本發(fā)明涉及一種海洋生物活性寡肽，具體涉及一種青蛤酶解寡肽的用途。
背景技術(shù)：
：前列腺癌的發(fā)病率在男性惡性腫瘤中位居首位，好發(fā)于老年男性。在我國(guó)，前列腺癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，居泌尿系統(tǒng)腫瘤的首位，嚴(yán)重威脅老年男性的健康。傳統(tǒng)治療方法如手術(shù)、放療和冷凍治療等效果并不理想，且復(fù)發(fā)率比較高，并且當(dāng)復(fù)發(fā)的前列腺癌轉(zhuǎn)化為非雄激素依賴性時(shí)，治療將更困難；而化療藥物產(chǎn)生耐藥性后，療效更差并毒副作用明顯。因此，尋找抗前列腺癌藥物成為學(xué)者們研究的熱點(diǎn)。海洋是發(fā)現(xiàn)新型抗癌藥物的一個(gè)豐富的資源寶庫(kù)，多種海洋寡肽、糖胺聚糖等都具有抗腫瘤、抗病毒、抗真菌等生理活性。從雙殼貝類(lèi)中提取的文蛤寡肽Mere15、菲律賓蛤仔寡肽對(duì)人慢性骨髓性白血病K562細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞具有增殖抑制作用，并導(dǎo)致濃度依賴性細(xì)胞凋亡；從近江牡蠣提取的糖胺聚糖具有體內(nèi)外抗腫瘤活性，不僅可以抑制K562、CNE-2Z、Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)，還對(duì)CTX損傷小鼠的免疫功能有一定的修復(fù)作用。青蛤（Cyclinasinensis）屬于軟體動(dòng)物門(mén)，鰓瓣綱，異齒亞綱，簾蛤目、簾蛤科，含高蛋白、低脂肪和高含量的不飽和脂肪酸，味道鮮美，具有很好的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。青蛤在民間入藥具有悠久的歷史，是一種重要的海洋藥物，具有軟堅(jiān)散結(jié)、清熱燥濕及鎮(zhèn)咳作用。ChangxingJ等從青蛤中提取出的多糖具有抗氧化和保肝活性，對(duì)人胃癌BGC-823細(xì)胞的生長(zhǎng)具有強(qiáng)烈的抑制作用。然而，目前關(guān)于青蛤寡肽的提取及活性的研究報(bào)道并不多，本實(shí)驗(yàn)采用蛋白酶酶解青蛤內(nèi)臟，經(jīng)正交實(shí)驗(yàn)獲得最佳酶解條件，經(jīng)分離純化，篩選出活性寡肽，研究其體外抗人前列腺癌DU-145細(xì)胞的活性，以期為青蛤活性寡肽的制備及抗癌作用研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種青蛤酶解寡肽的用途。本發(fā)明為解決上述技術(shù)問(wèn)題所采取的技術(shù)方案為：該寡肽的氨基酸序列為Ile-Leu-Tyr-Met-Pro（ILYMP），分子量為635.82Da。該肽采用如下方式制備：1）取青蛤勻漿，以活性酶在最適酶解溫度及pH值條件下，加蛋白酶200~12000U/g、保溫4~10h進(jìn)行酶解；然后后滅活，在0~4oC、12000r/min的條件下離心，取上清；2）取最佳酶種及最優(yōu)酶解條件下酶解的上清液，用截留分子量為3ku的超濾膜進(jìn)行超濾；3）取超濾組分進(jìn)行瓊脂糖凝膠層析分離，濃度：0.01~0.5g/mL，離心后取上清過(guò)0.22μm濾膜，進(jìn)行洗脫；收集洗脫產(chǎn)物，冷凍干燥；4）取組分過(guò)HPLC進(jìn)一步分離得到青蛤抗腫瘤酶解寡肽。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的一種青蛤抗腫瘤酶解寡肽的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明工藝科學(xué)合理，操作簡(jiǎn)單，隨著青蛤抗腫瘤酶解寡肽（CSOP）濃度的增加，作用時(shí)間的延長(zhǎng)，DU-145細(xì)胞的增殖抑制率明顯上升；倒置顯微鏡下觀察、AO/EB熒光染色、Hoechst33258熒光染色及透射電鏡技術(shù)實(shí)驗(yàn)表明細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)變化；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，細(xì)胞早期凋亡率及線粒體膜電位下降所占百分率增加，且隨著CSOP濃度增加，早期凋亡率增加較為明顯，其膜電位下降更為顯著，即預(yù)示線粒體凋亡信號(hào)通路在CSOP誘導(dǎo)的DU-145細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著重要作用。同時(shí)，本發(fā)明所制備的青蛤抗腫瘤酶解寡肽是天然原料經(jīng)酶解制得，安全、無(wú)毒副作用，抗腫瘤活性顯著，青蛤抗腫瘤酶解寡肽可以作為抗前列腺癌藥品、功能食品進(jìn)行開(kāi)發(fā)。附圖說(shuō)明圖1本為發(fā)明實(shí)施例分子結(jié)構(gòu)示意圖；圖2本為發(fā)明實(shí)施例瓊脂糖凝膠柱洗脫峰示意圖；圖3本為發(fā)明實(shí)施例寡肽組分在280nm處高效液相色譜圖；圖4本為發(fā)明實(shí)施例寡肽對(duì)DU-145細(xì)胞的增殖抑制作用對(duì)比圖；圖5為本發(fā)明實(shí)施例對(duì)DU-145細(xì)胞nm23H1蛋白的表達(dá)示意圖。具體實(shí)施方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。實(shí)施例：一種青蛤抗腫瘤酶解寡肽制備工藝流程如下：1）樣品的制備將青蛤洗凈、去殼、取內(nèi)臟，并用0.1mol/L的NaoH溶液浸泡去脂，于蒸餾水中輕輕攪拌去雜質(zhì)，加一倍體積的純水勻漿后備用。2）青蛤的酶解：分別取10.0g勻漿樣品，以堿性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶這5種酶為供試酶種，在各自最適酶解溫度及pH值條件下（見(jiàn)表1），加蛋白酶1200-1800U/g、保溫1-6h進(jìn)行酶解。結(jié)束后滅活15min，4oC、12000r/min離心10min，取上清。表1不同蛋白酶的最適酶解溫度和pH酶種酶解溫度（℃）酶解pH堿性蛋白酶45.010.0胰蛋白酶37.08.0木瓜蛋白酶60.06.0中性蛋白酶45.07.0胃蛋白酶37.02.0作為優(yōu)選，最優(yōu)酶種為木瓜蛋白酶。料液比為1:4，pH值為7.0，加酶量為1500U/g，溫度為45.0℃，酶解時(shí)間是4h。3）青蛤抗腫瘤酶解寡肽的分離純化：將選取上述上清液＜3ku分子段酶解液進(jìn)行下步純化。具體過(guò)程為：取＜3ku分子段凍干樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠層析，于280nm處出現(xiàn)三個(gè)峰，即峰1、峰2和峰3，見(jiàn)圖2，收集各峰組分，冷凍干燥。MTT法顯示峰1和峰3對(duì)DU-145細(xì)胞的抑制活性較好。收集峰1冷凍干燥。峰1即為青蛤酶解寡肽，該峰的保留時(shí)間約為12min，峰面積16.32，峰高1999.79，經(jīng)N端測(cè)序得出該肽的氨基酸序列為：Ile-Leu-Tyr-Met-Pro，分子量635.82Da。CSOP作用DU-145細(xì)胞后的MTT結(jié)果見(jiàn)圖4。青蛤酶解寡肽（即CSOP）濃度的增加、作用時(shí)間的延長(zhǎng)，增值抑制率IR明顯上升。當(dāng)CSOP濃度為2mg/mL，作用時(shí)間為24h，IR為9.89±0.49%；而當(dāng)濃度為15mg/mL，作用時(shí)間72h，IR達(dá)到84.17±4.21%，IC50為5.36±0.27mg/mL，與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。nm23H1蛋白陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕色結(jié)構(gòu)。A正常DU-145細(xì)胞B2mg/mLCSOP組DU-145細(xì)胞，C8mg/mLCSOP組DU-145細(xì)胞，D12mg/mLCSOP組DU-145細(xì)胞。對(duì)照組大部分細(xì)胞胞漿內(nèi)呈淺棕色，個(gè)別細(xì)胞呈現(xiàn)陰性（見(jiàn)A）。而隨著CSOP作用濃度的增加，視野下的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的陽(yáng)性部位顏色逐漸加深，出現(xiàn)了巨核細(xì)胞，部分細(xì)胞核呈固縮狀態(tài)。該寡肽可用于制備預(yù)防腫瘤的保健食品或食品添加劑的用途。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。SEQUENCELISTING<110>浙江海洋學(xué)院<120>一種青蛤酶解寡肽的用途<130>zjou-yzs-03<160>1<170>PatentInversion3.5<210>1<211>5<212>PRT<213>人工合成<400>1IleLeuTyrMetPro15當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3