cDNA。在某些實(shí)施方案中，外源序列可包含使得能選擇已經(jīng)歷靶向整合的細(xì)胞的標(biāo)記基因(上文所述)，和編碼其他功能性的連接序列。標(biāo)記基因的非限制性實(shí)例包括GFP、藥物選擇標(biāo)記等。在某些實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因可包括例如置換突變內(nèi)源序列的野生型基因。例如，野生型(或者其他功能型)基因序列可插入干細(xì)胞基因組中，其中基因的內(nèi)源拷貝被突變。轉(zhuǎn)基因可插入在內(nèi)源基因座處，或者可以可選地靶向安全港基因座。遵循本說(shuō)明書的教導(dǎo)，這些表達(dá)盒的構(gòu)建利用分子生物領(lǐng)域中公知的方法(參見(jiàn)例如Ausubel或Maniatis)。在使用表達(dá)盒來(lái)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物之前，可通過(guò)將表達(dá)盒引入合適的細(xì)胞系(例如，原代細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞或永生化細(xì)胞系)來(lái)測(cè)試表達(dá)盒對(duì)于與所選控制元件相關(guān)的應(yīng)力誘導(dǎo)物的反應(yīng)性。此外，盡管不是表達(dá)所需，但外源序列還可包括轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)序列，例如，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、絕緣子、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)、編碼2A肽的序列和/或多腺苷酸化信號(hào)。此外，目標(biāo)基因的控制元件可以可操作地連接至報(bào)告基因以產(chǎn)生嵌合基因(例如，報(bào)告表達(dá)盒)。示例性剪接受體位點(diǎn)序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且僅舉例而言，包括CTGACCTCTTCTCTTCCTCCCACAG，(SEQIDNO:1)(來(lái)自人HBB基因)和TTTCTCTCCACAG(SEQIDNO:2)(來(lái)自人免疫珠蛋白-γ基因)。也可能實(shí)現(xiàn)非編碼核酸序列的靶向插入。編碼反義RNA、RNAi、shRNA和微RNA(miRNA)的序列也可用于靶向插入。在其他實(shí)施方案中，供體核酸可包含對(duì)于其他核酸酶設(shè)計(jì)是特異性靶位點(diǎn)的非編碼序列。隨后，其他核酸酶可表達(dá)于細(xì)胞中以使得原始供體分子裂解并通過(guò)插入另一種目標(biāo)供體分子來(lái)修飾。以這種方式，可產(chǎn)生供體分子的反復(fù)整合，從而使得能在特定的目標(biāo)基因座處或在安全港基因座處特性堆疊。細(xì)胞因此，本文提供了經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞，例如包含失活基因和/或轉(zhuǎn)基因的干細(xì)胞，包括通過(guò)本文所述的方法產(chǎn)生的細(xì)胞。使用一種或多種核酸酶將轉(zhuǎn)基因以靶向方式整合到細(xì)胞的基因組中。與隨機(jī)整合不同，靶向整合確保轉(zhuǎn)基因整合到指定基因中。轉(zhuǎn)基因可以整合在靶基因的任何位置。在某些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因整合在核酸酶結(jié)合和/或裂解位點(diǎn)處或附近，例如整合在裂解和/或結(jié)合位點(diǎn)的上游或下游且介于1個(gè)-300個(gè)堿基對(duì)(或其間的任何數(shù)目的堿基對(duì))之間，優(yōu)選在裂解和/或結(jié)合位點(diǎn)的任一側(cè)介于1個(gè)至100個(gè)堿基對(duì)(或其間的任何數(shù)目的堿基對(duì))之間，甚至更優(yōu)選在裂解和/或結(jié)合位點(diǎn)的任一側(cè)介于1至50個(gè)堿基對(duì)之間。在某些實(shí)施方案中，整合序列不包括任何載體序列(例如，病毒載體序列)。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞包含由本文所述的核酸酶制備的修飾(例如插入和/或缺失)，使得修飾在β-珠蛋白基因的外顯子內(nèi)，例如在外顯子1、2或3內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，修飾校正β珠蛋白基因的外顯子1中的鐮狀細(xì)胞突變。在某些實(shí)施方案中，修飾是在或接近(例如，1個(gè)-300個(gè)堿基對(duì)或其間的任何數(shù)目的堿基對(duì))SEQIDNO:23或SEQIDNO:24。在其他實(shí)施方案中，修飾是SEQIDNO:23或SEQIDNO:24的1個(gè)-100個(gè)(或其間的任何數(shù)目的堿基對(duì))。在某些實(shí)施方案中，修飾是在SEQIDNO:23和/或SEQIDNO:24內(nèi)，例如是在SEQIDNO:23或SEQIDNO:24內(nèi)的1個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)的修飾。任何細(xì)胞類型可以如本文所述進(jìn)行遺傳修飾以包含轉(zhuǎn)基因，包括但不限于細(xì)胞和細(xì)胞系。本文所述的經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞的其他非限制性實(shí)例包括T細(xì)胞(例如CD4+、CD3+、CD8+等)；樹突細(xì)胞；B細(xì)胞；自體細(xì)胞(例如，患者衍生的)。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞是干細(xì)胞，包括異源多潛能(pluripotent)干細(xì)胞、全能干細(xì)胞或多能(multipotent)干細(xì)胞(例如，CD34+細(xì)胞、誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞(iPSC)、胚胎干細(xì)胞等)。在某些實(shí)施方案中，本文所述的細(xì)胞是源自患者的干細(xì)胞。本文所述的細(xì)胞可用于治療和/或預(yù)防患有病癥的受試者的所述疾癥，例如通過(guò)離體治療進(jìn)行。核酸酶修飾的細(xì)胞可以擴(kuò)增，然后使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)重新引入患者。參見(jiàn)，例如Tebasetal(2014)NewEngJMed370(10):901。在干細(xì)胞的情況下，在輸入受試者后，也發(fā)生這些前體體內(nèi)分化成表達(dá)功能性蛋白(來(lái)自插入的供體)的細(xì)胞。還提供了包含本文所述細(xì)胞的藥物組合物。此外，細(xì)胞可以在施用給患者之前冷凍保存。遞送本文描述的核酸酶、編碼這些核酸酶的多核苷酸、供體多核苷酸和包含所述蛋白和/或多核苷酸的組合物可通過(guò)任何合適的方式遞送。在某些實(shí)施方案中，核酸酶和/或供體在體內(nèi)遞送。在其他實(shí)施方案中，將核酸酶和/或供體遞送至分離的細(xì)胞(例如，自體或異源干細(xì)胞)，以提供用于離體遞送至患者的經(jīng)修飾細(xì)胞。如本文所述的遞送核酸酶的方法描述于例如美國(guó)專利No.6,453,242；No.6,503,717；No.6,534,261；No.6,599,692；No.6,607,882；No.6,689,558；No.6,824,978；No.6,933,113；No.6,979,539；No.7,013,219；和No.7,163,824中，其全部的公開內(nèi)容以全文引用的方式并入本文中。如本文所述的核酸酶和/或供體構(gòu)建體也可使用任何核酸遞送機(jī)制，包括裸DNA和/或RNA(例如mRNA)以及含有編碼組分中的一種或多種的序列的載體遞送。可使用任何載體系統(tǒng)，包括但不限于質(zhì)粒載體、DNA小環(huán)、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、痘病毒載體；皰疹病毒載體和腺相關(guān)病毒載體等以及其組合。也參見(jiàn)美國(guó)專利No.6,534,261；No.6,607,882；No.6,824,978；No.6,933,113；No.6,979,539；No.7,013,219；和No.7,163,824，以及美國(guó)專利申請(qǐng)No.14/271,008，其以全文引用的方式并入本文中。此外，將顯而易見(jiàn)的是，任何這些系統(tǒng)可包含一種或多種治療所需的序列。因此，當(dāng)將一種或多種核酸酶和供體構(gòu)建體引入細(xì)胞中時(shí)，核酸酶和/或供體多核苷酸可攜帶在相同遞送系統(tǒng)上或不同遞送系統(tǒng)上。當(dāng)使用多個(gè)系統(tǒng)時(shí)，每個(gè)遞送系統(tǒng)可包含編碼一個(gè)或多個(gè)核酸酶和/或供體構(gòu)建體的序列(例如，編碼一種或多種核酸酶的mRNA和/或攜帶一種或多種供體構(gòu)建體的mRNA或AAV)?？墒褂贸Ｒ?guī)的基于病毒和非病毒的基因轉(zhuǎn)移方法來(lái)將編碼核酸酶的核酸和供體構(gòu)建體引入細(xì)胞(例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞)和靶組織中。非病毒載體遞送系統(tǒng)包括DNA質(zhì)粒、DNA小環(huán)、裸核酸，和與遞送媒介物(例如脂質(zhì)體、脂質(zhì)納米粒子、聚乳酸-乙醇酸納米粒子、聚胺絡(luò)合劑或泊洛沙姆)復(fù)合的核酸。病毒載體遞送系統(tǒng)包括DNA和RNA病毒，其在遞送至細(xì)胞后具有游離體或整合的基因組。對(duì)于基因治療程序的綜述，參見(jiàn)Science256:808-813(1992)；Nabel&Felgner,TIBTECH11:211-217(1993)；Mitani&Caskey,TIBTECH11:162-166(1993)；Dillon,TIBTECH11:167-175(1993)；Miller,Nature357:455-460(1992)；VanBrunt,Biotechnology6(10):1149-1154(1988)；Vigne,RestorativeNeurologyandNeuroscience8:35-36(1995)；Kremer&Perricaudet,BritishMedicalBulletin51(1):31-44(1995)；Haddadaetal.,inCurrentTopicsinMicrobiologyandImmunologyDoerflerand(eds.)(1995)；andYuetal.,GeneTherapy1:13-26(1994)。核酸的非病毒遞送方法包括電穿孔、脂轉(zhuǎn)染、顯微注射、基因槍法、病毒顆粒、脂質(zhì)體、免疫脂質(zhì)體、聚陽(yáng)離子或脂質(zhì):核酸綴合物、裸DNA、裸RNA、加帽RNA、人工病毒粒子和DNA的藥劑增強(qiáng)吸收。使用例如Sonitron2000系統(tǒng)(Rich-Mar)進(jìn)行的聲孔作用(Sonoporation)還可用于遞送核酸。其他示例性核酸遞送系統(tǒng)包括由AmaxaBiosystems(Cologne，Germany)、Maxcyte,Inc.(Rockville，Maryland)、BTXMolecularDeliverySystems(Holliston，MA)和CopernicusTherapeuticsInc.所提供的那些(參見(jiàn)例如美國(guó)專利No.6,008,336)。脂轉(zhuǎn)染描述于例如美國(guó)專利No.5,049,386；No.4,946,787；和No.4,897,355中并且脂轉(zhuǎn)染試劑可商業(yè)銷售(例如，TransfectamTM和LipofectinTM)。適于多核苷酸的有效受體識(shí)別脂轉(zhuǎn)染的陽(yáng)離子性和中性脂質(zhì)包括Felgner、WO91/17424、WO91/16024的那些。脂質(zhì):核酸復(fù)合物(包括靶向脂質(zhì)體，例如免疫脂質(zhì)復(fù)合物)的制備是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的(參見(jiàn)例如Crystal,Science270:404-410(1995)；Blaeseetal.,CancerGeneTher.2:291-297(1995)；Behretal.,BioconjugateChem.5:382-389(1994)；Remyetal.,BioconjugateChem.5:647-654(1994)；Gaoetal.,GeneTherapy2:710-722(1995)；Ahmadetal.,CancerRes.52:4817-4820(1992)；美國(guó)專利No.4,186,183,No.4,217,344,No.4,235,871,No.4,261,975,No.4,485,054,No.4,501,728,No.4,774,085,No.4,837,028,和No.4,946,787)。其他遞送方法包括使用待遞送至EnGeneIC遞送媒介物(EDV)中的核酸的包裝。使用雙特異性抗體將這些EDV特別遞送至靶組織，其中所述抗體的一個(gè)臂對(duì)靶組織具有特異性并且另一個(gè)對(duì)EDV具有特異性?？贵w將EDV送至靶細(xì)胞表面，然后通過(guò)內(nèi)吞使EDV進(jìn)入細(xì)胞中。一旦在細(xì)胞中，就釋放出內(nèi)含物(參見(jiàn)MacDiarmidetal(2009)NatureBiotechnology27(7):643)。使用基于RNA或DNA病毒的系統(tǒng)來(lái)遞送編碼工程改造的CRISPR/Cas系統(tǒng)的核酸，其利用用于將病毒靶向體內(nèi)的特異性細(xì)胞的高度進(jìn)化方法以及向細(xì)胞核運(yùn)輸病毒有效載荷。病毒載體可直接施用于受試者(體內(nèi))或者它們可用于在體外處理細(xì)胞并且將經(jīng)過(guò)修飾的細(xì)胞施用至受試者(離體)。常規(guī)的用于遞送CRISPR/Cas系統(tǒng)的基于病毒的系統(tǒng)包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、牛痘和單純皰疹病毒載體以用于基因轉(zhuǎn)移。利用逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒和腺相關(guān)病毒基因轉(zhuǎn)移方法整合于宿主基因組中是可能的，通常導(dǎo)致所插入轉(zhuǎn)基因的長(zhǎng)期表達(dá)。另外，已經(jīng)在許多不同的細(xì)胞類型和靶組織中觀察到高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。可通過(guò)并入外來(lái)包膜蛋白來(lái)改變逆轉(zhuǎn)錄病毒的趨向性，從而擴(kuò)大靶細(xì)胞的潛在靶標(biāo)群體。慢病毒載體是能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)或感染非分裂細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體并且通常產(chǎn)生高病毒滴度。逆轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的選擇取決于靶組織。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體由具有至多6-10kb的外來(lái)序列的包裝容量的順式作用的長(zhǎng)末端重復(fù)序列構(gòu)成。最小的順式作用LTR足以用于載體的復(fù)制和包裝，其然后用于將治療基因整合至靶細(xì)胞中以提供永久的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。廣泛使用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括基于鼠類白血病病毒(MuLV)、長(zhǎng)臂猿白血病病毒(GaLV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、人免疫缺陷病毒(HIV)和其組合的那些(參見(jiàn)例如Buchscheretal.,J.Virol.66:2731-2739(1992)；Johannetal.,J.Virol.66:1635-1640(1992)；Sommerfeltetal.,Virol.176:58-59(1990)；Wilsonetal.,J.Virol.63:2374-2378(1989)；Milleretal.,J.Virol.65:2220-2224(1991)；PCT/US94/05700)。在其中優(yōu)選短暫表達(dá)的應(yīng)用中，可使用基于腺病毒的系統(tǒng)?；谙俨《镜妮d體能夠在許多細(xì)胞類型中具有非常高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率并且不需要細(xì)胞分裂。利用這些載體，已經(jīng)獲得高滴度和高水平表達(dá)。這種載體可大量產(chǎn)生于相對(duì)簡(jiǎn)單的系統(tǒng)中。腺相關(guān)病毒(“AAV”)載體還用于轉(zhuǎn)導(dǎo)具有靶核酸的細(xì)胞，例如，在核酸和肽的體外產(chǎn)生中，以及用于體內(nèi)和離體基因療法程序(參見(jiàn)例如Westetal.,Virology160:38-47(1987)；美國(guó)專利No.4,797,368；WO93/24641；Kotin，HumanGeneTherapy5:793-801(1994)；Muzyczka，J.Clin.Invest.94:1351(1994)。重組AAV載體的構(gòu)建描述于多個(gè)出版物中中，包括美國(guó)專利No.5,173,414；Tratschinetal.,Mol.Cell.Biol.5:3251-3260(1985)；Tratschin,etal.,Mol.Cell.Biol.4:2072-2081(1984)；Hermonat&Muzyczka,PNAS81:6466-6470(1984)；以及Samulskietal.,J.Virol.63:03822-3828(1989)。可以使用任何AAV血清型，包括AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6和AAV8、AAV8.2、AAV9和AAVrh10以及假型AAV，例如AAV2/8，AAV2/5和AAV2/6。至少六種病毒載體方法目前可用于臨床試驗(yàn)中的基因轉(zhuǎn)移，其利用涉及通過(guò)插入輔助細(xì)胞系中的基因來(lái)補(bǔ)充有缺陷的載體以產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)劑的方法。pLASN和MFG-S是已用于臨床試驗(yàn)中的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的實(shí)例(Dunbaretal.,Blood85:3048-305(1995)；Kohnetal.,Nat.Med.1:1017-102(1995)；Malechetal.,PNAS94:2212133-12138(1997))。PA317/pLASN是用于基因療法試驗(yàn)中的第一治療載體。(Blaeseetal.,Science270:475-480(1995))。對(duì)于MFG-S包裝載體已觀察到50％或更大的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。(Ellemetal.,ImmunolImmunother.44(1):10-20(1997)；Dranoffetal.,Hum.GeneTher.1:111-2(1997)。重組腺相關(guān)病毒載體(rAAV)是基于有缺陷的和非致病性細(xì)小病毒腺相關(guān)2型病毒的一種有前途的可選基因遞送系統(tǒng)。所有載體都源自僅保留側(cè)接轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒的AAV145堿基對(duì)(bp)反向末端重復(fù)序列的質(zhì)粒。由于整合至轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的基因組中而導(dǎo)致的有效基因轉(zhuǎn)移和穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因遞送是這種載體系統(tǒng)的關(guān)鍵特征。(Wagneretal.,Lancet351:91171702-3(1998),Kearnsetal.,GeneTher.9:748-55(1996))。也可以根據(jù)本發(fā)明使用其他AAV血清型，包括AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9和AAVrh10以及其所有變體。復(fù)制缺陷型重組腺病毒載體(Ad)可以高滴度產(chǎn)生并且容易感染多種不同的細(xì)胞類型。大多數(shù)腺病毒載體經(jīng)過(guò)工程改造以使得轉(zhuǎn)基因置換AdE1a、E1b和/或E3基因；隨后復(fù)制缺陷型載體在提供反式缺失基因功能的人293細(xì)胞中增殖。Ad載體可在體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)多種類型的組織，包括非分裂、分化的細(xì)胞，例如在肝臟、腎臟和肌肉中發(fā)現(xiàn)的那些。常規(guī)的Ad載體具有大的攜帶能力。在臨床試驗(yàn)中使用Ad載體的實(shí)例涉及用肌肉內(nèi)注射進(jìn)行抗腫瘤免疫的多核苷酸療法(Stermanetal.,Hum.GeneTher.7:1083-9(1998))。在臨床試驗(yàn)中使用腺病毒載體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移的其他實(shí)例包括Roseneckeretal.,Infection24:15-10(1996)；Stermanetal.,Hum.GeneTher.9:71083-1089(1998)；Welshetal.,Hum.GeneTher.2:205-18(1995)；Alvarezetal.,Hum.GeneTher.5:597-613(1997)；Topfetal.,GeneTher.5:507-513(1998)；Stermanetal.,Hum.GeneTher.7:1083-1089(1998)。使用包裝細(xì)胞形成能夠感染宿主細(xì)胞的病毒粒子。這些細(xì)胞包括293細(xì)胞，其包裝腺病毒；以及ψ2細(xì)胞或PA317細(xì)胞，其包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒。通常通過(guò)將核酸載體包裝至病毒粒子中的產(chǎn)生劑細(xì)胞系來(lái)生成基因療法中所用的病毒載體。所述載體通常含有包裝所需的以及(如果適用的話)隨后整合至宿主中的最小病毒序列，其他病毒序列被編碼待表達(dá)的蛋白的表達(dá)盒置換。通過(guò)包裝細(xì)胞系反式提供缺少的病毒功能。例如，在基因療法中使用的AAV載體通常僅具有來(lái)自AAV基因組的反向末端重復(fù)(ITR)序列，其為包裝和整合至宿主基因組中所需。將病毒DNA包裝在細(xì)胞系中，其含有編碼其他AAV基因(即rep和cap)的輔助質(zhì)粒，但缺乏ITR序列。細(xì)胞系也被用腺病毒作為輔助而感染。輔助病毒促進(jìn)AAV載體的復(fù)制和來(lái)自輔助質(zhì)粒的AAV基因的表達(dá)。由于缺乏ITR序列，因此輔助質(zhì)粒不以顯著量包裝。可以通過(guò)例如熱處理來(lái)降低腺病毒污染，腺病毒比AAV對(duì)熱處理更敏感。在許多基因療法應(yīng)用中，希望基因療法載體以高特異性程度遞送至特定組織類型。因此，通過(guò)在病毒的外表面上表達(dá)與病毒外殼蛋白作為融合蛋白的配體，病毒載體可被修飾以對(duì)特定細(xì)胞類型具有特異性。所述配體被選擇為對(duì)已知在目標(biāo)細(xì)胞類型上存在的受體具有親和力。例如，Hanetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:9747-9751(1995)報(bào)道了莫洛尼鼠類白血病病毒可以被修飾以表達(dá)與gp70融合的人調(diào)蛋白(Heregulin)，并且重組病毒感染某些表達(dá)人表皮生長(zhǎng)因子受體的人乳腺癌細(xì)胞。這種原理可以擴(kuò)展到其他病毒-靶細(xì)胞對(duì)，其中靶細(xì)胞表達(dá)受體并且病毒表達(dá)包含細(xì)胞表面受體的配體的融合蛋白。例如，絲狀噬菌體可以被工程改造以顯示對(duì)幾乎任何所選細(xì)胞受體具有特異性結(jié)合親和力的抗體片段(例如，F(xiàn)AB或Fv)。盡管上面的描述主要適用于病毒載體，但相同的原理可適用于非病毒載體。這些載體可以被工程改造以含有有利于被特異性靶細(xì)胞吸收的特異性吸收序列?；虔煼ㄝd體可通過(guò)施用至個(gè)體受試者，通常通過(guò)如下所述的全身施用(例如，靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下或顱內(nèi)輸注)或局部施用在體內(nèi)遞送。可選地，載體可離體遞送至細(xì)胞，例如從個(gè)體患者外植的細(xì)胞(例如，淋巴細(xì)胞、骨髓抽吸物、組織活檢)或普遍供體造血干細(xì)胞，接著將細(xì)胞再植入患者中，通常在選擇已合并有載體的細(xì)胞后。還可以直接向用于轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的生物體體內(nèi)直接施用含有核酸酶和/或供體構(gòu)建體的載體(例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、脂質(zhì)體等)?？蛇x地，可施用裸DNA。施用是通過(guò)通常用于將分子引入與血液或組織細(xì)胞最終接觸的任何途徑，包括但不限于注射、輸注、局部施用和電穿孔。適于施用這些核酸的方法是可用的并且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，并且盡管可使用一種以上途徑來(lái)施用特定組合物，但特定途徑通常可相比于另一種途徑提供更直接和更有效的反應(yīng)。適于引入本文所述的多核苷酸的載體包括非整合慢病毒載體(IDLV)。參見(jiàn)例如Oryetal.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:11382-11388；Dulletal.(1998)J.Virol.72:8463-8471；Zufferyetal.(1998)J.Virol.72:9873-9880；Follenzietal.(2000)NatureGenetics25:217-222；美國(guó)專利公布No.2009/054985。藥學(xué)上可接受的載體部分地通過(guò)所施用的特定組合物，以及通過(guò)用于施用組合物的特定方法確定。因此，存在廣泛的多種合適的如下所述可用的藥物組合物的制劑(參見(jiàn)例如Remington'sPharmaceuticalSciences，第17版，1989)。將顯而易見(jiàn)的是，可使用相同或不同的系統(tǒng)來(lái)遞送編碼核酸酶的序列和供體構(gòu)建體。例如，供體多核苷酸可由AAV攜帶，而一種或多種核酸酶可由mRNA攜帶。此外，不同的系統(tǒng)可通過(guò)相同或不同的途徑(肌肉內(nèi)注射、尾靜脈注射、其他靜脈內(nèi)注射、腹膜內(nèi)施用和/或肌肉內(nèi)注射施用。載體可同時(shí)或以任何連續(xù)順序遞送。用于離體和體內(nèi)施用的制劑包括于液體或乳化液體中的懸浮液?；钚猿煞滞ǔＥc賦形劑混合，所述賦形劑是藥學(xué)上可接受的并且與所述活性成分相容。合適的賦形劑包括例如水、鹽水、右旋糖、甘油、乙醇等，以及它們的組合。另外，組合物可含有少量的輔助物質(zhì)，例如，潤(rùn)濕或乳化劑、pH緩沖劑、穩(wěn)定劑或其他增強(qiáng)藥物組合物的有效性的試劑。試劑盒還提供用于執(zhí)行上述方法中的任何一種的試劑盒。試劑盒通常含有編碼一種或多種核酸酶、一種或多種影響干細(xì)胞擴(kuò)增的因子和/或如本文所述的供體多核苷酸的多核苷酸以及用于施用所述因子的說(shuō)明書，所述因子影響干細(xì)胞進(jìn)入內(nèi)部引入了核酸酶和/或供體多核苷酸(或周圍培養(yǎng)基)的細(xì)胞。試劑盒還可以含有細(xì)胞、用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的緩沖液、用于細(xì)胞的培養(yǎng)基和/或用于進(jìn)行測(cè)定的緩沖液。通常，試劑盒還包含標(biāo)簽，所述標(biāo)簽包括任何材料，例如附接或以其他方式伴隨試劑盒的其他組分的說(shuō)明書、包裝或廣告?zhèn)鲉?。下列?shí)施例涉及本公開的示例性實(shí)施方案，其中核酸酶包含一種或者多種ZFN或一種或者多種TALEN。應(yīng)理解，這只是為了示例目的并且可使用其他核酸酶，例如具有工程改造的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的歸巢核酸內(nèi)切酶(大范圍核酸酶)和/或天然存在的工程改造的歸巢核酸內(nèi)切酶(大范圍核酸酶)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與異源裂解結(jié)構(gòu)域、大型TAL、緊密TALEN以及核酸酶系統(tǒng)(如使用工程改造的單導(dǎo)向RNA的TtAgo和CRISPR/Cas)的融合體。實(shí)施例實(shí)施例1：鋅指蛋白核酸酶(ZFN)的設(shè)計(jì)、構(gòu)建和一般表征對(duì)鋅指蛋白進(jìn)行設(shè)計(jì)并且并入質(zhì)粒、AAV或腺病毒載體中，基本上如Urnovetal.(2005)Nature435(7042):646-651,Perezetal(2008)NatureBiotechnology26(7):808-816中所述，以及如美國(guó)專利No.6,534,261中所述并且被測(cè)試以供結(jié)合。關(guān)于對(duì)人β珠蛋白基因座具有特異性的ZFN和TALEN，參見(jiàn)共同擁有的美國(guó)專利No.7,888,121和美國(guó)專利公布No.20130137104與No.20130122591。實(shí)施例2：珠蛋白特異性ZFN的活性使用靶向人珠蛋白基因座的ZFN對(duì)來(lái)測(cè)試這些ZFN在特定靶位點(diǎn)誘導(dǎo)DSB的能力。所示ZFN的每個(gè)指的識(shí)別螺旋區(qū)域的氨基酸序列示于下表1。靶位點(diǎn)(DNA靶位點(diǎn)以大寫字母指示；非接觸核苷酸以小寫字母指示)示于表2。表1：人β珠蛋白特異性鋅指蛋白識(shí)別螺旋設(shè)計(jì)表2：人β珠蛋白特異性鋅指的靶位點(diǎn)獲得人類CD34+細(xì)胞，并如下進(jìn)行處理。所有臍血(CB)標(biāo)本根據(jù)加州大學(xué)批準(zhǔn)的指南獲得，并且被認(rèn)為是免除IRB審查的匿名醫(yī)療廢物。在收集的48小時(shí)內(nèi)處理細(xì)胞。來(lái)自具有SCD的志愿者供體的骨髓(BM)抽吸物在其對(duì)UCLAIRB協(xié)議#10-001399知情同意的情況下獲得。使用FicollHypaque(StemCellTechnologies)密度離心從BM和CB分離單核細(xì)胞(MNC)。然后通過(guò)將MNC與抗CD34微珠(MiltenyiBiotecInc.)在4℃下溫育30分鐘，使用免疫磁性柱分離來(lái)富集CD34+細(xì)胞。接著使細(xì)胞通過(guò)磁性柱，收集CD34+細(xì)胞，并置于具有冷凍培養(yǎng)基(10％二甲亞砜(SigmaAldrich)，90％FBS)的冷凍管中，并冷凍保存在液氮中。動(dòng)員后CD34+細(xì)胞(mPB)購(gòu)自Allcells。為了產(chǎn)生用于電穿孔的mRNA，將編碼表1所示ZFN的質(zhì)粒用SpeI(NewEnglandBiolabs)線性化，并在用作用于體外轉(zhuǎn)錄的模板之前通過(guò)苯酚:氯仿純化。根據(jù)制造商的方案使用mMessageT7ULTRA轉(zhuǎn)錄試劑盒(LifeTechnologies)來(lái)產(chǎn)生體外轉(zhuǎn)錄的mRNA，并用清潔試劑盒(Qiagen)凈化。為了電穿孔，遵循以下方案：將CBCD34+細(xì)胞在37℃下解凍，在補(bǔ)充有20％胎牛血清(GeminiBio-products)和(1×谷氨酰胺、青霉素和鏈霉素)的Iscove改良Dulbecco培養(yǎng)基(Iscove’sModifiedDulbecco’sMedium：IMDM；LifeTechnologies))中洗滌，并在含有谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素、50ng/ml的SCF、50ng/ml的Flt-3和50ng/ml的TPO(Peprotech)的X-VIVO15培養(yǎng)基(Lonza)中預(yù)刺激48小時(shí)。為了電穿孔，將每個(gè)反應(yīng)的200,000個(gè)細(xì)胞以90g旋轉(zhuǎn)15分鐘，重懸于100μl的BTXpress緩沖液(HarvardApparatus)中，與指定量的ZFNmRNA和/或寡核苷酸(如果適用)混合，并在BTXECM830方波電穿孔儀(HarvardApparatus)中在250V下5毫秒脈沖一次。電穿孔后，細(xì)胞在室溫下靜置10分鐘，然后加入培養(yǎng)基并轉(zhuǎn)移到總共500μl的平板中。供體IDLV以針對(duì)適當(dāng)樣品所述的濃度存在于最終培養(yǎng)基中?；蛐Ｕ突蚱茐姆治鋈缦拢菏褂肗ucleaseAssay(Cel-1)來(lái)測(cè)定ZFN誘導(dǎo)的位點(diǎn)特異性等位基因破壞。使用Cel1Fwd(5’-gacaggtacggctgtcatca-3’SEQIDNO:25)和Cel1Rev(5’-cagcctaagggtgggaaaat-3’SEQIDNO:26)，利用AccuprimeTaqHi-Fi(LifeTechnologies)，從200ng基因組DNA來(lái)PCR擴(kuò)增圍繞ZFN結(jié)合位點(diǎn)的410bp區(qū)域。完成變性、再退火、酶切、電泳和光密度測(cè)定分析，如所描述的那樣(例如Joglekatetal(2013)Mol.Ther:JoftheAmerSocGeneTher21:1705-17)。通過(guò)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RestrictionFragmentLengthPolymorphism：RFLP)檢測(cè)位點(diǎn)特異性基因修飾。使用引物BgloOuterFwd(5’-atgcttagaaccgaggtagagttt-3’,SEQIDNO:27)和BgloOuterRev(5’-cctgagacttccacactgatg-3’,SEQIDNO:28)和AccuprimeTaqHi-Fi(LifeTechnologies)對(duì)圍繞ZFN結(jié)合位點(diǎn)的1.1kb區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物使用PCR清除試劑盒(LifeTechnologies)純化，并使用10單位HhaI(NewEnglandBiolabs)在37℃下酶切3.5小時(shí)。酶切產(chǎn)物在用GelGreen(Biotium)預(yù)染色的1.0％的TBE-瓊脂糖凝膠上分離，并在TyphoonFLA9000生物分子成像儀(GEHealthcare)上成像。為了定量基因修飾，使用基于定量PCR的測(cè)定。使用上述的1.1kbPCR產(chǎn)物作為模板進(jìn)行一組兩個(gè)PCR反應(yīng)。將未純化的PCR模板以1:5,000稀釋，以下每個(gè)25ul反應(yīng)中使用其中的1ul。使用引物HhaIFwd(5’-gaagtctgccgttactgcg-3’,SEQIDNO:29)和HhaIRev(5’-cccagtttctattggtctcc-3’,SEQIDNO:30)進(jìn)行第一次PCR以擴(kuò)增經(jīng)修飾的基因組。使用引物ExonIIFwd(5’-ctcggtgcctttagtgatgg-3’,SEQIDNO:31)和ExonIIRev(5’-gactcaccctgaagttctc-3’,SEQIDNO:32)進(jìn)行第二次PCR以使輸入模板標(biāo)準(zhǔn)化。這些PCR都使用PowerSYBRGreenPCRMasterMix(LifeTechnologies)進(jìn)行定量，并在ViiA7(LifeTechnologies)上獲得。使用兩個(gè)反應(yīng)之間的Ct(循環(huán)至閾值)差異和質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線確定基因修飾的頻度。發(fā)現(xiàn)所有ZFN都是有活性的。在IlluminaMiSeq機(jī)器上PCR擴(kuò)增和深度測(cè)序珠蛋白旁系同源物(paralogs)以分析脫靶標(biāo)修飾。用于PCR的引物如下：HBB:5'-acacgacgctcttccgatctnnnngggctgggcataaaagtcag-3'(SEQIDNO:33)和5'-gacgtgtgctcttccgatcttccacatgcccagtttctatt-3'(SEQIDNO:34)；HBD:5'-acacgacgctcttccgatctnnnntaaaaggcagggcagagtcga-3'(SEQIDNO:35)和5'-gacgtgtgctcttccgatctacatgcccagtttccatttgc-3'(SEQIDNO:36)；HBE1:5'-acacgacgctcttccgatctnnnnctgcttccgacacagctgcaa-3'(SEQIDNO:37)和5'-gacgtgtgctcttccgatcttcacccttcattcccatgcat-3'(SEQIDNO:38)；HBG1和HBG2:5'-acacgacgctcttccgatctnnnnggaacgtctgaggttatcaat-3'(SEQIDNO:39)和5'-gacgtgtgctcttccgatcttccttccctcccttgtcc-3'(SEQIDNO:40)。使用擴(kuò)增子內(nèi)的基因座特異性SNP將HBG1和HBG2共擴(kuò)增，并將序列讀數(shù)分配給HBG1或HBG2。正向引物內(nèi)的混合堿基允許測(cè)序期間的族群去旋(clusterdeconvolution)。根據(jù)細(xì)胞類型，ZFN誘導(dǎo)在β-珠蛋白基因座處的35-65％的等位基因破壞(indel)，而在β珠蛋白旁系同源物(paralogs)處的檢測(cè)到的修飾較低，如下表3所示。表3：人β珠蛋白及其在K562或CD34+細(xì)胞中的旁系同源物的ZFN相關(guān)修飾(33488/33501)將編碼ZFN的體外轉(zhuǎn)錄的mRNA電穿孔到從人臍帶血(CB)以及動(dòng)員后外周血(mPB)分離的CD34+中，導(dǎo)致靶基因座的有效裂解，如通過(guò)SurveyorNuclease測(cè)定法所確定的(圖1B)。結(jié)果顯示ZFN驅(qū)動(dòng)在β-珠蛋白基因座處的高水平的基因修飾。實(shí)施例4：在鐮狀細(xì)胞堿基處的ZFN驅(qū)動(dòng)的校正在靶向的β-珠蛋白基因座成功裂解后，我們?cè)噲D確定使用同源供體模板是否可能校正該位點(diǎn)的鐮狀堿基。為此，同時(shí)設(shè)計(jì)并測(cè)試了兩種類型的基因校正模板：短DNA寡核苷酸和IDLV。將克隆到IDLV中的1.1kb人β-珠蛋白基因片段供體模板設(shè)計(jì)為包括鐮狀突變的校正變化以及沉默限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)，以產(chǎn)生用于同源性重組的替代分析的HhaI限制性位點(diǎn)(圖1C)。供體模板通過(guò)IDLV遞送(參見(jiàn)圖2D)，使得能以最小的細(xì)胞毒性有效轉(zhuǎn)導(dǎo)CD34+HSPC，從而以最小的基因組整合瞬時(shí)產(chǎn)生高模板拷貝數(shù)。用ZFN(對(duì)33488/33501)加上IDLV供體處理的CD34+細(xì)胞中的基因修飾水平最初通過(guò)HhaIRFLP酶切(圖1D)和基于定量PCR(qPCR)的測(cè)定確定在平均18.0±2.2％的等位基因(圖1E)。ZFNmRNA和IDLV供體濃度的優(yōu)化被執(zhí)行(圖2和圖3)，并且證明了在目標(biāo)細(xì)胞類型中滴定ZFN試劑以實(shí)現(xiàn)高水平修飾同時(shí)保持細(xì)胞數(shù)量和生存力的重要性。使用寡核苷酸作為基因修飾/校正模板將具有速度、成本、可重復(fù)性和實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)易方面的優(yōu)點(diǎn)。使用來(lái)自mPB的HSPC中的寡核苷酸供體模板的引入了被設(shè)計(jì)用于在β-珠蛋白基因(HBB)中產(chǎn)生AvrIIRFLP的3堿基對(duì)序列的初始實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生15％的基因修飾(參見(jiàn)圖4)。為了改進(jìn)寡核苷酸供體的用途，測(cè)試了一組寡核苷酸，其對(duì)應(yīng)于以ZFN裂解位點(diǎn)為中心的一條或另一條鏈和對(duì)稱增加的長(zhǎng)度(參見(jiàn)下表4)，其中粗體表示相對(duì)于野生型序列突變的堿基。用's'標(biāo)記的寡核苷酸包含設(shè)計(jì)為將鐮狀突變引入野生型基因的序列。如表中所示，在標(biāo)記為“S”的列中，野生型序列在該位置包含A，而鐮狀突變包含T。表4：寡聚核苷酸供體使用更長(zhǎng)的反向鏈寡核苷酸得到最高水平的基因修飾(參見(jiàn)圖5)。由于在SCD突變位點(diǎn)處的基因修飾或校正不會(huì)改變ZFN結(jié)合位點(diǎn)的序列或間隔，因此沉默突變被設(shè)計(jì)到供體模板中并共同導(dǎo)入染色體中以防止或減少ZFN結(jié)合和經(jīng)修飾的等位基因的再裂解。使用反向鏈供體與在3'ZFN結(jié)合位點(diǎn)引入沉默突變是相容的(圖4C)。將沉默突變的各種組合引入供體寡核苷酸，并測(cè)定基因修飾的頻度。沉默突變位點(diǎn)(SMS)一和二的組合(SMS12)產(chǎn)生最高水平的HBB修飾，并用于所有子序列后續(xù)實(shí)驗(yàn)(圖4D)。經(jīng)基因修飾的HBB等位基因和經(jīng)修飾然后重新裂解的等位基因之間的反向關(guān)系表明SMS供體確實(shí)用于阻斷ZFN再裂解(圖4E)。檢查在HSPC庫(kù)和爆發(fā)形成單位中的HBB轉(zhuǎn)錄物，紅細(xì)胞菌落(BFU-E)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)改變來(lái)自任何SMS等位基因的mRNA剪接的證據(jù)。在高ZFNmRNA(對(duì)47773/47817)濃度下，使用含有SMS012的供體寡核苷酸比使用SMS12供體產(chǎn)生更多的經(jīng)HBB-修飾的等位基因(圖17B)。在用ZFN和SMS124供體處理后HBB的分子結(jié)果的綜合分析僅顯示了較小水平的意外的DNA修復(fù)事件，例如來(lái)自同源性定向和基于NHEJ的基因修飾的組合(1.5％)或來(lái)自寡核苷酸的基于NHEJ的捕獲(0.4％)的那些(參見(jiàn)下表5)。表5：用ZFN和寡核苷酸供體處理HSPC的分子結(jié)果結(jié)果頻度(％)沒(méi)有變化46.1NHEJ-介導(dǎo)的缺失30.5寡核苷酸模板化基因修飾18.8NHEJ-介導(dǎo)的插入2.8半基因修飾，半NHEJ1.5供體寡核苷酸的捕獲0.4最后，部分同源性指導(dǎo)的基因修飾事件(SMS12對(duì)SMS24)的過(guò)度豐富提供了對(duì)以下構(gòu)思的強(qiáng)有力的支持：在寡核苷酸模板化的基因修飾過(guò)程中的新的DNA合成使用切除的DSB的左手3'單鏈末端進(jìn)行(參見(jiàn)圖6)。ZFN、寡核苷酸和HSPC供體的最佳組合允許30-40％的等位基因的基因修飾(參見(jiàn)圖4F)。因此，當(dāng)與同源供體模板一起遞送時(shí)，ZFN能夠誘導(dǎo)初級(jí)HSPC中的高水平的靶向DSB以及高水平的位點(diǎn)特異性基因修飾。實(shí)施例5:ZFN特異性由于β-珠蛋白與其他珠蛋白基因(δ-，ε-，Aγ-，Gγ-和偽β-珠蛋白)具有高同源性，因此設(shè)計(jì)ZFN以避免在這些區(qū)域中的裂解(圖6A)。使用Surveyor核酸酶測(cè)定法并通過(guò)高通量DNA測(cè)序，測(cè)定使用33488/33501對(duì)的同源珠蛋白基因的裂解速率。對(duì)這些區(qū)域中的每一個(gè)的分析顯示僅在mPB、CB和SCDBMCD34+細(xì)胞中的高度同源的δ-珠蛋白基因處的脫靶修飾(圖6B，表3)。我們補(bǔ)充這些脫靶ZFN裂解的直接測(cè)試與更全面、無(wú)傾向性的全基因組方法來(lái)識(shí)別脫靶位點(diǎn)。該測(cè)定基于非同源IDLV在雙鏈斷裂位點(diǎn)被捕獲的傾向，并且使用針對(duì)其對(duì)IDLV捕獲的允許而選擇的K562細(xì)胞中的整合的下游聚類整合位點(diǎn)分析(CLIS)。所遵循的程序概述如下:用以下引物PCR擴(kuò)增β-珠蛋白基因簇位點(diǎn)：HBD:5’–ggttcatttttcattctcaca-3’(SEQIDNO:41)和5’-gtaatctgagggtaggaaaac-3’(SEQIDNO:42)；HBBP1:5’-cacccttgaccaatagattc-3’(SEQIDNO:52)和5’-gagactgtgggatagtcata-3’(SEQIDNO:43)；HBE1:5’-cattatcacaaacttagtgtcc-3’(SEQIDNO:44)和5’-agtctatgaaatgacaccatat-3’(SEQIDNO:45)；HBG1:5’-gcaaaggctataaaaaaaattagc-3’(SEQIDNO:46)和5’-gagatcatccaggtgctttg-3’(SEQIDNO:47)；HBG2:5’-ggcaaaggctataaaaaaaattaagca-3’(SEQIDNO:48)和5’-gagatcatccaggtgcttta-3’(SEQIDNO:49)，并通過(guò)如上所述的核酸酶進(jìn)行分析。K562細(xì)胞用15μg/mL的ZFNmRNA電穿孔，并用2E+08TU/mL(MOI＝250)的含有由MND啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GFP轉(zhuǎn)基因的IDLV轉(zhuǎn)導(dǎo)(參見(jiàn)Challita,P.M.etal.(1995)JofVirol69,748-55)，且與β-珠蛋白基因座缺乏任何同源性以確保雙鏈斷裂處的整合是由于NHEJ介導(dǎo)的捕獲而實(shí)現(xiàn)的(參見(jiàn)圖7A)。完成了ZFN+IDLV的四個(gè)單獨(dú)的生物復(fù)制以維持對(duì)潛在的全基因組靶外位點(diǎn)的高敏感性，同時(shí)完成兩個(gè)對(duì)照以確定背景整合的水平。對(duì)照細(xì)胞接受GFPIDLV，但沒(méi)有ZFNmRNA以檢測(cè)捕獲IDLV而無(wú)ZFN作用的天然存在的DSB的位點(diǎn)。將K562細(xì)胞在具有10％胎牛血清(GeminiBio-products)和1％青霉素/鏈霉素/L-谷氨酰胺(GeminiBio-products)的RPMI1640(Cellgro)中培養(yǎng)60天。在此期間，定期進(jìn)行GFP陽(yáng)性的流式細(xì)胞術(shù)分析以確保任何非整合的IDLV被稀釋出樣品。在第60天，通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選(FACS)分選樣品以分離GFP+細(xì)胞，擴(kuò)增5天，提取基因組DNA，并通過(guò)非限制性線性擴(kuò)增介導(dǎo)的PCR35(nonrestrictiveLinearAmplificationMediated-PCR35)制備用于載體整合位點(diǎn)測(cè)序的樣品。如先前概述的(Gabriel,R.,etal(2011)NatBiotech.29(9):816-23)用500個(gè)堿基對(duì)的CLIS窗口進(jìn)行聚集整合位點(diǎn)(CLIS)分析以揭示ZFN裂解的位點(diǎn)。分析所有CLIS以確定每個(gè)位點(diǎn)與ZFN對(duì)序列的同源性水平。同源性百分比定義為在間隔物(spacer)長(zhǎng)度高達(dá)20個(gè)核苷酸的ZFN結(jié)合(同源二聚體和異源二聚體)的所有重復(fù)的位點(diǎn)處的匹配堿基對(duì)的數(shù)目。每個(gè)CLIS的最高同源性百分比記錄在下表6中。對(duì)于該表，列出所有確定的CLIS，其具有在其整合位點(diǎn)的200個(gè)堿基對(duì)內(nèi)的與ZFN靶位點(diǎn)的最高同源性百分比。評(píng)價(jià)了ZFN結(jié)合(異源二聚體和同源二聚體)的所有可能的重復(fù)，并分析了高達(dá)20nt的間隔物長(zhǎng)度。裂解的兩個(gè)ZFN位點(diǎn)以粗體突出顯示。CLIS確定的所有其他脆弱位點(diǎn)都是斜體。Chr：染色體；CLIS：聚類整合位點(diǎn)；L：“左”ZFN單體(SBS#33488)；R：'右'ZFN單體(SBS#33501)；而ZFN二聚體中的數(shù)目對(duì)應(yīng)于給出與ZFN靶位點(diǎn)有最大百分比的同源性的間隔物大小。使用此方法分析20,000個(gè)隨機(jī)基因組位點(diǎn)以確定跨基因組的ZFN同源性的背景水平。表6：CLIS和與ZFN靶位點(diǎn)的同源性的百分比如所預(yù)測(cè)的，CLIS分析顯示在β-珠蛋白和δ-珠蛋白的捕獲(圖7，表6)。在CLIS分析中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與ZFN結(jié)合位點(diǎn)具有顯著同源性的其他推定的脫靶位點(diǎn)。這些結(jié)果表明該對(duì)ZFN在其全基因組規(guī)模上對(duì)其預(yù)期靶位點(diǎn)的高水平的特異性。實(shí)施例6:經(jīng)修飾的HSPC的體外分化為了確保經(jīng)基因修飾的HSPC能夠有正常的、廣譜的紅細(xì)胞和髓樣分化，將經(jīng)處理的細(xì)胞作為單細(xì)胞且在大量培養(yǎng)物中進(jìn)行測(cè)定。監(jiān)測(cè)單細(xì)胞在含有促進(jìn)HSPC分化的細(xì)胞因子的甲基纖維素培養(yǎng)基中的菌落形成潛能。簡(jiǎn)言之，在電穿孔后一天，在基于MethoCultTMOptimum甲基纖維素的培養(yǎng)基(StemCellTechnologies)中，將100個(gè)活細(xì)胞和300個(gè)活細(xì)胞在每個(gè)35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中按一式兩份鋪板。對(duì)于使用寡核苷酸供體的實(shí)驗(yàn)，在電穿孔后5天將細(xì)胞鋪板接種。在5％CO2、37℃和潮濕氣氛下培養(yǎng)兩周后，基于菌落的形態(tài)表征和計(jì)數(shù)不同類型的菌落。單獨(dú)用ZFN(對(duì)33488/33501)處理的HSPC或用ZFN和寡核苷酸供體處理的HSPC產(chǎn)生類似的數(shù)量和模式的紅細(xì)胞和骨髓克隆。用于SCDBM樣品的體外紅細(xì)胞分化技術(shù)改編自Giarratanaetal.((2005)NatBiotech23:69-74)并描述于Romero和Urbinati等((2013)JClinInvest123(8):3317–3330)中。在電穿孔后一天，將細(xì)胞置于紅細(xì)胞培養(yǎng)物中。為了獲得大量的細(xì)胞以用于下游分析，在方案的第12天而非第8天將細(xì)胞置于共培養(yǎng)物中，以允許增加的紅細(xì)胞擴(kuò)增。細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)的第22天收獲，沉淀，并進(jìn)行HPLC分析(見(jiàn)下文)。還使用5'-acatttgcttctgacacaac-3'(外顯子1，SEQIDNO:50)和5'-gaaattggacagcaagaaagc-3'(外顯子3，SEQIDNO:51)通過(guò)RT-PCR進(jìn)行HBB剪接的測(cè)定，沒(méi)有觀察到外顯子跳躍，也沒(méi)有觀察到內(nèi)含子保留。單個(gè)紅細(xì)胞菌落的基因分型證實(shí)在預(yù)期頻度存在預(yù)期的編輯。此外，在大量培養(yǎng)物中，HSPC被誘導(dǎo)分化成紅細(xì)胞(Giarratana,M.etal.(2011)Blood118,5071-9)。在整個(gè)紅細(xì)胞分化中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行取樣，并通過(guò)高通量DNA測(cè)序來(lái)測(cè)量編輯的細(xì)胞的頻度。與我們對(duì)在甲基纖維素中生長(zhǎng)的紅細(xì)胞菌落的單細(xì)胞分析一致，不管在基因庫(kù)(pool)中的基因修飾的起始水平如何，在大量培養(yǎng)物中分化為紅細(xì)胞期間，發(fā)現(xiàn)經(jīng)修飾的細(xì)胞的頻度基本上沒(méi)有變化(圖9A)。為了分析珠蛋白鏈，執(zhí)行HPLC(圖9B)。對(duì)于SCDBM樣品，對(duì)通過(guò)終末期紅細(xì)胞產(chǎn)生的血紅蛋白(Hb)物質(zhì)執(zhí)行HPLC，如Wilber,A.etal.((2011)Blood117:2817-26)所描述的，但略有修改。在紅系細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束(第22天)時(shí)收獲紅系細(xì)胞(1-2E+07)，沉淀，并在-80℃冷凍儲(chǔ)存直至裂解。解凍后，將細(xì)胞重懸浮于25μL溶血試劑(HelenaLaboratories)中，冷凍過(guò)夜，然后在4℃以20,800×g離心10分鐘以除去細(xì)胞碎片。將澄清的上清液用于通過(guò)HPLC使用陽(yáng)離子交換柱(Ultra2VariantResolutionAnalyzer；PrimusDiagnostics)和人血紅蛋白的校準(zhǔn)樣品來(lái)表征Hb的產(chǎn)生?；诒Ａ魰r(shí)間，利用伴隨HPLC儀器的軟件來(lái)識(shí)別對(duì)應(yīng)于Hb物質(zhì)的峰?；诎ㄒ阴；貉t蛋白，HbFAc；胎兒血紅蛋白，HbF；野生型血紅蛋白，HbA；和鐮狀血紅蛋白HbS的每個(gè)初級(jí)血紅蛋白峰的曲線下面積的總和計(jì)算針對(duì)每個(gè)樣品產(chǎn)生的HbA的相對(duì)百分比。對(duì)于mPB樣品，在紅細(xì)胞培養(yǎng)的第18天收獲紅系細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀并在室溫下在水中裂解10分鐘。在20,000g離心5分鐘以除去細(xì)胞碎片后，將細(xì)胞裂解物在-80℃冷凍儲(chǔ)存。解凍后，細(xì)胞裂解物在流動(dòng)相A中以1:10稀釋，并使用弱陽(yáng)離子交換柱(PolyCATATM，PolyLCINC.)通過(guò)HPLC(Infinity1260，Agilent)表征。FASC參考物質(zhì)(TrinityBiotech)用于限定常見(jiàn)血紅蛋白(HbF、HbA、HbS、HbC)的洗脫時(shí)間。使用OpenLABCDSChemstation軟件進(jìn)行分析和峰積分?；诎ㄒ阴；貉t蛋白，HbFAc；胎兒血紅蛋白，HbF；野生型血紅蛋白，HbA；和鐮狀血紅蛋白HbS的每個(gè)血紅蛋白峰的曲線下面積的總和計(jì)算針對(duì)每個(gè)樣品產(chǎn)生的HbA的相對(duì)百分比。在平行實(shí)驗(yàn)中，我們將14％的HBB等位基因轉(zhuǎn)換為鐮狀形式，并通過(guò)HPLC測(cè)定紅系分化18天后存在的珠蛋白鏈。這些細(xì)胞產(chǎn)生的約18％的血紅蛋白是鐮狀血紅蛋白，證明了基因修飾事件在蛋白水平的影響(圖9B)。實(shí)施例7：經(jīng)修飾的細(xì)胞植入小鼠為了確定經(jīng)ZFN修飾的細(xì)胞是否維持其造血再增殖能力，將經(jīng)ZFN和供體處理或模擬處理的CB來(lái)源的HSPC異種移植到免疫缺陷型NSG小鼠中。簡(jiǎn)而言之，在用ZFNmRNA電穿孔并用供體IDLV(2E+07TU/mL；MOI＝50)轉(zhuǎn)導(dǎo)之前，預(yù)刺激來(lái)自多個(gè)健康個(gè)體的新鮮CBCD34+細(xì)胞2天。使用包含含有谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素，50ng/mlSCF、50ng/mlFlt-3和50ng/mlTPO(Peprotech)的X-VIVO15培養(yǎng)基(Lonza)的預(yù)刺激培養(yǎng)基?；謴?fù)一天后，通過(guò)尾靜脈注射將含有0.1％BSA(Sigma)的PBS(Corning)中的1E+06活細(xì)胞移植到6至8周齡的用250cGy全身照射后的NSG小鼠(TheJacksonLaboratory)中。使用平行培養(yǎng)但未暴露于mRNA、電穿孔或IDLV(模擬處理)的CD34+細(xì)胞的對(duì)照樣品。將小等分試樣在體外培養(yǎng)用于多重分析。將mPB樣品在電穿孔后1天冷凍，在之后的日子解凍，并允許移植前如上所述進(jìn)行一天的恢復(fù)。使用V450-綴合的抗人CD45與APC-綴合的抗鼠CD45在移植后第5周通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)人類細(xì)胞的移植。在用抗體孵育后，用BDFACS裂解液(BDBiosciences)裂解紅細(xì)胞。移植效果百分比定義為％huCD45+/(％huCD45++％muCD45+)。使用V450-綴合的抗人CD45、V500-綴合的抗-鼠CD45、FITC-綴合的抗-人CD33、PerCP-綴合的抗-人CD3、PE綴合的抗人CD56，PE-Cy7綴合的抗人CD19和APC綴合的抗人CD34(所有抗體BDBiosciences)在移植后8周和16周通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)外周血和BM中的移植效果和譜系分布。包括結(jié)果變量的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差的描述性統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)都被報(bào)告并以圖形方式呈現(xiàn)。對(duì)于與基因修飾水平、植入和譜系相關(guān)的定量結(jié)果，如果存在超過(guò)兩個(gè)組，則通過(guò)不配對(duì)t檢驗(yàn)或在單因素方差分析(ANOVA)的框架內(nèi)進(jìn)行成對(duì)比較。進(jìn)行劑量-反應(yīng)分析以評(píng)價(jià)ZFN和供體比優(yōu)化。具體來(lái)說(shuō)，我們使用線性混合模型方法，但處理劑量作為連續(xù)和固定效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)作為隨機(jī)效應(yīng)。通過(guò)重復(fù)測(cè)量ANOVA評(píng)價(jià)SCD患者BM細(xì)胞隨時(shí)間推移的擴(kuò)增倍數(shù)。在我們的統(tǒng)計(jì)調(diào)查中，假設(shè)檢驗(yàn)是雙側(cè)的，使用用于p值的顯著性閾值0.05。所有統(tǒng)計(jì)分析使用SAS版本9.3(SASInstituteInc.2012)進(jìn)行。體外平行培養(yǎng)細(xì)胞表明，通過(guò)qPCRRFLP分析，基因修飾率在5％-20％范圍內(nèi)，平均值為14.5±6.4％(圖10)。高通量測(cè)序顯示10.5±4.0％的等位基因在鐮狀位置含有交換的堿基，在32.0±9.9％中看到插入或缺失(indel)。此外，在體外菌落形成測(cè)定中評(píng)價(jià)這些細(xì)胞的造血潛能；相對(duì)于所有可分析譜系中的未經(jīng)處理的模擬樣品，細(xì)胞保持了它們的廣譜菌落形成能力。在注射后5和8周，評(píng)價(jià)經(jīng)移植的小鼠，人HSPC的移植效果測(cè)量為人CD45+細(xì)胞占全部CD45+細(xì)胞(來(lái)自人和鼠)的百分比。經(jīng)ZFN和IDLV處理的HSPC的植入水平與未經(jīng)處理的對(duì)照的植入水平相當(dāng)，在第5周平均為14.8±11.4％，在第8周增加至45％(圖10C)。小鼠的外周血的譜系分析(T細(xì)胞的CD3，骨髓細(xì)胞的CD33，HSPC的CD34，B細(xì)胞的CD19和NK細(xì)胞的CD56)是如同在該模型中預(yù)期的(圖11)。對(duì)在接受用ZFN和寡核苷酸供體處理過(guò)的細(xì)胞的小鼠中的人類細(xì)胞的分析揭示了與經(jīng)ZFN和IDLV處理的HSPC的HSPC分化光譜類似的HSPC分化光譜(圖10E)。在移植后16周對(duì)小鼠實(shí)施安樂(lè)死，以使得能評(píng)價(jià)人類細(xì)胞移植效果和基因修飾水平。對(duì)于接受經(jīng)ZFN和IDLV處理的細(xì)胞的小鼠，對(duì)外周血的評(píng)價(jià)顯示高水平的移植效果和預(yù)期的譜系分布。骨髓(BM)區(qū)室的分析是相似的(圖12)。類似地，在接收經(jīng)ZFN和寡核苷酸兩者處理的細(xì)胞中，移植水平和譜系分布與在外周血和BM中接受經(jīng)ZFN和IDLV處理的HSPC的小鼠組中觀察到的相似。為了確定小鼠中存在的人類細(xì)胞是否確實(shí)是通過(guò)ZFN試劑修飾的那些細(xì)胞，從每只小鼠的BM和脾組織中分離基因組DNA，并且研究人β-珠蛋白基因。通過(guò)在接受經(jīng)ZFN和IDLV處理的細(xì)胞的小鼠的組織中的qPCR分析HhaIRFLP揭示了這些小鼠中存在基因修飾，但是比針對(duì)輸入細(xì)胞觀察到的10.5％基因修飾水平，頻度更低(對(duì)于BM和脾分別為0.14±0.32％和0.16±0.18％)(圖13)。序列分析證實(shí)在BM和脾中的人類細(xì)胞中的鐮狀突變處的基因修飾分別具有0.21±0.39％和0.27±0.31％的類似的平均值(圖13B)。對(duì)在切割位點(diǎn)通過(guò)NHEJ引起的插入和缺失(indel)的分析顯示相比于通過(guò)HDR引起的有更高水平的變化，來(lái)自含indel的BM的所有序列讀數(shù)的4.8±7.8％和來(lái)自脾的所有序列讀數(shù)的3.8±3.7％(圖14)。對(duì)接受經(jīng)ZFN和寡核苷酸處理的細(xì)胞的小鼠的BM和脾的基因組分析也表明維持基因修飾，所述細(xì)胞在施用之前在鐮狀堿基具有17.3％的基因修飾且在主群體中有19.8％的indel。對(duì)來(lái)自這些組織的DNA進(jìn)行高通量測(cè)序，分別在BM和脾中顯示0.85±0.81％和2.11±1.19％的靶向基因修飾(圖13C)。在這些組織中的indel的評(píng)價(jià)顯示在BM中為3.34±2.65％的水平以及在脾中為5.86±2.30％的水平(圖14)。這些結(jié)果表明已經(jīng)經(jīng)歷通過(guò)ZFN和同源定向的基因修飾進(jìn)行的位點(diǎn)特異性DNA裂解的CD34+細(xì)胞能夠移植并進(jìn)行多譜系分化。實(shí)施例8:鐮狀骨髓中的基因校正由于鐮狀細(xì)胞疾病患者不是利用G-CSF的干細(xì)胞動(dòng)員的候選者，因此我們從這些患者的BM吸出物獲得CD34+HSPC。使用ZFNmRNA和IDLV供體進(jìn)行位點(diǎn)特異性基因校正。將細(xì)胞置于紅細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基中，然后使用已建立的方法分化(Romeroetal,同上,Giarratanaetal,同上)。此外，評(píng)價(jià)一部分細(xì)胞的菌落形成潛能。與模擬、非電穿孔的對(duì)照樣品相比，用ZFN+IDLV(對(duì)33488/33501)處理的細(xì)胞顯示適度較低的(35％)菌落形成能力(圖15)。在初始紅系擴(kuò)增后(但在去核前)，收獲細(xì)胞用于基因組分析。通過(guò)這些樣品的qPCR進(jìn)行的RFLP分析顯示平均為20.1±8.8％的基因修飾水平(圖16A)。這些結(jié)果通過(guò)深度測(cè)序證實(shí)，以18.4±6.7％的讀數(shù)顯示SCD突變的校正(圖16B)。此外，測(cè)序證實(shí)，包含SCD突變的校正的大多數(shù)等位基因也在HhaI位置處包含堿基變化，從而表明大多數(shù)HDR驅(qū)動(dòng)的事件涵蓋這兩個(gè)堿基之間的至少22bp的距離。紅系培養(yǎng)結(jié)束后，收集樣品，以通過(guò)高壓液相色譜(HPLC)分析珠蛋白四聚體(圖16C)。來(lái)源于經(jīng)ZFN和IDLV處理的樣品的紅細(xì)胞中HbA峰的存在表明基因校正導(dǎo)致βS等位基因功能性轉(zhuǎn)化為βA等位基因。在來(lái)源于模擬處理的細(xì)胞的紅細(xì)胞中沒(méi)有觀察到這樣的峰。由于經(jīng)ZFN處理的樣品中HbS峰的減少，因而HbF峰顯示相對(duì)增加。在經(jīng)ZFN和IDLV處理的樣品中HbA的相對(duì)誘導(dǎo)率平均為5.3±0.02％，其中蛋白校正水平高達(dá)10.0％(圖16D)。這些結(jié)果證明了ZFN與IDLV供體組合以校正來(lái)自鐮狀細(xì)胞疾病患者的骨髓的HSPC表型的能力。這里顯示的結(jié)果表明使用鋅指核酸酶在體外人造血干/祖細(xì)胞鐮狀細(xì)胞疾病突變的基因校正的高水平。在本研究中，我們?cè)O(shè)計(jì)了ZFN對(duì)來(lái)裂解β-珠蛋白基因座。這些ZFN與同源供體模板(作為寡核苷酸或通過(guò)整合酶缺陷型慢病毒載體遞送)組合，能夠在祖細(xì)胞中以高水平誘導(dǎo)同源定向修復(fù)。ZFN裂解位點(diǎn)的分析揭示大部分核酸酶活性發(fā)生在β-珠蛋白基因座靶位點(diǎn)處，在同源δ-珠蛋白基因處裂解的比例較小。由于在成年紅系細(xì)胞中的低水平的δ-珠蛋白表達(dá)(<所有珠蛋白的3.5％)，在細(xì)胞亞群中的該基因處的ZFN活性不太可能是有害的。使用IDLV末端捕獲對(duì)在K562細(xì)胞中的ZFN靶外裂解位點(diǎn)的無(wú)傾向性的全基因組評(píng)價(jià)證實(shí)了ZFN的高特異性，僅發(fā)現(xiàn)背景整合到天然脆弱位點(diǎn)內(nèi)。當(dāng)ZFN和經(jīng)供體處理的細(xì)胞移植到小鼠中時(shí)，細(xì)胞的移植效率和譜系分布在經(jīng)模擬處理的和經(jīng)ZFN和供體處理的樣品之間是相等的。然而，盡管在移植前的體外樣品中基因修飾的平均水平為10-20％，但在植入16周后，在小鼠的脾臟和BM中的人類細(xì)胞中的基因校正水平顯著降低。這些發(fā)現(xiàn)與本領(lǐng)域最近公開的工作一致(Genoveseetal(2014)Nature510:235–240)，并且可能意味著雖然更成熟的祖細(xì)胞被有效地校正，但是通過(guò)修飾早期的更原始的造血干細(xì)胞提供持續(xù)的益處(例如臨床益處)。與位點(diǎn)特異性基因破壞的效率(參見(jiàn)Holtetal(2010)Natbiotech:839-47regardingCCR5disruption)相比，在更原始HSPC中的同源定向的基因校正的效率可能是由于在使用含有校正堿基的供體模板中的差異，其是共遞送的并且細(xì)胞DNA損傷修復(fù)途徑必須使用HDR而不是NHEJ來(lái)分辨DSB。由于NHEJ傾向于靜止、原始的HSC(參見(jiàn)Mohrinetal(2010)Cellstemcell7:174-85)，修復(fù)途徑選擇的傾向性可能限制原始HSC中的基因校正。因而，不受一種理論的束縛，ZFN在成熟和原始細(xì)胞群體中以相似的效率起作用是可能的，但是每種細(xì)胞類型中的活性修復(fù)途徑不同，使得HDR在更成熟的細(xì)胞中更具活性，并且在原始HSC中較不具活性。特別地，移植到小鼠中的細(xì)胞與它們保持基因修飾的輸入水平相比在較大程度上保持了indel的輸入水平(對(duì)于IDLV和寡聚實(shí)驗(yàn)，相比于43.9和11.7倍的基因修飾變化，相應(yīng)的indel變化為7.4和4.3倍)。來(lái)自鐮狀細(xì)胞疾病患者的BMCD34+細(xì)胞中的實(shí)驗(yàn)提供了臨床翻譯的前景。對(duì)于這些實(shí)驗(yàn)，典型鐮狀形突變(至少在紅系祖細(xì)胞中)的校正水平平均為18％，并且在分化后，這些細(xì)胞產(chǎn)生校正的野生型血紅蛋白(HbA)?；趤?lái)自用于SCD的同種異體造血干細(xì)胞移植物的數(shù)據(jù)，由于正常的供體來(lái)源的紅細(xì)胞的選擇優(yōu)勢(shì)，因此10-30％的供體嵌合率可導(dǎo)致顯著的臨床改善(Andreanietal(2011)Chimerism2(1):21-22和Waltersetal(2001)AmSocBloodandMarrowTranspl7:665-73)。此外，SCD突變的雜合子通常不經(jīng)歷疾病的癥狀。因此，校正每個(gè)HSC中的僅一個(gè)等位基因可證明足以減輕與SCD相關(guān)的大部分癥狀。盡管基于慢病毒的用于血紅蛋白病，并且特別是用于SCD的基因治療最近有進(jìn)展(參見(jiàn)Romeroetal,同上，以及ChandrakasanandMalik(2014)Hematol/oncolClinofNorthAmer28:199-216)，但是由于需要治療性轉(zhuǎn)基因的長(zhǎng)期和適當(dāng)調(diào)節(jié)的表達(dá)，因而潛在的并發(fā)癥仍然存在。在HSC中使用靶向核酸酶的經(jīng)典A至T致病鐮狀顛換的位點(diǎn)特異性校正提供了維持β珠蛋白在其內(nèi)源啟動(dòng)子和基因座控制區(qū)下的表達(dá)的獨(dú)特能力。此外，基因組校正試劑僅需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行一次性的、瞬時(shí)的離體處理而導(dǎo)致永久校正?？傊@些數(shù)據(jù)支持作為SCD潛在治療的HSPC中基因組編輯的持續(xù)發(fā)展。本文提及的所有專利、專利申請(qǐng)和公開特此通過(guò)引用全文并入。雖然為了清楚理解的目的，通過(guò)說(shuō)明和實(shí)施例相當(dāng)詳細(xì)地提供了公開內(nèi)容，但是對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，可以實(shí)踐各種改變和修改方案。因此，前述描述和實(shí)施例不應(yīng)被解釋為是限制性的。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3