本發(fā)明屬于血漿游離DNA檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)染色體非整倍體的血漿游離DNA測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建方法及試劑盒。

背景技術(shù)：

血漿游離DNA為小片段、碎片化DNA，片段長(zhǎng)度100～300bp之間，峰值在160bp左右。1997年，盧煜明教授發(fā)現(xiàn)在孕婦外周血漿中含有胎兒的游離DNA，從而開(kāi)創(chuàng)以游離DNA為檢測(cè)來(lái)源，分析孕婦所懷胎兒是否有染色體異常。血漿中也存在來(lái)源于腫瘤細(xì)胞的循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)，ctDNA被廣泛用來(lái)做腫瘤液態(tài)活檢，可以無(wú)創(chuàng)傷性的早期診斷、伴隨診斷、預(yù)后隨訪等。

血漿游離DNA的檢測(cè)方法有PCR、基因芯片、數(shù)字PCR、高通量測(cè)序等技術(shù)。PCR、數(shù)字PCR技術(shù)適合于單個(gè)或少數(shù)位點(diǎn)的檢測(cè)，由于游離DNA是碎片化的特點(diǎn)，所以PCR技術(shù)的檢出率不高?；蛐酒夹g(shù)是利用多個(gè)探針和目標(biāo)片段進(jìn)行雜交，然而基因芯片技術(shù)需要樣本起始量較多，同時(shí)也受限于也有的探針的具體情況，檢測(cè)的靈敏度和特異性不佳。高通量測(cè)序是通過(guò)大規(guī)模平行測(cè)序，每次檢測(cè)數(shù)千萬(wàn)條序列，可以精準(zhǔn)的定性、定量游離DNA含量和堿基突變情況。

市場(chǎng)上主流的高通量測(cè)序儀主要由Illumina、ThermoFisher等提供，任何一種高通量測(cè)序平臺(tái)在進(jìn)行檢測(cè)前都會(huì)要求首先把待測(cè)DNA樣本構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，即在待測(cè)DNA兩端連接上測(cè)序儀通用的接頭DNA序列，從而讓該待測(cè)片段DNA可以在測(cè)序儀不同的芯片上進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。

高通量測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建的基本流程是：1.末端補(bǔ)平；2.堿基最后增加一個(gè)A；3.連接接頭；4.PCR擴(kuò)增。由于每一步都有獨(dú)立的酶和緩沖體系，所以在常規(guī)的高通量測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中，每一次反應(yīng)中間都需要進(jìn)行基于硅膠柱或磁性顆粒的DNA純化。也就說(shuō)常規(guī)的高通量測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建流程有：1.末端補(bǔ)平；2.純化；3.堿基最后增加一個(gè)A；4.純化；5.連接接頭；6.純化；7.PCR擴(kuò)增等7個(gè)步驟。整個(gè)試驗(yàn)流程需要5～8個(gè)小時(shí)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

血漿游離DNA在外周血漿中含量低，每ml血漿約6～10ng DNA，每一次繁瑣的建庫(kù)步驟都會(huì)有一定的損失，會(huì)造成需要起始樣本量要求高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于目前血漿游離脫氧核糖核酸(DNA)的常規(guī)建庫(kù)過(guò)程需要末端補(bǔ)平、純化、加A、純化、連接接頭、純化、PCR、純化等八個(gè)步驟，需要6～8個(gè)小時(shí)，該過(guò)程存在耗時(shí)長(zhǎng)、樣本損失大的缺陷。本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)染色體非整倍體的血漿游離DNA測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建方法，是一種可實(shí)現(xiàn)單管、無(wú)需PCR擴(kuò)增的游離DNA建庫(kù)方法。

一種游離DNA文庫(kù)構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)抽提血漿中游離DNA，加入游離DNA末端補(bǔ)平酶和dNTP，補(bǔ)平游離DNA末端并在游離DNA的3’端增加堿基A；

2)直接往步驟1反應(yīng)體系中加入磷酸化酶去除多余的dNTP；

3)直接往步驟2反應(yīng)體系中加入DNA連接試劑，使目標(biāo)待測(cè)DNA與DNA接頭連接。

本發(fā)明整合末端補(bǔ)平加A在一步完成，同時(shí)為了避免過(guò)量dNTP會(huì)引起后續(xù)步驟DNA接頭自連，在完成補(bǔ)平加A后創(chuàng)新地加入微量的磷酸化酶，去除過(guò)量dNTP，隨后不需要純化DNA，直接在反應(yīng)體系中加入DNA連接酶及DNA接頭，完成文庫(kù)構(gòu)建。整個(gè)過(guò)程在一個(gè)反應(yīng)體系中完成，DNA樣本加入試管后，分別加入三步試劑，不需要純化和PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系在一個(gè)試管中完成。

進(jìn)一步地，所述構(gòu)建方法還包括步驟4)：將步驟3)的產(chǎn)物用硅膠柱或磁性顆粒純化。產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱或磁性顆粒純化后，無(wú)需進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可直接在illuminaHiSeq、NextSeq CN500、NextSeq AR550、MiSeq、MiniSeq等測(cè)序儀上直接檢測(cè)使用。

所述游離DNA末端補(bǔ)平酶為T(mén)4DNA聚合酶、Klenowexo-、T4DNA磷酸激酶(T4DNA PNK)、Taq聚合酶或Klenow酶中的一種或多種。步驟1反應(yīng)條件是37℃20分鐘，反應(yīng)后無(wú)需純化。

所述磷酸化酶為細(xì)菌堿性磷酸酶(BAP)或蝦源磷酸酶(SAP)。步驟2反應(yīng)條件是37℃1分鐘，75℃變性，反應(yīng)后無(wú)需純化。

所述DNA連接試劑主要由T4DNA連接酶和DNA接頭組成。步驟3反應(yīng)條件是20℃15～20分鐘，反應(yīng)后無(wú)需純化。

本發(fā)明的高通量測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建方法中包括三種酶蛋白：(1)游離DNA末端補(bǔ)平酶(T4DNA聚合酶或和Klenowexo-、T4DNA PNK、Taq或Klenow酶)；(2)磷酸化酶(細(xì)菌堿性磷酸酶(BAP)或蝦源磷酸酶(SAP))、(3)DNA連接酶。

這三類(lèi)酶的組合，創(chuàng)新地把游離DNA高通量測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建減少到兩步。游離DNA末端補(bǔ)平酶，把天然的游離DNA的末端碎片進(jìn)行補(bǔ)平，并增加一個(gè)堿基A。磷酸化酶可去除過(guò)量的dNTP，最后通過(guò)DNA連接酶把測(cè)序平臺(tái)需要的接頭和目標(biāo)待測(cè)DNA進(jìn)行連接。

本發(fā)明創(chuàng)造性的結(jié)合了游離DNA末端補(bǔ)平和加A在一步反應(yīng)，在反應(yīng)體系中引入微量的磷酸酶去除過(guò)量的dNTP，以免由于單管法各種酶滅活不徹底造成的后期DNA接頭自連，同時(shí)通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)酶的選擇和合適的緩沖體系，省卻了補(bǔ)平加A和連接DNA接頭之間的純化步驟，更重要的是通過(guò)反應(yīng)體系的構(gòu)建，免除了游離DNA文庫(kù)的PCR環(huán)節(jié)，大大降低了PCR過(guò)程中產(chǎn)生的GC偏好及氣溶膠污染的可能。

針對(duì)極低量的血漿游離DNA的高通量測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建，本發(fā)明大大簡(jiǎn)化了試驗(yàn)流程、減少了制備過(guò)程中的損耗、減少了DNA接頭自連的比例、避免了PCR氣溶膠污染，使得的無(wú)創(chuàng)胎兒染色體非整倍體檢測(cè)、無(wú)創(chuàng)胎兒?jiǎn)位虿z測(cè)、無(wú)創(chuàng)胎兒多基因病檢測(cè)、無(wú)創(chuàng)胎兒全基因組檢測(cè)、游離DNA靶向測(cè)序、游離DNA全基因組測(cè)序、ctDNA檢測(cè)可以更加穩(wěn)定，所需樣本量更低，病人依從度更高。這種無(wú)需擴(kuò)增的游離DNA高通量測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)，是一個(gè)更快速、更準(zhǔn)確的高通量測(cè)序檢測(cè)技術(shù)。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種構(gòu)建用于檢測(cè)染色體非整倍體的血漿游離DNA測(cè)序文庫(kù)的試劑盒，采用該試劑盒，無(wú)需進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

一種構(gòu)建游離DNA文庫(kù)的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒主要包括游離DNA末端補(bǔ)平酶、dNTP、ATP、磷酸化酶、DNA連接試劑、Tris、二硫蘇糖醇。

上述試劑中分成三組試劑，第一組為游離DNA末端補(bǔ)平試劑：由2單位/μl末端補(bǔ)平酶(T4DNA聚合酶或、Klenowexo-、T4DNA PNK、Taq或Klenow酶)、490uM的dNTPs，55mM的Tris緩沖液組成，反應(yīng)條件是37℃20分鐘，反應(yīng)后無(wú)需純化。

第二組試劑為磷酸化酶，直接在前一步驟中加入1μl 0.1單位/μl細(xì)菌堿性磷酸酶(BAP)或蝦源磷酸酶(SAP)，37℃1分鐘，75℃變性。

第三組試劑為DNA連接試劑：由100單位/μl的DNA連接酶，3.5mM的ATP，55mM的Tris緩沖液，30mM的二硫蘇糖醇及DNA接頭組成。反應(yīng)條件是20℃15～20分鐘，反應(yīng)結(jié)束后直接由硅膠柱或磁性顆粒純化即可直接上高通量測(cè)序儀檢測(cè)。

血漿游離DNA可以用來(lái)進(jìn)行無(wú)創(chuàng)的產(chǎn)前和腫瘤基因檢測(cè)，在待檢血漿游離DNA樣本中加入游離DNA末端補(bǔ)平試劑，37℃溫浴20分鐘，直接加入磷酸化酶37℃1分鐘，升溫到75度變性蛋白酶5分鐘，不用純化，直接加入連接試劑和DNA接頭，20℃15～20分鐘，反應(yīng)即完成。直接可放置到高通量測(cè)序儀進(jìn)行檢測(cè)。由于試驗(yàn)步驟少，損失小，操作速度快，所以本發(fā)明試劑盒檢測(cè)靈敏度更高、起始樣本需要量更少、結(jié)果更穩(wěn)定。

本發(fā)明通過(guò)多個(gè)蛋白酶的選擇、組合，以及它們之間的互相作用、溫度，緩沖體系的建立，實(shí)現(xiàn)了單管、無(wú)需PCR擴(kuò)增的游離DNA建庫(kù)方法，大大加快了游離DNA的建庫(kù)流程，避免了由于常規(guī)試驗(yàn)所需PCR擴(kuò)增而引起的氣溶膠污染，從而使今后基于游離DNA的無(wú)創(chuàng)胎兒染色體非整倍體檢測(cè)、無(wú)創(chuàng)胎兒?jiǎn)位虿z測(cè)、無(wú)創(chuàng)胎兒多基因病檢測(cè)、無(wú)創(chuàng)胎兒全基因組檢測(cè)、游離DNA靶向測(cè)序、游離DNA全基因組測(cè)序、ctDNA檢測(cè)制備流程大大簡(jiǎn)化。

本發(fā)明具有以下技術(shù)特點(diǎn)：

(1)無(wú)需PCR擴(kuò)增：由于血漿游離DNA含量低，每毫升血漿只有6～10ng DNA，是常規(guī)核酸檢測(cè)起始量的百分之至千分之一，所以目前市面上所有的游離DNA高通量測(cè)序建庫(kù)試劑盒，都需要進(jìn)行PCR擴(kuò)增以后才能上機(jī)檢測(cè)，否則無(wú)法得出穩(wěn)定的結(jié)果。本發(fā)明通過(guò)工程酶的組合、緩沖體系的優(yōu)化、反應(yīng)溫度優(yōu)化、試驗(yàn)步驟的減少，讓最后的結(jié)果無(wú)需PCR擴(kuò)增就可以穩(wěn)定得到，從而也大大減少了PCR可能引起的氣溶膠污染的可能。

(2)單管法：常規(guī)的游離DNA建庫(kù)試劑盒，需要有補(bǔ)平-純化-加A-純化-連接-純化-PCR-純化，四步試驗(yàn)加四次純化，每次純化都要由試驗(yàn)反應(yīng)條件的PCR管換成1.5ml的EP管，從而在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程有多個(gè)液體轉(zhuǎn)移、開(kāi)閉管蓋的步驟，存在樣本轉(zhuǎn)移出錯(cuò)及開(kāi)閉管蓋引起的氣溶膠污染。本方法只要在一個(gè)試管中完成，中間沒(méi)有純化步驟，只需要持續(xù)在一個(gè)試管加入反應(yīng)液體，減少了樣本轉(zhuǎn)移過(guò)程可能出錯(cuò)的可能。同時(shí)由于沒(méi)有PCR環(huán)節(jié)，開(kāi)關(guān)管蓋也不會(huì)引起氣溶膠污染。

(3)快速：由于試驗(yàn)步驟減少到兩步，同時(shí)在一管完成，以往常規(guī)需要在6～8個(gè)小時(shí)完成的文庫(kù)構(gòu)建工作，本方法可以在40分鐘完成，大大加快了整個(gè)試驗(yàn)流程。

(4)工程酶選擇：高通量測(cè)序構(gòu)建文庫(kù)的方法很多，本方法通過(guò)大量的組合測(cè)試，選擇了本方法陳述的工程酶選擇組合，實(shí)現(xiàn)了單管、無(wú)需純化、無(wú)需PCR的建庫(kù)流程。

(5)DNA接頭自連少：由于在連接之前去除了過(guò)量的dNTP，減少了接頭在反應(yīng)中補(bǔ)平后產(chǎn)生自連的現(xiàn)象，因此減少了自連的產(chǎn)生，避免測(cè)序產(chǎn)生大量無(wú)效數(shù)據(jù)。

附圖說(shuō)明

圖1是常規(guī)高通量測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建方法流程圖。

圖2是本發(fā)明高通量測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建方法流程圖。

圖3是通過(guò)熒光定量PCR建庫(kù)檢測(cè)建庫(kù)的有效性。高通量測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建是在目標(biāo)待測(cè)DNA左右加上通用的DNA接頭，可以通過(guò)DNA接頭里面對(duì)應(yīng)的引物，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增檢測(cè)來(lái)看建庫(kù)的有效性，如果能有熒光信號(hào)，說(shuō)明樣本已經(jīng)被連接上特異的DNA接頭，建庫(kù)成功。

圖4a、4b、4c是本方法構(gòu)建的高通量測(cè)序文庫(kù)，經(jīng)過(guò)測(cè)序儀檢測(cè)后，比對(duì)到基因組，通過(guò)計(jì)數(shù)基因組DNA數(shù)量反應(yīng)孕婦所懷的胎兒是否有染色體非整倍體。圖4a顯示13號(hào)染色體三體和正常樣本的區(qū)別，圖4b顯示18號(hào)染色體三體和正常樣本的區(qū)別，圖4c顯示21號(hào)染色體三體和正常樣本的區(qū)別。

圖5是本方法構(gòu)建的高通量測(cè)序文庫(kù)，經(jīng)過(guò)測(cè)序儀檢測(cè)后，比對(duì)到基因組，通過(guò)計(jì)數(shù)基因組DNA數(shù)量反應(yīng)孕婦所懷的胎兒是否有染色體非整倍體。黑色三角形為XXX染色體異常，黑色方塊為正常女胎對(duì)照樣本，黑色圓點(diǎn)為正常男胎對(duì)照樣本。

圖6是本方法構(gòu)建的高通量測(cè)序文庫(kù)，檢測(cè)特定基因突變情況。結(jié)果為測(cè)序所得堿基和參考序列比對(duì)結(jié)果，可以看到通過(guò)本方法構(gòu)建的測(cè)序文庫(kù)，經(jīng)過(guò)高通量測(cè)序以后在特定堿基位置發(fā)現(xiàn)基因由T到G的突變。

具體實(shí)施方式

以下具體實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明提供的方法與技術(shù)方案的進(jìn)一步說(shuō)明，但不應(yīng)理解成對(duì)本發(fā)明的限制。

本發(fā)明中使用的生物材料來(lái)源：

(1)游離DNA樣本來(lái)源于孕婦血漿、腫瘤病人血漿。

(2)DNA接頭由大連寶生物公司合成。

實(shí)施例1

本實(shí)施例用于說(shuō)明本方法能快速構(gòu)建血漿游離DNA文庫(kù)。

1、1ml孕婦血漿，經(jīng)由QIAamp Circμlating Nucleic Acid Kit抽提血漿游離DNA。

2、加入2單位/μl末端補(bǔ)平酶(T4DNA聚合酶或和Klenowexo-)、490uM的dNTPs，55mM的Tris緩沖液組成，反應(yīng)條件是37℃20分鐘。

3、直接在試管中加入1μl CAP，37℃ 1分鐘，75℃ 5分鐘變性。

4、直接在試管中加入DNA連接試劑：100單位/μl的DNA連接酶，3.5mM的ATP，55mM的Tris緩沖液，30mM的二硫蘇糖醇及DNA接頭組成。反應(yīng)條件是20℃20分鐘，反應(yīng)結(jié)束后直接由硅膠柱或磁性顆粒純化即可直接上高通量測(cè)序儀檢測(cè)。

5、文庫(kù)可用于illuminaHiSeq、NextSeq、MiSeq、MiniSeq測(cè)序儀檢測(cè)。

實(shí)施例2

本實(shí)施例用于說(shuō)明本方法構(gòu)建孕婦血漿游離DNA，可檢測(cè)胎兒染色體非整倍體。(見(jiàn)圖3、圖4a、4b、4c)

1、懷有不同染色體異常的孕婦血漿1ml，經(jīng)由QIAamp Circμlating Nucleic Acid Kit抽提血漿游離DNA。

2、加入2單位/μl末端補(bǔ)平酶(T4DNA聚合酶或和Klenowexo-)、490uM的dNTPs，55mM的Tris緩沖液組成，反應(yīng)條件是37℃ 20分鐘。

3、直接在試管中加入1μl CAP，37℃ 1分鐘，75℃ 5分鐘變性。

4、直接在試管中加入DNA連接試劑：100單位/μl的DNA連接酶，3.5mM的ATP，55mM的Tris緩沖液，30mM的二硫蘇糖醇及DNA接頭組成。反應(yīng)條件是20℃20分鐘，反應(yīng)結(jié)束后直接由硅膠柱或磁性顆粒純化即可直接上高通量測(cè)序儀檢測(cè)。

5、文庫(kù)可用于illuminaHiSeq、NextSeq、MiSeq、MiniSeq測(cè)序儀檢測(cè)。

6、每個(gè)樣本測(cè)序三百萬(wàn)條在染色體上唯一對(duì)應(yīng)的DNA序列，每條序列通過(guò)BWA軟件進(jìn)行染色體比對(duì)，從而得到每條染色體的測(cè)序所得序列的比值。

7、按照盧煜明教授2008年發(fā)表的胎兒染色體非整倍體算法，得到每個(gè)染色體的Z值，Z值在-3和3之間的屬于正常樣本，超出范圍的都為染色體非整倍體。

實(shí)施例3

本實(shí)施例用于說(shuō)明本方法構(gòu)建腫瘤病人血漿游離DNA，可檢測(cè)循環(huán)腫瘤DNA突變。(結(jié)果見(jiàn)圖5)

1、腫瘤病人血漿1ml，經(jīng)由QIAamp Circμlating Nucleic Acid Kit抽提血漿游離DNA。

2、加入2單位/μl末端補(bǔ)平酶(T4 DNA聚合酶或和Klenowexo-)、490uM的dNTPs，55mM的Tris緩沖液組成，反應(yīng)條件是37℃20分鐘。

3、直接在試管中加入1μl CAP，37℃1分鐘，75℃5分鐘變性。

4、直接在試管中加入DNA連接試劑：100單位/μl的DNA連接酶，3.5mM的ATP，55mM的Tris緩沖液，30mM的二硫蘇糖醇及DNA接頭組成。反應(yīng)條件是20℃20分鐘，反應(yīng)結(jié)束后直接由硅膠柱或磁性顆粒純化即可直接上高通量測(cè)序儀檢測(cè)。

5、文庫(kù)可用于illuminaHiSeq、NextSeq、MiSeq、MiniSeq測(cè)序儀檢測(cè)。

6、每個(gè)樣本測(cè)序三億條在染色體上唯一對(duì)應(yīng)的DNA序列，每條序列通過(guò)BWA軟件進(jìn)行染色體比對(duì)，從而得到全基因組相應(yīng)堿基的突變情況。