本發(fā)明涉及一種篩選方法，具體的為一種具有生物肥應(yīng)用潛力的固氮藍藻的篩選方法，屬于微生物領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

藍藻，又稱藍綠藻、藍細菌，是藻類生物中最簡單、最原始的一種微藻。固氮藍藻如念珠藻(Nostoc)、魚腥藻(Anabaena)、單崎藻(Tolypothrix)等，均能夠通過細胞中固氮酶的作用，將大氣中游離態(tài)的分子氮還原成可供植物利用的氮素化合物，同時在其生長過程中不斷分泌出多糖、氨基酸、多肽等氮類化合物及活性物質(zhì)，在提高土壤肥力的同時促進作物生長。

Karthikeyan等研究了從小麥根際分離得到的三種藍藻(Calothrix ghosei、Hapalosiphon intricatus、Nostoc sp.)對谷物產(chǎn)量的影響，結(jié)果表明，不同環(huán)境、不同藍藻組合對谷物產(chǎn)量的影響不同，Hapalosiphon intricatus及三種藍藻組合的使用使得谷物產(chǎn)量明顯增加，Hapalosiphon intricatus及Nostoc sp.的組合的使用使得谷物的高度明顯增高。Prasanna等通過研究寬松魚腥藻(Anabaena laxa)、魚腥藻(Anabaena sp.)、人蒼白桿菌(Ochrobactrum anthropi)對大米產(chǎn)量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三種微生物同時作用時，大米的產(chǎn)量較未加任何微生物的大米的產(chǎn)量提高了19.02％，每公頃節(jié)約N為40-80Kg。Kumar等研究了不同藍藻及不同嗜熱細菌組合對香料作物生長的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加只添加魚腥藻的實驗組的茴香種子發(fā)芽率較未添加微生物的實驗組的茴香種子發(fā)芽率增加了25％，只添加了眉藍細菌實驗組的芽/根長度較未加任何微生物的實驗組的芽/根長度增加了30％-50％。董俊德等在北京水稻田分離出固氮藍藻6屬15種。按每公頃接種1125kg鮮混合藻，該混合藻由念珠藻(BA02和BA03)、魚腥藻(BA01)及少量筒孢藻(BA66)。分蘗期主要是固氮藍藻和固氮菌共同固氮，抽穗期主要是藍藻固氮。王秀紅等在上海地區(qū)的水稻田施用鮮藻750kg/公頃，干藻80kg/公頃。藻種也是武漢水生生物研究所來的混合藻種。肥效和有機肥及化肥相當。齊永安等用武漢水生生物研究所在湖北大面積應(yīng)用的8種單藻組成的混合藻，以及由南京和武漢引來的9個單藻組成的混合藻種在黑龍江尚志縣做了水稻大田實驗，增產(chǎn)效果明顯。這些實驗充分驗證了固氮藍藻作為微生物肥料對水稻的增產(chǎn)效果。

一般來說，篩選具有生物肥料潛力的藍藻，先在實驗室內(nèi)對微藻的生長和固氮酶活性進行評價，再做花盆實驗考察對微藻作物的萌發(fā)或增產(chǎn)效果，有些還需要在大田培養(yǎng)考察生長 情況。但是實驗室篩選存在的問題有以下幾個方面1)實驗室內(nèi)的生長評價一般是僅對單一藻種進行，而在實際應(yīng)用中往往使用的是混合藻種；2)實驗室內(nèi)的固氮酶活性測定一般是在缺氮或限氮條件下進行的，實際應(yīng)用時土壤中不會處于嚴格缺氮的狀態(tài)，而且固氮酶活性在固氮藍藻的生命周期中也是變化的，實驗室內(nèi)的考察指標僅具有參考價值；3)藍藻對作物的增產(chǎn)機制也不僅限于固氮帶來的土壤有效氮含量增加。此外，土壤的微生物種群非常豐富，即使接種了大量的固氮藍藻，經(jīng)過土壤微生物種群的動態(tài)調(diào)整，藍藻在其中還是處于豐度較低的種群。由于多種固氮藍藻之間可能存在相互抑制作用，藍藻和土壤微生物間也存在相互作用，因此高效率的篩選多種固氮藍藻組合是很有必要的。

高通量篩選是指以分子水平和細胞水平的試驗方法為基礎(chǔ)，以微板形式作為實驗工具的實驗過程，簡言之是指通過一次實驗可以獲得大量信息，并從中找到有價值的信息。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種高效的具有生物肥應(yīng)用潛力的固氮藍藻的篩選方法。

為實現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明提供了一種具有生物肥應(yīng)用潛力的固氮藍藻的篩選方法，其特征在于，所述篩選方法至少包括：

1)準備3-10種候選的固氮藍藻藻株、至少2種土壤中的細菌以及為微孔細胞培養(yǎng)板，設(shè)計藻-藻共生實驗以及藻-菌共生實驗將藻株和細菌接種在微孔細胞培養(yǎng)基上培養(yǎng)以評價不同固氮藍藻以及固氮藍藻和細菌之間的相互作用；

2)測定每組實驗中的固氮藍藻的葉綠素a以及細菌的CFU個數(shù)。

3)選出葉綠素a增加2mg/L以上以及細菌CFU個數(shù)超過2×106/L。

優(yōu)選地,所述步驟1)中每個實驗方案中固氮藍藻的初始細胞接種密度為0.01-0.2g/L。

優(yōu)選地,所述固氮藍藻含有兩種或者三種固氮藍藻且每種固氮藍藻的干重相同。

優(yōu)選地,所述步驟1)中的細菌選自現(xiàn)有微生物菌種庫或野外篩選到的土壤微生物，包括芽孢桿菌和解磷菌。

優(yōu)選地,所述步驟1)中每種細菌的初始CFU為1×10⁵-2×10⁶L^-1。

優(yōu)選地,所述步驟1)中的微孔細胞培養(yǎng)板的孔體積為3-5mL，培養(yǎng)基為BG11培養(yǎng)基，培養(yǎng)的溫度為20-30℃，光照強度為70-120μmol/m²/s，光暗循環(huán)(光：暗＝14:10)，培養(yǎng)時間為6-8天。

優(yōu)選地，所述步驟1)中的設(shè)計藻-藻共生實驗以及藻-菌共生實驗是根據(jù)高通量原理獲得的實驗方案。

優(yōu)選地,還包括步驟3)設(shè)計盆栽實驗驗證固氮藍藻對土壤肥力的影響。

優(yōu)選地,所述步驟3)中盆栽實驗培養(yǎng)溫度20-30℃，光強度為50-150mol/m²/s，光暗循環(huán)(光：暗＝14:10)。

優(yōu)選地,所述固氮藍藻對土壤肥力的影響的判斷指標為測定在土壤中加入固氮藍藻的第10-15天測定土壤中有效磷、可溶性有機碳及總可溶性氮含量的變化量。

如上所述，本發(fā)明的藍藻多糖的制備和使用方法，具有以下有益效果：采用本實驗篩選出的固氮藍藻可以從整體上反應(yīng)出對土壤微生物的影響,并不局限于僅僅根據(jù)固氮的能力作為判斷指標,所以評價結(jié)果更加符合實際應(yīng)用；本實驗篩選出的實驗可以篩選出當具有多種藻共生時具有高效生物肥效力藻株，相對于在單一藻株存在的條件下的篩選結(jié)構(gòu)更加符合現(xiàn)實需求。

附圖說明

圖1實施例1中固氮藍藻與Btsk共培養(yǎng)7天后后葉綠素a含量的增加；

圖2實施例1中固氮藍藻與Pf共培養(yǎng)7天后后葉綠素a含量的增加；

圖3實施例1中固氮藍藻與細菌混合物共培養(yǎng)7天后后葉綠素a含量的增加；

圖4a實施例1固氮藍藻與細菌Btsk共培養(yǎng)7天后菌的CFU數(shù)量；

圖4b實施例1固氮藍藻與細菌Pf共培養(yǎng)7天后菌的CFU數(shù)量；

圖4c實施例1固氮藍藻與混合細菌共培養(yǎng)7天后菌的CFU數(shù)量；

圖5A為實施例2中固氮藍藻對土壤中有效磷的影響；

圖5B為實施例2中固氮藍藻對土壤中可溶性有機碳的影響；

圖5C為實施例2中固氮藍藻對土壤中總可溶性氮的影響。

具體實施方式

以下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實施方式加以實施或應(yīng)用，本說明書中的各項細節(jié)也可以基于不同觀點與應(yīng)用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進行各種修飾或改變。

在進一步描述本發(fā)明具體實施方式之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護范圍不局限于下述特定的具體實施方案；還應(yīng)當理解，本發(fā)明實施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體實施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護范圍；在本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中，除非文中另外明確指出，單數(shù)形式“一個”、“一”和“這個”包括復(fù)數(shù)形式。

當實施例給出數(shù)值范圍時，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端點以 及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實現(xiàn)本發(fā)明。

除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻中已有完善說明，具體可參見Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

實施例1固氮藍藻與兩種菌的共生實驗

選用固氮藍藻中魚腥藻B1611(購自美國德州大學(xué)UTEX藻種庫)，念珠藻F280和魚腥藻F243(分別購自中國科學(xué)院FACHB淡水藻種庫)，三種土壤微生物蘇云金芽孢桿菌肯尼亞亞種(Btsk)、熒光假單胞菌(Pf)(分別購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC))，編號分別為1.1012和1.867。

根據(jù)高通量實驗原理，固氮藍藻與細菌共生實驗共設(shè)計31組實驗，每組實驗的培養(yǎng)體積為5mL，培養(yǎng)溫度為27±2℃，光照強度為87.63±3.44μmol/m2/s，光暗循環(huán)(光：暗＝14:10)，培養(yǎng)基為BG11培養(yǎng)基，培養(yǎng)時間為7天，測定三種藍藻的葉綠素a含量的變化、兩種細菌的CFU個數(shù)。實驗方案見表1。

葉綠素a的測定參考Pruvost等的方法【Pruvost J.,G.Van Vooren,B.Le Gouic,et al.,Systematic investigation of biomass and lipid productivity by microalgae in photobioreactors for biodiesel application.Bioresour Technol,2011.102(1):150-158】；CFU計數(shù)參考Lundholm等的方法【Lundholm I.M.,Comparison of methods for quantitative determinations of airborne bacteria and evaluation of total viable counts.Applied and Environmental Microbiology,1982.44(1):179-183】；

表1固氮藍藻與兩種菌共生實驗方案設(shè)計表

實驗結(jié)果：

參見圖1，T9、T10以及T12實驗組中的葉綠素a含量都較其相應(yīng)的藍藻無菌純培養(yǎng)組(T1、T2和T4)高，說明加入蘇云金芽孢桿菌Btsk可以促進相應(yīng)藍藻的生長(圖1)。

參見圖2和3，熒光假單胞菌Pf對藻類生長的影響有不完全相同的趨勢。Pf同樣促進F280的生長(T18)，但是對B1611和B1611+F280確有抑制作用。對三藻共培養(yǎng)實驗組，加入Btsk后B1611+F280+F243的葉綠素有一定增加，但是加入Pf后則三種藍藻的生長顯著受到抑制。比較圖2和圖3可以發(fā)現(xiàn)，加入熒光假單胞菌Pf后F280+F243的葉綠素含量有一定增加，而加入Btsk+Pf對F280和F243共培養(yǎng)是不利的。除了對F280+F243共培養(yǎng)體系的影響不同外，加入Pf或同時添加Btsk和Pf對其它的藍藻純培養(yǎng)(B1611，F(xiàn)280和F243)或組合(B1611+F280，B1611+F243和B1611+F280+F243)的影響是一致的。說明熒光假單胞菌Pf對藍藻生長的影響強于蘇云金芽孢桿菌Btsk。

參見圖4a，B1611、F280、F243純培養(yǎng)及其混合培養(yǎng)對蘇云金芽孢桿菌B生長的影響差異較大。其中B1611+Btsk組(T9)和B1611+F243+Btsk組(T13)中蘇云金芽孢桿菌Btsk均有較好生長(CFU含量均為2.7×10⁶/L，顯著高于初始值2.0×10⁶/L)，藍藻的其余各組中蘇云金芽孢桿菌Btsk的含量都明顯低于初始接種值2.0×10⁶/L，說明B1611+B和B1611+F243可以促進蘇云金芽孢桿菌菌Btsk的生長。

參見圖4b，B1611+Pf(T17)、F280+Pf(T18)、B1611+F280+Pf(T20)、B1611+F243+Pf(T21)組中熒光假單胞菌Pf的CFU含量分別為3.1×10⁶/L、3.9×10⁶/L、2.5×10⁶/L、4.5×10⁶/L，均高于初始接種值2.0×10⁶/L，說明B1611、F280、B1611+F280、B1611+F243都能促進熒光假單胞菌Pf的生長，其中促進作用最明顯的是B1611+F243，其次是F280。

參見圖4c,B1611(T25)、B1611+F280(T28)與F280+F243(T30)組中細菌的CFU含量分別為1.8×10⁶/L、1.5×10⁶/L、0.9×10⁶/L，低于初始接種值2.0×10⁶/L，說明B1611、B1611+F280與F280+F243對混合的細菌(Btsk+Pf)生長具有抑制作用，B1611+F280+F243(T31)對Btsk+Pf略有促進，其余各組都對B+P有很強的促進作用。

通過實施例1中的測定，F(xiàn)280可以作為候選藻株。

實施例2盆栽實驗

為判斷實施例1中單一藍藻及不同藍藻組合對土壤肥力的影響進行盆栽土壤實驗，共設(shè)計8組實驗，培養(yǎng)溫度22℃，光強度為64.33±17.62mol/m2/s，光暗循環(huán)(光：暗＝14:10)， 第6天測定土壤中有效磷、可溶性有機碳、總可溶性氮的含量，實驗設(shè)計方案見表2。

土壤有效磷的測定參考Watanabe等的方法【W(wǎng)atanabe F.S.,S.R.Olsen,Test of an Ascorbic Acid Method for Determining Phosphorus in Water and NaHCO3Extracts from Soil.Soil Science Society of America Journal,1965.29(6):677-678】；可溶性有機碳、總可溶性氮含量的測定參考Techtmann等的方法【Techtmann S.M.,J.L.Fortney,K.A.Ayers,et al.,The unique chemistry of eastern Mediterranean water masses selects for distinct microbial communities by depth.PloS one,2015.10(3):e0120605】。

表2花盆土壤實驗方案設(shè)計表

參見圖5A，所有的藍藻處理組的AP(有效磷)含量均高于空白對照組，其中T3(F243組)、T5(B1611+F243組)和T6(F280+F243組)的AP含量顯著高于空白對照組；其余各組AP含量雖略高于空白對照組。

參見圖5B，所有藍藻處理組的DOC(可溶性有機碳)含量均不低于空白對照組。其中T5組(B1611+F243組)顯著高于空白對照組；T2(F280)、T4(B1611+F280)、T6(F280+F243)和T7(B1611+F280+F243)組顯示其平均值亦遠高于空白對照組。

參見圖5C，各組之間的TDN(總可溶性氮)含量的差異較大，其中T4(B1611+F280)、T5(B1611+F243)、T6(F280+F243)和T7(B1611+F280+F243)各組的平均值略低于空白對照組；T2(F280)組的平均值高于空白對照組；T1(B1611)和T3(F243)組TDN顯著高于空白對照組。

綜合實施例1和實施例2的結(jié)果，可以看到在所有31組藻菌組合中，既有利于藍藻又有助于細菌生長的藍藻體系為F280純培養(yǎng)組。

添加細菌的F280組在葉綠素a含量上均具有很大的優(yōu)勢(圖1、2、3)，F(xiàn)280在促進細菌生長的方面也較好，但對于細菌Btsk的促長作用略小(圖4a)。實驗室篩選結(jié)果表明，F(xiàn)280較其它實驗組更適合開發(fā)成生物肥。土壤分析上來看，F(xiàn)280對于土壤AP含量、DOC含量和TDN含量都有一定的提升作用，說明實驗室篩選方法是可行的?？梢栽谟写罅總溥x藻種和菌種，藻菌組合數(shù)量比較大的情況下，便捷、有效地篩選具有應(yīng)用于微藻生物肥潛力的藍藻。

實施例3固氮藍藻與兩種菌的共生實驗

選用固氮藍藻中魚腥藻B1611(購自美國德州大學(xué)UTEX藻種庫)，念珠藻F280和魚腥藻F243(分別購自中國科學(xué)院FACHB淡水藻種庫)，三種土壤微生物蘇云金芽孢桿菌肯尼亞亞種(Btsk)、熒光假單胞菌(Pf)和枯草芽孢桿菌(Bs)(分別購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC))，編號分別為1.1012、1.867和1.4255。

根據(jù)高通量實驗原理，固氮藍藻與細菌共生實驗共設(shè)計63組實驗，每組實驗的培養(yǎng)體積為3mL，培養(yǎng)溫度為20℃，光照強度為87.63±3.44μmol/m2/s，光暗循環(huán)(光：暗＝14:10)，培養(yǎng)基為BG11培養(yǎng)基，培養(yǎng)時間為8天，實驗方案見表3。

表3固氮藍藻與三種菌共生實驗方案設(shè)計表

采用和實施1中相同的實驗原理設(shè)計實驗方案，最終測定固氮藍藻的葉綠素a和細菌的CFU的數(shù)量，結(jié)果表明F280或F280+F243可以作為開發(fā)生物肥的藻株。

以上的實施例是為了說明本發(fā)明公開的實施方案，并不能理解為對本發(fā)明的限制。此外，本文所列出的各種修改以及發(fā)明中方法、組合物的變化，在不脫離本發(fā)明的范圍和精神的前提下對本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員來說是顯而易見的。雖然已結(jié)合本發(fā)明的多種具體優(yōu)選實施例對本發(fā)明進行了具體的描述，但應(yīng)當理解，本發(fā)明不應(yīng)僅限于這些具體實施例。事實上，各種如上所述的對本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員來說顯而易見的修改來獲取發(fā)明都應(yīng)包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。