1.領(lǐng)域

本文的公開內(nèi)容涉及免疫學領(lǐng)域，并且更具體地，涉及T淋巴細胞或其它免疫細胞的修飾。

2.背景

T淋巴細胞識別特異性抗原(包括腫瘤相關(guān)或腫瘤特異性抗原)并與之相互作用。由于T淋巴細胞能夠殺滅腫瘤細胞，因此過去25年以來在用T淋巴細胞(無論是抗原特異性T淋巴細胞，還是經(jīng)遺傳修飾以表達一個或多個嵌合抗原受體(CAR；參見，例如，Eshhar，美國專利號7,741,465；Eshhar，美國專利申請公開號2012/0093842)的T淋巴細胞)靶向腫瘤細胞方面投入濃厚興趣。然而，鑒于將CAR T細胞靶向身體必需區(qū)域的難度，需要尋找新的方法來增強CAR T細胞的歸巢。

3.概述

本文提供了經(jīng)遺傳修飾的細胞，例如免疫細胞，諸如T淋巴細胞，例如人T淋巴細胞，其包含某種受體，該受體引起表達所述受體的細胞歸巢至特定解剖區(qū)、特定組織或特定類型細胞，例如淋巴結(jié)的B細胞區(qū)、胃腸道或皮膚。在具體實施方案中，本文提供的經(jīng)遺傳修飾的細胞是T淋巴細胞，例如原代T淋巴細胞。在某些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的細胞表達嵌合抗原受體(CAR)。不希望受任何特定機制或理論的束縛，據(jù)信，當本文經(jīng)遺傳修飾的細胞表達某些受體(該受體引起表達所述受體的細胞歸巢至特定區(qū))時，它們更可能暴露于天然抗原，其中細胞(例如，表達CAR的細胞)能夠被活化。

在第一個方面，本文提供包含(例如已被工程化以表達)歸巢受體和CAR的細胞，例如T淋巴細胞，例如原代T淋巴細胞，或此類細胞群。在某些實施方案中，歸巢受體通常不在T淋巴細胞中表達或內(nèi)源性地在T淋巴細胞中表達。在某些實施方案中，歸巢受體是B細胞區(qū)歸巢受體。在具體實施方案中，B細胞區(qū)歸巢受體是CXCR5。在更具體的實施方案中，包含歸巢受體(例如B細胞區(qū)歸巢受體)的細胞或細胞群，另外缺乏T細胞區(qū)歸巢受體(例如CXCR7)的表達，或與正常T細胞相比具有降低的所述T細胞區(qū)歸巢受體的表達，例如該細胞或細胞群被工程化以比正常T細胞更低的水平表達T細胞歸巢受體。

在某些實施方案中，歸巢受體是胃腸歸巢受體。在具體實施方案中，胃腸歸巢受體是整聯(lián)蛋白α4β7(也稱為淋巴細胞派伊爾結(jié)(Peyer patch)粘附分子)。在其它具體實施方案中，胃腸歸巢受體是CCR9(C-C趨化因子受體類型9)。在某些實施方案中，細胞，例如T淋巴細胞，例如原代T淋巴細胞，或此類細胞群，包含(例如已被工程化以表達)一種以上(例如第二)胃腸歸巢受體，例如，原代T淋巴細胞包含CCR9和整聯(lián)蛋白α4β7。

在一個實施方案中，包含(例如已被工程化以表達)胃腸歸巢受體的細胞，例如T淋巴細胞，或此類細胞群，在維生素A代謝物存在下已被活化、擴增，或既被活化又被擴增。在具體實施方案中，維生素A代謝物是視黃酸。

在某些實施方案中，歸巢受體是皮膚歸巢受體。在具體實施方案中，皮膚歸巢受體是CLA(皮膚淋巴細胞相關(guān)抗原受體)。在其它具體實施方案中，皮膚歸巢受體是CCR4、CCR8或CCR10。在某些實施方案中，細胞，例如T淋巴細胞，例如原代T淋巴細胞，或此類細胞群，包含(例如已被工程化以表達)第二皮膚歸巢受體。在其它實施方案中，細胞，例如T淋巴細胞，例如原代T淋巴細胞，或此類細胞群，包含(例如表達)第三皮膚歸巢受體。在其它實施方案中，細胞，例如T淋巴細胞，例如原代T淋巴細胞，或此類細胞群，包含(例如表達)第四皮膚歸巢受體。在其它實施方案中，細胞或細胞群包含(例如表達)兩種或更多種皮膚歸巢受體，例如，CLA、CCR4、CCR8和/或CCR10中的兩種或更多種。

在一個實施方案中，包含(例如表達)皮膚歸巢受體的細胞，例如T淋巴細胞，例如原代T淋巴細胞，或此類細胞群，在維生素D代謝物存在下已被活化、擴增，或既被活化又被擴增。在具體實施方案中，維生素D代謝物是1,26-二羥膽鈣化醇(1,25(OH)₂D₃)。在一些實施方案中，細胞，例如T淋巴細胞，例如原代T淋巴細胞，或此類細胞群，在IL-12存在下已被活化、擴增，或既被活化又被擴增。在具體實施方案中，細胞，例如T淋巴細胞，例如原代T淋巴細胞，或此類細胞群，在IL-12和維生素D代謝物二者存在下已被活化、擴增，或既被活化又被擴增。

在一些實施方案中，細胞，例如T淋巴細胞，例如原代T淋巴細胞，或此類細胞群，包含(例如已被工程化以表達)胃腸歸巢受體或皮膚歸巢受體，并且另外包含B細胞歸巢受體。在具體實施方案中，B細胞歸巢受體是CXCR5。

在另一個方面，本文提供產(chǎn)生表達歸巢受體的細胞，例如T淋巴細胞，例如原代T淋巴細胞，或此類細胞群的方法。在某些實施方案中，本文提供產(chǎn)生歸巢至淋巴結(jié)的B細胞區(qū)的細胞，例如T淋巴細胞，例如原代T淋巴細胞，或此類細胞群的方法，該方法包括使細胞或細胞群工程化來以足以引起該細胞或細胞群歸巢至淋巴結(jié)的B細胞區(qū)的量或水平表達B細胞區(qū)歸巢受體。在具體實施方案中，B細胞區(qū)歸巢受體是CXCR5。

在某些實施方案中，本文提供產(chǎn)生歸巢至胃腸道的細胞，例如T淋巴細胞，例如原代T淋巴細胞，或此類細胞群的方法，該方法包括使細胞或細胞群工程化來以足以引起細胞或細胞群歸巢至胃腸道的量或水平表達胃腸歸巢受體。在具體實施方案中，胃腸歸巢受體是整聯(lián)蛋白α4β7。在其它具體實施方案中，胃腸歸巢受體是CCR9。在某些實施方案中，本文提供產(chǎn)生細胞，例如T淋巴細胞，例如原代T淋巴細胞，或此類細胞群的方法，該方法包括使細胞或細胞群工程化以表達另外的胃腸歸巢受體，例如，另外表達第二胃腸歸巢受體。在某些實施方案中，本文提供的方法另外包括其中在維生素A代謝物存在下細胞或細胞群被活化、擴增，或既被活化又被擴增的步驟。在具體實施方案中，維生素A代謝物是視黃酸。

在某些實施方案中，本文提供產(chǎn)生歸巢至皮膚的細胞，例如T淋巴細胞，例如原代T淋巴細胞，或此類細胞群的方法，該方法包括使細胞或細胞群工程化來以足以引起細胞或細胞群歸巢至皮膚的量或水平表達皮膚歸巢受體。在具體實施方案中，皮膚歸巢受體是CLA。在其它具體實施方案中，皮膚歸巢受體是CCR4、CCR8或CCR10。在某些實施方案中，本文提供產(chǎn)生細胞，例如T淋巴細胞，例如原代T淋巴細胞，或此類細胞群的方法，該方法包括使細胞或細胞群工程化以表達另外的皮膚歸巢受體，例如，另外表達第二皮膚歸巢受體。在某些實施方案中，本文提供產(chǎn)生細胞，例如T淋巴細胞，例如原代T淋巴細胞，或此類細胞群的方法，該方法包括使細胞或細胞群工程化以另外表達第三皮膚歸巢受體。在某些實施方案中，本文提供產(chǎn)生細胞，例如T淋巴細胞，例如原代T淋巴細胞，或此類細胞群的方法，該方法包括使細胞或細胞群工程化以另外表達第四皮膚歸巢受體。在某些實施方案中，本文提供的方法另外包括其中在維生素D代謝物存在下細胞或細胞群被活化、擴增，或既被活化又被擴增的步驟。在具體實施方案中，維生素D代謝物是1,26-二羥膽鈣化醇(1,25(OH)₂D₃)。在某些實施方案中，本文提供的方法另外包括其中在IL-12存在下細胞或細胞群被活化、擴增，或既被活化又被擴增的步驟。

在某些實施方案中，本文提供產(chǎn)生被工程化以表達胃腸歸巢受體或皮膚歸巢受體，并且另外被工程化以表達B細胞區(qū)歸巢受體的細胞，例如T淋巴細胞，例如原代T淋巴細胞，或此類細胞群的方法。在具體實施方案中，本文提供產(chǎn)生被工程化以表達胃腸歸巢受體或皮膚歸巢受體，并且另外被工程化以表達CXCR5的細胞，例如T淋巴細胞，例如原代T淋巴細胞，或此類細胞群的方法。

在某些實施方案中，本文提供產(chǎn)生被工程化以表達胃腸歸巢受體或皮膚歸巢受體的細胞，例如T淋巴細胞，例如原代T淋巴細胞，或此類細胞群的方法，所述方法包括向T淋巴細胞施用編碼嵌合抗原受體(CAR)的慢病毒載體的步驟。

在另一個方面，本文提供治療個體的癌癥或腫瘤的方法，該方法包括向需要其的個體施用T淋巴細胞或T淋巴細胞群，所述T淋巴細胞或T淋巴細胞群包含(i)B細胞區(qū)歸巢受體；和(ii)CAR。在某些實施方案中，B細胞區(qū)歸巢受體是CXCR5。

在某些實施方案中，本文提供治療個體的胃腸癌癥或腫瘤的方法，該方法包括向需要其的個體施用T淋巴細胞或T淋巴細胞群，所述T淋巴細胞或T淋巴細胞群包含(例如表達)(i)胃腸歸巢受體；和(ii)CAR。在具體實施方案中，胃腸歸巢受體是整聯(lián)蛋白α4β7。在其它具體實施方案中，胃腸歸巢受體是CCR9。在某些實施方案中，本文提供治療個體的胃腸癌癥或腫瘤的方法，該方法包括向需要其的個體施用T淋巴細胞或T淋巴細胞群，所述T淋巴細胞或T淋巴細胞群另外包含(例如表達)第二胃腸歸巢受體。

在某些實施方案中，本文提供治療個體的皮膚癌癥或腫瘤的方法，該方法包括向需要其的個體施用T淋巴細胞或T淋巴細胞群，所述T淋巴細胞或T淋巴細胞群包含(i)皮膚歸巢受體；和(ii)CAR。在具體實施方案中，皮膚歸巢受體是CLA。在其它具體實施方案中，皮膚歸巢受體是CCR4、CCR8或CCR10。在某些實施方案中，本文提供治療個體的皮膚癌癥或腫瘤的方法，該方法包括向需要其的個體施用T淋巴細胞或T淋巴細胞群，所述T淋巴細胞或T淋巴細胞群另外包含第二皮膚歸巢受體。在某些實施方案中，本文提供治療個體的皮膚癌癥或腫瘤的方法，該方法包括向需要其的個體施用T淋巴細胞或T淋巴細胞群，所述T淋巴細胞或T淋巴細胞群另外包含第三皮膚歸巢受體。在某些實施方案中，本文提供治療個體的皮膚癌癥或腫瘤的方法，該方法包括向需要其的個體施用T淋巴細胞或T淋巴細胞群，所述T淋巴細胞或T淋巴細胞群另外包含第四皮膚歸巢受體。

在某些實施方案中，本文提供治療個體的胃腸癌癥或腫瘤的方法，該方法包括向需要其的個體施用T淋巴細胞或T淋巴細胞群，所述T淋巴細胞或T淋巴細胞群包含(i)胃腸歸巢受體；和(ii)CAR，其中T淋巴細胞或T淋巴細胞群還包含B細胞區(qū)歸巢受體。在具體實施方案中，B細胞區(qū)歸巢受體是CXCR5。在某些實施方案中，本文提供的T淋巴細胞用于治療胃腸癌癥或腫瘤的方法。

在某些實施方案中，本文提供治療個體的皮膚癌癥或腫瘤的方法，該方法包括向需要其的個體施用T淋巴細胞或T淋巴細胞群，所述T淋巴細胞或T淋巴細胞群包含(i)皮膚歸巢受體；和(ii)CAR，其中T淋巴細胞或T淋巴細胞群還包含B細胞區(qū)歸巢受體。在具體實施方案中，B細胞區(qū)歸巢受體是CXCR5。在某些實施方案中，本文提供的T淋巴細胞用于治療皮膚癌癥或腫瘤的方法。

在具體實施方案中，本文提供治療個體的癌癥或腫瘤的方法，該方法包括向需要其的個體施用T淋巴細胞或T淋巴細胞群，所述T淋巴細胞或T淋巴細胞群包含(i)歸巢受體；和(ii)CAR，其中CAR的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合選自由以下組成的組的抗原：Her2、前列腺干細胞抗原(PSCA)、α-胎兒蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原-125(CA-125)、CA19-9、鈣網(wǎng)膜蛋白(calretinin)、MUC-1、上皮膜蛋白(EMA)、上皮腫瘤抗原(ETA)、酪氨酸酶、黑色素瘤相關(guān)抗原(MAGE)、CD19、CD34、CD45、CD99、CD117、嗜鉻粒蛋白、細胞角蛋白、結(jié)蛋白、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、巨囊性病液狀蛋白(GCDFP-15)、HMB-45抗原、高分子量黑色素瘤相關(guān)抗原(HMW-MAA)、蛋白黑素-A(由T淋巴細胞識別的黑色素瘤抗原；MART-1)、myo-D1、肌肉特異性肌動蛋白(MSA)、神經(jīng)絲、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、胎盤堿性磷酸酶、突觸素(synaptophysis)、甲狀腺球蛋白、甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1、丙酮酸激酶同工酶M2型的二聚體形式(腫瘤M2-PK)、異常ras蛋白、異常p53蛋白、fuc-GM1、GM2(癌胚抗原免疫原性-1；OFA-I-1)；GD2(OFA-I-2)、GM3、GD3、α-輔肌動蛋白-4、Bage-1、BCR-ABL、Bcr-Abl融合蛋白、β-連環(huán)蛋白、CA 15-3(CA 27.29\BCAA)、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、Casp-8、cdc27、cdk4、cdkn2a、coa-1、dek-can融合蛋白、EBNA、EF2、EB病毒抗原、ETV6-AML1融合蛋白、HLA-A2、HLA-A11、hsp70-2、KIAAO205、Mart2、Mum-1,2和3、neo-PAP、I類肌球蛋白、OS-9、pml-RARα融合蛋白、PTPRK、磷酸丙糖異構(gòu)酶、Gage 3,4,5,6,7、GnTV、Herv-K-mel、Lage-1、NA-88、NY-Eso-1/Lage-2、SP17、SSX-2、TRP2-Int2、gp100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、RAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15(58)、RAGE、、SCP-1、Hom/Mel-40、PRAME、HER-2/neu、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、人乳頭瘤病毒(HPV)抗原E6和E7、TSP-180、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72-4、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、13-連環(huán)蛋白、Mum-1、p16、TAGE、PSMA、CT7、端粒酶、43-9F、5T4、791Tgp72、13HCG、BCA225、BTAA、、CD68\KP1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB\70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90、TAAL6、TAG72、TLP、TPS、CD19、CD22、CD27、CD30、CD70、EGFRvIII(表皮生長因子變體III)、精子蛋白17(Sp17)、間皮素、PAP(前列腺酸性磷酸酶)、前列腺癌相關(guān)蛋白(prostein)、TARP(T細胞受體γ交替閱讀框蛋白)、Trp-p8、STEAP1(前列腺六次跨膜上皮抗原1)、整聯(lián)蛋白αvβ3(CD61)、泌乳激素和Ral-B。在具體實施方案中，本文提供治療個體的胃腸癌癥或腫瘤的方法，該方法包括向需要其的個體施用T淋巴細胞或T淋巴細胞群，所述T淋巴細胞或T淋巴細胞群包含(i)胃腸歸巢受體；和(ii)CAR，其中CAR的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合與胃腸腫瘤或癌癥有關(guān)(例如由其表達)的抗原。在具體實施方案中，與胃腸腫瘤或癌癥有關(guān)(例如由其表達)的抗原是CEA、Her2、CA242、MUC1、CA125或CA19-9。在具體實施方案中，本文提供的T淋巴細胞用于治療癌癥或腫瘤的方法。

在其它具體實施方案中，本文提供治療個體的皮膚癌癥或腫瘤的方法，該方法包括向需要其的個體施用T淋巴細胞或T淋巴細胞群，所述T淋巴細胞或T淋巴細胞群包含(i)皮膚歸巢受體；和(ii)CAR，其中CAR的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合與皮膚腫瘤或癌癥有關(guān)的抗原。在具體實施方案中，與皮膚腫瘤或癌癥有關(guān)(例如由其表達)的抗原是HMW-MAA、Her2、GD2、GD3、CEA或SPAG9。在其它具體實施方案中，本文提供的T淋巴細胞用于治療皮膚癌癥或腫瘤的方法。

4.發(fā)明詳述

適應性免疫應答始于二級淋巴器官，包括淋巴結(jié)。B細胞和T細胞分別被隔離在淋巴結(jié)的稱為“B細胞區(qū)”(位于淋巴結(jié)或濾泡的外皮層)和“T細胞區(qū)”(更廣泛地分布在濾泡周圍的區(qū)域(也稱為副皮質(zhì)))的不同區(qū)域。B細胞和T細胞表達允許它們歸巢至這些各個區(qū)，使得它們可以暴露于抗原的受體。完整抗原存在于B細胞區(qū)，而在T細胞區(qū)，抗原是由抗原呈遞細胞(例如樹突細胞)呈遞。完整抗原(例如腫瘤抗原)也存在于腫瘤位點。

本文提供經(jīng)遺傳修飾的細胞，例如免疫細胞，諸如T淋巴細胞，例如人T淋巴細胞，其包含某種受體，所述受體引起表達所述受體的細胞歸巢至特定解剖區(qū)、特定組織或特定類型細胞，例如淋巴結(jié)的B細胞區(qū)、胃腸道或皮膚。在具體實施方案中，本文提供的遺傳修飾的細胞是T淋巴細胞。在某些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的細胞表達嵌合抗原受體(CAR)，如章節(jié)4.4所述。在某些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的細胞表達CAR并內(nèi)源性表達一個或多個歸巢受體，例如引起表達該受體的細胞歸巢至淋巴結(jié)的B細胞區(qū)、胃腸道或皮膚的受體。不希望受任何特定機制或理論的束縛，據(jù)信，當本文經(jīng)遺傳修飾的細胞表達某種受體(該受體引起表達所述受體的細胞歸巢至特定區(qū))時，它們更可能暴露于天然抗原，其中細胞(例如表達CAR的細胞)能夠被活化。

4.1包含B細胞區(qū)歸巢受體的細胞、其制備方法及用途

在一個實施方案中，本文提供包含(例如已被工程化以表達)引起細胞歸巢至淋巴結(jié)的B細胞區(qū)(例如淋巴結(jié)的濾泡)的受體的經(jīng)遺傳修飾的細胞，例如免疫細胞，例如T淋巴細胞，例如人T淋巴細胞。此類受體在本文中被稱為“B細胞區(qū)歸巢受體”。在具體實施方案中，B細胞區(qū)歸巢受體是CXCR5，例如人CXCR5。GenBank^TM登錄號NM_001716.4和NM_032966.2提供人CXCR5的示例性核苷酸序列。GenBank^TM登錄號NP_116743.1和NP_001707.1提供人CXCR5的示例性氨基酸序列。人歸巢受體的示例性核苷酸和氨基酸序列可見于表1。在具體實施方案中，本文提供的經(jīng)遺傳修飾的細胞是T淋巴細胞。在某些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的細胞表達B細胞區(qū)歸巢受體，并且還表達CAR，如章節(jié)4.4所述。在某些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的細胞表達CAR并內(nèi)源性表達一種或多種B細胞區(qū)歸巢受體。

本文還提供產(chǎn)生歸巢至淋巴結(jié)的B細胞區(qū)(例如淋巴結(jié)的濾泡)的被基因工程化的T淋巴細胞的方法，該方法包括使T淋巴細胞工程化以表達B細胞區(qū)歸巢受體(例如CXCR5)的步驟，其中所述B細胞區(qū)歸巢受體以足以引起細胞歸巢至淋巴結(jié)的B細胞區(qū)的水平或量由該細胞表達。在一些實施方案中，使T細胞工程化以表達B細胞區(qū)歸巢受體的步驟包括將包含一個或多個受體核酸序列(即，編碼一個或多個受體的一個或多個核酸序列)的一個或多個載體引入細胞的步驟。在具體實施方案中，載體包含人CXCR5的核酸序列。在某個實施方案中，使T淋巴細胞工程化以表達B細胞區(qū)歸巢受體的步驟通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法進行。

用于使T淋巴細胞工程化以表達B細胞區(qū)歸巢受體的示例性核酸公開(例如)于章節(jié)4.5。

本文還提供治療個體的癌癥或腫瘤的方法，該方法包括向個體施用治療有效量的經(jīng)遺傳修飾的細胞，例如人T淋巴細胞，所述細胞包含(i)引起表達某種受體的細胞歸巢至淋巴結(jié)的B細胞區(qū)(例如淋巴結(jié)的濾泡)的所述受體，和(ii)CAR。在具體實施方案中，B細胞區(qū)歸巢受體是CXCR5。在某些實施方案中，包含(i)引起表達某種受體的細胞歸巢至淋巴結(jié)的B細胞區(qū)(例如淋巴結(jié)的濾泡)的所述受體，和(ii)CAR的經(jīng)遺傳修飾的細胞，例如人T淋巴細胞，抑制腫瘤細胞的增殖。在某些實施方案中，包含(i)引起表達某種受體的細胞歸巢至淋巴結(jié)的B細胞區(qū)(例如淋巴結(jié)的濾泡)的所述受體，和(ii)CAR的經(jīng)遺傳修飾的細胞，例如人T淋巴細胞，抑制腫瘤的生長。在某些實施方案中，包含(i)引起表達某種受體的細胞歸巢至淋巴結(jié)的B細胞區(qū)(例如淋巴結(jié)的濾泡)的所述受體，和(ii)CAR的經(jīng)遺傳修飾的細胞，例如人T淋巴細胞，殺滅腫瘤細胞。在具體實施方案中，CAR的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合選自由以下組成的組的抗原：Her2、前列腺干細胞抗原(PSCA)、α-胎兒蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原-125(CA-125)、CA19-9、鈣網(wǎng)膜蛋白、MUC-1、上皮膜蛋白(EMA)、上皮腫瘤抗原(ETA)、酪氨酸酶、黑色素瘤相關(guān)抗原(MAGE)、CD19、CD34、CD45、CD99、CD117、嗜鉻粒蛋白、細胞角蛋白、結(jié)蛋白、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、巨囊性病液狀蛋白(GCDFP-15)、HMB-45抗原、高分子量黑色素瘤相關(guān)抗原(HMW-MAA)、蛋白黑素-A(由T淋巴細胞識別的黑色素瘤抗原；MART-1)、myo-D1、肌肉特異性肌動蛋白(MSA)、神經(jīng)絲、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、胎盤堿性磷酸酶、突觸素、甲狀腺球蛋白、甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1、丙酮酸激酶同工酶M2型的二聚體形式(腫瘤M2-PK)、異常ras蛋白、異常p53蛋白、fuc-GM1、GM2(癌胚抗原免疫原性-1；OFA-I-1)；GD2(OFA-I-2)、GM3、GD3、α-輔肌動蛋白-4、Bage-1、BCR-ABL、Bcr-Abl融合蛋白、β-連環(huán)蛋白、CA 15-3(CA 27.29\BCAA)、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、Casp-8、cdc27、cdk4、cdkn2a、coa-1、dek-can融合蛋白、EBNA、EF2、EB病毒抗原、ETV6-AML1融合蛋白、HLA-A2、HLA-A11、hsp70-2、KIAAO205、Mart2、Mum-1,2和3、neo-PAP、I類肌球蛋白、OS-9、pml-RARα融合蛋白、PTPRK、磷酸丙糖異構(gòu)酶、Gage 3,4,5,6,7、GnTV、Herv-K-mel、Lage-1、NA-88、NY-Eso-1/Lage-2、SP17、SSX-2、TRP2-Int2、gp100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、RAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15(58)、RAGE、、SCP-1、Hom/Mel-40、PRAME、HER-2/neu、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、人乳頭瘤病毒(HPV)抗原E6和E7、TSP-180、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72-4、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、13-連環(huán)蛋白、Mum-1、p16、TAGE、PSMA、CT7、端粒酶、43-9F、5T4、791Tgp72、13HCG、BCA225、BTAA、、CD68\KP1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB\70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90、TAAL6、TAG72、TLP、TPS、CD19、CD22、CD27、CD30、CD70、EGFRvIII(表皮生長因子變體III)、精子蛋白17(Sp17)、間皮素、PAP(前列腺酸性磷酸酶)、前列腺癌相關(guān)蛋白、TARP(T細胞受體γ交替閱讀框蛋白)、Trp-p8、STEAP1(前列腺六次跨膜上皮抗原1)、整聯(lián)蛋白αvβ3(CD61)、泌乳激素和Ral-B。本文還提供了用于治療癌癥或腫瘤的方法中的經(jīng)遺傳修飾的細胞。

4.2.包含胃腸歸巢受體的細胞、其制備方法及用途

在一個實施方案中，本文提供包含(例如已被工程化以表達)某種受體的經(jīng)遺傳修飾的細胞，例如免疫細胞，諸如T淋巴細胞，例如人T淋巴細胞，該受體引起表達所述受體的細胞歸巢至胃腸道，例如胃腸器官、組織或細胞。此類引起細胞歸巢至胃腸道的受體在本文中被稱作“胃腸歸巢受體”。在具體實施方案中，本文提供的經(jīng)遺傳修飾的細胞是T淋巴細胞。在某些實施方案中，胃腸歸巢受體是CCR9或整聯(lián)蛋白α4β7，例如，人CCR9或人整聯(lián)蛋白α4β7。GenBank^TM登錄號NM_031200.2和NM001256369.1提供人CCR9的示例性核苷酸序列。GenBank^TM登錄號NP_112477.1和NP_001243298.1提供人CCR9的示例性氨基酸序列。GenBank^TM登錄號NM_000885.4和NM_000889.2分別提供人α4和人β7的示例性核苷酸序列。GenBank^TM登錄號NP_000876.3和NP_000880.1分別提供人α4和人β7的示例性氨基酸序列。人歸巢受體的示例性核苷酸和氨基酸序列可見于表1。在某些實施方案中，遺傳修飾的細胞還包括第二胃腸歸巢受體。在一些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的細胞包含第一胃腸歸巢受體，其中所述第一胃腸歸巢受體是CCR9，并且還包含第二胃腸歸巢受體，其中第二胃腸歸巢受體是整聯(lián)蛋白α4β7。在其它具體實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的細胞包含胃腸歸巢受體CXCR3。

在某些實施方案中，含有一種個或多種胃腸歸巢受體的經(jīng)遺傳修飾的細胞在維生素A代謝物存在下被擴增、活化，或既被擴增又被活化。在具體實施方案中，擴增、活化，或擴增和活化二者在體內(nèi)、體外或離體發(fā)生。在具體實施方案中，維生素A代謝物是視黃酸。在某些實施方案中，含有一種或多種胃腸歸巢受體的經(jīng)遺傳修飾的細胞包含B細胞區(qū)歸巢受體。在具體實施方案中，B細胞區(qū)歸巢受體是CXCR5。在某些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的細胞表達胃腸歸巢受體，并且還表達CAR，如章節(jié)4.4所述。在某些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的細胞表達CAR并內(nèi)源性表達一種或多種胃腸歸巢受體。

本文還提供產(chǎn)生包含一種或多種受體的經(jīng)遺傳修飾的細胞，例如人T淋巴細胞的方法，該一種或多種受體引起表達所述一種或多種受體的細胞歸巢至胃腸道，例如胃腸器官、皮膚或組織。在某些實施方案中，包含一種或多種受體(例如CCR9或整聯(lián)蛋白α4β7)的T淋巴細胞通過包括使T淋巴細胞工程化以表達一種或多種胃腸歸巢受體的步驟的方法產(chǎn)生，該一種或多種受體引起表達所述一種或多種受體的細胞歸巢至胃腸道。在一些實施方案中，使T淋巴細胞工程化以表達一種或多種胃腸歸巢受體的步驟包括將包含編碼所述受體的核酸序列的一個或多個載體引入細胞。在具體實施方案中，載體包含人CCR9的核酸序列、人整聯(lián)蛋白α4β7的核酸序列，或兩者兼而有之。

在某些實施方案中，歸巢至胃腸道的T淋巴細胞通過以下方法產(chǎn)生，所述方法包括用誘導一種或多種胃腸歸巢受體(例如，CCR9或α4β7)的表達的分子處理細胞的步驟。在具體實施方案中，分子是維生素A。

在某些實施方案中，用于產(chǎn)生包含一種或多種受體(該受體引起表達所述一種或多種受體的細胞歸巢至胃腸道)的經(jīng)遺傳修飾的T淋巴細胞的方法包括使細胞擴增的步驟，該步驟在維生素A代謝物存在下進行。在某些實施方案中，用于產(chǎn)生包含一種或多種受體的歸巢至胃腸道的經(jīng)遺傳修飾的T淋巴細胞的方法包括使細胞活化的步驟，該步驟在維生素A代謝物存在下進行。在某些實施方案中，擴增和活化步驟均在維生素A代謝物存在下進行。在某些實施方案中，維生素A代謝物是視黃酸。在某個實施方案中，使T細胞工程化以表達胃腸歸巢受體的步驟通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法進行。

用于使T淋巴細胞工程化以表達胃腸歸巢受體的示例性核酸討論(例如)于章節(jié)4.5。

本文還提供治療個體的胃腸癌癥或腫瘤的方法，該方法包括向個體施用治療有效量的經(jīng)遺傳修飾的細胞，例如人T淋巴細胞，所述細胞包含(i)引起表達一種或多種受體的細胞歸巢至胃腸道的所述一種或多種受體，和(ii)CAR。在某些實施方案中，胃腸歸巢受體是CCR9或α4β7。在某些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的細胞還包含第二胃腸歸巢受體。在一些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的細胞包含第一胃腸歸巢受體，其中所述第一胃腸歸巢受體是CCR9，并且還包含第二胃腸歸巢受體，其中所述第二胃腸歸巢受體是α4β7。在某些實施方案中，包含(i)引起表達一種或多種受體的細胞歸巢至胃腸道的所述一種或多種受體，和(ii)CAR的經(jīng)遺傳修飾的細胞，例如人T淋巴細胞，抑制腫瘤細胞的增殖。在某些實施方案中，包含(i)引起表達一種或多種受體的細胞歸巢至胃腸道的所述一種或多種受體，和(ii)CAR的經(jīng)遺傳修飾的細胞，例如人T淋巴細胞，抑制腫瘤生長。在某些實施方案中，包含(i)引起表達一種或多種受體的細胞歸巢至胃腸道的所述一種或多種受體，和(ii)CAR的經(jīng)遺傳修飾的細胞，例如人T淋巴細胞，殺滅腫瘤細胞。在具體實施方案中，胃腸癌癥或腫瘤是肝癌、胃癌、食道癌、膽囊癌、結(jié)腸直腸癌、肛門癌或胰腺癌。在某些實施方案中，CAR的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合與胃腸癌癥或腫瘤相關(guān)的抗原。本文還提供用于治療胃腸癌癥或腫瘤的方法中的經(jīng)遺傳修飾的細胞。

4.3.包含皮膚歸巢受體的細胞、其制備方法及用途

在一個實施方案中，本文提供包含某種受體的經(jīng)遺傳修飾的細胞，例如免疫細胞，諸如T淋巴細胞，例如人T淋巴細胞，該受體引起表達所述受體的細胞歸巢至皮膚，例如，皮膚組織或皮膚細胞。在具體實施方案中，本文提供的經(jīng)遺傳修飾的細胞是T淋巴細胞。在某些實施方案中，皮膚歸巢受體是CCR10、CCR8、CCR4或CLA，例如，人CCR10、人CCR8、人CCR4或人CLA。GenBank^TM登錄號NM_016602.2和AF215981.1提供人CCR10的示例性核苷酸序列。GenBank^TM登錄號NP_057686.2和P46092.3提供人CCR10的示例性氨基酸序列。GenBank^TM登錄號NM_005201.3和BC107159.1提供人CCR8的示例性核苷酸序列。GenBank^TM登錄號NP_005192.1和AAI07160.1提供人CCR8的示例性氨基酸序列。GenBank^TM登錄號NM_005508.4提供人CCR4的示例性核苷酸序列。GenBank^TM登錄號P51679.1提供人CCR4的示例性氨基酸序列。GenBank^TM登錄號NM_001206609.1和NM_003006.4提供人CLA的示例性核苷酸序列。GenBank^TM登錄號NP_001193538.1和NP_002997.2提供人CLA的示例性氨基酸序列。人歸巢受體的示例性核苷酸和氨基酸序列可見于表1。在某些實施方案中，遺傳修飾的細胞還包括第二皮膚歸巢受體。在一些實施方案中，遺傳修飾的細胞包括第一皮膚歸巢受體，其中第一皮膚歸巢受體是CCR10，并且還包括第二皮膚歸巢受體，其中第二皮膚歸巢受體是CLA。在一些實施方案中，遺傳修飾的細胞包括第一皮膚歸巢受體，其中第一皮膚歸巢受體是CCR10，并且還包括第二皮膚歸巢受體，其中第二皮膚歸巢受體是CCR4。在一些實施方案中，遺傳修飾的細胞包括第一皮膚歸巢受體，其中第一皮膚歸巢受體是CCR4，并且還包括第二皮膚歸巢受體，其中第二皮膚歸巢受體是CLA。在某些實施方案中，遺傳修飾的細胞還包括第三皮膚歸巢受體。在一些實施方案中，遺傳修飾的細胞包括第一皮膚歸巢受體，其中第一皮膚歸巢受體是CCR10，還包括第二皮膚歸巢受體，其中第二皮膚歸巢受體是CCR4，并且還包括第三皮膚歸巢受體，其中第三皮膚歸巢受體是CLA。在一些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的細胞包含第一皮膚歸巢受體，其中第一皮膚歸巢受體是CCR8，并且還包含第二皮膚歸巢受體，其中第二皮膚歸巢受體是CLA、CCR4或CCR10。在一些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的細胞包含第一皮膚歸巢受體，其中第一皮膚歸巢受體是CCR8，還包含第二皮膚歸巢受體，其中第二皮膚歸巢受體是CLA、CCR4或CCR10，并且還包含第三皮膚歸巢受體，其中第三皮膚歸巢受體不同于第二皮膚歸巢受體，并且選自由CLA、CCR4和CCR10組成的組。在一些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的細胞還包含第三皮膚歸巢受體。在一些實施方案中，遺傳修飾的細胞包括第一皮膚歸巢受體，其中第一皮膚歸巢受體是CCR10，還包括第二皮膚歸巢受體，其中第二皮膚歸巢受體是CCR4，還包括第三皮膚歸巢受體，其中第三皮膚歸巢受體是CLA，并且還包括第四皮膚歸巢受體，其中第四皮膚歸巢受體是CCR8。在某些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的細胞包含一個或多個皮膚歸巢受體。在其它具體實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的細胞包含皮膚歸巢受體CCR6。

在某些實施方案中，含有一種或多種皮膚歸巢受體的經(jīng)遺傳修飾的細胞在維生素D代謝物存在下被擴增、活化，或既被擴增又被活化。在具體實施方案中，擴增、活化，或擴增和活化二者在體內(nèi)、體外或離體發(fā)生。在具體實施方案中，維生素D代謝物是1,25-二羥膽鈣化醇(1,25(OH)₂D₃)。在某些實施方案中，含有一種或多種皮膚歸巢受體的經(jīng)遺傳修飾的細胞在IL-12存在下被擴增、活化，或既被擴增又被活化。在具體實施方案中，擴增、活化，或擴增和活化二者在體內(nèi)、體外或離體發(fā)生。在更具體的實施方案中，含有一種或多種皮膚歸巢受體的經(jīng)遺傳修飾的細胞在維生素D代謝物和IL-12存在下被擴增、活化，或既被擴增又被活化。在具體實施方案中，擴增、活化，或擴增和活化二者在體內(nèi)、體外或離體發(fā)生。在某些實施方案中，含有一種或多種皮膚歸巢受體的經(jīng)遺傳修飾的細胞另外包含B細胞區(qū)歸巢受體。在具體實施方案中，B細胞區(qū)歸巢受體是CXCR5。在某些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的細胞表達皮膚歸巢受體，并且還表達CAR，如章節(jié)4.4所述。在某些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的細胞表達CAR，并內(nèi)源性表達一種或多種皮膚歸巢受體。

本文還提供產(chǎn)生包含一種或多種受體的歸巢至皮膚(例如，皮膚組織或細胞)的經(jīng)遺傳修飾的細胞(例如人T淋巴細胞)的方法。在某些實施方案中，歸巢至皮膚的T淋巴細胞由以下方法產(chǎn)生，所述方法包括使T淋巴細胞工程化以表達皮膚歸巢受體(例如，CCR4、CCR8、CCR10或CLA)的步驟。在一些實施方案中，使T淋巴細胞工程化以表達皮膚歸巢受體的步驟包括將一個或多個包含一個或多個受體核酸序列(即，編碼一個或多個受體的一個或多個核酸序列)的載體引入細胞。在具體實施方案中，載體包含人CCR10的核酸序列、人CLA的核酸序列，或兩者兼而有之。在具體實施方案中，載體包含人CCR4的核酸序列，和任選地人CLA的核酸序列。在具體實施方案中，載體包含人CCR4的核酸序列和人CCR10的核酸序列。在具體實施方案中，載體包含人CCR10的核酸序列、人CCR4的核酸序列和人CLA的核酸序列。在具體實施方案中，載體包含人CCR8的核酸序列。在具體實施方案中，載體包含人CCR8的核酸序列，和任選地人CLA的核酸序列。在具體實施方案中，載體包含人CCR8的核酸序列和人CCR10的核酸序列。在具體實施方案中，載體包含人CCR8的核酸序列、人CCR4的核酸序列和人CLA的核酸序列。在具體實施方案中，載體包含人CCR8的核酸序列、人CCR10的核酸序列和人CLA的核酸序列。在具體實施方案中，載體包含人CCR8的核酸序列、人CCR4的核酸序列和人CCR10的核酸序列。在具體實施方案中，載體包含人CCR8的核酸序列、人CCR4的核酸序列、CCR10的核酸和人CLA的核酸序列。

在某些實施方案中，歸巢至皮膚的細胞(例如T淋巴細胞)通過以下方法產(chǎn)生，所述方法包括用誘導(例如增加)一種或多種皮膚歸巢受體(例如，CCR4、CCR10、CCR8或CLA)的表達的分子處理細胞(例如T淋巴細胞)的步驟。在具體實施方案中，分子是維生素D。在某些實施方案中，皮膚歸巢受體的表達的誘導通過用IL-12處理細胞(例如T淋巴細胞)來輔助，例如，以足夠增加所述細胞的CCR4、CCR8、CCR10或CLA中一種或多種的表達的量使細胞與IL-12接觸一段時間。

在某些實施方案中，用于產(chǎn)生包含一種或多種受體(該受體引起表達所述一種或多種受體的細胞歸巢至皮膚)的經(jīng)遺傳修飾的T淋巴細胞的方法包括使細胞擴增的步驟，該步驟在維生素D代謝物和任選的IL-12存在下進行。在某些實施方案中，用于產(chǎn)生包含一種或多種受體(該受體引起表達所述一種或多種受體的細胞歸巢至胃腸道)的經(jīng)遺傳修飾的T淋巴細胞的方法包括使細胞活化的步驟，該步驟在維生素D代謝物和任選的IL-12存在下進行。在某些實施方案中，擴增和活化步驟均在維生素D代謝物和任選的IL-12存在下進行。在某些實施方案中，維生素D代謝物是1,25(OH)₂D₃。在某個實施方案中，使T細胞工程化以表達皮膚歸巢受體的步驟通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法進行。

用于使T淋巴細胞工程化以表達皮膚歸巢受體的示例性核酸討論(例如)于章節(jié)4.5。

本文還提供治療個體的皮膚癌癥或腫瘤的方法，該方法包括向個體施用治療有效量的經(jīng)遺傳修飾的細胞，例如人T淋巴細胞，所述細胞包含(i)引起表達一個或多個受體的細胞歸巢至皮膚的所述一種或多種受體，和(ii)CAR。在某些實施方案中，皮膚歸巢受體是CCR10、CCR8、CCR4或CLA。在某些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的細胞還包含第二皮膚歸巢受體。在一些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的細胞包含第一皮膚歸巢受體，其中第一皮膚歸巢受體是CCR10，并且還包含第二皮膚歸巢受體，其中第二皮膚歸巢受體是CLA。在一些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的細胞包含第一皮膚歸巢受體，其中第一皮膚歸巢受體是CCR10，并且還包含第二皮膚歸巢受體，其中第二皮膚歸巢受體是CCR4。在一些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的細胞包含第一皮膚歸巢受體，其中第一皮膚歸巢受體是CCR10，并且還包含第二皮膚歸巢受體，其中第二皮膚歸巢受體是CCR8。在一些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的細胞包含第一皮膚歸巢受體，其中第一皮膚歸巢受體是CCR4，并且還包含第二皮膚歸巢受體，其中第二皮膚歸巢受體是CLA。在一些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的細胞包含第一皮膚歸巢受體，其中第一皮膚歸巢受體是CCR4，并且還包含第二皮膚歸巢受體，其中第二皮膚歸巢受體是CCR8。在一些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的細胞包含第一皮膚歸巢受體，其中第一皮膚歸巢受體是CLA，并且還包含第二皮膚歸巢受體，其中第二皮膚歸巢受體是CCR8。在一些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的細胞還包含第三皮膚歸巢受體。在一些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的細胞包含第一皮膚歸巢受體，其中第一皮膚歸巢受體是CCR10，還包含第二皮膚歸巢受體，其中第二皮膚歸巢受體是CCR4，并且還包含第三皮膚歸巢受體，其中第三皮膚歸巢受體是CLA。在一些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的細胞包含第一皮膚歸巢受體，其中第一皮膚歸巢受體是CCR10，還包含第二皮膚歸巢受體，其中第二皮膚歸巢受體是CCR4，并且還包含第三皮膚歸巢受體，其中第三皮膚歸巢受體是CCR8。在一些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的細胞包含第一皮膚歸巢受體，其中第一皮膚歸巢受體是CCR8，還包含第二皮膚歸巢受體，其中第二皮膚歸巢受體是CCR4，并且還包含第三皮膚歸巢受體，其中第三皮膚歸巢受體是CLA。在一些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的細胞包含第一皮膚歸巢受體，其中第一皮膚歸巢受體是CCR10，還包含第二皮膚歸巢受體，其中第二皮膚歸巢受體是CCR8，并且還包含第三皮膚歸巢受體，其中第三皮膚歸巢受體是CLA。在某些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的細胞還包含第四皮膚歸巢受體。在一些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的細胞包含第一皮膚歸巢受體，其中第一皮膚歸巢受體是CCR10，還包含第二皮膚歸巢受體，其中第二皮膚歸巢受體是CCR4，還包含第三皮膚歸巢受體，其中第三皮膚歸巢受體是CLA，并且還包含第四皮膚歸巢受體，其中第四皮膚歸巢受體是CCR8。在某些實施方案中，包含(i)引起表達一種或多種受體的細胞歸巢至皮膚的所述一種或多種受體，和(ii)CAR的經(jīng)遺傳修飾的細胞(例如人T淋巴細胞)，抑制腫瘤細胞的增殖。在某些實施方案中，包含(i)引起表達一種或多種受體的細胞歸巢至皮膚的所述一種或多種受體，和(ii)CAR的經(jīng)遺傳修飾的細胞(例如人T淋巴細胞)，抑制腫瘤的生長。在某些實施方案中，包含(i)引起表達一種或多種受體的細胞歸巢至皮膚的所述一種或多種受體，和(ii)CAR的經(jīng)遺傳修飾的細胞(例如人T淋巴細胞)，殺滅腫瘤細胞。在具體實施方案中，皮膚癌癥或腫瘤是黑色素瘤、鱗狀細胞癌或基底細胞癌。在某些實施方案中，CAR的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合與皮膚癌癥或腫瘤相關(guān)的抗原。本文還提供用于治療皮膚癌癥或腫瘤的方法中的經(jīng)遺傳修飾的細胞。

表1.人歸巢受體的示例性核苷酸和氨基酸序列。

4.4.嵌合抗原受體

當本文提供的細胞是如上所述包含歸巢受體的T淋巴細胞時，在某些實施方案中，此類T淋巴細胞可以包含嵌合抗原受體(CAR)，所述CAR是將T淋巴細胞引導至抗原，并刺激T淋巴細胞殺死呈現(xiàn)抗原的細胞的人工膜結(jié)合蛋白。參見，例如，Eshhar，美國專利號7,741,465。CAR至少包含結(jié)合抗原(例如細胞上的抗原)的細胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和將初級活化信號傳遞至免疫細胞的胞內(nèi)(細胞質(zhì))信號傳導結(jié)構(gòu)域。當CAR表達于(例如)T淋巴細胞(例如原代T淋巴細胞)的表面，并且CAR的細胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合抗原的所有其它條件滿足時，胞內(nèi)信號傳導結(jié)構(gòu)域?qū)⑿盘杺鬟f至T淋巴細胞以活化和/或增殖并且(如果抗原存在于細胞表面)殺死表達抗原的細胞。由于T淋巴細胞需要兩種信號，初級活化信號和共刺激信號，因此為了最大程度地活化，通常CAR還包含共刺激結(jié)構(gòu)域，使得抗原與細胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)合導致初級活化信號和共刺激信號二者的傳遞。

4.4.1.一般CAR結(jié)構(gòu)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域

在某些實施方案中，CAR的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域是或包括在T淋巴細胞的表面上表達并觸發(fā)所述T淋巴細胞的活化和/或增殖的蛋白質(zhì)的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域或基序。此類結(jié)構(gòu)域或基序能夠傳遞響應于抗原結(jié)合到CAR的胞外部分的T淋巴細胞活化所必需的初級抗原結(jié)合信號。通常，此結(jié)構(gòu)域或基序包括(或者是)ITAM(基于免疫受體酪氨酸的活化基序)。適用于CAR的含有ITAM的多肽包括(例如)ζCD3鏈(CD3ζ)或其含有ITAM的部分。在具體實施方案中，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域是CD3ζ胞內(nèi)信號傳導結(jié)構(gòu)域。在其它具體實施方案中，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域來自淋巴細胞受體鏈、TCR/CD3復合物蛋白質(zhì)、Fc受體亞基或IL-2受體亞基。

在某些實施方案中，CAR另外包含一個或多個共刺激結(jié)構(gòu)域或基序，例如，作為多肽的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的一部分。一個或多個共刺激結(jié)構(gòu)域或基序可以是(或包括)共刺激CD27多肽序列、共刺激CD28多肽序列、共刺激OX40(CD134)多肽序列、共刺激4-1BB(CD137)多肽序列、或共刺激可誘導的T細胞共刺激(ICOS)多肽序列、或其它共刺激結(jié)構(gòu)域或基序中的一個或多個。

跨膜區(qū)可以是可并入功能CAR的任何跨膜區(qū)，通常是來自CD4或CD8分子的跨膜區(qū)。

4.4.2.CAR胞外結(jié)構(gòu)域

多肽的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合目標抗原。在本文描述的任何多肽的某些實施方案中，胞外結(jié)構(gòu)域包括結(jié)合所述抗原的受體、或受體的一部分。胞外結(jié)構(gòu)域可以是(例如)結(jié)合所述抗原的受體、或受體的一部分。在某些實施方案中，胞外結(jié)構(gòu)域包括(或者是)抗體或其抗原結(jié)合部分。在具體實施方案中，胞外結(jié)構(gòu)域包括(或者是)單鏈Fv結(jié)構(gòu)域。單鏈Fv結(jié)構(gòu)域可以包括(例如)通過柔性接頭連接到V_H的V_L，其中所述V_L和V_H來自結(jié)合所述抗原的抗體。

多肽的胞外結(jié)構(gòu)域所結(jié)合的抗原可以是任何目標抗原，例如，可以是腫瘤細胞上的抗原。腫瘤細胞可以是(例如)實體瘤的細胞或血液癌癥的細胞?？乖梢允窃谌魏文[瘤或癌癥類型的細胞，例如淋巴瘤、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、腎上腺皮質(zhì)癌、甲狀腺癌、鼻咽癌、黑色素瘤(例如，惡性黑色素瘤)、皮膚癌、結(jié)腸直腸癌、硬纖維瘤、促結(jié)締組織增生性小圓細胞腫瘤、內(nèi)分泌腫瘤、尤因肉瘤(Ewing sarcoma)、外圍原始神經(jīng)外胚層瘤、生殖細胞實體腫瘤、肝母細胞瘤、神經(jīng)母細胞瘤、非橫紋肌軟組織肉瘤、骨肉瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、維爾姆斯腫瘤(Wilms tumor)、成膠質(zhì)細胞瘤、粘液瘤、纖維瘤、脂肪瘤等的細胞上表達的任何抗原。在更具體的實施方案中，所述淋巴瘤可以是慢性淋巴細胞性白血病(小淋巴細胞性淋巴瘤)、B細胞幼淋巴細胞性白血病、淋巴漿細胞性淋巴瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥(macroglobulinemia)、脾邊緣區(qū)淋巴瘤、漿細胞骨髓瘤、漿細胞瘤、結(jié)外邊緣區(qū)B細胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤、結(jié)內(nèi)邊緣區(qū)B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、縱隔(胸腺)大B細胞淋巴瘤、血管內(nèi)大B細胞淋巴瘤、原發(fā)性滲出性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、T淋巴細胞幼淋巴細胞性白血病、T淋巴細胞大顆粒淋巴細胞性白血病、侵襲性NK細胞白血病、成人T淋巴細胞白血病/淋巴瘤、結(jié)外NK/T淋巴細胞淋巴瘤、鼻型、腸病型T淋巴細胞淋巴瘤、肝脾型T淋巴細胞淋巴瘤、母細胞NK細胞淋巴瘤、蕈樣肉芽腫病、塞扎里綜合征(Sezary syndrome)、原發(fā)性皮膚間變性大細胞淋巴瘤、淋巴瘤樣丘疹病、血管免疫母細胞T淋巴細胞淋巴瘤、外周T淋巴細胞淋巴瘤(未指定)、間變性大細胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)或非霍奇金淋巴瘤。

在某些實施方案中，抗原是腫瘤相關(guān)抗原或腫瘤特異性抗原。在各種(但不限制)具體實施方案中，腫瘤相關(guān)抗原或腫瘤特異性抗原是Her2、前列腺干細胞抗原(PSCA)、α-胎兒蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原-125(CA-125)、CA19-9、鈣網(wǎng)膜蛋白、MUC-1、上皮膜蛋白(EMA)、上皮腫瘤抗原(ETA)、酪氨酸酶、黑色素瘤相關(guān)抗原(MAGE)、CD19、CD34、CD45、CD99、CD117、嗜鉻粒蛋白、細胞角蛋白、結(jié)蛋白、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、巨囊性病液狀蛋白(GCDFP-15)、HMB-45抗原、高分子量黑色素瘤相關(guān)抗原(HMW-MAA)、蛋白黑素-A(由T淋巴細胞識別的黑色素瘤抗原；MART-1)、myo-D1、肌肉特異性肌動蛋白(MSA)、神經(jīng)絲、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、胎盤堿性磷酸酶、突觸素、甲狀腺球蛋白、甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1、丙酮酸激酶同工酶M2型的二聚體形式(腫瘤M2-PK)、異常ras蛋白、或異常p53蛋白。

在某些實施方案中，TAA或TSA是癌癥/睪丸(CT)抗原，例如，BAGE、CAGE、CTAGE、FATE、GAGE、HCA661、HOM-TES-85、MAGEA、MAGEB、MAGEC、NA88、NY-ESO-1、NY-SAR-35、OY-TES-1、SPANXB1、SPA17、SSX、SYCP1或TPTE。

在某些其它實施方案中，TAA或TSA是碳水化合物或神經(jīng)節(jié)苷脂，例如fuc-GM1、GM2(癌胚抗原免疫原性-1；OFA-I-1)、GD2(OFA-I-2)、GM3、GD3等。

在某些其它實施方案中，TAA或TSA是α-輔肌動蛋白-4、Bage-1、BCR-ABL、Bcr-Abl融合蛋白、β-連環(huán)蛋白、CA 125、CA 15-3(CA27.29\BCAA)、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、Casp-8、cdc27、cdk4、cdkn2a、CEA、coa-1、dek-can融合蛋白、EBNA、EF2、EB病毒抗原、ETV6-AML1融合蛋白、HLA-A2、HLA-A11、hsp70-2、KIAAO205、Mart2、Mum-1,2和3、neo-PAP、I類肌球蛋白、OS-9、pml-RARα融合蛋白、PTPRK、K-ras、N-ras、磷酸丙糖異構(gòu)酶、Gage 3,4,5,6,7、GnTV、Herv-K-mel、Lage-1、NA-88、NY-Eso-1/Lage-2、SP17、SSX-2、TRP2-Int2、gp100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、RAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15(58)、RAGE、、SCP-1、Hom/Mel-40、PRAME、p53、H-Ras、HER-2/neu、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、人乳頭瘤病毒(HPV)抗原E6和E7、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72-4、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、13-連環(huán)蛋白、Mum-1、p16、TAGE、PSMA、CT7、端粒酶、43-9F、5T4、791Tgp72、13HCG、BCA225、BTAA、、CD68\KP1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB\70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90、TAAL6、TAG72、TLP、TPS、CD19、CD22、CD27、CD30、CD70、GD2(神經(jīng)節(jié)苷脂G2)、EGFRvIII(表皮生長因子變體III)、精子蛋白17(Sp17)、間皮素、PAP(前列腺酸性磷酸酶)、前列腺癌相關(guān)蛋白、TARP(T細胞受體γ交替閱讀框蛋白)、Trp-p8、STEAP1(前列腺六次跨膜上皮抗原1)、異常ras蛋白、或異常p53蛋白。在另一個具體的實施方案中，所述腫瘤相關(guān)抗原或腫瘤特異性抗原是整合蛋白αvβ3(CD61)、泌乳激素，K-Ras(V-Ki-ras2Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因)或Ral-B。其它腫瘤相關(guān)和腫瘤特異性抗原是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。

結(jié)合TSA和TAA的抗體和scFv是本領(lǐng)域已知的，編碼它們的核苷酸序列也一樣。

在某些具體的實施方案中，抗原是不被認為是TSA或TAA的抗原，但其仍然與腫瘤細胞或由腫瘤引起的損傷相關(guān)。在某些實施方案中，(例如)抗原是(例如)生長因子、細胞因子或白介素，例如與血管生成或血管發(fā)生相關(guān)的生長因子、細胞因子或白介素。此類生長因子、細胞因子或白介素可以包括(例如)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、血小板衍生的生長因子(PDGF)、肝細胞生長因子(HGF)、胰島素樣生長因子(IGF)或白介素-8(IL-8)。腫瘤也可以創(chuàng)建腫瘤局部的缺氧環(huán)境。同樣地，在其它具體實施方案中，抗原是缺氧相關(guān)因子，例如HIF-1α、HIF-1β、HIF-2α、HIF-2β、HIF-3α或HIF-3β。腫瘤也可能導致對正常組織的局部損傷，引起被稱為損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular pattern)分子(DAMP；也稱為警報素)的分子釋放。因此，在某些其它具體實施方案中，抗原是DAMP，例如熱休克蛋白、染色質(zhì)相關(guān)蛋白質(zhì)高遷移率族蛋白1(HMGB1)、S100A8(MRP8，鈣粒蛋白A)、S100A9(MRP14，鈣粒蛋白B)、血清淀粉樣蛋白A(SAA)，或者可以是脫氧核糖核酸、三磷酸腺苷、尿酸或硫酸肝素。

在其中癌癥是胃腸癌癥(例如肝癌、胃癌、食道癌、膽囊癌、結(jié)腸直腸癌、肛門癌或胰腺癌)的具體實施方案中，抗原是胃腸癌特異性的或與胃腸癌相關(guān)的抗原。在具體實施方案中，本文提供的T淋巴細胞表達胃腸歸巢受體，并且還表達具有結(jié)合與胃腸癌相關(guān)的抗原的胞外結(jié)構(gòu)域的CAR。在具體實施方案中，CAR的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合CEA。在其它具體實施方案中，CAR的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合Her2、CA242、MUC1、CA125或CA19-9。

在其中癌癥是皮膚癌(例如黑色素瘤、鱗狀細胞癌或基底細胞癌)的具體實施方案中，抗原是皮膚癌特異性的或與皮膚癌相關(guān)的抗原。在具體實施方案中，本文提供的T淋巴細胞表達皮膚歸巢受體，并且還表達具有結(jié)合與皮膚癌相關(guān)的抗原的胞外結(jié)構(gòu)域的CAR。在具體實施方案中，CAR的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合HMW-MAA。在其它具體實施方案中，CAR的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合Her2、GD2、GD3、CEA或SPAG9。

在本文描述的多肽的某些實施方案中，胞外結(jié)構(gòu)域通過接頭、間隔子或鉸鏈多肽序列(例如來自CD28的序列)連接到所述跨膜結(jié)構(gòu)域。

4.5.分離的核酸

在一個實施方案中，本文提供編碼本文提供的多肽(例如，嵌合受體和歸巢受體)的多核苷酸序列。多核苷酸可以包含在適合于轉(zhuǎn)化免疫細胞(例如T淋巴細胞)的任何多核苷酸載體中。例如，T淋巴細胞可以使用含有編碼第一和第二多肽(例如，嵌合受體)的多核苷酸的合成載體、慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、自主復制質(zhì)粒、病毒(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒或皰疹病毒)等轉(zhuǎn)化。適合于T淋巴細胞轉(zhuǎn)化的慢病毒載體包括(但不限于)例如，在美國專利號5,994,136；6,165,782；6,428,953；7,083,981；和7,250,299中描述的慢病毒載體，所述美國專利的公開內(nèi)容在此通過引用整體并入本文。適合于T淋巴細胞轉(zhuǎn)化的HIV載體包括(但不限于)例如，在美國專利號5,665,577中描述的載體，所述美國專利的公開內(nèi)容在此通過引用整體并入本文。

用于產(chǎn)生本文提供的多肽的核酸(例如在T淋巴胞內(nèi))包括DNA、RNA或核酸類似物。核酸類似物可以在堿基部分、糖部分或磷酸骨架處進行修飾，并且可以包括脫氧尿苷取代脫氧胸苷、5-甲基-2'-脫氧胞苷或5-溴-2'-脫氧胞苷取代脫氧胞苷。糖部分的修飾可包括核糖的2'羥基的修飾以形成2'-O-甲基或2'-O-烯丙基糖。脫氧核糖磷酸骨架可以被修飾以產(chǎn)生嗎啉代核酸，其中每個堿基部分與六元嗎啉代環(huán)或肽核酸連接，其中脫氧磷酸骨架被假肽骨架代替，并保留四個堿基。參見，例如，Summerton和Weller(1997)Antisense Nucleic Acid Drug Dev.7:187-195；和Hyrup等人(1996)Bioorgan.Med.Chain.4:5-23。另外，脫氧磷酸骨架可以替換為(例如)硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯骨架、亞磷酰胺或烷基磷酸三酯骨架。

編碼本文提供的多肽的核酸可以作為載體(諸如例如，表達載體)的一部分被引入宿主細胞中。此外，本文提供的多肽可通過用編碼此類多肽的核酸轉(zhuǎn)染宿主細胞來產(chǎn)生，并且此類核酸可以是載體的一部分。在具體實施方案中，載體是能夠指導編碼本文提供的多肽的核酸的表達的表達載體。表達載體的非限制性實例包括(但不限于)質(zhì)粒和病毒載體，如復制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、新城疫病毒、牛痘病毒和桿狀病毒。標準分子生物學技術(shù)可以用于將編碼本文提供的多肽的核酸引入表達載體中。

表達載體包含呈適合于在宿主細胞或非人受試者中表達核酸的形式的編碼本文提供的多肽的核酸。在具體實施方案中，表達載體包含一個或多個基于用于表達的宿主細胞進行選擇的可操作地連接到待表達的核酸的調(diào)控序列。在表達載體內(nèi)，“可操作地連接”旨在意指目標核酸以允許核酸表達的方式(例如，在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)或當載體被引入宿主細胞時在宿主細胞中)連接到一個或多個調(diào)控序列。調(diào)控序列包括啟動子、增強子和其它表達控制元件(例如，聚腺苷酸化信號)。調(diào)控序列包括在許多類型的宿主細胞中指導核酸的組成型表達的那些序列，僅在某些宿主細胞中指導核酸表達的那些序列(例如，組織特異性調(diào)控序列)，以及在用特定試劑刺激后指導核酸表達的那些序列(例如，可誘導的調(diào)控序列)。將由本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的是，表達載體的設計可取決于諸如例如待轉(zhuǎn)化的宿主細胞的選擇、所需蛋白質(zhì)的表達水平等因素。

可通過常規(guī)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)將表達載體引入宿主細胞。此類技術(shù)包括(但不限于)磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導的轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染和電穿孔。用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞的合適方法可見于Sambrook等人，1989，Molecular Cloning-A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Press，New York，和其它實驗室手冊。在某些實施方案中，用含有編碼本文提供的多肽的核酸的表達載體瞬時轉(zhuǎn)染宿主細胞。在其它實施方案中，用含有編碼本文提供的多肽的核酸的表達載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染宿主細胞。

4.6.細胞

可以使用歸巢受體的細胞的非限制性實例包括(但不限于)天然殺傷(NK)細胞、樹突細胞(DC)、胎盤干細胞(例如，在美國專利號7,468,276；8,057,788和8,202,703中公開的胎盤干細胞，所述美國專利的公開內(nèi)容在此通過引用整體并入本文)，來自臍帶血、胎盤血、外周血、骨髓、牙髓、脂肪組織、骨軟骨組織等的間充質(zhì)樣干細胞；胚胎干細胞、胚胎生殖細胞、神經(jīng)嵴干細胞、神經(jīng)干細胞和分化細胞(例如，成纖維細胞等)。歸巢受體也可以用于腫瘤細胞系，例如用于動物模型實驗目的。

在具體實施方案中，包含本文提供的多肽的細胞是T淋巴細胞。包含本文提供的多肽的T淋巴細胞可以是天然T淋巴細胞或MHC限制性T淋巴細胞。在某些實施方案中，T淋巴細胞是腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)。在某些實施方案中，T淋巴細胞已從腫瘤活檢分離，或已從由腫瘤活檢分離的T淋巴細胞擴增。在某些其它實施方案中，T淋巴細胞已從外周血、臍帶血或淋巴分離，或從由外周血、臍帶血或淋巴擴增的T淋巴細胞擴增。

在某些實施方案中，在本方法中使用的免疫細胞(例如T淋巴細胞)對于施用T淋巴細胞的個體是自體型的。在某些實施方案中，T淋巴細胞對于施用T淋巴細胞的個體是同種異體型的。當同種異體T淋巴細胞用于制備T淋巴細胞時，優(yōu)先選擇將降低個體的移植物抗宿主病(GVHD)的可能性的T淋巴細胞。例如，在某些實施方案中，選擇病毒特異性T淋巴細胞來制備T淋巴細胞；此類淋巴細胞將被預期具有結(jié)合任何受體抗原，從而被任何受體抗原活化的大大降低的天然能力。在某些實施方案中，受體介導的同種異體T淋巴細胞的排斥可以通過向宿主共同施用一種或多種免疫抑制劑(例如環(huán)孢霉素、他克莫司、西羅莫司、環(huán)磷酰胺等)而降低。

在一個實施方案中，T淋巴細胞從個體獲得，然后任選地擴增，然后用編碼一種或多種歸巢受體的多核苷酸和任選地一個或多編碼一種或多種CAR的多核苷酸轉(zhuǎn)化，然后任選地擴增。在另一個實施方案中，T淋巴細胞從個體獲得，然后任選地擴增，然后用編碼一種或多種歸巢受體的多核苷酸和任選地一個或多個編碼一種或多種CAR的多核苷酸轉(zhuǎn)化，然后任選地擴增。含有任何多核苷酸的細胞可以使用一個或多個可選擇的標志物進行選擇。

在某些實施方案中，任何本文提供的T淋巴細胞表達或包含天然TCR蛋白，例如能夠形成天然TCR復合物的TCR-α和TCR-β。在某些其它實施方案中，將T淋巴細胞中編碼TCR-α和TCR-β的天然基因的任一者或兩者修飾為無功能的，例如部分或全部缺失，插入突變等。

在某些實施方案中，任何本文提供的T淋巴細胞從腫瘤病灶分離，例如，是腫瘤浸潤性淋巴細胞；此類T淋巴細胞預期對TSA或TAA具有特異性。

T淋巴細胞，和包含含有CD3ζ信號傳導結(jié)構(gòu)域和CD28共刺激結(jié)構(gòu)域的多肽的T淋巴細胞可以使用針對CD3和CD28的抗體(例如，附著于珠粒或附著于細胞培養(yǎng)板表面上的抗體)來擴增；參見，例如，美國專利號5,948,893；6,534,055；6,352,694；6,692,964；6,887,466；和6,905,681。

在某些實施方案中，抗原和/或抗體可以游離存在于培養(yǎng)T淋巴細胞的培養(yǎng)基中，或任一者或兩者可附著于固體支持物，例如，組織培養(yǎng)塑料制品表面、珠粒等。

4.7.使用包含歸巢受體的細胞的方法

在一個方面，如本文別處所述，本文提供的包含一種或多種歸巢受體和任選的一種或多種CAR的細胞(例如T淋巴細胞)用于治療具有一種或多種待由本文描述的細胞靶向所需的類型的細胞(例如，待殺滅的一種或多種類型的細胞)的個體。在某些實施方案中，待殺滅的細胞是癌細胞，例如腫瘤細胞。在具體實施方案中，癌細胞是實體瘤細胞。在具體實施方案中，細胞是淋巴瘤、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、腎上腺皮質(zhì)癌、甲狀腺癌、鼻咽癌、黑色素瘤(例如惡性黑色素瘤)、皮膚癌、結(jié)腸直腸癌、硬纖維瘤、促結(jié)締組織增生性小圓細胞腫瘤、內(nèi)分泌腫瘤、尤因肉瘤、外圍原始神經(jīng)外胚層瘤、生殖細胞實體腫瘤、肝母細胞瘤、神經(jīng)母細胞瘤、非橫紋肌軟組織肉瘤、骨肉瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、維爾姆斯腫瘤、成膠質(zhì)細胞瘤、粘液瘤、纖維瘤、脂肪瘤等的細胞。在更具體的實施方案中，所述淋巴瘤可以是慢性淋巴細胞性白血病(小淋巴細胞性淋巴瘤)、B細胞幼淋巴細胞性白血病、淋巴漿細胞性淋巴瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥、脾邊緣區(qū)淋巴瘤、漿細胞骨髓瘤、漿細胞瘤、結(jié)外邊緣區(qū)B細胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤、結(jié)內(nèi)邊緣區(qū)B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、縱隔(胸腺)大B細胞淋巴瘤、血管內(nèi)大B細胞淋巴瘤、原發(fā)性滲出性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、T淋巴細胞幼淋巴細胞性白血病、T淋巴細胞大顆粒淋巴細胞性白血病、侵襲性NK細胞白血病、成人T淋巴細胞白血病/淋巴瘤、結(jié)外NK/T淋巴細胞淋巴瘤、鼻型、腸病型T淋巴細胞淋巴瘤、肝脾型T淋巴細胞淋巴瘤、母細胞NK細胞淋巴瘤、蕈樣肉芽腫病、塞扎里綜合征、原發(fā)性皮膚間變性大細胞淋巴瘤、淋巴瘤樣丘疹病、血管免疫母細胞T淋巴細胞淋巴瘤、外周T淋巴細胞淋巴瘤(未指定)、間變性大細胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。

在某些實施方案中，將經(jīng)修飾的細胞(例如本文描述的經(jīng)修飾的T淋巴細胞)施用于需要其的受試者，使得所選歸巢受體的組合與已施用細胞(例如T淋巴細胞)的患者群體(或亞群)相容。例如，基于患者中存在的腫瘤或癌癥類型來選擇歸巢受體的組合。

在具體實施方案中，將表達胃腸歸巢受體的T淋巴細胞施用于患有胃腸腫瘤或癌癥的患者。在某些實施方案中，胃腸腫瘤或癌癥是食道癌、胃癌、肝癌、膽囊癌、胰腺癌、結(jié)腸直腸癌或肛門癌。在具體實施方案中，所述T細胞還包含具有結(jié)合與胃腸腫瘤或癌癥相關(guān)的抗原的胞外結(jié)構(gòu)域的CAR。

在其它具體實施方案中，將表達皮膚歸巢受體的T淋巴細胞施用于患有皮膚腫瘤或癌癥的患者。在某些實施方案中，皮膚腫瘤或癌癥是黑色素瘤、基底細胞癌或鱗狀細胞癌。在具體實施方案中，所述T細胞還包含具有結(jié)合與皮膚腫瘤或癌癥相關(guān)的抗原的胞外結(jié)構(gòu)域的CAR。在具體實施方案中，包含歸巢受體的T淋巴細胞還包含具有結(jié)合在患者的腫瘤或癌癥細胞中表達的抗原的胞外結(jié)構(gòu)域的CAR。

施用于患有由此類細胞(例如T淋巴細胞)可治療的疾病或病癥的個體(例如患有癌癥的個體)后的細胞(例如T淋巴細胞)的功效可以通過一個或多個對特定疾病或病癥有特異性、本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知、指示疾病或病癥進展的標準來評估。通常，當一個或多個所述標準可檢測地(例如顯著地)從疾病狀態(tài)值或范圍移動到(或向)正常值或范圍時，將細胞施用于此類個體是有效的。

在某些實施方案中，將細胞(例如T淋巴細胞)配制在藥學上可接受的溶液中。在優(yōu)選的實施方案中，藥學上可接受的溶液適用于遞送活細胞。在具體實施方案中，藥學上可接受的溶液是(例如)鹽溶液(如林格氏溶液)、明膠、碳水化合物(如乳糖、直鏈淀粉、淀粉等)、脂肪酸酯、羥甲基纖維素或聚乙烯基吡咯烷。在更具體的實施方案中，將藥學上可接受的溶液在加入細胞之前滅菌。在其它更具體的實施方案中，藥學上可接受的溶液可以與諸如潤滑劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、影響滲透壓的鹽、緩沖劑和著色劑的助劑混合。適用于配制細胞的藥物載體是本領(lǐng)域已知的，并且描述于例如WO 96/05309中。

在某些實施方案中，將細胞(例如T淋巴細胞)配制成單個劑量，其中所述單個劑量包括至少、至多、或約1×10⁴、5×10⁴、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰或1×10¹¹個T淋巴細胞。在某些實施方案中，將細胞(例如T淋巴細胞)配制成單個劑量，其中所述單個劑量包括1×10⁴至5×10⁴、5×10⁴至1×10⁵、1×10⁵至5×10⁵、5×10⁵至1×10⁶、1×10⁶至5×10⁶、5×10⁶至1×10⁷、1×10⁷至5×10⁷、5×10⁷至1×10⁸、1×10⁸至5×10⁸、5×10⁸至1×10⁹、1×10⁹至5×10⁹、5×10⁹至1×10¹⁰、1×10¹⁰至5×10¹⁰或5×10¹⁰至1×10¹¹個T淋巴細胞的范圍。在某些實施方案中，配制細胞用于靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、腸胃外、肌內(nèi)、皮下、鞘內(nèi)或眼內(nèi)施用，或在特定器官或組織內(nèi)施用。

5.實施例

5.1.實施例1：鼠CXCR5⁺CAR T細胞的產(chǎn)生和體內(nèi)研究

T淋巴細胞從B6 Thy 1.1小鼠的脾臟獲得。產(chǎn)生包含嵌合抗原受體(CAR)的慢病毒構(gòu)建體，所述嵌合抗原受體包含人源化小鼠抗人CEA-scFv或抗人HER2-scFv和小鼠共刺激胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域和CD3ζ。CAR T細胞的驗證是通過經(jīng)由小鼠CXCL13趨化性試驗的表型表征和功能評估完成。

對于體內(nèi)測定，將鼠CXCR5+CAR T細胞的活性與CXCR5-CAR T細胞和未轉(zhuǎn)導的T細胞的活性進行比較。將可自發(fā)形成CEA+胃腸腫瘤(或HER2+乳腺腫瘤)的人CEA(或HER2)-轉(zhuǎn)基因小鼠用作受試者。通過靜脈內(nèi)施用一個或多個劑量來實現(xiàn)細胞的過繼轉(zhuǎn)移。

為了檢查過繼轉(zhuǎn)移的CAR T細胞在引流淋巴結(jié)(對于CEA轉(zhuǎn)基因小鼠為腸系膜淋巴結(jié)或?qū)τ贖ER2轉(zhuǎn)基因小鼠為腋下淋巴結(jié))中的位置，通過引流淋巴結(jié)免疫組織化學進行讀取測定(readout assay)。處死動物并鑒別引流淋巴結(jié)。用彎鉗夾取淋巴結(jié)并拉取去掉附著的組織。將淋巴結(jié)包埋在最佳切割溫度化合物中并在干冰上冷凍，然后保存在-80℃。切割冷凍切片，空氣干燥，并在丙酮中固定。切片與兔(或山羊)血清在室溫下預孵育，隨后與一抗(大鼠抗小鼠CD3、CD8、CD4，生物素化的小鼠抗小鼠Thy-1.1、生物素化的山羊-抗-人IgG(H+L))、和生物素化的兔(或山羊)抗大鼠IgG(小鼠吸附)、然后親和素-過氧化物酶(或熒光染料)綴合物孵育。然后切片用過氧化物酶的底物孵育進行顯色。免疫組織化學染色結(jié)果的圖像是利用共聚焦顯微術(shù)獲得的。由抗小鼠Thy1.1鑒別供體T細胞并且用抗-人IgG鑒別CAR T細胞。

為了檢查在引流淋巴結(jié)中抗原特異性免疫應答的建立，通過從引流淋巴結(jié)中分離的CAR T細胞的流式細胞術(shù)來完成讀取測定。進行表面標志物Thy 1.1、抗人IgG、CXCR5、CD69和HLA-DR的表型表征。CD69是活化的T細胞的標志物。HLA-DR是抗原呈遞細胞的標志物。完成功能評價以測定增殖、Ki67表達和CAR T細胞計數(shù)。刺激后通過胞內(nèi)細胞因子染色來評價細胞因子產(chǎn)生。

為了檢測CAR T細胞在腫瘤部位的腫瘤殺傷活性，測定腫瘤體積和存活。通過外部卡尺體內(nèi)測定腫瘤的體積。測定最大縱向直徑(長度)和最大橫向直徑(寬度)?；诳ǔ邷y量的腫瘤體積由修改的橢圓形公式計算：腫瘤體積＝1/2(長度×寬度²)。

5.2.實施例2：人CXCR5⁺CAR T細胞的產(chǎn)生

T淋巴細胞從人PBMC獲得。產(chǎn)生包含由人源化小鼠抗人CEA-scFv或抗人HER2-scFv和人共刺激胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域和CD3ζ組成的嵌合抗原受體(CAR)的慢病毒構(gòu)建體，并用于轉(zhuǎn)導T細胞以創(chuàng)建CEA-特異性CAR T細胞群。CAR T細胞進一步用含有編碼人CXCR5的核酸序列的慢病毒載體轉(zhuǎn)導；選擇表達CXCR5的CAR T細胞用于進一步研究。CAR T細胞的驗證通過經(jīng)由人CXCL13趨化性測定的表型表征和功能評估完成。

5.3.實施例3：鼠胃腸歸巢CAR T細胞的產(chǎn)生和體內(nèi)研究

T淋巴細胞從小鼠脾臟獲得。CAR T細胞使用如上所述含有編碼CAR的核苷酸序列的慢病毒構(gòu)建體產(chǎn)生，所述CAR包含人源化小鼠抗人CEA-scFv和小鼠共刺激胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域和CD3ζ。胃腸歸巢受體經(jīng)由鼠CCR9和α4β7核酸序列的慢病毒轉(zhuǎn)導引入。在T細胞活化過程中進行視黃酸處理。CAR T細胞的驗證通過經(jīng)由小鼠TECK(胸腺表達趨化因子，或CCL25)趨化性測定的表型表征和功能評估完成(Binger,等，2009,Experimental Cell Research 315:1468-79)。使用96多孔形式趨化板中的5μm孔徑的聚碳酸酯膜來評估對TECK的趨化反應。含有剝奪培養(yǎng)基(deprivation medium)中的TECK的下部孔通過膜與上部孔分離。將剝奪培養(yǎng)基中的T細胞接種到上部孔中，并在37℃孵育20小時。去除留在膜上方的未遷移細胞。遷移的細胞被固定、染色，并顯微計數(shù)，或經(jīng)由具有計數(shù)珠的流式細胞儀計數(shù)。陰性對照在不含趨化因子的剝奪培養(yǎng)基中進行，并且陽性對照在含有10％FBS的細胞培養(yǎng)介質(zhì)中進行。

對于體內(nèi)測定，可自發(fā)形成CEA+胃腸腫瘤的人CEA轉(zhuǎn)基因小鼠被用作受試者。通過靜脈內(nèi)施用一個或多個劑量來實現(xiàn)細胞的過繼轉(zhuǎn)移。

為了檢查過繼轉(zhuǎn)移的CAR T細胞在建立的胃腸道腫瘤中的位置，經(jīng)由胃腸道免疫組織化學完成讀取測定。處死動物，并去除胃腸道。將小腸切成4-5份，然后浸沒固定。將切片與兔(或山羊)血清在室溫下預孵育，隨后與一抗(大鼠抗小鼠CD3、生物素化的小鼠抗小鼠Thy-1.1、生物素化的山羊-抗-人IgG(H+L))、和生物素化的大鼠(或山羊)抗大鼠IgG(小鼠吸附)、然后親和素-過氧化物酶(或熒光染料)綴合物孵育。然后將切片與過氧化物酶的底物孵育進行顯色。免疫組織化學染色結(jié)果的圖像利用顯微術(shù)獲得。經(jīng)由抗小鼠Thy1.1鑒別供體T細胞并且用抗-人IgG鑒別CAR T細胞。也進行胃腸道的qRT-PCR或PCR用于檢測組織中的遷移的CAR T細胞。

為了檢查抗原特異性免疫應答在胃腸道中的建立，經(jīng)由從胃腸道分離的CAR T細胞的流式細胞術(shù)來完成讀取測定。進行表面標志物Thy 1.1、抗人IgG、CCR9、α4β7、CD69和HLA-DR的表型表征。完成功能評價以測定增殖、Ki67表達和CAR T細胞計數(shù)。刺激后通過胞內(nèi)細胞因子染色來評價細胞因子產(chǎn)生。

為了檢測CAR T細胞在腫瘤部位的腫瘤殺傷活性，測定腫瘤體積和存活。

5.4.實施例4：人胃腸歸巢CAR T細胞的產(chǎn)生

T淋巴細胞從人PBMC獲得。使用包含人源化小鼠抗人CEA-scFv和小鼠共刺激胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域和CD3ζ的CAR進行CAR T細胞的產(chǎn)生。CAR T細胞進一步用含有編碼人CCR9和α4β7的核酸序列的慢病毒載體轉(zhuǎn)導；選擇表達這兩種蛋白的CAR T細胞用于進一步的研究。在隨后的T細胞活化過程中，使CAR T細胞與視黃酸接觸，使得相比于表達這兩種蛋白質(zhì)但不與視黃酸接觸的CAR T細胞，CCR9和α4β7的水平增加。CAR T細胞的驗證通過經(jīng)由人TECK趨化性測定的表型表征和功能評估來完成。

5.5.實施例5：小鼠皮膚歸巢CAR T細胞的產(chǎn)生和體內(nèi)研究

T淋巴細胞從小鼠脾臟獲得。使用包含人源化小鼠抗人HMW-MAA-scFv和小鼠共刺激胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域和CD3ζ的CAR進行CAR T細胞的產(chǎn)生。CAR T細胞進一步用含有編碼人CCR10或CCR4和/或CLA的核酸序列的慢病毒載體轉(zhuǎn)導；選擇表達這兩種蛋白的CAR T細胞用于進一步的研究。CAR T細胞的驗證通過經(jīng)由小鼠CCL27趨化性測定的表型表征和功能評估來完成。使用96多孔形式趨化板中的5μm孔徑的聚碳酸酯膜來評估對CCL27的趨化反應。含有剝奪培養(yǎng)基中的CCL27的下部孔通過膜與上部孔分離。將剝奪培養(yǎng)基中的T細胞接種到上部孔中，并在37℃孵育20小時。去除留在膜上方的未遷移細胞。遷移的細胞被固定、染色，并顯微計數(shù)，或經(jīng)由使用計數(shù)珠粒的流式細胞術(shù)計數(shù)。陰性對照用不含趨化因子的剝奪培養(yǎng)基中進行，并且陽性對照用含有10％FBS的細胞培養(yǎng)基進行。

對于體內(nèi)測定，使用用表達HMW-MAA的人黑色素瘤細胞系移植的免疫缺陷小鼠作為受試者。通過使用多劑量靜脈內(nèi)施用的過繼轉(zhuǎn)移來施用細胞。

為了檢查過繼轉(zhuǎn)移的CAR T細胞在建立的黑色素瘤中的位置，經(jīng)由免疫組織化學完成讀取測定。經(jīng)由抗CD3來鑒別供體T細胞并且用抗-小鼠IgG來鑒別CAR T細胞。也進行用于檢測組織中遷移的CAR T細胞的qRT-PCR或PCR。

為了檢查在黑色素瘤中的抗原特異性免疫應答建立，經(jīng)由從黑色素瘤中分離的CAR T細胞的流式細胞術(shù)來完成讀取測定。進行表面標志物CD3、抗小鼠IgG、CCR10(或CCR4)、CLA、CD69和HLA-DR的表型表征。完成功能評價以測定增殖、Ki67表達和CAR T細胞的計數(shù)。刺激后通過胞內(nèi)細胞因子染色來評價細胞因子產(chǎn)生。

為了檢查CAR T細胞在腫瘤部位的腫瘤殺傷活性，測定腫瘤體積和存活。

5.6.實施例6：人皮膚歸巢CAR T細胞的產(chǎn)生

T淋巴細胞從人PBMC獲得。使用由人源化小鼠抗人HMW-MAA-scFv和人共刺激胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域和CD3ζ組成的CAR進行CAR T細胞產(chǎn)生。胃腸歸巢受體經(jīng)由人CCR10或CCR4和CLA核酸序列的慢病毒轉(zhuǎn)導而引入。在T細胞活化過程中進行用1,25(OH)₂VD₃和IL-12的處理。CAR T細胞的驗證通過經(jīng)由人CCL27趨化性測定的表型表征和功能評估完成，如在實施例5中。

5.7.實施例7：胃腸腫瘤的治療

個體呈現(xiàn)胃腸腫瘤，例如結(jié)腸腺瘤樣息肉。來自個體的腫瘤細胞的測試確定腫瘤細胞表達CEA。T淋巴細胞從個體獲得，用包含編碼嵌合抗原受體(CAR)的核苷酸序列的慢病毒載體轉(zhuǎn)染，并用包含編碼人CCR9和/或α4β7核酸序列的核苷酸序列的第二慢病毒載體轉(zhuǎn)染。在視黃酸存在下，使用CD3+CD28包被的珠粒將T淋巴細胞擴增到足夠用于施用的數(shù)量。嵌合受體包含結(jié)合CEA的胞外抗原結(jié)合區(qū)域；跨膜結(jié)構(gòu)域；來自CD28的胞內(nèi)共刺激結(jié)構(gòu)域；和胞內(nèi)CD3ζ結(jié)構(gòu)域。在30分鐘內(nèi)通過靜脈內(nèi)輸注向個體施用200mL鹽溶液中的10⁹和10¹⁰個之間的T淋巴細胞。重新評估個體的胃腸腫瘤階段和到淋巴結(jié)的擴散，并在施用后30、60和90天進行活檢的胃腸組織的組織學。

5.8.實施例8：黑色素瘤的治療

個體呈現(xiàn)黑色素瘤。來自個體的腫瘤細胞的測試確定腫瘤細胞表達HMW-MAA。T淋巴細胞從個體獲得，用包含編碼嵌合抗原受體(CAR)的核苷酸序列的慢病毒載體轉(zhuǎn)染，并用包含編碼人CCR10(或CCR4)和CLA核酸序列的核苷酸序列的第二慢病毒載體轉(zhuǎn)染。在1,25(OH)₂VD₃和IL-12存在下，使用CD3+CD28包被的珠粒將T淋巴細胞擴增到足夠用于施用的數(shù)量。嵌合受體包含結(jié)合HMW-MAA的胞外抗原結(jié)合區(qū)域；跨膜結(jié)構(gòu)域；來自CD28的胞內(nèi)共刺激結(jié)構(gòu)域；和胞內(nèi)CD3ζ結(jié)構(gòu)域。在30分鐘內(nèi)通過靜脈內(nèi)輸注向個體施用200mL鹽溶液中的介于10⁹和10¹⁰個之間的T淋巴細胞。重新評估個體的黑色素瘤階段和到淋巴結(jié)的擴散，并在施用后30、60和90天進行活檢的皮膚組織的組織學。

等效案

本公開并不限于本文所述的具體實施方案的范圍內(nèi)。事實上，根據(jù)以上描述，除了所描述的那些之外的對本文提供的主題的各種修改對本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。此類修改旨在落入所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。

本文引用了各種出版物、專利和專利申請，其公開內(nèi)容通過引用整體并入。

本發(fā)明的T淋巴細胞用于本文公開的方法中。