本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物品種培育領(lǐng)域。本發(fā)明涉及具有抗蟲(chóng)抗草甘膦玉米轉(zhuǎn)化事件“雙抗12-5”和“雙抗12-15”及其特異性檢測(cè)方法。

(二)

背景技術(shù)：

玉米(Zea mays)是一種重要的作物，是世界上很多地區(qū)的主要食物來(lái)源。隨著植物基因工程的發(fā)展，通過(guò)導(dǎo)入外源基因來(lái)進(jìn)行遺傳改造成為遺傳育種的主要手段之一。在玉米生產(chǎn)中，抗蟲(chóng)和抗除草劑都是非常需要的農(nóng)藝性狀。抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因玉米能夠大幅度地降低化學(xué)殺蟲(chóng)劑的使用量，從而降低生產(chǎn)成本并且減少農(nóng)藥對(duì)環(huán)境和農(nóng)作物產(chǎn)品的污染?？钩輨┯衩卓梢源蠓冉档头乐坞s草所需要的農(nóng)業(yè)勞動(dòng)力，降低勞動(dòng)力的投入，減少雜草對(duì)玉米產(chǎn)量的影響。此外，利用除草劑防治雜草也更加有利于推廣免耕技術(shù)，減少土壤和肥料的流失。因此抗蟲(chóng)和抗除草劑性能在玉米生產(chǎn)中具有突出的重要性。

轉(zhuǎn)化事件是由外源基因在基因組插入位點(diǎn)的上下游側(cè)翼區(qū)和外源基因構(gòu)成的分子結(jié)構(gòu)。通常，外源基因轉(zhuǎn)化植物可以得到一個(gè)轉(zhuǎn)化體群體，這個(gè)轉(zhuǎn)化體群體包含大量獨(dú)立的事件，其中每個(gè)事件都是獨(dú)特的。外源基因在植物中的表達(dá)受到外源基因所插入的染色體位置的影響。這可能源自染色質(zhì)結(jié)構(gòu)或者整合位點(diǎn)附近轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的影響。相同基因在不同轉(zhuǎn)化事件中的表達(dá)水平具有很大的差異，在表達(dá)的空間或時(shí)間模式上也可能存在差異。而且外源基因的插入也可能會(huì)影響內(nèi)源基因的表達(dá)。因此，每個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件對(duì)受體植物的影響都是不同的。獲得能有效表達(dá)外源基因，同時(shí)不影響植株本身農(nóng)藝性狀的植物轉(zhuǎn)化事件在培育轉(zhuǎn)基因作物新品種中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

目前并不清楚外源基因在植物中的插入位點(diǎn)整合規(guī)律，因此研發(fā)過(guò)程中需要產(chǎn)生大量轉(zhuǎn)化體并從中篩選理想的轉(zhuǎn)化事件。通常需要產(chǎn)生數(shù)百乃至數(shù)千的不同轉(zhuǎn)化事件，并在這些轉(zhuǎn)化事件中篩選出具有預(yù)期轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平和模式的單一轉(zhuǎn)化事件。利用育種方法、體細(xì)胞原生質(zhì)融合技術(shù)可以將該轉(zhuǎn)化事件導(dǎo)入到不同遺傳背景的玉米基因組中，從而賦予玉米抗蟲(chóng)抗草甘膦的能力。

通過(guò)轉(zhuǎn)化事件專(zhuān)利對(duì)轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物進(jìn)行知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)是目前國(guó)際上通用方法，能夠進(jìn)入商業(yè)化的轉(zhuǎn)化事件是從大量轉(zhuǎn)化事件中篩選鑒定獲得，外源基因與受體作物基因組特異位點(diǎn)整合，具有獨(dú)特的分子特征，同時(shí)外源基因表達(dá)規(guī)律與生產(chǎn)實(shí)際需要相吻合，在基因分子特征和表達(dá)規(guī)律上都與一般轉(zhuǎn)化事件不同，因此具有明顯的新穎性、實(shí)用性和創(chuàng)造性。目前，國(guó)際上商業(yè)化的轉(zhuǎn)化事件多獲得知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)，部分轉(zhuǎn)化事件在中國(guó)申請(qǐng)并獲得專(zhuān)利保護(hù)。

(三)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供優(yōu)良的玉米抗蟲(chóng)抗草甘膦轉(zhuǎn)化事件“雙抗12-5”和“雙抗12-15”，這兩個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件所含外源基因的設(shè)計(jì)構(gòu)思相同，是同個(gè)植物轉(zhuǎn)化載體侵染玉米后，通過(guò)篩選獲得的優(yōu)良轉(zhuǎn)化事件，這兩個(gè)轉(zhuǎn)化事件都可實(shí)現(xiàn)將外源基因引入到玉米品系中，賦予受體玉米具有抗蟲(chóng)抗草甘膦的能力；抗蟲(chóng)抗草甘膦基因外源基因在受體玉米中能夠穩(wěn)定遺傳；抗蟲(chóng)抗草甘膦基因的表達(dá)對(duì)受體玉米的農(nóng)藝性狀不會(huì)產(chǎn)生不良影響。

本發(fā)明提供一種玉米轉(zhuǎn)化事件，所述轉(zhuǎn)化事件以SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列為外源基因的左側(cè)翼區(qū)，以SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列為外源基因的右側(cè)翼區(qū)或者以SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列為外源基因的左側(cè)翼區(qū)，以SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列為外源基因的右側(cè)翼區(qū)。所述外源基因包括抗蟲(chóng)基因和抗草甘膦基因，所述抗蟲(chóng)基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.4所示，所述抗草甘膦基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.5所示。

進(jìn)一步，優(yōu)選所述外源基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.2所示。

進(jìn)一步，優(yōu)選所述玉米轉(zhuǎn)化事件以SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列為外源基因的左側(cè)翼區(qū)，以SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列為外源基因的右側(cè)翼區(qū)，即本發(fā)明提供抗蟲(chóng)抗草甘膦玉米轉(zhuǎn)化事件“雙抗12-5”，其特征DNA序列由外源T-DNA插入序列SEQ ID NO.2、插入序列左側(cè)翼區(qū)玉米基因組序列SEQ ID NO.1和插入序列右側(cè)翼區(qū)玉米基因組序列SEQ ID NO.3構(gòu)成。

進(jìn)一步，所述玉米轉(zhuǎn)化事件以SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列為外源基因的左側(cè)翼區(qū)，以SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列為外源基因的右側(cè)翼區(qū)，即本發(fā)明提供抗蟲(chóng)抗草甘膦玉米轉(zhuǎn)化事件“雙抗12-15”，其特征DNA序列由外源T-DNA插入序列SEQ ID NO.2、插入序列左側(cè)翼區(qū)玉米基因組序列SEQ ID NO.14和插入序列右側(cè)翼區(qū)玉米基因組序列SEQ ID NO.15構(gòu)成。

本發(fā)明所述玉米轉(zhuǎn)化事件“雙抗12-5”和“雙抗12-15”是利用農(nóng)桿菌侵染法，將含有抗蟲(chóng)抗草甘膦基因表達(dá)框的外源T-DNA序列導(dǎo)入玉米細(xì)胞中，通過(guò)再生含有外源基因的玉米細(xì)胞獲得玉米轉(zhuǎn)基因群體，并利用分子生物學(xué)和生物測(cè)定的方法篩選得到能夠滿足生產(chǎn)需要的玉米轉(zhuǎn)化事件。

本發(fā)明提供的外源T-DNA含有抗蟲(chóng)基因表達(dá)框和抗草甘膦基因表達(dá)框。

本發(fā)明提供的抗蟲(chóng)基因表達(dá)框由玉米polyubiquitin-1基因啟動(dòng)子(pZmUbi-1)、抗蟲(chóng)融合基因cry1Ab-cry2Aj和玉米PEP carboxylase基因(pepc)終止子構(gòu)成。其中玉米polyubiquitin-1基因啟動(dòng)子(pZmUbi-1)大小為2.1kb，核苷酸序列為SEQ ID NO.7，是組成型啟動(dòng)子，可驅(qū)動(dòng)目的基因在玉米所有組織中表達(dá)。PEP carboxylase基因(pepc)終止子，來(lái)源于玉米，大小為0.2kb，核苷酸序列為SEQ ID NO.8。

進(jìn)一步，所述抗蟲(chóng)基因是cry1Ab和cry2Aj的融合基因，核苷酸序列為SEQ ID NO.4，其中，1-1947bp為cry1Ab的核苷酸序列；1948-1965bp核苷酸序列為CCCGGGAAGGGTGGAGGA，編碼Cry1Ab和Cry2Aj之間的連接肽，連接肽序列為PGKGGG；1966-3861bp為cry2Aj改良基因的核苷酸序列。融合基因全長(zhǎng)為3861bp，編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO.6。所編碼的蛋白質(zhì)由1287個(gè)氨基酸殘基組成，蛋白分子量大小為142.8kDa。Cry1和Cry2是兩類(lèi)被廣泛應(yīng)用的抗蟲(chóng)基因，其中Cry1Ab，Cry1Ac，Cry1F和Cry2Ab等在玉米、棉花中已經(jīng)大規(guī)模推廣應(yīng)用，Cry1Ab是一種殺蟲(chóng)能力比較強(qiáng)的Bt晶體殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)，特別是其對(duì)玉米螟的殺蟲(chóng)活性尤為高。Cry2Aj對(duì)主要農(nóng)作物鱗翅目害蟲(chóng)具有比較高的殺蟲(chóng)能力，與目前生產(chǎn)大量推廣的Cry2Ab的殺蟲(chóng)譜比較接近，氨基酸序列也比較相似。這些基因的安全性和抗蟲(chóng)能力已經(jīng)得到充分證明。本發(fā)明使用了cry1Ab和cry2Aj的融合基因，其特點(diǎn)是同時(shí)利用兩種不同的抗蟲(chóng)Bt基因，并且它們?cè)谟衩字斜磉_(dá)量相同。目前的研究認(rèn)為，二個(gè)不同類(lèi)型抗蟲(chóng)基因同時(shí)表達(dá)有可能減緩害蟲(chóng)抗性的發(fā)生(Zhao et al.,2003,Nat.Biotechnol.21:1493-1497)，有利于抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因玉米的長(zhǎng)期有效利用。

本發(fā)明提供的抗草甘膦表達(dá)框是由花椰菜花斑病病毒(Cauliflower Mosaic Virus,CaMV)的35S啟動(dòng)子和玉米polyubiquitin-1基因啟動(dòng)子組成的復(fù)合啟動(dòng)子(p35S-pZmUbi-1，核苷酸序列為SEQ ID NO.9)，5’端連有一段編碼AHAS基因葉綠體信號(hào)肽的G10evo(EPSPS)(核苷酸序列為SEQ ID NO.5，編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO.10)和CaMV的35S基因終止子(SEQ ID NO.11)構(gòu)成。

進(jìn)一步，所述抗草甘膦基因是5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)基因。草甘膦是一種廣譜滅生性除草劑，它通過(guò)抑制植物中5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的活性，導(dǎo)致植物不能合成芳香族氨基酸而死亡。為了方便雜草控制，通過(guò)在作物轉(zhuǎn)入對(duì)草甘膦具有抗性的EPSPS可以使作物獲得抗草甘膦的能力，實(shí)現(xiàn)在農(nóng)作物生長(zhǎng)的同時(shí)選擇性地除草。

本發(fā)明還涉及一種含玉米轉(zhuǎn)化事件的重組載體，其含有本發(fā)明所述T-DNA插入序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體圖譜如附圖1所示，載體序列為SEQ ID NO.13。

本發(fā)明提供一種含玉米轉(zhuǎn)化事件的重組細(xì)胞，重組細(xì)胞中含有本發(fā)明所述的重組載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組細(xì)胞為含有本發(fā)明所述重組載體的重組農(nóng)桿菌細(xì)胞。

本發(fā)明提供用于檢測(cè)轉(zhuǎn)化事件“雙抗12-5”的引物對(duì)，所述引物對(duì)由特異性識(shí)別T-DNA插入序列的第一引物和任意特異性識(shí)別SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3的第二引物組成。在一些實(shí)施方案中，所述第一引物序列為：SP1或R1，所述第二引物序列為：RB-Test或LB-test。

本發(fā)明提供一種鑒定玉米轉(zhuǎn)化事件“雙抗12-5”的方法，其包括：

1)從待鑒定的玉米樣品提取基因組DNA；

2)以提取的DNA樣品為模板，使用本發(fā)明提供的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

3)檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如果擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度與轉(zhuǎn)化事件上所述PCR引物對(duì)的序列之間的理論長(zhǎng)度一致，則說(shuō)明所述樣品中含有“雙抗12-5”。

本發(fā)明還提供一種玉米轉(zhuǎn)化事件“雙抗12-5”特異性的PCR鑒定方法，所述用于玉米轉(zhuǎn)化事件“雙抗12-5”特異性PCR鑒定的引物(SP1和RB-Test是檢測(cè)外源基因右側(cè)是否與玉米基因組特異性位點(diǎn)連接，R1和LB-test是檢測(cè)外源基因左側(cè)是否與玉米基因組特異性位點(diǎn)連接)為：

SP1：5’-TTTCTCCATAATAATGTGTGAGTAGTTCCC-3’(SEQ ID NO.17)；

RB-Test：5’-CTCGTCATCGACCAAGTCATGAAG-3’(SEQ ID NO.18)。

R1：5’-CGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGG-3’(SEQ ID NO.19)；

LB-test：5’-AAGACGTCCGGGGGAACCGTTGTTC-3’(SEQ ID NO.20)；

本發(fā)明所述PCR反應(yīng)體系為：

PCR反應(yīng)條件為：32個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)是95℃，45秒；65℃，50秒；72℃，30秒。

本發(fā)明提供用于檢測(cè)轉(zhuǎn)化事件“雙抗12-15”的引物對(duì)，所述引物對(duì)由特異性識(shí)別T-DNA插入序列的第一引物和任意特異性識(shí)別SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.15的第二引物組成。在一些實(shí)施方案中，所述第一引物序列為：LB-15T或RB-15T，所述第二引物序列為：LB-15G或RB-15G。

本發(fā)明提供一種鑒定玉米轉(zhuǎn)化事件“雙抗12-15”的方法，其包括：

4)從待鑒定的玉米樣品提取基因組DNA；

5)以提取的DNA樣品為模板，使用本發(fā)明提供的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

6)檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如果擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度與轉(zhuǎn)化事件上所述PCR引物對(duì)的序列之間的理論

長(zhǎng)度一致，則說(shuō)明所述樣品中含有“雙抗12-15”。

本發(fā)明還提供一種玉米轉(zhuǎn)化事件“雙抗12-15”特異性的PCR鑒定方法，所述用于玉米轉(zhuǎn)化事件“雙抗12-15”特異性PCR鑒定的引物(RB-15T和RB-15G是檢測(cè)外源基因右側(cè)是否與玉米基因組特異性位點(diǎn)連接，LB-15T和LB-15G是檢測(cè)外源基因左側(cè)是否與玉米基因組特異性位點(diǎn)連接)為：

LB-15T：5’-CTAAAACCAAAATCCAGTACTAAAATCC-3’(SEQ ID NO.21)；

LB-15G：5’-GCCGTACGTTTCCCAGCC-3’(SEQ ID NO.22)。

RB-15T：5’-AGCTTGAGCTTGGATCAGATTGTCGT-3’(SEQ ID NO.23)；

RB-15G：5’-CGTACAGGGAGCTTAGGGGG-3’(SEQ ID NO.24)；

本發(fā)明所述PCR反應(yīng)體系為：

PCR反應(yīng)條件為：32個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)是95℃，45秒；65℃，50秒；72℃，30秒。

本發(fā)明提供一種所述玉米轉(zhuǎn)化事件在制備抗蟲(chóng)抗草甘膦玉米細(xì)胞中的應(yīng)用，利用含有所述玉米轉(zhuǎn)化事件的玉米材料與玉米育種材料進(jìn)行雜交后，進(jìn)一步進(jìn)行回交，獲得所述抗蟲(chóng)抗草甘膦玉米細(xì)胞。具體利用抗蟲(chóng)抗草甘膦轉(zhuǎn)化事件“雙抗12-5”培育抗蟲(chóng)抗草甘膦玉米的方法，包括：利用含有轉(zhuǎn)化事件“雙抗12-5”的玉米材料與其它玉米育種材料進(jìn)行雜交后，進(jìn)一步進(jìn)行回交，獲得含有本發(fā)明所述轉(zhuǎn)化事件“雙抗12-5”的新材料。

本發(fā)明提供利用抗蟲(chóng)抗草甘膦轉(zhuǎn)化事件“雙抗12-15”培育抗蟲(chóng)抗草甘膦玉米的方法，包括：利用含有轉(zhuǎn)化事件“雙抗12-15”的玉米材料與其它玉米育種材料進(jìn)行雜交后，進(jìn)一步進(jìn)行回交，獲得含有本發(fā)明所述轉(zhuǎn)化事件“雙抗12-15”的新材料。

本發(fā)明所述含“雙抗12-5”轉(zhuǎn)化事件(即SEQ ID NO.12)的植物細(xì)胞，即玉蜀黍?qū)儆衩譠eamays L.雙抗12-5種子，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)CCTCC NO：P201506，保藏日期：2015年4月27日，保藏地址：中國(guó)武漢武漢大學(xué)，郵編430072。

本發(fā)明所述含“雙抗12-15”轉(zhuǎn)化事件(即SEQ ID NO.16)的植物細(xì)胞，即玉蜀黍?qū)儆衩譠eamays L.雙抗12-15種子，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)CCTCC NO:P201607，保藏日期：2016年4月11日，保藏地址：中國(guó)武漢武漢大學(xué)，郵編430072。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明提供了優(yōu)良的轉(zhuǎn)化事件“雙抗12-5”和“雙抗12-15”，所述轉(zhuǎn)化事件可實(shí)現(xiàn)將外源基因特異性引入到玉米品系中，賦予受體玉米具有抗蟲(chóng)抗草甘膦的能力；抗蟲(chóng)抗草甘膦基因在受體玉米中能夠穩(wěn)定遺傳；抗蟲(chóng)抗草甘膦基因的表達(dá)對(duì)受體玉米的農(nóng)藝性狀不會(huì)產(chǎn)生不良影響。

(四)附圖說(shuō)明

圖1、實(shí)施例1含目的基因的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖，LB和RB：T-DNA的邊界序列；pZmUbi-1：玉米polyubiqutin-1啟動(dòng)子；p35S：35S啟動(dòng)子(CaMV病毒)；G10evo：抗草甘膦EPSPS基因；Cry1Ab-Cry2Aj：抗蟲(chóng)Bt融合基因cry1Ab/cry2Aj。

圖2、雙抗12-5抗草甘膦基因的Southern雜交后的熒光顯影圖；BamHI為基因組經(jīng)BamHI單酶切；XbaI為基因組經(jīng)XbaI單酶切；以地高辛標(biāo)記的G10evo全長(zhǎng)DNA作為探針雜交到尼龍基質(zhì)膜上以后熒光顯影；圖右側(cè)為DNA長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)(bp)標(biāo)記，箭頭指雜交產(chǎn)生的特異性條帶。

圖3、雙抗12-5抗蟲(chóng)基因的Southern雜交后熒光顯影圖；KpnI為雙抗12-5的基因組DNA經(jīng)過(guò)KpnI酶切；SmaI為“雙抗12-5”的基因組DNA經(jīng)過(guò)SmaI酶切，地高辛標(biāo)記的Cry1Ab全長(zhǎng)DNA作為探針，雜交到尼龍基質(zhì)膜上以后熒光顯影，圖右側(cè)為DNA長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)(bp)。

圖4、雙抗12-15抗蟲(chóng)基因的Southern雜交后的熒光顯影圖；SacI為基因組經(jīng)SacI單酶切,AclI位雙抗12-15基因組經(jīng)AclI單酶切，M為DNA長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)(bp).

圖5、雙抗12-15抗草甘膦基因的Southern雜交后的熒光顯影圖；BamHI為雙抗12-15基因組經(jīng)BamHI單酶切；XbaI為雙抗12-15基因組經(jīng)XbaI單酶切；以地高辛標(biāo)記的G10evo全長(zhǎng)DNA作為探針雜交到尼龍基質(zhì)膜上以后熒光顯影；M為DNA長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)(bp)標(biāo)記。

圖6、插入位點(diǎn)的PCR驗(yàn)證電泳圖；1為轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5左側(cè)翼PCR；2為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ兆髠?cè)翼PCR；3為轉(zhuǎn)基因玉米右側(cè)翼PCR；4為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼覀?cè)翼PCR；M為DNA大小標(biāo)準(zhǔn)(PCR產(chǎn)物在200-500bp之間)。

圖7、插入位點(diǎn)的PCR驗(yàn)證電泳圖；玉米“雙抗12-15”左側(cè)翼PCR；1和2為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ眨挥镜?-6為轉(zhuǎn)基因玉米“雙抗12-15”；M為DNA大小標(biāo)準(zhǔn)(PCR產(chǎn)物在1170bp左右)。

圖8、插入位點(diǎn)的PCR驗(yàn)證電泳圖；玉米“雙抗12-15”右側(cè)翼PCR；1和2為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?；泳?-6為轉(zhuǎn)基因玉米“雙抗12-15”；M為DNA大小標(biāo)準(zhǔn)(PCR產(chǎn)物在600bp左右)。

圖9、雙抗12-5在受體玉米中的DNA遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)電泳圖；M為DNA大小標(biāo)準(zhǔn)樣品(100bp梯度)；-為陰性對(duì)照(非轉(zhuǎn)基因玉米)；+為陽(yáng)性對(duì)照(加入了經(jīng)過(guò)序列測(cè)定驗(yàn)證的PCR陽(yáng)性產(chǎn)物的非轉(zhuǎn)基因玉米樣品)；1，2，3，4，5，6，7分別是第1，2，3，4，5，6，7代的受體玉米樣品；PCR產(chǎn)物的預(yù)期大小是145bp，與PCR產(chǎn)物電泳分析的大小基本一致。

圖10、“雙抗12-15”在受體玉米中的DNA遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)電泳圖；M為DNA大小標(biāo)準(zhǔn)樣品(100bp梯度)；-為陰性對(duì)照(非轉(zhuǎn)基因玉米)；+為陽(yáng)性對(duì)照(加入了經(jīng)過(guò)序列測(cè)定驗(yàn)證的PCR陽(yáng)性產(chǎn)物的非轉(zhuǎn)基因玉米樣品)；1，2，3，4，5，6，7分別是第1，2，3，4，5，6，7代的受體玉米樣品；PCR產(chǎn)物的預(yù)期大小是1000bp，與PCR產(chǎn)物電泳分析的大小基本一致。

(五)具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

實(shí)施例1：轉(zhuǎn)化事件的獲得

(1)含有外源基因的質(zhì)粒載體的獲得

本發(fā)明用于玉米轉(zhuǎn)化的載體圖譜如圖1所示，轉(zhuǎn)化質(zhì)粒載體核苷酸序列為SEQ ID NO.13，具體載體組成元件的名稱、位置如表1所示。其中T-DNA基因的核苷酸序列為SEQ ID NO:2所示。SEQ ID NO:2包含完整的抗草甘膦表達(dá)框和抗蟲(chóng)表達(dá)框，具體由如下部分組成，抗草甘膦表達(dá)框：來(lái)源于CaMV的35S啟動(dòng)子與玉米Polyubiqutin-1啟動(dòng)子形成的復(fù)合啟動(dòng)子(核苷酸序列為SEQ IDNO.9所示)，該復(fù)合啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)5’端連有一段編碼AHAS基因葉綠體信號(hào)肽的抗草甘膦基因G10evo(EPSPS)(核苷酸序列為SEQ ID NO.5所示)，終止子是CaMV的35S基因終止子(長(zhǎng)度為0.2kb，其核苷酸序列為SEQ ID NO.11)?？瓜x(chóng)表達(dá)框：Cry1Ab-PGKGGG-Cry2Aj融合基因，驅(qū)動(dòng)Cry1Ab-Cry2Aj融合基因的啟動(dòng)子為來(lái)源于玉米polyubiquitin-1基因啟動(dòng)子(pZmUbi-1)(通過(guò)PCR從玉米基因組獲得，大小為2.1kb，核苷酸序列為SEQ ID NO.7，pZmUbi-1可驅(qū)動(dòng)目的基因在所有植物組織中表達(dá))，終止子為來(lái)源于玉米的PEP carboxylase基因(pepc)終止子(大小為0.2kb，核苷酸序列為SEQ ID NO.8)。利用電擊法(2500V)將獲得的植物轉(zhuǎn)化質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404中，獲得含有植物轉(zhuǎn)化載體的農(nóng)桿菌。

表1玉米轉(zhuǎn)化載體組成元件的名稱、位置和功能

(2)玉米遺傳轉(zhuǎn)化

本研究中獲得玉米轉(zhuǎn)化事件所用的方法是農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法，根據(jù)Frame等報(bào)道的方法和培養(yǎng)基配方(Plant Physiol,2002,129:13-22)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，使用草甘膦為篩選試劑，具體步驟如下：

(1)取授粉后8～10天的親本玉米穗，收集大小為1.0-1.5mm未成熟胚。將含有轉(zhuǎn)化載體的農(nóng)桿菌與未成熟胚在22℃共培養(yǎng)2-3天。

(2)將步驟(1)培養(yǎng)后的未成熟胚轉(zhuǎn)移到含有終濃度200mg/L特美汀抗生素(葛蘭素史克，美國(guó))的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)10-14天殺滅農(nóng)桿菌。

(3)將步驟(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)后的所有愈傷組織轉(zhuǎn)到含有終濃度2mM草甘膦的篩選培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)2-3周。

(4)轉(zhuǎn)移步驟(3)所有的愈傷組織到新鮮的含有(2mM)草甘膦的篩選培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)2-3周。

(5)然后，轉(zhuǎn)移步驟(4)成活的胚性組織到再生培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)10-14天，每皿一個(gè)株系。

(6)轉(zhuǎn)移步驟(5)胚性組織到新鮮的再生培養(yǎng)基上，26℃光照培養(yǎng)10-14天。

(7)轉(zhuǎn)移步驟(6)所有發(fā)育完全的植株到生根培養(yǎng)基上，26℃光照培養(yǎng)直到根發(fā)育完全，將生根后的再生苗移植到溫室中生長(zhǎng)繁種，用于篩選分析。

實(shí)施例2：轉(zhuǎn)化事件的篩選

通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)獲得了240個(gè)抗蟲(chóng)抗草甘膦玉米獨(dú)立轉(zhuǎn)化體(實(shí)施例1)。根據(jù)載體序列(SEQID NO.13設(shè)計(jì)引物，用PCR方法篩選含有抗草甘膦基因G10eve(核苷酸序列為SEQ ID NO.5所示)和抗蟲(chóng)基因cry1Ab-cry2Aj(核苷酸序列為SEQ ID NO.4所示)，同時(shí)不含載體骨架序列的玉米轉(zhuǎn)化體，并在溫室中進(jìn)行抗蟲(chóng)抗草甘膦性能的初步測(cè)試：通過(guò)噴施0.4wt％的草甘膦，去除草甘膦抗性差的轉(zhuǎn)化體，在剩余的轉(zhuǎn)化體上接玉米螟，篩選沒(méi)有玉米螟為害的轉(zhuǎn)化體，共計(jì)獲得15個(gè)含轉(zhuǎn)化事件編號(hào)為“雙抗12-1”～“雙抗12-15”的具有較強(qiáng)抗蟲(chóng)抗草甘膦能力的玉米轉(zhuǎn)化體。分別將含雙抗獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件的轉(zhuǎn)化體與玉米自交系B73雜交留種，進(jìn)行隨后的篩選分析。

(1)草甘膦抗性篩選

選擇15個(gè)含轉(zhuǎn)化事件“雙抗12-1”-轉(zhuǎn)化事件“雙抗12-15”的轉(zhuǎn)化體的T3和T5代轉(zhuǎn)基因玉米進(jìn)行草甘膦抗性對(duì)比。轉(zhuǎn)基因玉米和親本非轉(zhuǎn)基因?qū)φ辗N子發(fā)芽后20-30天，長(zhǎng)至4-5葉期，噴施終濃度為0.4wt％的草甘膦(農(nóng)達(dá)，孟山都公司，美國(guó))，使用量為25L/畝，7天后記錄玉米生長(zhǎng)發(fā)育情況和死亡率。草甘膦噴施試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，轉(zhuǎn)基因品系都具有明顯的抗草甘膦能力。其中含有轉(zhuǎn)化事件“雙抗12-1”、“雙抗12-3”、“雙抗12-4”、“雙抗12-5”、“雙抗12-7”、“雙抗12-9”、“雙抗12-10”、“雙抗12-12”、“雙抗12-13”、“雙抗12-14”和“雙抗12-15”的草甘膦抗性水平比較高。

表2.雙抗玉米草甘膦抗性試驗(yàn)

(2)抗蟲(chóng)能力測(cè)試

1)田間抗蟲(chóng)能力測(cè)試

分別選擇15個(gè)含轉(zhuǎn)化事件“雙抗12-1”～“雙抗12-15”的轉(zhuǎn)化體的T3和T5代轉(zhuǎn)基因玉米進(jìn)行抗蟲(chóng)性能分析。轉(zhuǎn)基因玉米和親本非轉(zhuǎn)基因?qū)φ諟厥抑邪l(fā)芽后20天噴灑終濃度為0.4wt％的草甘膦確定是轉(zhuǎn)基因后，各取10株，每株接1齡亞洲玉米螟10個(gè)，亞洲玉米螟來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所玉米害蟲(chóng)組。將卵塊至于28±1℃，RH 70±5％，16h:8h(L:D)條件下孵化，選取孵化12小時(shí)內(nèi)的幼蟲(chóng)供生測(cè)實(shí)驗(yàn)用。接蟲(chóng)6天后調(diào)查玉米螟為害情況，進(jìn)行抗蟲(chóng)分級(jí)。抗蟲(chóng)分級(jí)采用9級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(Marcon et al.,1999)：1～3級(jí)：蟲(chóng)孔針刺狀(1級(jí)：稀少、分散；2級(jí)：中等數(shù)量；3級(jí)：大量)。4～6級(jí)：蟲(chóng)孔火柴頭大小(4級(jí)：稀少、分散；5級(jí)：中等數(shù)量；6級(jí)：大量)。7～9級(jí)：蟲(chóng)孔大于火柴頭(7級(jí)：稀少分散；8級(jí)：中等數(shù)量；9級(jí)：大量)?？剐约?jí)別分類(lèi)：1～2級(jí)(高抗)，3～4級(jí)(抗蟲(chóng))，5～6級(jí)(感蟲(chóng))，7～9級(jí)(高感)。結(jié)果如表3所示，“雙抗12-1”、“雙抗12-5”、“雙抗12-9”、“雙抗12-10”、“雙抗12-11”、“雙抗12-13”、“雙抗12-14”和“雙抗12-15”具有高抗蟲(chóng)性能。

表3：不同轉(zhuǎn)化事件對(duì)玉米螟的抗性等級(jí)鑒定

2)實(shí)驗(yàn)室抗蟲(chóng)性能測(cè)試

分別選擇15個(gè)含轉(zhuǎn)化事件“雙抗12-1”～“雙抗12-15”的轉(zhuǎn)化體的T3和T5代轉(zhuǎn)基因玉米，在轉(zhuǎn)基因玉米和對(duì)照玉米心葉中期(6-8葉完全展開(kāi))選擇未完全展開(kāi)的心葉葉片在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行玉米螟抗性測(cè)定。接玉米螟2天后調(diào)查取食面積和玉米螟死亡情況。結(jié)果見(jiàn)表4所示，結(jié)果顯示大部分轉(zhuǎn)基因玉米抗性良好。它們的葉片被取食非常少，特別是雙抗12-5、雙抗12-9、雙抗12-11、雙抗12-14和雙抗12-15接蟲(chóng)2天后玉米螟取食面積不到10mm²。接蟲(chóng)2天以后玉米螟死亡率在80％以上，4天以后大部分轉(zhuǎn)基因玉米螟死亡率到達(dá)100％。

表4：轉(zhuǎn)基因玉米心葉期對(duì)亞洲玉米螟的抗蟲(chóng)性

注：表4中a、b表示差異顯著

(3)外源基因插入拷貝數(shù)鑒定

綜合抗蟲(chóng)和抗草甘膦測(cè)定結(jié)果，選擇抗蟲(chóng)和耐草甘膦能力都比較強(qiáng)的雙抗12-1、雙抗12-5、雙抗12-9、雙抗12-10、雙抗12-14和雙抗12-15進(jìn)行外源基因插入拷貝數(shù)鑒定。使用羅氏公司(DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II，Roche)進(jìn)行Southern分析，遵照試劑盒提供的操作步驟進(jìn)行雜交探針制作和DNA雜交檢測(cè)。即提取玉米基因組DNA，分別經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶BamHI和XbaI酶切(這些限制性內(nèi)切酶在外源基因中具有單個(gè)的識(shí)別位點(diǎn))，在瓊脂糖膠上電泳分離酶切片段，然后將DNA轉(zhuǎn)移到尼龍基質(zhì)膜上，利用地高辛標(biāo)記的G10eve(核苷酸序列SEQ ID NO.5)全長(zhǎng)DNA作為探針雜交到尼龍基質(zhì)膜上以后熒光顯影。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化事件“雙抗12-5”在BamHI酶切時(shí)獲得一條大約14kb的信號(hào)帶，利用XbaI酶切時(shí)獲得大約5.0kb的信號(hào)帶(圖2)，證明“雙抗12-5”中抗草甘膦基因是單拷貝插入。轉(zhuǎn)化事件“雙抗12-15”在BamHI酶切時(shí)獲得一條大約2.5kb的信號(hào)帶，而在XbaI酶切時(shí)獲得大約8.7kb的信號(hào)帶(圖5)，證明“雙抗12-15”中抗草甘膦基因是單拷貝插入。

利用T-DNA中右邊的抗蟲(chóng)融合基因的Cry1Ab作為探針對(duì)“雙抗12-5”抗蟲(chóng)基因拷貝數(shù)進(jìn)行Southern雜交分析，分別用限制性內(nèi)切酶KpnI和SmaI對(duì)“雙抗12-5”的基因組DNA進(jìn)行單酶切，在瓊脂糖膠上分離以后，轉(zhuǎn)移到尼龍基質(zhì)膜上，然后利用地高辛標(biāo)記的Cry1Ab(核苷酸序列SEQ ID NO.4中1-1947bp)作為探針雜交到尼龍基質(zhì)膜上以后熒光顯影。結(jié)果顯示，用KpnI酶切時(shí)獲得一條大約7kb的信號(hào)帶，而在SmaI酶切時(shí)獲得大約6.5kb的信號(hào)帶(圖3)。

分別用限制性內(nèi)切酶SacI和AclI對(duì)轉(zhuǎn)化事件“雙抗12-15”的基因組DNA進(jìn)行單酶切，在瓊脂糖膠上分離以后，轉(zhuǎn)移到尼龍基質(zhì)膜上，然后利用地高辛標(biāo)記的Cry1Ab(核苷酸序列SEQ ID NO.4中1-1947bp)作為探針雜交到尼龍基質(zhì)膜上以后熒光顯影。結(jié)果顯示，SacI酶切時(shí)獲得一條大約7.8kb的信號(hào)帶，而用AclI酶切時(shí)獲得大約5.0kb的信號(hào)帶(圖4)。

因此上述實(shí)驗(yàn)證明轉(zhuǎn)化事件“雙抗12-5”和“雙抗12-15”是一個(gè)抗蟲(chóng)基因和抗草甘膦基因都是單拷貝插入的轉(zhuǎn)化事件。

(4)轉(zhuǎn)基因玉米的農(nóng)藝性狀

根據(jù)抗蟲(chóng)性能、抗草甘膦能力和外源基因插入拷貝數(shù)，篩選獲得具有高抗蟲(chóng)抗草甘膦能力，外源基因單拷貝插入的“雙抗12-5”和“雙抗12-15”進(jìn)行農(nóng)藝性狀分析。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化事件“雙抗12-5”和“雙抗12-15”生長(zhǎng)期、花期與非轉(zhuǎn)基因親本沒(méi)有差異，在轉(zhuǎn)基因玉米上使用草甘膦除草對(duì)“雙抗12-5”和“雙抗12-15”的產(chǎn)量沒(méi)有影響(表5)。

表5：轉(zhuǎn)基因玉米的每穗粒數(shù)、100粒重量和生育期

注：*表示由于嚴(yán)重的蟲(chóng)害造成粒重和粒數(shù)降低。

實(shí)施例3：外源基因插入位點(diǎn)側(cè)翼序列的鑒定

使用Liu等報(bào)道的TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR)方法(Liu，Plant Journal1995，8(3):457-463)對(duì)優(yōu)良轉(zhuǎn)化事件“雙抗12-5”和“雙抗12-15”外源轉(zhuǎn)基因DNA插入點(diǎn)兩側(cè)的區(qū)域序列進(jìn)行測(cè)定。該方法通過(guò)3個(gè)嵌套的特異性引物分別和簡(jiǎn)并引物組合進(jìn)行連續(xù)的PCR擴(kuò)增，利用不同退火溫度選擇性地?cái)U(kuò)增目標(biāo)片段。對(duì)擴(kuò)增獲得的DNA片段進(jìn)行克隆、測(cè)序并與網(wǎng)上玉米基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.maizegdb.org)進(jìn)行比對(duì)分析。

對(duì)轉(zhuǎn)化事件“雙抗12-5”T-DNA左側(cè)翼區(qū)的DNA片段進(jìn)行測(cè)序和比對(duì)，獲得的序列為SEQ ID NO.1，其中核苷酸1-576bp之間的序列對(duì)應(yīng)于玉米基因組DNA，核苷酸577-826bp之間的序列對(duì)應(yīng)于外源DNA。對(duì)T-DNA右側(cè)翼區(qū)的DNA片段進(jìn)行測(cè)序和比對(duì)，獲得的序列為SEQ ID NO.3，其中，核苷酸1-210bp的序列對(duì)應(yīng)于外源DNA，核苷酸211-1007bp的序列對(duì)應(yīng)于玉米基因組DNA。將上述經(jīng)測(cè)序比對(duì)和驗(yàn)證過(guò)的插入位點(diǎn)上下游旁側(cè)序列和外源T-DNA序列整合形成本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)化事件“雙抗12-5”的特異性核苷酸序列，序列編號(hào)為SEQ ID NO.12(即SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的拼接而成)。

對(duì)轉(zhuǎn)化事件“雙抗12-15”T-DNA左側(cè)翼區(qū)的DNA片段進(jìn)行測(cè)序和比對(duì)，獲得的序列為SEQID NO.14，其中核苷酸1-1064bp之間的序列對(duì)應(yīng)于玉米基因組DNA，核苷酸1065-1172bp之間的序列對(duì)應(yīng)于外源DNA。對(duì)T-DNA右側(cè)翼區(qū)的DNA片段進(jìn)行測(cè)序和比對(duì)，獲得的序列為SEQ ID NO.15，其中，核苷酸1-54bp的序列對(duì)應(yīng)于外源DNA，核苷酸55-604bp的序列對(duì)應(yīng)于玉米基因組DNA。將上述經(jīng)測(cè)序比對(duì)和驗(yàn)證過(guò)的插入位點(diǎn)上下游旁側(cè)序列外源T-DNA序列整合形成本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)化事件“雙抗12-15”的特異性核苷酸序列，序列編號(hào)為SEQ ID NO.16(即SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.15的拼接而成)。

(2)外源基因特異性檢測(cè)

根據(jù)轉(zhuǎn)化事件的核苷酸序列(SEQ ID NO.12)設(shè)計(jì)可以用于特異性檢測(cè)“雙抗12-5”的PCR引物(如表6所示)。

表6.“雙抗12-5”特異性檢測(cè)引物

所述PCR反應(yīng)體系為：10×擴(kuò)增緩沖液5μL，dNTP混合物200μmol/L，正向引物10pmol，反向引物10pmol，基因組DNA0.1～2μg，Taq DNA聚合酶2.5μL，MgCl₂1.5mmol/L，加雙蒸水至50μL。

PCR條件是：32個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)是95℃，45秒；65℃，50秒；72℃，30秒。PCR的條件可以根據(jù)使用的酶和反應(yīng)體系進(jìn)行調(diào)整。對(duì)獲得PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳分析。左右邊界的特異PCR產(chǎn)物分別是304bp和350bp(圖6)。必要的時(shí)候也可以對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定進(jìn)一步驗(yàn)證。

根據(jù)轉(zhuǎn)化事件的核苷酸序列(SEQ ID NO.16)設(shè)計(jì)可以用于特異性檢測(cè)雙抗12-15的PCR引物(如表7所示)。

表7.雙抗12-15特異性檢測(cè)引物

所述PCR反應(yīng)體系為：10×擴(kuò)增緩沖液5μL，dNTP混合物200μmol/L，正向引物10pmol，反向引物10pmol，基因組DNA0.1～2μg，Taq DNA聚合酶2.5μL，MgCl₂1.5mmol/L，加雙蒸水至50μL。

PCR條件是：32個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)是95℃，45秒；65℃，50秒；72℃，30秒。PCR的條件可以根據(jù)使用的酶和反應(yīng)體系進(jìn)行調(diào)整。對(duì)獲得PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳分析。左右邊界的特異PCR產(chǎn)物分別是1171bp(圖7)和604bp(圖8)。必要的時(shí)候也可以將PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定進(jìn)一步驗(yàn)證。

實(shí)施例4：遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)

1)轉(zhuǎn)化事件“雙抗12-5”在受體玉米中的遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)

根據(jù)轉(zhuǎn)化事件“雙抗12-5”的重組DNA分子(SEQ ID NO.12)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行插入位點(diǎn)特異性的PCR檢測(cè)，分別取1-7代次的受體玉米提取基因組，利用PCR鑒定T-DNA整合情況。引物為：BR-1(5’GGCGAATGCTAGAGCAGCTTGAGCT-3’)(SEQ ID NO.25)和GN-1(5’CCTACTGCGATGACGTTCGGTGCC-3’)(SEQ ID NO.26)，

反應(yīng)體系：10×擴(kuò)增緩沖液5μL，dNTP混合物200μmol/L，BR-110pmol，10pmolGN-1，基因組DNA0.1～2μg，Taq DNA聚合酶2.5μL，MgCl₂1.5mmol/L，加雙蒸水至50μL。

反應(yīng)條件：95℃1分鐘，60℃40秒，72℃30秒，30個(gè)循環(huán)。TAQ酶從上海生工獲得。結(jié)果顯示，所有代次的轉(zhuǎn)基因玉米PCR結(jié)果都為陽(yáng)性。瓊脂糖電泳分析顯示，PCR產(chǎn)物大小與預(yù)期大小一致是145bp(圖9)。

“雙抗12-5”抗蟲(chóng)抗草甘膦生物測(cè)定

玉米螟生物測(cè)定(Marcon et al.,1999)表明第1,2,3,4,5,6,7代的轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)一齡玉米螟的殺蟲(chóng)效果都是100％，抗蟲(chóng)能力穩(wěn)定遺傳。噴施草甘膦試驗(yàn)表明，第1,2,3,4,5,6,7代的轉(zhuǎn)基因玉米都能抗每畝100克活性草甘膦含量的草甘膦農(nóng)藥?？共莞熟⒛芰Ψ€(wěn)定遺傳。結(jié)果證明抗蟲(chóng)和抗草甘膦能力穩(wěn)定遺傳。

2)轉(zhuǎn)化事件“雙抗12-15”在受體玉米中的遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)

根據(jù)轉(zhuǎn)化事件“雙抗12-15”的重組DNA分子(SEQ ID NO.16)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行插入位點(diǎn)特異性的PCR檢測(cè)，分別取1-7代次的受體玉米提取基因組，利用PCR鑒定T-DNA整合情況。引物為：LB-SP4：5’CTAAAACCAAAATCCAGTACTAAAATCC(SEQ ID NO.27)和LB-M:CTGTTCTGATGGTGGCAGGCAGG(SEQ ID NO.28)，

反應(yīng)體系：10×擴(kuò)增緩沖液5μL，dNTP混合物200μmol/L，BR-110pmol，10pmolGN-1，基因組DNA0.1～2μg，Taq DNA聚合酶2.5μL，MgCl₂1.5mmol/L，加雙蒸水至50μL。

反應(yīng)條件：95℃1分鐘，60℃40秒，72℃30秒，30個(gè)循環(huán)。TAQ酶從上海生工獲得。結(jié)果顯示，所有代次的轉(zhuǎn)基因玉米PCR結(jié)果都為陽(yáng)性。瓊脂糖電泳分析顯示，PCR產(chǎn)物大小與預(yù)期大小一致是1000bp(圖10)。

“雙抗12-15”抗蟲(chóng)抗草甘膦生物測(cè)定

玉米螟生物測(cè)定表明第1,2,3,4,5代的轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)一齡玉米螟的殺蟲(chóng)效果都是100％，抗蟲(chóng)性能穩(wěn)定遺傳。噴施草甘膦試驗(yàn)表明，第1,2,3,4,5代的轉(zhuǎn)基因玉米都能抗每畝100克活性草甘膦含量的草甘膦農(nóng)藥。抗草甘膦性能穩(wěn)定遺傳。結(jié)果證明抗蟲(chóng)和抗草甘膦能力穩(wěn)定遺傳。

實(shí)施例5：抗蟲(chóng)抗草甘膦玉米品種培育

1)“雙抗12-5”雜交轉(zhuǎn)育

以含有“雙抗12-5”轉(zhuǎn)化事件的玉米為供體親本，以玉米自交系B73為受體親本進(jìn)行一次雜交，4次回交和3次自交。在回交過(guò)程中使用草甘膦來(lái)清除不含“雙抗12-5”轉(zhuǎn)基因復(fù)合結(jié)構(gòu)的分離株系。于BC4F3代(回交4代后自交3代)獲得了含有本發(fā)明所述的復(fù)合轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定自交系B735。從該株系葉片組織中提取DNA，擴(kuò)增出外源插入基因及其側(cè)翼的DNA片斷，經(jīng)測(cè)序分析證實(shí)，來(lái)自與供體親本的復(fù)合轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)序列一致，說(shuō)明“雙抗12-5”轉(zhuǎn)化事件穩(wěn)定轉(zhuǎn)育到新的受體材料中。以B735為母本，Mo17為父本組配獲得雜交種B7M，對(duì)B7M進(jìn)行外源插入基因及其側(cè)翼DNA的PCR分析和測(cè)序，結(jié)果顯示B7M含有轉(zhuǎn)化事件“雙抗12-5”。田間抗性試驗(yàn)顯示，B7M具有良好的抗草甘膦能力和抗蟲(chóng)性能。

1)“雙抗12-15”有性雜交轉(zhuǎn)育

以含有“雙抗12-15”轉(zhuǎn)化事件的玉米為供體親本，以玉米自交系MR-1為受體親本進(jìn)行一次雜交，4次回交和3次自交。在回交過(guò)程中使用草甘膦來(lái)清除不含“雙抗12-15”轉(zhuǎn)基因復(fù)合結(jié)構(gòu)的分離株系。于BC4F3代(回交4代后自交3代)獲得了含有本發(fā)明所述的復(fù)合轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定自交系M45。從該株系葉片組織中提取DNA，擴(kuò)增出外源插入基因及其側(cè)翼的DNA片斷，經(jīng)測(cè)序分析證實(shí)，來(lái)自與供體親本的復(fù)合轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)序列一致，說(shuō)明“雙抗12-15”轉(zhuǎn)化事件穩(wěn)定轉(zhuǎn)育到新的受體材料中。以M45為母本，RF1為父本組配獲得雜交種M7R，對(duì)M7R進(jìn)行外源插入基因及其側(cè)翼DNA的PCR分析和測(cè)序，結(jié)果顯示M7R含有轉(zhuǎn)化事件“雙抗12-15”。田間抗性試驗(yàn)顯示，M7R具有良好的抗草甘膦能力和抗蟲(chóng)性能。