本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及具有抑菌活性的綿馬次酸類化合物Rxj-33(1)、Rxj-43(2)、Rxj-18(3)、Rxj-19(4)及其制備方法，以該化合物為活性成分的食品、化妝品、藥物組合物，以及其在制備預(yù)防和治療細(xì)菌感染導(dǎo)致的皮膚問題的化妝品和藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
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金絲桃屬(Hypericum)是藤黃科(Guttiferae)的一個大屬，全世界約400種，除南北兩極地或荒漠地及大部分熱帶低地外世界廣布。我國約有55種8亞種，幾產(chǎn)于全國各地，但主要集中在西南地區(qū)。除了用于觀賞，金絲桃屬植物具有抗抑郁、抗病毒、抗菌和抗腫瘤等多種藥理活性。

地耳草(Hypericum japonicum Thunb.)：《中藥大辭典》記載品種，別名田基黃、雀舌草。一年生草本，產(chǎn)于江蘇、浙江、四川、云南等地。具有清熱利濕，消腫解毒等功效，用于黃疸熱淋，腫毒，毒蛇咬傷。文獻(xiàn)報道該植物的化學(xué)成分有黃酮、xanthone等?，F(xiàn)有技術(shù)中未見有本發(fā)明所涉及的從地耳草中分離所得的綿馬次酸類化合物，以及它們的藥物活性功能的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明目的在于提供從地耳草(H.japonicum)中分離得到的綿馬次酸類化合物，以其為活性成分的食品、化妝品或藥物組合物，其制備方法，及其在制備預(yù)防和治療細(xì)菌感染疾病的藥物中的應(yīng)用，以及在制備預(yù)防細(xì)菌感染導(dǎo)致的皮膚問題的化妝品中的應(yīng)用，能用于預(yù)防細(xì)紋和/皺紋，皮膚紅疹，干性、敏感肌膚，皮膚瘙癢，膚色不均或皮膚黑斑，皮膚發(fā)炎和其它與此相關(guān)的皮膚不適癥。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：

下述結(jié)構(gòu)式所示的綿馬次酸類化合物Rxj-33(1)、Rxj-43(2)、Rxj-18(3)、Rxj-19(4)或其藥用鹽，

如所述的綿馬次酸類化合物Rxj-33(1)、Rxj-43(2)、Rxj-18(3)、Rxj-19(4)或其藥用鹽，所述的藥用鹽為是指藥學(xué)上可接受的鹽，是與有機(jī)酸形成的鹽，所述的有機(jī)酸為酒石酸、甲酸、乙酸、乙二酸、丁酸、馬來酸、琥珀酸、己二酸、藻酸、檸檬酸、天冬氨酸、苯磺酸、樟腦酸、樟腦磺酸、二葡糖酸、環(huán)戊烷丙酸、十二烷基硫酸、乙磺酸、葡庚糖酸、甘油磷酸、庚酸、己酸、延胡索酸、2‐羥基乙磺酸、乳酸、甲磺酸、煙酸、2‐萘磺酸、撲酸、果膠酯酸、3‐苯基丙酸、新戊酸、丙酸、對‐甲苯磺酸和十一烷酸。

化妝品，由所述的綿馬次酸類化合物1-4任一種或任幾種的混合物和化妝品常用載體組成。

含有治療有效量的綿馬次酸類化合物1-4任一種或任幾種的混合物或其藥用鹽和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。

所述的綿馬次酸類化合物1-4任一種或任幾種的混合物在制備化妝品或食品中的應(yīng)用。

所述的綿馬次酸類化合物1-4任一種或任幾種的混合物在制備預(yù)防細(xì)菌大腸桿菌、傷寒桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸桿菌感染導(dǎo)致的皮膚不適癥的化妝品中的應(yīng)用。

所述的綿馬次酸類化合物1-4任一種或任幾種的混合物在制備預(yù)防皮膚不適癥的化妝品中的應(yīng)用，所述的皮膚不適癥為細(xì)紋和/皺紋，皮膚紅疹，干性、敏感肌膚，皮膚瘙癢，膚色不均或皮膚黑斑，皮膚發(fā)炎。

所述的綿馬次酸類化合物1-4任一種或任幾種的混合物或其藥用鹽在制備預(yù)防或治療由細(xì)菌感染導(dǎo)致的疾病的藥物中的應(yīng)用，所述的疾病是由大腸桿菌、傷寒桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸桿菌感染所導(dǎo)致的疾病。

制備權(quán)利要求1所述的綿馬次酸類化合物1-4的方法，取地耳草干燥全草，粉碎，用甲醇室溫下冷浸2次，每次24小時，合并提取液，減壓蒸餾濃縮，得浸膏，浸膏用100-200目硅膠拌樣，硅膠柱層析，用氯仿洗脫得到氯仿段，氯仿段用1.5倍量的聚酰胺拌樣，過MCI柱，以7:3-10:0的MeOH-H₂O進(jìn)行梯度洗脫，得到5個大段A-E，B段經(jīng)硅膠柱層析，以1:0-0:1的石油醚-丙酮進(jìn)行梯度洗脫，得到4個小段B1-B4，其中B3段經(jīng)制備HPLC，甲醇-水，95:5分離純化后得到Rxj-33；同樣，B4部分經(jīng)制備HPLC，甲醇-水，95:5分離純化后得到Rxj-18和Rxj-19；C段用100-200目硅膠拌樣，硅膠柱層析，以1:0-0:1的石油醚-丙酮進(jìn)行梯度洗脫，得到5個部分C1-C5，其中C2部分經(jīng)制備HPLC，甲醇-水，95:5分離純化后得到Rxj-43。

本發(fā)明的化合物1-4為新的綿馬次酸類(二聚間苯三酚類衍生物)化合物，化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎，作為抗菌藥物有較多優(yōu)勢?；衔?-4具有顯著的體外抑制細(xì)菌生長的活性，對大腸桿菌、傷寒桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸桿菌都有顯著的抑制作用。尤其是化合物1-4對傷寒桿菌抑制濃度低于陽性對照頭孢噻肟(cefotaxime)，以及化合物1和3對金黃色葡萄球菌的抑制濃度也低于陽性對照。這些化合物可作為活性成分用于制備預(yù)防皮膚病的化妝品，或作為抗菌藥物制劑，具有較好的藥用價值。

本發(fā)明中含有化合物以及化妝品常用載體的組合物可用于局部皮膚護(hù)理或護(hù)發(fā)產(chǎn)品。這些組合物可以做成乳化劑(例如水包油、油包水、硅油包水，水包硅油，水包油包水，油包水包油，油包水包硅油等)，霜劑，護(hù)膚液，液體(例如水劑或水-醇溶液)，無水基質(zhì)(例如唇膏或粉劑等)，啫喱，油膏，奶液，軟膏，噴霧劑，固體劑，眼霜等。局部施用這些組合物可治療干性皮膚、敏感皮膚或皮膚搔癢或減小膚色不均的外觀。皮膚病包括干性皮膚、皮膚搔癢、皮膚發(fā)炎、紅斑、皮膚過敏、瘙癢癥、蜘蛛血管、雀斑、老年斑、老年性紫癜、角化癥、黑斑病、疙瘩、細(xì)紋或皺紋、結(jié)節(jié)、皮膚太陽損傷、皮炎(脂溢性皮炎、錢幣狀皮炎、接觸性皮炎、異位性皮炎、剝脫性皮炎、口周皮炎和淤滯性皮炎等)、牛皮癬、毛囊炎、紅斑痤瘡、痤瘡、膿胞病、丹毒、紅癬、濕疹、日光灼傷、皮膚燒傷、開放性傷口、感染性皮膚病等。皮膚病還可由暴露在紫外光下、年齡、輻射、長期暴露在太陽下、環(huán)境污染、空氣污染、風(fēng)、冷、熱、化學(xué)品、病理、吸煙或缺乏營養(yǎng)等引起。

附圖說明：

圖1為本發(fā)明化合物Rxj-33(1)、Rxj-43(2)、Rxj-18(3)、Rxj-19(4)的結(jié)構(gòu)示圖。

具體實施方式：

下面結(jié)合附圖，用本發(fā)明的實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此來限定本發(fā)明。

實施例1：

化合物Rxj-33(1)、Rxj-43(2)、Rxj-18(3)、Rxj-19(4)的制備：

取地耳草干燥全草(14kg)，粉碎，用甲醇室溫下冷浸2次，每次24小時，合并提取液，減壓蒸餾濃縮，得浸膏2.5kg。粗提物用100-200目硅膠拌樣，硅膠柱層析，用氯仿洗脫得到氯仿段(164.2g)。氯仿段用1.5倍量的聚酰胺拌樣，過MCI柱，以MeOH-H₂O(7:3-10:0)進(jìn)行梯度洗脫，得到5個大段(A-E)。B段(25.5g)經(jīng)硅膠柱層析，以石油醚-丙酮(1:0-0:1)進(jìn)行梯度洗脫，得到4個小段(B1-B4)。其中B3段(3.0g)經(jīng)制備HPLC(甲醇-水，95:5)分離純化后得到Rxj-33(180mg)；同樣，B4部分(6.4g)經(jīng)制備HPLC(甲醇-水，95:5)分離純化后得到Rxj-18(310mg)和Rxj-19(230mg)。C段(25.5g)用100-200目硅膠拌樣，硅膠柱層析，以石油醚-丙酮(1:0-0:1)進(jìn)行梯度洗脫，得到5個部分(C1-C5)，其中C2部分(3.2g)最終經(jīng)制備HPLC(甲醇-水，95:5)分離純化后得到Rxj-43(850mg)。

化合物1-4的結(jié)構(gòu)解析：

化合物1(Rxj-33)，無色膠狀物。ESI-MS譜給出準(zhǔn)分子離子峰為m/z 547[M-H]^-，結(jié)合高分辨負(fù)離子HRESI-MS(m/z[M-H]^-547.2337,calcd for 547.2332)及¹³C和DEPT NMR譜圖提供的信息，確定其分子式為C₃₂H₃₆O₈，計算不飽和度為15。UV光譜在206(4.39),241(4.11),331(3.89)nm處有吸收，說明分子中存在較長的共軛系統(tǒng)。分析¹H和¹³C NMR譜，再結(jié)合HSQC譜表明化合物1中含有32個碳信號，包括6個甲基，3個亞甲基，8個次甲基(包括7個烯碳)，15個季碳(其中1個飽和季碳)。仔細(xì)分析這些數(shù)據(jù)表明1為綿馬次酸類化合物，且與已知化合物sarothralin很相似。最后通詳細(xì)地分析HMBC和¹H-¹H COSY譜，確定了化合物sarothralin中的異丙基被1中的仲丁基所取代。至此，化合物1的結(jié)構(gòu)被確定。

同樣地，化合物2被確定為sarothralen A的衍生物，sarothralen A中C-7位異丙基被2中的仲丁基取代?；衔?為化合物2的15'氧化產(chǎn)物，并伴隨著16',17'雙鍵的形成。化合物4與3的不同之處為，C-7位羰基上攜帶的是一個仲丁基?；衔?-4的¹H和¹³C NMR譜數(shù)據(jù)如表1和2所示。

表1.化合物1-4的NMR ¹³C譜數(shù)據(jù)(acetone)

表2.化合物1-4的NMR ¹H譜數(shù)據(jù)(acetone)

化合物1-4的結(jié)構(gòu)式如下所示：

實施例2

采用定量稀釋法測定化合物1-4的抑菌活性：

1培養(yǎng)基配置：將肉湯蛋白粉配置成濃度為20g/L的肉湯培養(yǎng)液和肉湯固體培養(yǎng)基，經(jīng)滅菌處理后，待用。

2菌種活化：將大腸桿菌、傷寒桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸桿菌依次用肉湯固體培養(yǎng)接種，37℃培養(yǎng)24h。將活化的細(xì)菌用無菌環(huán)接種于肉湯固體培養(yǎng)基，置于搖床上，以220r/min，37℃培養(yǎng)18h，離心除去培養(yǎng)液后再用0.9％鹽水離心處理3次，以便于準(zhǔn)確測定細(xì)菌懸浮液的吸光度。調(diào)節(jié)懸浮液的吸光度在0.10-600nm的范圍內(nèi)，與此相關(guān)的懸浮液細(xì)菌濃度為10⁸CFU/mL(吸光度為0.1時)；使用前用肉湯培養(yǎng)液稀釋細(xì)菌懸浮液濃度100倍至10⁶CFU/mL，待用。

3待測樣品配置：將待測的單體化合物溶解于DMSO溶液中，濃度配置為4μg/mL；陽性對照：以頭孢噻肟(cefotaxime)為陽性對照品，用肉湯液體培養(yǎng)基依照成倍稀釋的方法將待測化合物樣品濃度調(diào)整到1.56μg/mL、0.78μg/mL、0.39μg/mL、0.19μg/mL；空白對照：含DMSO 5％體積比的肉湯液體培養(yǎng)基溶液。

4抗菌活性測試：用移液槍吸取待測樣品(4μg/mL)100μL轉(zhuǎn)至96孔板中，其中DMSO的含量需低于5％體積比；繼續(xù)加入100μL的細(xì)菌培養(yǎng)液至每一個小孔，采用成倍稀釋的方法將待測化合物樣品濃度調(diào)整到2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL、0.06μg/mL、0.03μg/mL、0.015μg/mL八個濃度梯度。每孔再加入需測試的濃度為10⁶CFU/mL的細(xì)菌懸浮液，置恒溫箱(37℃)中培養(yǎng)24h后，用酶標(biāo)儀進(jìn)行測定。每個單體化合物均采用上述方法對每個菌種進(jìn)行最小抑菌濃度(MIC值)的測定，檢測結(jié)果如表3所示。

表3.化合物1-4對4種細(xì)菌的最小抑菌濃度(MIC值)

由表3可見：化合物1-4對大腸桿菌、傷寒桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸桿菌都有顯著的抑制作用。尤其是化合物1-4對傷寒桿菌抑制濃度低于陽性對照頭孢噻肟(cefotaxime)，以及化合物1和3對金黃色葡萄球菌的抑制濃度也低于陽性對照。這些化合物可作為活性成分用于制備抗菌藥物制劑，具有較好的藥用價值。

實施例3

化合物1-4體外抗氧化活性實驗：

將待測藥物與DPPH(終濃度為100μM)混合反應(yīng)，設(shè)定3個重復(fù)孔，同時設(shè)置不含藥物的空白對照和Trolox陽性對照，30℃，1h，酶標(biāo)儀測定OD值，檢測波長為515nm。計算得到抗氧化率。

表4樣品體外抗氧化活性結(jié)果

實施例4

酪氨酸酶抑制活性實驗：

將待測藥物與L-Dopa(終濃度1.25mM)混合，加入酪氨酸酶(終濃度25U/mL)開始反應(yīng)，設(shè)定3個重復(fù)孔，同時設(shè)置不含藥物的空白對照和KojicAcid陽性對照，室溫，5min，酶標(biāo)儀測定OD值，檢測波長為490nm。計算得到酪氨酸酶活性抑制率。

表5樣品對酪氨酸酶的抑制作用活性

實施例5

B16細(xì)胞黑色素生成抑制活性實驗：

96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，將B16細(xì)胞與不同濃度的待測藥物溶液混合，設(shè)定8個重復(fù)孔，同時設(shè)置不含藥物的空白照和KojicAcid陽性對照。37℃，5％CO₂培養(yǎng)5天，酶標(biāo)儀測定OD值，檢測波長為405nm，加入MTS，采用MTS比色法檢測490nm的OD值。計算得到B16細(xì)胞黑色素生成抑制率。

表6樣品對B16細(xì)胞黑色素生成的抑制作用結(jié)果

實施例6

促膠原蛋白分泌活性實驗：

12孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，將HDFa細(xì)胞與不同濃度的待測藥物溶液混合，設(shè)置不含藥物的空白照和TGF-β陽性對照。37℃，5％CO₂培養(yǎng)3天，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，存于-80℃；加入MTS，采用MTS比色法檢測490nm的OD值；按膠原蛋白ELISA試劑盒中提供的方法檢測膠原蛋白的分泌，酶標(biāo)儀測定OD值，檢測波長為450nm。計算得到膠原蛋白分泌增加率。

表7樣品對HDFa細(xì)胞膠原蛋白分泌的促進(jìn)作用結(jié)果

實施例7

TNF-α分泌抑制活性實驗：

12孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，向HEKa細(xì)胞培養(yǎng)液中加入PMA(終濃度為0.01μg/mL)，然后將不同濃度的待測藥物溶液與上述細(xì)胞溶液混合，同時設(shè)置不含藥物的空白照和PMA對照。37℃，5％CO₂培養(yǎng)4-6h，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，存于-80℃；加入MTS，采用MTS比色法檢測490nm的OD值；按TNF-αELISA試劑盒中提供的方法檢測TNF-α的分泌，酶標(biāo)儀測定OD值，檢測波長為450nm，校正波長為540nm。計算得到TNF-α分泌抑制率。

表8樣品對HEKa細(xì)胞TNF-α分泌的抑制作用結(jié)果

實施例8：

含有化合物1-4任一或組合的美白霜配方(W％)：

按常規(guī)制作化妝品的方法制得本發(fā)明上述配方的化妝品。

實施例9：

含有化合物1-4任一或組合的乳劑配方(W％)：

按常規(guī)制作化妝品的方法制得本發(fā)明上述配方的化妝品。

實施例10：

按實施例1制得化合物1-4，按化合物1-4任一種或任幾種混合與賦形劑重量比1:1或1:2的比例加入賦形劑，制粒壓片。

實施例11：

按實施例1制得化合物1-4，按常規(guī)膠囊制劑方法制成膠囊。

實施例12：

先按實施例1制得化合物1-4，再按下述方法制成片劑

制備方法：將化合物1-4任一種或任幾種混合與助劑混合，過篩，在合適的容器中均勻混合，把得到的混合物制粒壓片。

實施例13：

膠囊劑：化合物1-4任一種或任幾種混合 100mg

淀粉 適量

硬脂酸鎂 適量

制備方法：將化合物1-4任一種或任幾種混合與助劑混合，過篩，在合適的容器中均勻混合，把得到的混合物裝入硬明膠膠囊。

實施例14：

片劑：實施例1所得化合物1-4任一種或任幾種混合10mg，乳糖180mg，淀粉55mg，硬脂酸鎂5mg；

制備方法：將化合物1-4任一種或任幾種混合、乳糖和淀粉混合，用水均勻濕潤，把濕潤后的混合物過篩并干燥，再過篩，加入硬脂酸鎂，然后將混合物壓片，每片重250mg，化合物含量為10mg。

實施例15：

安瓿劑：實施例1所得化合物1-4任一種或任幾種混合2mg，氯化鈉10mg；

制備方法：將化合物1-4任一種或任幾種混合和氯化鈉溶解于適量的注射用水中，過濾所得溶液，在無菌條件下裝入安瓿瓶中。

實施例16：

膠囊劑：實施例1所得化合物1-4任一種或任幾種混合10mg，乳糖187mg，硬脂酸鎂3mg；

制備方法：將化合物1-4任一種或任幾種混合與助劑混合，過篩，均勻混合，把得到的混合物裝入硬明膠膠囊，每個膠囊重200mg，活性成分含量為10mg。